KR101271330B1 - SSR primer for screening race or line of Lilium spp. Longiflorum section and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 나리 속 나팔나리 절 식물의 품종 또는 육성계통 판별을 위한 SSR프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 34로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 나리 속 나팔나리 절 식물의 품종 또는 육성계통 판별을 위한 SSR프라이머 및 이를 이용한 품종 또는 육성계통 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머는 백합속 나팔나리절 품종 및 육성계통 식물 식물의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 나리 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 SSR 프라이머는 백합속 나팔나리절 품종 및 육성계통 식물의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 이를 통하여 나리의 품종을 판별할 수 있다.The present invention relates to an SSR primer and its use for discriminating varieties or growing systems of the genus Lilium bug leaf plant, and more specifically, SSR primer having two base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34 The present invention relates to a pair of SSR primers for discriminating varieties or growing systems of the genus Lichen bug plants, including performing PCR using the same, and a breeding or breeding method using the same. SSR primer according to the present invention can be very useful for preparing the DNA profile of the genus Lilium Bugle varieties and growing plant plants. In this way, by efficiently evaluating Nari genetic resources, it is possible to effectively conduct redundancy analysis and establish novelty with existing resources when introducing new genetic resources. In addition, the SSR primer according to the present invention can effectively detect the DNA polymorphism of the genus Liliaceae bugle varieties and breeding plants, through which can determine the varieties of Lilium.
Description
본 발명은 나리 속 나팔나리 절 식물의 품종 또는 육성계통 판별을 위한 SSR프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 34로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 나리 속 나팔나리 절 식물의 품종 또는 육성계통 판별을 위한 SSR프라이머 및 이를 이용한 품종 또는 육성계통 판별 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an SSR primer and its use for discriminating varieties or growing systems of the genus Lilium bug leaf plant, and more specifically, SSR primer having two base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34 The present invention relates to a pair of SSR primers for discriminating varieties or growing systems of the genus Lichen bug plants, including performing PCR using the same, and a breeding or breeding method using the same.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
Large quantities of genetic resources are collected annually in most major crops and cultivated crops used for breeding. However, on the other hand, the evaluation of genetic resources has not been sufficiently made. Rapid discrimination between species and subspecies varieties of collected genetic resources is very important for accurate management and protection of genetic resources. In addition to the identification of varieties, the identification and classification of trait traits and genetic relationships of genetic resources are very important for the conservation of genetic resources, the creation of new varieties, and the improvement of crops.
최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류/동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 핵산지문법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 초위성체 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요작물 및 소재배 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 한창 진행 중에 있다.
Recent rapid advances in molecular biology have led to the development of nucleic acid fingerprint analysis methods and various DNA markers that enable bio-diversity studies at the nucleic acid (DNA) level. This makes it possible to search useful traits, identify species of species, classify / identify varieties and analyze flexible relationships of populations in a simple and quick way with little influence on the external environment. Nucleic acid fingerprinting using polymerase chain reaction (PCR) developed so far includes randomly amplified polymorphic DNAs (RAPD), amplified fragment length polymorphic DNA (AFLP), and simple sequence repeat (SSR). The RAPD method has a disadvantage of poor reproducibility because the non-specific PCR product is amplified, and the AFLP method is spotlighted by high DNA polymorphism detection, but has a disadvantage of complicated appearance and analysis of a low reproducible band. In contrast, the SSR method is a method of constructing a PCR primer based on nucleotide sequence information of a microsatellite region, which is a DNA repeat sequence. Frequently used. In particular, the SSR method has the advantage that it is not affected by the external environment at all. Due to the superiority of this SSR method, studies are underway to develop SSR markers in several major crops and cultivated crops.
벼에서는 벼 게놈에 반복되는 SSR을 PCR 기술로 증폭하여 벼 품종의 유전자형을 동정하는 초위성체 마커들이 개발되었다(특허출원번호 제2001-34003호). 미국의 탕(Tang) 박사팀은 879개의 SSR 마커들을 개발한 해바라기의 유전자 지도를 발표한 바 있다(Tang et al., Theor. Appl. Genet., 105: 1124-1136, 2002). 이외에도 보리, 콩, 율무, 매실, 귤, 인삼, 생강, 아마란스, 잔디, 조, 녹두, 기장, 옥수수, 메밀, 팥, 다래, 구기자, 버섯, 마늘, 참깨, 들깨 등 많은 식물에서 SSR 마커들이 개발되었다. 그러나, 나리(백합)에 대한 SSR 마커가 전혀 개발된 바 없다.
In rice, supersatellite markers have been developed that amplify SSR repeated in the rice genome by PCR technology to identify genotypes of rice varieties (Patent Application No. 2001-34003). Tang's team in the United States published a genetic map of sunflowers that developed 879 SSR markers (Tang et al., Theor. Appl. Genet., 105: 1124-1136, 2002). In addition, SSR markers have been developed in many plants such as barley, soybeans, yulmu, plums, tangerines, ginseng, ginger, amaranth, grass, crude, green beans, millet, corn, buckwheat, red beans, azalea, wolfberry, mushrooms, garlic, sesame and perilla It became. However, no SSR marker for lily has been developed.
나리(백합)는 식물학적으로 현화식물(Phanerogamae), 피자식물아문(Angiospermae), 단자엽식물강(Monocotyledonea), 나리과군(Liliales), 나리과(Liliaceae), 나리속(Lilium)에 속하는 내한성 추식 구근이며, 2배체(2n)또는 3배체(3n)로서 체세포 염색체 수는 24 또는 36이다. 나리는 북반구 온대지역에 130여종이 자생하고 있는데, 이 중 71종이 아시아에, 22종이 유럽 및 유라시아에, 그 밖에 37종이 북미대륙에 분포되어 있는 것으로 알려져 있으며 변종을 합치면 모두 600여종에 달하고 원예품종은 4,000종에 이를 정도로 많다(허북구, 한용희, 이순봉, 김삼곤. 1994. 나리(백합)재배의 실제와 이론).
Lilium (lily) is a cold-resistant bulb belonging to the botanical plants of Panerogamae, Angiospermae, Monocotyledonea, Liliales, Liliaceae and Lilium. The somatic chromosome number as either diploid (2n) or triploid (3n) is 24 or 36. There are more than 130 species native to the northern hemisphere, 71 of which are known to be distributed in Asia, 22 to Europe and Eurasia, and 37 to the North American continent. There are as many as 4,000 species (Hebuk-gu, Han Yong-hee, Lee Soon-bong, Kim Sam-gon. 1994. Actuality and Theory of Nari Cultivation).
나리 속에 관한 분류는 1754년 Linne에 의해 처음으로 구분되었으며 그 당시에는 Lilium candidum , L. bulbiferum, L. pomponium , L. chalcedonicum , L. martagon , L. canadence , L. camtschatcence 등 7종 만이 포함되었으나, 그 후 많은 종의 나리가 추가로 발견되어 현재에는 130여 종의 나리 원종이 나리 속에 포함된다. 윌슨은 화서, 꽃의 형태 잎의 모양 및 인경 등을 기초로 하여 나팔나리 아속(Leucolirion; 통상화측향 또는 하향, 상향개화), 산나리아속(Archelirion; 누두화 상향개화, 측향개화), 틈나리아속(Pseudolirion; 배상화 상향개화), 말나리아속(Marathon; 종종상화 하향개화) 등 4가지 아속으로 분류하였다(Wilson EH. 1925. The lilies of Eastern Asia: A Monograph. Dulau & Company, LTD. London). 콤버는 각 종(Species)의 화형, 지리적인 분포, 구근의 모양, 잎의 부착모양, 종자의 발아습성, 발육과정 등을 고려하여 원종을 구분하였는데(Comber HF. 1949. A New classification of the genus Lilium. R. H. S. Lily Yearbook 15:86-105) 이러한 분류는 몇몇 종에서는 분류상 다소 의문이 가는 것도 있지만 원종의 유사성 및 교배친화성 측면에서는 윌슨의 분류법보다 타당성이 높아 폭넓게 이용되고 있다. 이 후 원종간의 교잡이 진행되어 다수의 원예품종이 육성되어, 원예학적 분류가 필요하게 되면서, 1967년 영국 왕립원예학회(RHS; Royal Horiticultural Society)에서 발행한 ‘The International Lily Register’에 의한 분류법이 보편적으로 사용되고 있다. 이 분류법은 교잡 친화성에 따라 아시아계 (Asiatic group), 말타곤계 (Martagon group or Turk’s Cap group), 캔디듐계 (Candidum group), 아메리칸계 (American group), 나팔나리계 (Longiflorum group), 트럼펫계 (Trumpet group), 오리엔탈계 (Oriental group)등 7계이고, 이 중에 동서양을 막론하고 절화, 분화, 화단용 등 상업적으로 많이 이용되고 있는 것은 아시아틱계, 나팔나리계, 오리엔탈계 등이다. 이 후 Oriental hybrids, 기타 나머지 종을 한 계로 하여 2가지 절을 새로 추가 원예품종들을 8개의 계로 분류, 현재까지 이용되고 있다(McRae, E, A. 1998. Lilies. Timber Press, Portland).
The classification of Lilium was first distinguished by Linne in 1754, when Lilium was Only seven species, including candidum , L. bulbiferum, L. pomponium , L. chalcedonicum , L. martagon , L. canadence , L. camtschatcence , were found. Origin is included in Lilium. Wilson uses Leucolirion (orientated or downward or upward), Archelirion (Prunus), or Pseudolirion (4) subclassification (Wilson EH. 1925. The lilies of Eastern Asia: A Monograph. Dulau & Company, LTD. London). The comber classified the species in consideration of the species' shape, geographical distribution, bulb shape, leaf attachment, seed germination and development process (Comber HF. 1949. A New classification of the genus) Lilium RHS Lily Yearbook 15: 86-105) Although this classification is somewhat questionable in some species, it is widely used because of its similarity and mating affinity. After the hybridization between the cultivars, a number of horticultural varieties were raised, and horticultural classification was required. It is used universally. This taxonomy is Asian, Maltagon or Turk's Cap group, Candidum group, American group, Longiflorum group, Trumpet group, depending on hybridization affinity. ) And Oriental group. Among them, Asian, Trumpet, Oriental, etc. are widely used for cut flowers, differentiation and flower beds regardless of East and West. Since then, two additional horticultural varieties have been classified into eight families, with Oriental hybrids and other remaining species as limits (McRae, E, A. 1998. Lilies. Timber Press, Portland).
이와 같이 나리는 북반구 온대에 약 70종이 자생하고 있고, 우리나라에는 약 11종이 분포하고 있어서 한국은 나리의 자생국이라 할 수 있다. 하지만 우리 나라 자생 나리에 대한 연구로는 일부 종류의 재배와 번식학적인 면에서 약간의 연구가 있을 뿐 유전적 다양성에 대해서는 그 실적이 매우 미흡한 실정이다 (정적학, 김기선, 염도의, 홍영표. 1989. 한국 자생나리의 분포 및 생태, 형태학적 특성에 관한 연구). DNA 마커는 품종의 유전적 특성을 본질적으로 반영할 뿐만 아니라 생물체의 보편적 특성으로서 전 작물에 대하여 개발 및 적용이 가능하며 이론적으로 거의 무한대의 마커를 확보하여 품종 특성화 할 수 있다는 측면에서 그 이상성을 발견 할 수 있다. 더욱이 DNA 마커를 품종식별 목적으로 사용할 경우 품종 및 품종간 구별성을 계량화 하여 정의할 수 있으며 환경의 영향을 받지 않고 품 종구별성에 대한 기여도가 동일하여 구별성 정의에 왜곡이 없는 등 활용도가 매우 높다고 할 수 있다(박성환, 다카라코리아. Microsatellite marker를 이용한 품종판별 Life Science & Biotechnology 14-15p). 백합은 전세계적으로 매우 중요한 화훼 작물로 우리나라에서는 세번째로 많이 생산되고 있다. 우리나라 자생나리는 백합원예 품종육성의 중요 모본으로 활용되어 왔으며 지금도 많은 국가에서 이용되고 있다. 특히 Longiflorum 절의 품종들은 흰색의 백합을 대표하는 그룹으로 많은 종과 품종이 육성되어 왔다. Longiflorum 절에는 Lilium logiflorum, L. formosanum, L. philippinense등이 대표종이고 이들을 이용하여 육성된 대표적인 품종들은 ‘Gelria', 'Augusta', 'White american', 'Julius', ’August', 'Stuyava', ‘Raizan’ ‘Herald', 'Adelina’, ‘Hinomoto' 등이 있으나 이들 품종간 구별을 위한 분자마커는 아직 개발된적이 없다.
Thus, about 70 species of Nari grow in the temperate zone of the northern hemisphere, and about 11 species are distributed in Korea, and Korea is a native country of Nari. However, there are some studies on the native lilies of Korea, but some researches on the cultivation and reproduction are very poor. A Study on the Distribution, Ecology, and Morphological Characteristics of Korean Native Lilium). DNA markers not only reflect the genetic characteristics of varieties inherently, but are also universal characteristics of organisms, and can be developed and applied to all crops. can do. Moreover, when DNA markers are used for cultivar identification purposes, they can be defined by quantifying the distinction between varieties and varieties. (Park Sung-hwan, Takara Korea. Life Science & Biotechnology 14-15p). Lilies are a very important flower crop all over the world and are the third most produced in Korea. Korean native lilies have been used as an important model for the cultivation of lily horticulture varieties and are still used in many countries. In particular, Longiflorum Clause varieties represent white lilies, and many species and varieties have been grown. Lilium logiflorum, L. formosanum, L. philippinense are representative varieties of Longiflorum, and representative varieties cultivated using them are 'Gelria', 'Augusta', 'White american', 'Julius', 'August', 'Stuyava' , Raizan, Herald, Adelina, and Hinomoto, but no molecular markers have yet been developed to distinguish between these varieties.
이들 중요 품종들의 고유한 마커 개발은 새롭게 육성되는 품종들에 대한 고유특성을 부여할 수 있는 근거로 활용될 수 있기 때문에 매우 중요하다고 할 수 있다. 따라서 원예학적 측면에서만 연구되었던 나리를 분자유전학 측면에서 연구하고, SSR마커를 개발하여 나리 품종 또는 계통들간의 유전적 유사성과 다양성을 분석하고자 연구가 지속적으로 요구되어 왔다.
The development of unique markers of these important varieties is very important because they can be used as a basis for giving unique characteristics to newly cultivated varieties. Therefore, research has been continuously conducted to study Lilium, which has been studied only in horticultural aspects, in terms of molecular genetics, and to develop SSR markers to analyze genetic similarity and diversity among Lilium varieties or strains.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
이에 본 발명자들은 나리의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 백합속 Longiflorum 절의 품종 및 계통들에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머쌍을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors have completed the present invention by developing SSR primer pairs that show a large number of polymorphic variation in varieties and strains of the genus Longiflorum clause while developing the SSR markers that can efficiently evaluate the genetic resources of Lilium. It was.
따라서, 본 발명의 목적은 백합속 Longiflorum 절의 품종 및 육성계통을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커 및 이의 용도를 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an SSR marker and its use capable of efficiently evaluating the varieties and growing systems of the genus Longiflorum clause.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 34로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an SSR primer pair having two nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 분석하고자 하는 나리 속 식물로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 나리속 나팔나리 절의 품종 및 육성계통 식물의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) extracting genomic DNA from the genus Lilium plants to be analyzed; (b) using the extracted genomic DNA as a template and performing PCR using the SSR primer pair of the present invention; And (c) provides a method for detecting the DNA polymorphism of the varieties of the genus Lilium bugs, including the step of separating the PCR products by size.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 나리 및 대조군 나리 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및 (d) 상기 나리 및 대조군 나리 품종의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 나리속 나팔나리절 품종 또는 육성계통의 동정 방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) extracting genomic DNA from Lilium and Lilium varieties; (b) using each extracted genomic DNA as a template and performing PCR using the SSR primer pair of the present invention; (c) separating each PCR product by size; And (d) provides a method of identification of Lilium genus trumpet cultivars or breeding system comprising the step of comparing the results of the separation according to the size of the Lilium and the control Lilium varieties.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 SSR 프라이머쌍, DNA 중합효소 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 나리 속 식물의 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a kit for detecting DNA polymorphism of the genus Lilium plant comprising the SSR primer pair, DNA polymerase and PCR reaction buffer of the present invention.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 나리속 나팔나리절 품종 또는 육성계통 동정용 키트를 제공한다.
In order to achieve the another object of the present invention, the present invention provides a kit for identifying a genus trumpet cultivars or breeding system comprising the SSR primer pair of the present invention.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 나리 속(Lilium spp.) 나팔나리 절(Longiflorum section) 식물의 유전적 다양성을 특이적으로 분석할 수 있는 SSR 마커를 제공한다는 점에 특징이 있다. 본 발명에서는 AFLP와 한 방향(one way) PCR을 결합시킨 새로운 방법으로 나리 속 식물로부터 SSR 마커를 개발하였다.
The present invention is characterized in that it provides an SSR marker capable of specifically analyzing the genetic diversity of the Lilium spp. Longiflorum section plant. In the present invention, a SSR marker was developed from a plant of the genus Lilium by a novel method combining AFLP and one way PCR.
본 발명에서 제공하는 SSR 마커는 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 34로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 가진다. 바람직하게는 L37(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), L49(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), L50(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), L67(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), L75(서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), eL40(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), eL42(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), eL58(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), eL61(서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍), eL64(서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍), eL65(서열번호 21와 22로 표시되는 프라이머쌍), eL68(서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍), AAG37(서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍), AAC44(서열번호 27와 28로 표시되는 프라이머쌍), AGC43(서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍), f5(서열번호 31와 32로 표시되는 프라이머쌍) 및 f10(서열번호 33와 34로 표시되는 프라이머쌍)으로 이루어진 군에서 선택된다.
The SSR marker provided in the present invention refers to a PCR primer pair, and includes a forward primer and a reverse primer. SSR primer pair provided in the present invention has two base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34. Preferably, L37 (primary pair represented by SEQ ID NOs: 1 and 2), L49 (primary pair represented by SEQ ID NOs: 3 and 4), L50 (primary pair represented by SEQ ID NOs: 5 and 6), L67 (SEQ ID NO: 7 And primer pairs represented by 8), L75 (primer pairs represented by SEQ ID NOs: 9 and 10), eL40 (primer pairs represented by SEQ ID NOs: 11 and 12), and eL42 (primer pairs represented by SEQ ID NOs: 13 and 14) , eL58 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 15 and 16), eL61 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 17 and 18), eL64 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 19 and 20), eL65 (SEQ ID NOs: 21 and 22) Primer pairs represented by SEQ ID NO.), EL68 (primer pairs represented by SEQ ID NOs: 23 and 24), AAG37 (primer pairs represented by SEQ ID NOs: 25 and 26), AAC44 (primer pairs represented by SEQ ID NOs: 27 and 28), AGC43 (Primary pair represented by SEQ ID NOs: 29 and 30), f5 (primary pair represented by SEQ ID NOs: 31 and 32) Is selected from the group consisting of: f10 (SEQ ID NO: 33 and a primer pair represented by 34).
본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 17개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상 또는 17개 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하며, 가장 바람직하게는 30개의 SSR 프라이머 세트를 동시에 이용할 수 있다. 17개의 SSR 프라이머 세트를 동시에 이용하면 다른 나리 품종으로부터 나리 품종을 더욱 효율적으로 구분할 수 있다.
Primer set of the present invention is preferably at least one, at least two, at least three, at least four, at least five, at least six, at least seven, eight selected from the group consisting of the 17 SSR primer set At least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, or at least 17 SSR primer sets, most preferably 30 Two sets of SSR primers can be used simultaneously. By using 17 sets of SSR primers simultaneously, it is possible to more efficiently distinguish the cultivar from other cultivar varieties.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
In the present invention, "primer" refers to a single stranded oligonucleotide sequence that is complementary to the nucleic acid strand to be copied and may serve as a starting point for the synthesis of the primer extension product. The length and sequence of the primer should allow to start the synthesis of the extension product. The specific length and sequence of the primer will depend on the primer utilization conditions such as temperature and ionic strength as well as the complexity of the DNA or RNA target required.
본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 및 이들에 의해 증폭되는 초위성체에 존재하는 반복 모티브(repeat motif), 증폭되는 초위성체의 크기 및 초위성체가 존재하는 염색체 대립인자에 대한 정보를 하기 표 2에 기재하였다.
The primer pairs provided in the present invention and information on the repeat motifs present in the supersatellites to be amplified by them, the size of the supersatellites to be amplified, and the chromosomal alleles in which the supersatellites exist are shown in Table 2 below. .
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 나리 속 식물에서 DNA 다형성을 검출하고 유전적 다양성을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머를 이용하여 나리속 나팔나리절 품종 또는 육성계통 식물을 동정할 수 있으므로 나리 속 식물의 유전자원을 효율적으로 평가 및 보존할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 나리속 나팔나리 절의 품종 및 육성계통 식물의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다.
SSR primer pairs provided in the present invention can be usefully used for detecting DNA polymorphism and analyzing genetic diversity in the genus Lilium plants. Using the SSR primers according to the present invention can identify the genus Lilium bugs, varieties, or breeding plants can efficiently evaluate and preserve the genetic resources of the genus Lilium plants. Accordingly, the present invention provides a method for detecting DNA polymorphism of varieties of Lilium genus trumpet section and growing plant including the PCR using the SSR primer pair.
구체적으로 본 발명의 방법은Specifically, the method of the present invention
(a) 분석하고자 하는 나리 속 식물로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;(a) extracting genomic DNA from the genus Lilium plant to be analyzed;
(b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및(b) performing PCR using the extracted genomic DNA as a template and the SSR primer pair provided by the present invention; And
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함한다.
(c) separating the PCR products by size.
상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법 또는 SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990) CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다. The extraction of genomic DNA in step (a) is performed by phenol / chloroform extraction or SDS extraction (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990) commonly used in the art. Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) or commercially available DNA extraction kits.
아울러, 본 발명에서 나리 속 식물은 바람직하게는 나리속 나팔나리 절 식물일 수 있으나, 샘플 식물이 나팔나리 절 식물에 속하는지 판단이 필요할 경우도 있으므로 이에 제한되지는 않는다.
In addition, the genus Lilium plant in the present invention is preferably a Lilium genus trumpet plant, but is not limited to this because it may be necessary to determine whether the sample plants belong to the trumpet plant.
또한 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 나리 속 식물, 특히 나리 속 나팔나리 절 식물에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에 는 적당량의 Triton X-100이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 52-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 2분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 95℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 35 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨다.
In the step (b), the PCR may be carried out using a PCR reaction mixture containing various components known in the art required for the PCR reaction. The PCR reaction mixture contains genomic DNA extracted from the genus Lilium plant to be analyzed, in particular Lilium genus Lilium plant, and the SSR primer pair provided in the present invention, an appropriate amount of DNA polymerase, dNTP, PCR buffer and water (dH 2 O). ). The PCR buffer solution includes Tris-HCl, MgCl 2 , KCl, and the like. At this time, MgCl 2 concentration greatly affects amplification specificity and yield. Preferably in the range of 1.5-2.5 mM. Generally, if an excess of the Mg 2 + increase the non-specific PCR amplification products, and reduce the yield of a PCR product if the Mg 2 + insufficient. The PCR buffer solution may further contain an appropriate amount of Triton X-100. Also, PCR was performed by denaturing the template DNA at 94-95 ° C, followed by denaturation; Annealing; Followed by a cycle of amplification and extension followed by final elongation at 72 ° C. The denaturation and amplification may be performed at 94-95 ° C. and 72 ° C., respectively, and the temperature at the time of binding may vary depending on the type of primer. Preferably it is 52-57 degreeC, More preferably, it is 55 degreeC. The time and number of cycles in each step can be determined according to the conditions commonly practiced in the art. Optimal reaction conditions when performing PCR using the SSR primer pair according to the present invention are as follows: After denature the template DNA for 2 minutes at 95 ℃, 30 seconds at 95 ℃; 30 seconds at 55 ° C .; And 35 cycles of one minute at 72 ° C., followed by reaction at 72 ° C. for 5 minutes.
PCR 증폭 결과는 아가로스 겔(agarose gel), 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 크기별로 분리하여 확인할 수 있다(상기 (c) 단계). 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. 바람직하게는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 보다 바람직하게는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
PCR amplification results can be identified by size separation by agarose gel (agarose gel), polyacrylamide gel electrophoresis or fluorescence analysis (ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram) (step (c) ). At this time, in order to use the fluorescence analyzer PCR is performed in the step (b) using a primer pair attached to a fluorescent die known in the art. Preferably it can be confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis, more preferably by modified polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis results can be analyzed by silver staining after electrophoresis. General PCR performance and resulting analysis methods are well known in the art.
아울러, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 나리속 나팔나리절 품종 또는 육성계통의 품종 동정 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for identifying a variety of Lilium genus trumpet cultivars or breeding system comprising performing PCR using the SSR primer pair.
구체적으로 본 발명의 품종 동정 방법은Specifically, the breed identification method of the present invention
(a) 나리 및 대조군 나리 품종 또는 계통으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;(a) extracting genomic DNA from Lilium and Lilium varieties or lines;
(b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (b) performing PCR using each of the extracted genomic DNA as a template and the SSR primer pair provided by the present invention;
(c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및(c) separating each PCR product by size; And
(d) 상기 (c) 단계의 각각의 크기별 분리 결과를 서로 비교하는 단계를 포함한다.
(d) comparing the separation results for each size of step (c) with each other.
(a) 내지 (c) 단계의 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 상기에서 기재한 바와 같으며, 상기 (d) 단계에서 나리 및 대조군 나리 품종 또는 계통에 대한 비교는 동일한 조합의 SSR 프라이머쌍에 대한 시료가 되는 나리와 대조군 나리 품종 또는 계통의 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 SSR 프라이머쌍에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 나리와 대조군 나리 품종 또는 계통의 결과와 모두 일치하면 시료가 되는 나리는 대조군 나리 품종 또는 계통과 동일한 품종으로 동정할 수 있다. 이와 같은 품종 또는 계통의 동정 방법은 신규 유전자원 도입시 중복여부 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종 또는 계통의 동정이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
Genomic DNA extraction, PCR execution and isolation of PCR products by size of steps (a) to (c) are as described above, and in step (d) comparisons of Lilium and control Lilium varieties or strains of the same combination This is done by comparing the size of each of the PCR products of the Lili and the control Lili varieties or strains as samples for the SSR primer pairs. By comparing the size comparison results for each pair of SSR primers, if the results are the same as those of the control and the control or varieties or strains, the sample can be identified as the same varieties as the control or the breed. Such a method of identifying a variety or lineage may be useful when identifying a breed or lineage such as determining whether there is a violation of the indication of origin through judging whether there is a duplication when introducing a new genetic resource and checking the country of origin.
대조군 나리 품종 또는 계통에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 나리와 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 나리 보다 이전에 수행되어 동정의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 나리에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.
Genomic DNA extraction, PCR, and size-specific separation of PCR products for a control group or class of strains may be performed simultaneously with the sample, but may be performed prior to the sample, and prepared as a reference for identification. have. Using such a reference table can be useful because it can be compared with the reference table by performing genomic DNA extraction, PCR and separation of the size of the PCR product for the Lili to be a sample.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍, DNA 중합효소 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 나리 속 식물의 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다. 상기에서 PCR 반응 완충용액의 조성은 상기에서 기재한 바와 같다.
In another aspect, the present invention provides a kit for detecting DNA polymorphism of the genus Lilium plants comprising SSR primer pair, DNA polymerase and PCR reaction buffer solution according to the present invention. The composition of the PCR reaction buffer is as described above.
이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
In addition, the components necessary for performing electrophoresis capable of confirming amplification of PCR products may be further included in the kit of the present invention.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 나리속 나팔나리절 품종 또는 육성계통 동정용 키트를 제공한다. 품종 동정 방법은 상기에서 기재한 바와 같다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종 또는 계통에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
In addition, the present invention provides a kit for identifying a genus trumpet cultivars or growing system comprising the SSR primer pair according to the present invention. The method for identification of the breed is as described above. In addition to the DNA polymerase and the PCR reaction buffer of the above-described composition in order to be able to easily perform the PCR reaction may be further included, the components or known to perform electrophoresis to confirm whether the PCR product amplification or not Identification criteria for a given breed or lineage may be further included in the kit of the present invention.
본 발명에 적용될 수 있는 백합속 나팔나리절의 품종 및 육성계통은 Lilium formosanum 'TA13', Lilium longiflorum 'Gelria', Lilium longiflorum 'White American', Lilium formologi 'Julius', Lilium formologi ‘White Horn', Lilium formologi 'August', Lilium formologi 'Stuyava', Lilium formologi 'Raizan Herald', Lilium longiflorum 'Adelina', Lilium longiflorum 'Hinomoto', [Fu/Jin] /Adel/WHF1/RH, [Jin/WA]/AF1/ RH, [Jin/WA]/AF1, [Jin/Hin]/RH, [Jin/WA]/AF1 /RH /RH, [Jin/WA] /RH /RH, [RH/WA]/Adel/RH, [RH/WA]/AF1, [RH/WA]/A del/RH, [Jin/WA]/RH, Adel/AF1, AF1/ Adel, 어라연1호, 어라연2호, 어라연3호 또는 영월조생일 수 있다.
The varieties and breeding systems of Lilium trumpet section that can be applied to the present invention are Lilium formosanum 'TA13', Lilium longiflorum 'Gelria', Lilium longiflorum 'White American', Lilium formologi 'Julius', Lilium formologi' White Horn ', Lilium formologi' August ', Lilium formologi' Stuyava ', Lilium formologi' Raizan Herald ', Lilium longiflorum' Adelina ', Lilium longiflorum' Hinomoto ', [Fu / Jin] / Adel / WHF1 / RH, [Jin / WA] / AF1 / RH, [Jin / WA] / AF1, [Jin / Hin] / RH, [Jin / WA] / AF1 / RH / RH, [Jin / WA] / RH / RH, [RH / WA] / Adel / RH, [RH / WA] / AF1, [RH / WA] / A del / RH, [Jin / WA] / RH, Adel / AF1, AF1 / Adel, Eurayeon No. 1, Eurayeon No. 2, Eurayeon No. 3 or Yeongwol Early Bird .
따라서, 본 발명에 따른 SSR 프라이머는 백합속 나팔나리절 품종 및 육성계통 식물의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 나리 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 SSR 프라이머는 나리 속 식물의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 이를 통하여 나리의 품종을 판별할 수 있다. Therefore, the SSR primer according to the present invention can be very useful for preparing the DNA profile of the genus Lichen bugle varieties and breeding plants. In this way, by efficiently evaluating Nari genetic resources, it is possible to effectively conduct redundancy analysis and establish novelty with existing resources when introducing new genetic resources. In addition, the SSR primer according to the present invention can effectively detect the DNA polymorphism of the genus Lilium plant, it is possible to determine the varieties of Lilium.
도 1은 본 발명의 SSR 프라이머를 이용한 백합속 나팔나리절 품종 및 육성계통 식물 식물에서의 SSR 프로파일을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 SSR 프라이머를 이용한 백합속 나팔나리절 품종 및 육성계통 식물 식물에서의 SSR 프로파일을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 SSR 프라이머를 이용한 백합속 나팔나리절 품종 및 육성계통 식물 식물에서의 SSR 프로파일을 나타낸다.
도 4는 SSR 마커에 기초한 백합속 나팔나리절 품종 및 육성계통 식물 식물의 계통도를 나타낸다.Figure 1 shows the SSR profile of the genus Lichen bugle species and growing plant plants using the SSR primer of the present invention.
Figure 2 shows the SSR profile in the genus Lilium bugle variety and growing plant plants using the SSR primer of the present invention.
Figure 3 shows the SSR profile in the genus Liliaceae bugle varieties and growing plant plants using the SSR primer of the present invention.
Figure 4 shows a schematic diagram of the genus Liliaceae bugle varieties and breeding plant plants based on the SSR markers.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Below. The present invention will be described in detail by examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
<실험방법><Experimental Method>
1. 실험재료1. Experimental material
실험에 사용된 나리들은 강원대학교에서 제작한 개체 47종의 개체를 사용하였다(표 1 참조).
The lilies used in the experiment used 47 individuals from Kangwon National University (see Table 1).
2. 2. DNADNA 추출( extraction( extractionextraction ))
식물체의 게놈 DNA 추출(Genomic extraction)은 어린잎을 채취하여 마쇄 후 상용의 키트(QiAGEN. DNeasy plant Maxi kit)를 이용하여 제조사의 지침에 따라서 large prep을 하였다. 추출한 DNA는 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 정량분석을 하였다.
Genomic DNA extraction of plants was carried out using a commercial kit (QiAGEN. DNeasy plant Maxi kit), which was then pre-grounded using young leaves. The extracted DNA was quantitatively analyzed by electrophoresis on 1% agarose gel.
3. 3. ESTEST -- SSRSSR ( ( SimpleSimple SequenceSequence RepeatsRepeats ) ) 마커의Marker 개발 및 Development and 프라이머primer 디자인 design
전체 3329개의 Lilium EST-sequecnes중 Longiflorum , Fomosanum , Reagale , Hybrid에서 repeat motif를 가지는 EST-sequence 선별하였다. Repeat motif를 가진 EST-sequecne를 선별하고 ARGOS program을 이용하여 166개의 EST-SSR Primer를 제작 하였다(L, eL primer). 또한 SSR 모티프 유전자 도서관에서 임의적으로 560개의 white 콜로니를 선발하여 각 clone의 염기서열을 결정하였고, 확보한 560개의 염기서열 중 532개는 중복되지 않은 단일 염기서열이었으며 그 중 170개의 서열에는 SSR motif를 가지고 있는 것으로 확인되었다. 이 중 140개의 primer를 제작하였고(AAG37, AAC44, AGC43) 나리의 fosmid 유전자 도서관에서 15개의 fosmid SSR primer 15set(f primer)을 제작하였다(Table 2).
Among 3329 Lilium EST-sequecnes, EST-sequence was selected from Longiflorum , Fomosanum , Reagale , and Hybrid . EST-sequecne with repeat motif was selected and 166 EST-SSR Primers were prepared using ARGOS program (L, eL primer). In addition, 560 white colonies were randomly selected from the SSR motif gene library to determine the base sequence of each clone. Of the 560 obtained sequences, 532 were single non-overlapping sequences, and 170 of them were SSR motifs. It was confirmed to have. Of these, 140 primers were prepared (AAG37, AAC44, AGC43) and 15 fosmid SSR primer 15sets (f primers) were made from Lis' fosmid gene library (Table 2).
4. 4. SSRSSR (( SimpleSimple SequenceSequence RepeatsRepeats ) 분석) analysis
PCR 증폭은 정량분석된 DNA 3㎕에, 5 μM primer pair, 10X buffer, 2.5mM dNTPs, 5U/㎕ i-StarMAX II Taq DNApolymerase (iNtRON, Korea)를 첨가하여 25㎕ volume으로 하였고, PCR 반응 조건은 95℃, 2분간 전변성; 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분을 1cycle로 하여 35cycle; 및 72℃ 5분의 연장반응으로 하였다. 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여 5㎕를 전기영동 로딩 버퍼(electrophoresis loading buffer; 98% formamide, 0.02% BPB, 0.02% Xylene, and 5mM NaOH) 5㎕(1:1)로 섞어주어 6% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 120분간 전기영동(PAGE) 후 실버-스태이닝 (silver-staining)으로 결과물을 확인하였다.
PCR amplification was performed by adding 3 μl of quantitative DNA, 5 μM primer pair, 10X buffer, 2.5 mM dNTPs, 5 U / μl i-StarMAX II Taq DNA polymerase (iNtRON, Korea) to 25 μl volume. 95 ° C., total denaturation for 2 minutes; 35 cycles of 95 ° C. 30 seconds, 55 ° C. 30 seconds, and 72 ° C. 1 minute as 1 cycle; And 72 ° C. for 5 minutes. To identify the amplified PCR product, 5 μl was mixed with 5 μl (1: 1) of electrophoresis loading buffer (98% formamide, 0.02% BPB, 0.02% Xylene, and 5 mM NaOH) to 6% polyacrylic acid. The result was confirmed by silver-staining after electrophoresis (PAGE) for 120 minutes on an amide gel (polyacrylamide gel).
<실험결과><Experimental Results>
1. One. ESTEST -- SSRSSR 분석 analysis
나리에서 알려진 EST 서열 중에서 SSR 모티프를 가지고 있는 것으로부터 전체 166개의 SSR 프라이머를 디자인하였다. 나리 SSR motif 유전자 도서관에서 임의적으로 선별한 560개의 colony중 170개의 서열에서 SSR motif를 가진 것으로 확인 이중 140개의 SSR primer를 디자인 하였으며, 나리의 fosmid 유전자 도서관을 통해 15개의 fosmid ssr primer를 제작하였다. 총 321개의 SSR primer set을 10종의 cultivar plant를 이용하여 survey를 하였고 그 중 cultivar line에서 polymorphism을 보이는 마커를 선별하였고, 37종의 육성계통을 추가하여 총 47종의 품종에 대해 실험을 수행 하였다. 166개의 EST-SSR primer중 polymorphism을 보이는 primer 12개를 선별하였고, 140개의 SSR motif유전자 도서관에서 제작한 primer에서 polymorphism을 보이는 primer 3개를 선별, 15set의 fosmid primer에서 polymorphism을 보이는 primer 2개를 선별하였다. 이들 결과로부터 품종 구별에 사용할 수 있는 SSR Marker 17개를 선별하였다(표 2).
A total of 166 SSR primers were designed from those with SSR motifs among the known EST sequences in Lilium. Among the 560 colonies randomly selected from the Nari SSR motif gene library, 170 sequences were identified. Among them, 140 SSR primers were designed, and 15 fosmid ssr primers were constructed from Nari's fosmid gene library. A total of 321 SSR primer sets were surveyed using 10 cultivar plants. Among them, markers showing polymorphism were selected from the cultivar line, and a total of 47 varieties were tested by adding 37 breeding systems. . 12 primers showing polymorphism among 166 EST-SSR primers were selected, 3 primers showing polymorphism from primers produced by 140 SSR motif gene libraries, and 2 primers showing polymorphism from 15 sets of fosmid primers. It was. From these results, 17 SSR markers that could be used for differentiation were selected (Table 2).
이머Pra
Emma
번호order
number
증폭 결과를 바탕으로 한 품종 구분 방법의 예시는 다음과 같다. 기준이 되는 프라이머 조합은 L37로 하였다.(하기 기재는 “레인-구분가능한 SSR 마커 종류”의 형식으로 기재됨)Examples of varieties based on amplification results are as follows. The primer combination used as reference was L37. (The following description is given in the form of “lane-differentiable SSR marker types”).
(1) L37을 기준으로 1,5,9,14,19,43,45 교배종은 같은 allele패턴을 가짐 (1) 1,5,9,14,19,43,45 hybrids based on L37 have the same allele pattern
1-L37/ L49,L50,L67,L75,eL42,eL61,eL68 1-L37 / L49, L50, L67, L75, eL42, eL61, eL68
5-L37/ L67,f5,AAG37,eL42,eL64,eL65 5-L37 / L67, f5, AAG37, eL42, eL64, eL65
8-L37/L49/f10/eL40/ 8-L37 / L49 / f10 / eL40 /
9-L37/ AAG37,eL61 9-L37 / AAG37, eL61
14-L37/ L49,L75,f10,AAG37,eL6414-L37 / L49, L75, f10, AAG37, eL64
19-L37/ AAG37/eL4019-L37 / AAG37 / eL40
36-L37/ AAG37/eL40, L67,eL6436-L37 / AAG37 / eL40, L67, eL64
43-L37/ L67,f10,AAG37 43-L37 / L67, f10, AAG37
45-L37/L49/ f10/eL40/ 45-L37 / L49 / f10 / eL40 /
이중 19, 36 교배종은 L37/AAG37/eL40 프라이머 조합을 이용해 구별한다. 8,45 교배종은 L37/L49/ f10/eL40 프라이머 조합을 이용해 구별한다19 and 36 hybrids are distinguished using a combination of L37 / AAG37 / eL40 primers. 8,45 hybrids are distinguished using a combination of L37 / L49 / f10 / eL40 primers
(2) L37을 기준으로 2,10,17,18,47 교배종은 같은 allele패턴을 가짐 (2) 2,10,17,18,47 hybrids based on L37 have the same allele pattern
2-L37/ L67,eL42,eL58, eL68 2-L37 / L67, eL42, eL58, eL68
15-L37/ eL4215-L37 / eL42
17-L37/ AAG37,eL42,eL6417-L37 / AAG37, eL42, eL64
18-L37/ L67,AAG37,eL6418-L37 / L67, AAG37, eL64
47-L37/ L49,eL40 47-L37 / L49, eL40
(3) L37을 기준으로 4,21,26,28,29,35,37,39,41,44,46 교배종은 같은 allele 패턴을 가짐(3) 4,21,26,28,29,35,37,39,41,44,46 hybrids based on L37 have the same allele pattern
4-L37/ AAG37,eL58,eL68 4-L37 / AAG37, eL58, eL68
11-L37/ L6711-L37 / L67
13-L37/ L6713-L37 / L67
21-L37/ L67,eL6821-L37 / L67, eL68
26-L37/ L6726-L37 / L67
28-L37/ eL42/eL6428-L37 / eL42 / eL64
29-L37/ eL42/eL6429-L37 / eL42 / eL64
35-L37/ L67,eL40,eL6835-L37 / L67, eL40, eL68
37-L37/ AAG37,eL6837-L37 / AAG37, eL68
39-L37/ L4939-L37 / L49
41-L37/ AAG37,eL6441-L37 / AAG37, eL64
44-L37/ AAG3744-L37 / AAG37
46-L37/ L49,f10,eL4046-L37 / L49, f10, eL40
(4) L37을 기준으로7,27,30,31 교배종은 같은 allele 패턴을 가짐(4) 7,27,30,31 hybrids based on L37 have the same allele pattern
7-L37/L49,L75,f10,AAG37,eL58,eL64,eL68 7-L37 / L49, L75, f10, AAG37, eL58, eL64, eL68
27-L37/ L67,AAC44,AAG37,eL58,eL64,eL6827-L37 / L67, AAC44, AAG37, eL58, eL64, eL68
30-L37/ L50,AAC44,AAG37,EL58,eL6430-L37 / L50, AAC44, AAG37, EL58, eL64
31-L/37 L49,f10,eL58,eL6431-L / 37 L49, f10, eL58, eL64
(5) L37을 기준으로16,20 교배종은 같은 allele 패턴을 가짐(5) 16,20 hybrids based on L37 have the same allele pattern
16-L49,L50,eL40,eL42,eL64,eL6816-L49, L50, eL40, eL42, eL64, eL68
20-L49,L50,eL40,eL42,eL64,eL6820-L49, L50, eL40, eL42, eL64, eL68
(6) L37을 기준으로24,40 교배종은 같은 allele 패턴을 가짐(6) 24,40 hybrids based on L37 have the same allele pattern
24-L37/ L49,L50,L67,f5,AAC44,AAG37,eL40,eL42,eL58,eL61,eL6424-L37 / L49, L50, L67, f5, AAC44, AAG37, eL40, eL42, eL58, eL61, eL64
40-L37/ L49,L50,L67,f5,AAC44,AAG37,eL40,eL42,eL58,eL61,eL6440-L37 / L49, L50, L67, f5, AAC44, AAG37, eL40, eL42, eL58, eL61, eL64
(7) L37을 기준으로23, 32 교배종은 같은 allele 패턴을 가짐(7) 23 and 32 hybrids based on L37 have the same allele pattern
23-L37/ L67,L75,f10,AAC44,AAG37,eL42,eL58,eL6823-L37 / L67, L75, f10, AAC44, AAG37, eL42, eL58, eL68
32-L37/ L67,L75,f10,AAC44,AAG37,eL42,eL58,eL6932-L37 / L67, L75, f10, AAC44, AAG37, eL42, eL58, eL69
(8) L37을 기준으로25, 33 ,38교배종은 같은 allele 패턴을 가짐(8) 25, 33, 38 hybrids based on L37 have the same allele pattern
25-L37/ L49,L50,f10,eL58,eL6425-L37 / L49, L50, f10, eL58, eL64
33-L37/ L49,L67,L75,f5,AAC44,AAG37,eL58,eL64,eL6833-L37 / L49, L67, L75, f5, AAC44, AAG37, eL58, eL64, eL68
38-L37/ L49,AAG37,eL40,eL42,eL6438-L37 / L49, AAG37, eL40, eL42, eL64
(9) L37을 기준으로3,42교배종은 같은 allele 패턴을 가짐(9) 3,42 hybrids based on L37 have the same allele pattern
3-L37/ L50,L75,f5,f10,AAG37,eL42,eL61,eL68 3-L37 / L50, L75, f5, f10, AAG37, eL42, eL61, eL68
42-L37/ L50,L75,f5,f10,AAG37,eL42,eL61,eL6842-L37 / L50, L75, f5, f10, AAG37, eL42, eL61, eL68
(10) 기타(10) other
6-L37 6-L37
10-L3710-L37
12-L3712-L37
22-L3722-L37
34-L3734-L37
위와 같은 조합으로 47개 품종에 대하여 구분 지을 수 있다. 아울러, 본 발명의 실시예 및 도면에 기재된 결과를 통해 L37이 아닌 다른 프라이머쌍을 기준으로 하여 상기와 같은 품종의 구분 방법을 확립할 수 있다.
With the above combination, 47 varieties can be distinguished. In addition, through the results described in the examples and drawings of the present invention it is possible to establish a method of distinguishing the above varieties based on a primer pair other than L37.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 SSR 프라이머는 백합속 나팔나리절 품종 및 육성계통 식물 식물의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 나리 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 SSR 프라이머는 백합속 나팔나리절 품종 및 육성계통 식물의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 이를 통하여 나리의 품종을 판별할 수 있다.
As described above, the SSR primer according to the present invention can be very useful for preparing the DNA profile of the genus Lilium Bugle variety and growing plant plants. In this way, by efficiently evaluating Nari genetic resources, it is possible to effectively conduct redundancy analysis and establish novelty with existing resources when introducing new genetic resources. In addition, the SSR primer according to the present invention can effectively detect the DNA polymorphism of the genus Liliaceae bugle varieties and breeding plants, through which can determine the varieties of Lilium.
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Claims (7)
SSR primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and 2.
The method according to claim 1, wherein the SSR primer pair is a primer pair represented by SEQ ID NO: 3 and 4; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 7 and 8; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 9 and 10; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 11 and 12; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 13 and 14; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 15 and 16; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 17 and 18; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 19 and 20; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 21 and 22; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 23 and 24; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 25 and 26; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 27 and 28; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 29 and 30; SSR primer pairs further comprising a primer pair selected from the group consisting of a primer pair represented by SEQ ID NOs: 31 and 32 and a primer pair represented by SEQ ID NOs: 33 and 34.
The SSR primer pair according to claim 1 or 2, wherein the pair of SSR primers identifies a genus Trumpet plant variety or a growing plant.
(b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 또는 제2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 나리속 나팔나리절 품종 또는 육성계통 식물의 DNA 다형성 검출 방법.
(a) extracting genomic DNA from the genus Lilium plant to be analyzed;
(b) using the extracted genomic DNA as a template and performing PCR using the SSR primer pair of claim 1; And
(C) method for detecting DNA polymorphism of the genus Lilium bugs or cultivars plant comprising the step of separating the PCR product by size.
(b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 또는 제2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
(c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
(d) 상기 나리 및 대조군 나리 품종의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 나리속 나팔나리절 품종 또는 육성계통의 동정 방법.
(a) extracting genomic DNA from Lilium and Lilium varieties;
(b) performing PCR using each of the extracted genomic DNA as a template and the SSR primer pair of claim 1;
(c) separating each PCR product by size; And
(d) a method of identifying a genus Lilium bugle, or cultivated system comprising the step of comparing the results of the separation according to the size of the Lilium and the control Lilium varieties.
A kit for detecting DNA polymorphism of a genus Lilium plant comprising the SSR primer pair of claim 1 or 2, a DNA polymerase and a PCR reaction buffer.
Claim 1 or 2 of the genus Lilium Trumpet cultivars or growth system identification kit comprising the SSR primer pair.
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|---|---|---|---|
| KR1020110001407A KR101271330B1 (en) | 2011-01-06 | 2011-01-06 | SSR primer for screening race or line of Lilium spp. Longiflorum section and use thereof |
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|---|---|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100645445B1 (en) | 2004-09-09 | 2006-11-15 | 강원대학교산학협력단 | Method for producing a marker for detecting polymorphism in a plant |
-
2011
- 2011-01-06 KR KR1020110001407A patent/KR101271330B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100645445B1 (en) | 2004-09-09 | 2006-11-15 | 강원대학교산학협력단 | Method for producing a marker for detecting polymorphism in a plant |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Wageningen University, Course: Thesis Plant Breeding (PBR-80436), Jelle van den Haak의 학위논문, pp. 1-56 (2010.04.30.) * |
| 강원대학교 대학원, 분자생명과학과, 오혜영의 석사학위논문 (2009) * |
Also Published As
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| KR20120080002A (en) | 2012-07-16 |
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