KR101270422B1 - Transgenic Cats Expressing Red Fluorescence Protein and Producing Method Thereof - Google Patents

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Abstract

적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그 생산방법이 개시된다. 본 발명에 따른 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이의 생산방법을 이용하면 높은 효율로 적색 형광단백질 유전자가 도입된 고양이를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 유전적으로 설계된 "변형 애완동물"을 생산하는데 유용하다. 또한 본 발명에 따른 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이는 인간 질병치료를 위한 임상모델로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그의 자손에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그의 자손으로부터 분리된 세포에 관한 것이다.
A transgenic cat expressing a red fluorescent protein and a production method thereof are disclosed. The use of the method for producing a transgenic cat expressing a red fluorescent protein according to the present invention is useful for producing a genetically designed "modified pet" as well as producing a cat into which a red fluorescent protein gene has been introduced with high efficiency . Also, the transgenic cat expressing the red fluorescent protein according to the present invention can be usefully used as a clinical model for treating human diseases.
The present invention also relates to a transgenic cat expressing a red fluorescent protein produced by the above method and a progeny thereof. The present invention also relates to a cell isolated from a transgenic cat expressing a red fluorescent protein and its progeny.

Description

적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그 생산방법{Transgenic Cats Expressing Red Fluorescence Protein and Producing Method Thereof}Transgenic Cats Expressing Red Fluorescence Protein and Producing Method Thereof}

본 발명은 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 변형된 애완동물의 생산뿐만 아니라 인간 질병치료를 위한 임상모델로 유용하게 사용될 수 있는 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그 생산방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산되고 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 또는 그의 자손 및 그로부터 분리된 세포에 관한 것이다.
The present invention relates to a transgenic cat expressing a red fluorescent protein and a production method thereof, and more particularly, expresses a red fluorescent protein that can be usefully used as a clinical model for the treatment of human diseases as well as the production of modified pets. It relates to a transgenic cat and a production method thereof. In addition, the present invention relates to a transgenic cat produced by the above method and expressing a red fluorescent protein, or a progeny thereof, and a cell isolated therefrom.

고양이들은 인간들과 계통학적으로 가깝다. 그리고 고양잇과의 동물 유전자 지도는 설치류 동물들 또는 다른 실험실용 포유 동물들보다 인간들과 같이 높은 수준의 체계적인 보존을 보이고 있다(Menotti-Raymond M, et al., Genomics 1999; 57: 9-23). 또한, 약 250여가지의 유전학적 질병이 사람의 질병과 유사해 각종 난치성 질병을 연구하는데 중요 실험 모델로서 제안되고 있다(Gomez MC et al., Theriogenology , 2006; 66: 72-81; Pontius JU et al., Genome Research, 2007; 17:1675-1689). Cats are systematically close to humans. And the genetic map of cats shows a higher level of systematic conservation as in humans than rodents or other laboratory mammals (Menotti-Raymond M, et al. al ., Genomics 1999; 57: 9-23). In addition, about 250 genetic diseases are similar to human diseases, so they have been proposed as important experimental models for the study of various intractable diseases (Gomez MC et al ., Theriogenology , 2006; 66: 72-81; Pontius JU et al ., Genome Research, 2007; 17:1675-1689).

고양이의 유전자 조작은 생쥐에서 돌연변이를 목적으로 주로 생산하기 위해 사용되는 줄기 세포들(ES)과 같이 적합한 기술 부족에 의하여 제한을 받는다. 체세포 핵치환(SCNT)을 통하여 복제를 하는 것은 줄기세포 기술이 부재한 종들의 잠재적인 대체 접근방법이다. 체세포 복제는 분화된 체세포를 핵이 제거된 난자에 넣어 활성화시킨 다음에 일반 수정란과 동일한 방법으로 발생시키는 기술이다. 이와 같은 복제기술은 발생생물학 분야를 비롯한 기초과학 분야의 연구에 널리 이용될 수 있을 뿐만 아니라 유용 단백질의 생산, 질환 모델의 개발 및 장기 이식 분야 등 다양한 의학 및 의약 분야에 크게 기여할 것으로 예상되어 그 산업적 유용성이 매우 크다고 할 수 있다. Genetic manipulation in cats is limited by a lack of suitable technology, such as stem cells (ES), which are used primarily to produce mutations in mice. Cloning through somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a potential alternative approach for species lacking stem cell technology. Somatic cell cloning is a technique in which differentiated somatic cells are activated by placing them in an egg from which the nucleus has been removed, and then generated in the same way as a normal fertilized egg. Such cloning technology can be widely used for research in the field of basic science including developmental biology, and is expected to contribute greatly to various fields of medicine and medicine, such as the production of useful proteins, the development of disease models, and the field of organ transplantation. It can be said that it is very useful.

체세포 핵치환 기법은 형질전환과 복제 소(Cibelli JB et al., Science, 1998; 280: 1256-1258.), 양(Denning C. et al., Nature Biotechnology, 2001; 19: 559-562, McCreath KJ et al., Nature, 2000; 405: 1066-1069), 염소(Keefer CL et al., Biology of Reproduction, 2001; 64: 849-856), 그리고 돼지(Dai Y et al., Nature Biotechnology, 2002; 20: 251-255, Lai L & Prather RS., Annals of Medicine, 2002; 34: 501-506)를 생산하기 위해 사용되어져 왔다. Somatic cell nuclear replacement techniques are used for transformation and cloned cattle (Cibelli JB et al ., Science, 1998; 280: 1256-1258.), sheep (Denning C. et al.) al ., Nature Biotechnology, 2001; 19: 559-562, McCreath KJ et al ., Nature, 2000; 405: 1066-1069), goat (Keefer CL et al ., Biology of Reproduction, 2001; 64: 849-856), and pigs (Dai Y et al ., Nature Biotechnology, 2002; 20: 251-255, Lai L & Prather RS., Annals of Medicine, 2002; 34: 501-506) Has been used.

체세포 핵치환으로 형질전환 동물의 생산능력을 향상시키기 위하여, 대리모에 배아를 이식하기 전에 유전적으로 변형된 도너세포와 재건된 배아들을 선발하는 방법은 아주 중요하다. 체세포 핵치환으로 형질전환 새끼를 얻기 위해 생쥐(Sato K et al., Human Cell, 2001; 14: 301-304), 돼지(Park KW et al., Biology of Reproduction, 2002; 66: 1001-1005) 그리고 소(Bordignon V et al., Biology of Reproduction, 2003; 68: 2013-2023)로부터 생산하고자 도너 세포로서 녹색 형광단백질(GFP)이 쓰여졌다. GFP 유전자의 적중은 염색체 단백질 표지 및 특정 염색체 부위의 태깅(tagging)의 용이성, 세포질의 많은 단백질과 결합이 가능하며, 그 무해성으로 인하여 살아있는 세포에서 같은 성질의 세포골격사(cognate cytoskeletal filaments)를 발현시키데 많이 이용되고 있다. 1994년 샬피(Chalfie) 등은 해파리(Aequorea victoria)에서 얻은 GFP를 형광성 단백질 인식지표로 적용하여 돼지의 배아를 비롯한 살아있는 세포의 다양한 분자생물학적 변화를 관찰하였다. 이후 더욱 기능이 향상된 EGFP(enhanced GFP)가 개발되어 여러 동물에서 마커 유전자(marker gene)로 이용되고 있다. 적색 형광단백질(RFP)은 말미잘과 친척인 Discosoma [Matz MV et al., Nature Biotechnology, 1999; 17: 969-973]로부터 DsRed로서 처음 분리된 일종의 형광단백질이다. In order to improve the production capacity of transgenic animals by somatic cell nuclear replacement, it is very important to select genetically modified donor cells and reconstructed embryos before embryos are transplanted into surrogate mothers. Mice to obtain transgenic pups by somatic cell nuclear replacement (Sato K et al ., Human Cell, 2001; 14: 301-304), pig (Park KW et al ., Biology of Reproduction, 2002; 66: 1001-1005) and cattle (Bordignon V et al ., Biology of Reproduction, 2003; 68: 2013-2023), green fluorescent protein (GFP) was used as a donor cell. The hit of the GFP gene can be used to label chromosomal proteins, facilitate tagging of specific chromosomal regions, and bind to many proteins in the cytoplasm, and due to its harmlessness, cognate cytoskeletal filaments of the same properties in living cells. It is widely used for expression. In 1994, Chalfie et al. applied GFP obtained from jellyfish (Aequorea victoria) as a fluorescent protein recognition index to observe various molecular biological changes in living cells including porcine embryos. Since then, EGFP (enhanced GFP), which has improved functions, has been developed and is used as a marker gene in several animals. Red fluorescent protein (RFP) is an anemone relative to Discosoma [Matz MV et al., Nature Biotechnology, 1999; 17: 969-973], which was first isolated as DsRed.

목적 형광단백질 유전자를 체세포에 이식시키기 위한 방법으로는 바이랄 벡터(viral vector)로 감염시키거나, DNA를 옮기는 지질(리포솜) 또는 비지질(중합체) 물질로 전기천공(electroporation)하는 방법 등이 알려져 있다. 예를 들면, GFP 돼지를 생산하기 위해 retroviral vector를 사용하는 방법(Park KW et al., Animal Biotechnology, 2001; 12: 173-181), a-1,3-galactosyltransferase knockout 복제 돼지를 생산하기 위해 electroporation을 사용한 방법(Lai L et al., Science, 2002; 295: 1089-1092), 형질전환 돼지를 생산하기 위해 리포솜의 조절로 유전자를 이식하여 GFP 유전자를 삽입한 방법(Hyun S et al., Biology of Reproduction, 2003; 69:1060-1068) 등이 있다. 하지만, 아직까지 외부로부터 유래한 유전자를 발현하는 형질전환 복제 고양이에 대한 보고는 없었으며, 이를 위하여 많은 연구가 진행되고 있다.
As a method for transplanting the desired fluorescent protein gene into somatic cells, a method of infecting with a viral vector or electroporation with a lipid (liposome) or non-lipid (polymer) material that transfers DNA is known. have. For example, a method of using a retroviral vector to produce GFP pigs (Park KW et al., Animal Biotechnology, 2001; 12: 173-181), electroporation to produce a-1,3-galactosyltransferase knockout cloned pigs. (Lai L et al., Science, 2002; 295: 1089-1092), a method in which a GFP gene was inserted by transplanting a gene under the control of liposomes to produce a transgenic pig (Hyun S et al., Biology of Reproduction, 2003; 69:1060-1068). However, there have been no reports of transgenic cloned cats expressing genes derived from outside, and many studies are being conducted for this purpose.

임상적으로 많이 확인되는 망막성 퇴행에서 두드러지게 나타나는 결과는 시각기능의 쇠퇴를 일으킬 수 있는 광수용체(photoreceptor)와 같은 세포들의 손실이다. 이 상황에서 시각과 관련된 질병을 근본적으로 해결할 수 있는 발달치료 측면에서 해결점을 찾아야 된다. 여러 동물 모델로부터 망막이식 또는 망막전구세포나 뇌전구세포와 같은 세포를 망막질환 동물에 이식하여 외부 세포의 증식과 망막세포로의 분화를 통하여 시력기능으로서의 회복이 가능한지에 대한 여러 연구들이 진행되어 오고 있었다.The remarkable result of retinal degeneration, which is widely identified clinically, is the loss of cells such as photoreceptors, which can cause decline in visual function. In this situation, it is necessary to find a solution in terms of developmental therapy that can fundamentally solve vision-related diseases. Several studies have been conducted on whether retinal transplantation or retinal progenitor cells or cells such as brain progenitor cells from various animal models can be transplanted into retinal disease animals to recover as visual function through proliferation of external cells and differentiation into retinal cells. there was.

신경조직 이식은 파킨슨 또는 헌팅턴 질병과 같은 신경퇴행성 장애를 치료할 수 있는 새로운 형식으로 제공될 수 있을 것이다. 신경이식의 임상적용을 위해서 가장 진척이 되고 있는 질병이 선조체 도파민의 고갈과 퇴행을 가져오는 파킨승 질병이다. 사람에게 제공이 용이하고 도덕적 문제가 없는 방법을 사용하기 위해서는 먼저 동물의 장기로 적합하게 대체가 가능하여야 하고, 유전적으로 조작이 가능하다는 이점을 가지고 있어야 한다. Neurotransplantation could be offered as a new form of treatment for neurodegenerative disorders such as Parkinson's or Huntington's disease. The most advanced disease for clinical application of nerve transplantation is Parkinseung's disease, which causes depletion and degeneration of striatal dopamine. In order to use a method that is easy to provide to humans and does not have moral problems, it must first be able to be appropriately replaced with an animal organ, and must have the advantage of being genetically manipulated.

줄기세포(stem cell)는 대칭적 (symmetry)이거나 비대칭적 (asymmetry) 인 세포 분열 방법으로 무한 기간동안 자기의 분화 능력을 유지하거나 (self-renewal) 특정한 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포이다. 포유동물의 배아 발달과정에서 정자와 난자에 의해 수정이 이루어 진 직후 세포를 일컬어 전분화능(totipotent) 세포의 성격을 지니고 있다고 말할 수 있으며 상실배 단계까지 이러한 세포의 성격을 지닌다. 그 뜻은 모든 세포로의 분화뿐만 아니라 독립적으로 세포를 분리하여 자궁에 착상한다면 태아로 발달 할 수 있다. 수차례의 세포 분할이 된 다음 배아는 좀 더 특정한 성격을 지니며 안쪽이 공벽으로 남아있는 이른바 배반포 단계를 거치게 된다. 배반포는 영양막 (trophoblast)과 속세포 덩이 (Inner cell mass, ICM)로 구성되어 있으며 영양막은 자궁에서 태아 발달에 필요한 지지조직이나 태반을 형성하며 ICM은 실제로 모든 기관으로 분화 가능한 포텐셜을 가지는 세포가 형성된다. 이러한 ICM의 세포들은 전분화능 세포로 규정되며 모든 필요한 세포로 분화되지만 완전한 기관을 형성하지는 못한다. 이러한 ICM 세포를 배양하여 전분화능 상태의 배아 줄기 세포 (embryonic stem cell)가 형성되는 것이다.
Stem cells are cells with the ability to maintain their differentiation capacity for an infinite period of time (self-renewal) or differentiate into specific cells by means of a symmetric or asymmetry cell division method. . In the process of embryonic development in mammals, cells can be said to have the characteristics of totipotent cells immediately after fertilization by sperm and eggs, and they have the characteristics of these cells until the morula stage. That means, as well as differentiation into all cells, if the cells are independently separated and implanted in the uterus, they can develop into a fetus. After several cell divisions, the embryo has a more specific character and goes through the so-called blastocyst stage, where the inside remains as the scleral wall. The blastocyst is composed of trophoblast and inner cell mass (ICM), and the trophoblast forms the supporting tissue or placenta necessary for fetal development in the uterus, and the ICM actually forms cells with the potential to differentiate into all organs. do. These ICM cells are defined as pluripotent cells and differentiate into all necessary cells, but do not form complete organs. By culturing these ICM cells, embryonic stem cells in a pluripotent state are formed.

사람 질병의 생체 임상에 적용할 수 있는 질환 모델 동물로서의 고양이에 주목하여, 표지인자인 적색형광단배질이 도입되어 유전적으로 변형된 고양이를 체세포 핵 치환법으로 제조하고자 하였다.
By paying attention to cats as disease model animals that can be applied to human disease in vivo, a genetically modified cat with the introduction of red fluorescent protein, a marker, was prepared by somatic cell nuclear replacement.

이에, 본 발명자들은 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV)의 표면 당단백질인 VSV-G 단백질에 의해 슈도타입화된 몰로니(Moloney) 쥐 백혈병 바이러스(MoMLV)에 기초한 pLHCRW 벡터를 이용하면, 적색 형광단백질 유전자를 고양이 체세포에 높은 효율로 도입시키고, 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이를 생산할 수 있음을 확인하였다.
Accordingly, the present inventors use a pLHCRW vector based on MoMLV pseudotyped by VSV-G protein, a surface glycoprotein of Vesicular stomatitis virus (VSV), It was confirmed that the red fluorescent protein gene was introduced into cat somatic cells with high efficiency, and a transgenic cat expressing the red fluorescent protein could be produced.

본 발명의 목적은 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이의 생산방법을 제공하는데 있다.An object of the present invention is to provide a method for producing a transgenic cat expressing a red fluorescent protein.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 고양이의 생산에 사용될 수 있는 적색 형광단백질 발현용 벡터를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a vector for expression of red fluorescent protein that can be used in the production of the transgenic cat.

본 발명의 또 다른 목적은, 적색 형광단백질을 발현하는 유전자가 고양이 염색체 안에 통합되어 있는 형질전환 고양이 또는 그의 자손을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a transgenic cat or a progeny thereof in which a gene expressing a red fluorescent protein is integrated into a feline chromosome.

본 발명의 또 다른 목적은 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그 자손으로부터 분리된 세포를 제공하는데 있다.
Another object of the present invention is to provide a transgenic cat expressing a red fluorescent protein and a cell isolated from its progeny.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 고양이로부터 체세포를 분리하는 단계; (b) 적색 형광단백질을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 도 2의 개열지도를 갖는 발현벡터 pLHCRW를 제조하는 단계; (c) 상기 발현벡터 pLHCRW를 상기 분리된 체세포에 도입하고, 배양하는 단계; (d) 고양이로부터 채취한 난자의 핵을 제거한 후, 상기 (c)단계에서 배양된 발현벡터 pLHCRW가 도입된 체세포와 융합시켜 형질전환된 배아를 제조하고, 활성화시키는 단계; 및 (e) 상기 형질전환된 배아를 대리모 고양이의 난관에 이식하여, 새끼를 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이의 생산방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of: (a) separating somatic cells from cats; (b) preparing an expression vector pLHCRW having a cleavage map of FIG. 2 including a nucleic acid sequence encoding a red fluorescent protein; (c) introducing the expression vector pLHCRW into the isolated somatic cells and culturing them; (d) removing the nucleus of an egg collected from a cat, and fusion with somatic cells into which the expression vector pLHCRW cultured in step (c) was introduced to prepare and activate a transformed embryo; And (e) transplanting the transformed embryo into an oviduct of a surrogate mother cat to produce a kitten.

본 발명의 형질전환 고양이는 적색 형광단백질을 발현하는 외부 유전자가 고양이의 염색체 내에 안정하게 통합되도록 유전자 조작된 고양이를 의미한다. 또한, 고양이의 염색체 내에서 추가로 넉-아웃(knock-out) 또는 넉-인(knock-in)될 수 있다. 이 경우, 형질전환 고양이는 적색 형광단백질을 발현할 뿐만 아니라 고양이의 특정 유전자가 넉-아웃 또는 넉-인 되면서, 목적에 맞는 유전 형질을 추가로 획득할 수 있게 된다.The transgenic cat of the present invention refers to a cat genetically engineered to stably integrate a foreign gene expressing a red fluorescent protein into the cat's chromosome. In addition, it may be further knocked out or knocked in within the cat's chromosome. In this case, the transgenic cat not only expresses the red fluorescent protein, but also knock-out or knock-in a specific gene of the cat, it is possible to additionally obtain a genetic trait suitable for the purpose.

넉-아웃 또는 넉-인 되는 유전자는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 유용 단백질의 생산, 질환 모델의 개발 등의 목적으로 특정 유전자를 넉-아웃 또는 넉-인 시킬 수 있다.The gene to be knock-out or knock-in is not particularly limited. Specifically, specific genes may be knocked-out or knock-in for the purpose of producing useful proteins and developing disease models.

본 발명의 형질전환 고양이의 생산방법은 체세포 핵치환법에 따르며, 적색형광단백질을 코딩하는 유전자가 염색체 내에 삽입되어 구축될 수 있도록 도 2의 개열지도를 갖는 발현벡터 pLHCRW를 이용하는 것을 특징으로 한다.The production method of the transgenic cat of the present invention is characterized by using the expression vector pLHCRW having a cleavage map of Fig. 2 so that the gene encoding the red fluorescent protein can be inserted and constructed in the chromosome.

발현벡터 pLHCRW는 서열번호 1의 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 서열번호 2의 DsRed2 유전자 및 서열번호 3의 WPRE(woodchuck hepatitis virus posttrancriptional regulatory element)를 포함하는 것을 특징으로 한다. The expression vector pLHCRW is characterized by comprising a CMV (cytomegalovirus) promoter of SEQ ID NO: 1, a DsRed2 gene of SEQ ID NO: 2, and a woodchuck hepatitis virus posttrancriptional regulatory element (WPRE) of SEQ ID NO: 3.

또한, 발현벡터 pLHCRW는 고양이 염색체 내 특정 유전자를 넉-아웃 또는 넉-인시킬 수 있는 핵산서열을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 하나의 pLHCRW 벡터에서, 적색 형광단백질을 발현하는 벡터내 시스템과 별도로, 고양이 염색체 내 특정 유전자를 넉-아웃 또는 넉-인시킬 수 있는 핵산서열이 별도의 프로모터하에서 발현되는 형태이다. 상기 벡터는 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
In addition, the expression vector pLHCRW may further include a nucleic acid sequence capable of knock-out or knock-in a specific gene in the feline chromosome. In this case, in one pLHCRW vector, a nucleic acid sequence capable of knock-out or knock-in a specific gene in the feline chromosome is expressed under a separate promoter, apart from the system in the vector expressing the red fluorescent protein. The vector can be prepared using gene recombination techniques well known in the art.

또한, 상기방법에 의해 생산되고, 염색체 안에 서열번호 1의 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 서열번호 2의 DsRed2 유전자 및 서열번호 3의 WPRE(woodchuck hepatitis virus posttrancriptional regulatory element)를 포함하는 재조합 융합 유전자가 통합되어 있는 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그의 자손을 제공한다.In addition, a recombinant fusion gene produced by the above method and comprising a CMV (cytomegalovirus) promoter of SEQ ID NO: 1, a DsRed2 gene of SEQ ID NO: 2, and a woodchuck hepatitis virus posttrancriptional regulatory element (WPRE) of SEQ ID NO: 3 is integrated into the chromosome. Transgenic cats expressing a red fluorescent protein and their offspring are provided.

본 발명에 따른 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이의 생산방법을 이용하면, 대리모로 이식되기 전 양성반응을 보인 배아들을 선택할 수 있기 때문에 높은 효율로 적색 형광단백질 유전자가 도입된 고양이를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 알레르겐-프리(allergen-free) 고양이와 같은 유전적으로 설계된 "변형 애완동물"을 생산하는데 유용하다. 또한 본 발명에 따른 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이는 인간 질병치료를 위한 임상모델로 유용하게 이용될 수 있다.If the production method of a transgenic cat expressing red fluorescent protein according to the present invention is used, it is possible to select embryos that showed a positive reaction before being transplanted into a surrogate mother, so it is possible to produce cats with a red fluorescent protein gene introduced with high efficiency. In addition, it is useful for producing genetically designed "modified pets" such as allergen-free cats. In addition, the transgenic cat expressing the red fluorescent protein according to the present invention can be usefully used as a clinical model for the treatment of human diseases.

또한, 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이를 정상 고양이와 교배하여 얻은 자손에서도 적색 형광단백질을 안정적으로 발현되는 것을 확인하였다. 즉, 한 세대에서 후대로 전달되는 유전성을 획득한 것이다. In addition, it was confirmed that the red fluorescent protein was stably expressed in the offspring obtained by crossing the transgenic cat expressing the red fluorescent protein with a normal cat. In other words, it has acquired heredity transmitted from one generation to the next.

적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이의 자손은 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이를 정상 고양이 또는 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이와 교배하여 얻을 수 있으며, 형질전환 고양이의 체세포를 복제하여 얻을 수도 있다. 각 세대가 1세대 형질전환 고양이와 같은 유전자형 및 표현형을 가지는지를 체크하도록 한다.
The offspring of a transgenic cat expressing red fluorescent protein can be obtained by crossing a transgenic cat expressing red fluorescent protein with a normal cat or a transgenic cat expressing red fluorescent protein, and obtained by cloning somatic cells of a transgenic cat. May be. Check whether each generation has the same genotype and phenotype as the first-generation transgenic cat.

또한, 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그 자손으로부터 분리된 세포를 제공한다.In addition, a transgenic cat expressing a red fluorescent protein and cells isolated from its progeny are provided.

당업자는 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그 자손의 다양한 발생 단계의 다양한 기관에서 다양한 세포를 당업계에서 공지된 방법으로 분리할 수 있다. 조직 기원과 분리 방법에 따라 최종 분리된 세포의 특징은 차이가 나나, 본 발명의 형질전환 고양이 및 그 자손으로부터 분리된 세포 적색 형광단백질을 발현하는 특징을 가진다.A person skilled in the art can isolate various cells from various organs at various stages of development of transgenic cats expressing red fluorescent protein and their progeny by methods known in the art. The characteristics of the finally isolated cells differ depending on the tissue origin and the separation method, but they have a characteristic of expressing the red fluorescent protein of cells isolated from the transgenic cats and their progeny of the present invention.

예를 들어, 망막, 뇌 등의 조직으로부터 망막전구세포를 분리할 수 있으며, 골수로부터 중간엽 세포를 분리할 수 있으며, 고양이의 배반포로부터는 배아 줄기세포를 분리할 수 있다. For example, retinal progenitor cells can be isolated from tissues such as retina and brain, mesenchymal cells can be isolated from bone marrow, and embryonic stem cells can be isolated from blastocysts of cats.

각 조직으로부터, 세포를 분리하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 공지된 일반적인 방법들을 이용할 수도 있다. 예를 들어, 세포 밀도(cell density), 세포 표면 에피토프에 대한 항체 친화도, 세포 크기(cell size), 형광 방출(fluorescent emission) 정도에 의존하여 분리할 수 있다. 구체적으로, 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation), 항체를 이용하는 방법으로는 MACS(magnetic activated cell sorter) 등의 방법을, 형광을 이용하는 방법으로는 FACS 등의 방법이 있다. A method of separating cells from each tissue is not particularly limited, and known general methods may be used. For example, separation may be performed depending on cell density, antibody affinity for cell surface epitopes, cell size, and degree of fluorescence emission. Specifically, density gradient centrifugation, a method of using an antibody, such as a magnetic activated cell sorter (MACS), and a method of using fluorescence, such as a method such as FACS.

조직으로부터 분리된 세포를 배양하면 다양한 성질을 가지는 세포들이 포함될 수 있는데, 이런 세포 집단으로부터 특정세포만을 분리하기 위하여, 세포 표면 표지자를 이용하여, FACS를 이용하여 분리할 수도 있다.
When cells isolated from tissues are cultured, cells having various properties may be included. In order to separate only specific cells from such cell populations, cell surface markers may be used and FACS may be used to separate them.

즉, 형질전환 고양이 및 그 자손의 다양한 발생 단계 및 생체내의 다양한 기관에서 다양한 세포 집단을 재현성 있게 획득할 수 있다. 분리된 세포는 공지된 방법으로 배양, 분화시킬 수 있으며 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 배양 및 분화 방법은 특별히 제한되지 않고, 분화를 촉진하는 인자를 목적에 맞게 처리할 수 있다.
That is, various cell populations can be reproducibly obtained in various stages of development of the transgenic cat and its progeny and various organs in vivo. The isolated cells can be cultured and differentiated by a known method, and can be used for various purposes. The culture and differentiation methods are not particularly limited, and factors that promote differentiation may be treated according to the purpose.

본 발명은 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이의 생산방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing a transgenic cat expressing a red fluorescent protein.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 고양이의 생산에 사용될 수 있는 적색 형광단백질 발현용 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a red fluorescent protein expression vector that can be used in the production of the transgenic cat.

또한, 본 발명은 적색 형광단백질을 발현하는 유전자가 고양이 염색체 안에 통합되어 있는 형질전환 고양이 또는 그의 자손을 제공한다.In addition, the present invention provides a transgenic cat or a progeny thereof in which a gene expressing a red fluorescent protein is integrated into a feline chromosome.

또한, 본 발명은 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그 자손으로부터 분리된 세포를 제공한다.
In addition, the present invention provides a transgenic cat expressing a red fluorescent protein and a cell isolated from its progeny.

본 발명은 발생생물학 분야를 비롯한 기초과학 분야, 질환 모델의 개발 및 장기 이식 분야 등의 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.
The present invention can be usefully used in the field of basic science, including the field of developmental biology, the development of disease models, and the field of organ transplantation.

도 1은 본 발명에 따른 pLHCRW 벡터의 제작과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 적색 형광단백질 발현용 pLHCRW 벡터의 개열지도를 개략적으로 나타낸 도면이다(LTR: long terminal repeat, HygR: hygromycin-resistant gene, CMVp: cytomegalovirus promoter, DsRed2: 적색 형광단백질, WPRE: woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element, 대략적인 Southern blotting probe 위치와 DsRed2 (or RFP ) 유전자염기서열 증폭을 위한 PCR 프라이머 세트를 표시함).
도 3은 체세포 핵융합(SCNT)과정 및 고양이 섬유아세포에서의 RFP 발현을 나타낸 사진이다(a: semi-confluence 세포를 밝은빛 아래서 촬영한 것, b: 세미-콘플루언스(semi-confluence) 세포를 형광 아래서 촬영한 것, c: SCNT 전에 밝은 적색을 방출하는 트립신이 처리된 세포를 밝은빛 아래서 촬영한 것, d: SCNT 전에 밝은 적색을 방출하는 트립신이 처리된 세포를 형광 아래서 촬영한 것, e: RFP-양성 세포를 탈핵된 난자에 주입하는 것을 밝은빛 아래서 촬영한 것 f:RFP-양성 세포를 탈핵된 난자에 주입하는 것을 형광 아래서 촬영한 것, ×200).
도 4는 TG 고양이의 PCR 및 써던 블랏(Southern blot) 분석 사진이다(I) PCR분석: pLHCRW 플라스미드(P), LHCRW 레트로바이러스로 유전자 변형된 고양이 섬유아세포(cell+), 유전자 변형 안된 고양이 섬유아세포(cell-), 유전자 변형 안된 고양이의 근육(NTM), 사산된 TG 고양이의 근육(M), 간(L), 신장(K), 뇌(B), 대장(I), 심장(H), 피부(S), 고환(T); TG 생자의 태반(PL), 증폭된 RFP 유전자 산물의 기대된 사이즈(화살표); (Ⅱ) 써던 블랏 분석: 플라스미드 DNA(pLHCRW) 양성대조군(P), 마커(M), 비-TG 고양이(N) 사산된 TG 고양이(T), RFP 유전자 단편의 기대된 사이즈( 화살표).
도 5는 생후 60일의 형질전환 복제고양이(왼쪽) 및 대조군 고양이(오른쪽)의RFP 발현사진이다(a: 가시광선 사진, a': 형광사진, a′에서의 적색 형광은 540 ± 20nm의 조사(illumination) 및, 600 ± 25 nm 파장의 최장 투과도를 가진 emission filter로 검출한 것임).
도 6은 비-형질전환 고양이(왼쪽) 및 사산된 형질전환 고양이(오른쪽)의 몸과 장기를 자연광(왼쪽 사진)과 형광(오른쪽 사진) 아래에서 찍은 사진이다(a 및 a': 털, b 및 b': 근육, c 및 c': 뇌, d 및 d': 심장, e 및 e':신장, f 및 f': 위와 장, g 및 g': 기관지와 폐, h 및 h': 간, i 및 I': 비장, j 및 j': 혀, k 및 k': 배설물).
도 7은 도너 세포 표면에서 RFP 발현을 측정한 결과로, (A) 가시광성 이미지, (B) 도너 세포의 적색 형광 방출, (C) Non-RFP TG cat 세포주 (음성 대조구), (D) First RFP TG cat 세포주 (도너 세포). (E) RFP 유전자 형질전환된 세포주 (양성 대조구)를 나타낸다.
도 8은 Re-RFP TG (좌) 및 non-TG 대조구(우) 고양이에서 RFP 발현을 나타낸다. (A) 가시광선 이미지 및 (B)형광 이미지
도 9는 Re-RFP TG 고양이의 PCT 분석 결과이다. PCR 증폭에 사용된 지노믹 DNA는 다양한 기관에서 분리되었다 (a) 정소, (b) 간, (c) 대장, (d) 비장, (e) 신장, (f) 심장, (g) 십이지장, (h) 위, (i) 췌장, (j) 폐, (k) 피부, (l) 태반, (m) non-TG control cat, (n) 음성 대조구 II: Re-RFP TG cat (Re-TG), non Re-RFP TG control cat (non Re-TG), 및 음성대조구 (negative).
도 10은 F-1 고양이의 RFP 발현에 대한 가시광선 이미지 및 형광 이미지이다.
도 11은 F1 자손-RFP 형질전환체는 RFP 형질전환 수컷 고양이 (1)~(6)으로 RFP 트랜스 유전자를 유전됨을 보여주는 PCR 결과이다 (M) 마커, (a) non-TG, (b) 음성, (c) 간, (d) 근육, (e) 뇌, (f) 대장, (g) 방광, (h) 비장, (i) 생식기관, (j) 소장, (k) 신장, (l) 심장, (m) 위, (n) 췌장, (o) 간, (P) 피부.
도 12는 첫 분리배양 후 날짜가 지남에 따라 망막전구세포가 증식되고 있는 모습과 RFP 발현 정도를 보여준다.
도 13은 첫 분리배양 후 날짜가 지남에 따라 뇌전구세포가 증식되고 있는 모습과 RFP 발현 정도를 보여주고 있는 모습을 보여준다.
도 14는 RFP-형질전환 고양이의 골수 유래 MSC를 성체 쥐 오른쪽 선조체 (striatum)에 이식한 2주 후 형광 사진이다. A, 일반 사진. B, RFP 발현 중인 이식 세포. C, III-튜블린 양성 형광사진. D, DAPI 핵 염색 사진. E, B와 C, D의 합성 사진
도 15는 RFP-형질전환 고양이의 골수 유래 MSC를 성체 쥐 오른쪽 선조체 에 이식한 2주 후 형광 사진이다. A, 일반 사진. B, RFP 발현 중인 이식 세포. C, NF-M 양성 형광사진. D, DAPI 핵 염색 사진. E, B와 C, D의 합성 사진.
도 16은 RFP-형질전환 고양이의 골수 유래 MSC를 성체 쥐 오른쪽 선조체에 이식한 2주 후의 형광 사진이다. A, 일반 사진. B, RFP 발현 중인 이식 세포. C, GFAP 양성 형광사진. D, DAPI 핵 염색 사진. E, B와 C, D의 합성 사진
도 17은 RFP-형질전환 고양이의 골수 유래 MSC를 성체 쥐 오른쪽 선조체에 이식한 2주 후 형광 사진이다. A, 일반 사진. B, RFP 발현 중인 이식 세포. C, MOSP 양성 형광사진. D, DAPI 핵 염색 사진. E, B와 C, D의 합성 사진
도 18은 RFP-형질전환 고양이의 골수 유래 MSC를 성체 쥐 오른쪽 선조체에 이식한 3주 후 형광 사진이다. A, 일반 사진. B, RFP 발현 중인 이식 세포. C, III-튜불린 양성 형광사진. D, DAPI 핵 염색 사진. E, B와 C, D의 합성 사진
도 19는 RFP-형질전환 고양이의 골수 유래 MSC를 성체 쥐 오른쪽 선조체에 이식한 3주 후 형광 사진이다. A, 일반 사진. B, RFP 발현 중인 이식 세포. C, NF-M 양성 형광사진. D, DAPI 핵 염색 사진. E, B와 C, D의 합성 사진.
도 20은 RFP-형질전환 고양이의 골수 유래 MSC를 성체 쥐 오른쪽 선조체에 이식한 3주 후 형광 사진이다. A, 일반 사진. B, RFP 발현 중인 이식 세포. C, GFAP 양성 형광사진. D, DAPI 핵 염색 사진. E, B와 C, D의 합성 사진.
도 21은 RFP-형질전환 고양이의 골수 유래 MSC를 성체 쥐 오른쪽 선조체에 이식한 3주 후 형광 사진이다. A, 일반 사진. B, RFP 발현 중인 이식 세포. C, MOSP 양성 형광사진. D, DAPI 핵 염색 사진. E, B와 C, D의 합성 사진.
도 22는 RFP-형질전환 고양이의 골수 유래 MSC를 성체 쥐 오른쪽 선조체에 이식한 4, 5, 6주 후 형광 사진이다. A , D, G는 일반 사진. B, E, H는 RFP 발현 중인 이식 세포. C, F, I는 DAPI 핵 염색 사진
도 23은 고양이 태아에서 유래한 고양이 배아섬유아세포(embryonic fibroblasts)이다 (A) 태아는 임신 4주 후에 암컷 고양이에서 얻었으며 (B) 배양 동안에 cEF 세포 증식을 보여준다 (100X).
도 24는 cEF 피더 층에서 성장한 후에 배반포에서 유래한 유사배아줄기세포를 나타낸다. (A) 인 비보-생성된 배반포 (63X). (B) 배반포의 ICM (100X). (C-F) KSR-배지(C, 100X; D, 200X) 또는 FBS-배지 (E, 40X; F, 200X) 에서 고양이 ES 유사 세포 콜로니의 형성을 나타낸다.
도 25는 3계대 ES-유사 세포 콜로니에서 비분화 특성을 나타낸다. (A) AP 발현 (100X). (D, G, J) ES-유사 세포의 위상차 이미지 (B, E, H, K) Hoechst33342로 역염색한 이미지 (C, F, I, L) Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 및 SSEA-4 발현 검출을 위한 면역형광 염색을 나타낸다 (100X).
도 26은 다양한 세포 타입으로의 EB의 분화를 보여준다. (A) A simple EB (좌) 및 cystic EB (우) (40X). (B) 상피세포-유사 세포 (100X). (C) 뉴런-유사 세포(200X). (D) 고양이 ES-유사 세포의 위상차 이미지 (E 및 F) Hoechst33342 (푸른색)으로 역염색되고 중배엽(mesoderm) 마커인 desmin으로 면역형광염색된 동일 EB (G) 배양 2주 후에 미오카디오사이트(myocardiocytes) 로 자발적으로 분화한 ES-유사 콜로니의 상대비 이미지(40X). (H 및 I) Hoechst33342로 역염색(푸른색) 및 α-액틴으로 면역형광염색(적색)된 것을 보여주는 동일 콜로니 (40X).
도 27은 cPOU5F1(GenBank accession no. EU366914), 인간 (GenBank accession no. NM_002701) 및 마우스(GenBank accession no. NM_013633) 상동체간의 아미노산 서열 비교를 나타낸다. POU-특이적 및 POU 호메오도메인은 밑줄 및 굵은 글씨체로 표시하였다. 두 도메인 영역을 연결하는 링커 영역은 밑줄로 표시하였다.
도 28은 cNANOG(GenBank accession no. EU366913), 인간 (GenBank accession no. NM_024865) 및 마우스 (GenBank accession no. NM_028016) 동족체의 아미노산 서열 비교를 나타낸다. SMAD4 상동 도메인 및 호메오도메인은 밑줄 및 굵은 글씨체로 나타내고 트립토판 (W) 반복 도메인은 박스로 나타내었다. 서열 배열은 Clustal W를 이용하여 수행하였다.
도 29는 3계대 ES-유사 세포와 섬유아세포 피터 세포에서 cPOU5F1 및 cNANOG mRNA 발현을 나타낸다. cPOU5F1, cNANOG 및 GAPDH 발현은 RT-PCT로 측정하였다. cPOU5F1, cNANOG 및 GAPDH에 해당하는 PCT 산물의 크기는 각각 285, 271, 246 bp 이다. Li, 간; St, 위; Sp, 비장; Ov, 난소; Lu, 폐; Br, 노뇌; S, cat ES-like cells; F, fibroblast feeder cells; B, blastocyst; N, 음성 대조구.
도 30은 인 비보-생성된 고양이 배반포 및 비분화 ES-유사 세포 콜로니에서의 면역세포화학 결과를 나타낸다. A 및 D, 배반포에서 핵을 Hoechst33342 로 염색(푸른색) B 및 E, 양성 대조구로 배반포의 ICM 세포에서 POU5F1 및 NANOG 발현; C 및 F, 음성 대조구로 2차 항체로 염색; G 및 J, ES-유사 세포의 위상차 이미지; H 및 K, Hoechst33342으로 역염색(blue); I 및 L, ES-유사 세포에서 POU5F1 및 NANOG 발현 (red). 확대, 200X.
1 is a diagram showing the manufacturing process of the pLHCRW vector according to the present invention.
2 is a diagram schematically showing a cleavage map of a pLHCRW vector for red fluorescent protein expression (LTR: long terminal repeat, Hyg R : hygromycin-resistant gene, CMVp: cytomegalovirus promoter, DsRed2: red fluorescent protein, WPRE: woodchuck hepatitis virus. posttranscriptional regulatory element, approximate Southern blotting probe location and DsRed2 ( or RFP ) PCR primer set for gene base sequence amplification is indicated).
3 is a photograph showing the somatic cell fusion (SCNT) process and RFP expression in feline fibroblasts (a: semi-confluence cells taken under bright light, b: semi-confluence cells) Taken under fluorescence, c: Taken under bright light of trypsin-treated cells that emit bright red before SCNT, d: Taken under fluorescence of trypsin-treated cells that emit bright red before SCNT, e : Injecting RFP-positive cells into enucleated oocytes was photographed under bright light f: Injecting RFP-positive cells into enucleated oocytes was photographed under fluorescence, ×200).
4 is a photo of PCR and Southern blot analysis of TG cats (I) PCR analysis: pLHCRW plasmid (P), feline fibroblasts genetically modified with LHCRW retrovirus (cell+), feline fibroblasts not genetically modified ( cell-), unmodified cat's muscle (NTM), stillborn TG cat's muscle (M), liver (L), kidney (K), brain (B), large intestine (I), heart (H), skin (S), testis (T); Placenta (PL) of live TG, expected size of amplified RFP gene product (arrow); (II) Southern blot analysis: Plasmid DNA (pLHCRW) positive control (P), marker (M), non-TG cat (N) stillborn TG cat (T), expected size of RFP gene fragment (arrow).
5 is a photo of RFP expression of a transformed cloned cat (left) and a control cat (right) at 60 days of age (a: visible light photo, a': fluorescence photo, red fluorescence in a'is irradiation of 540 ± 20 nm) (illumination) and detection by an emission filter with the longest transmittance of 600 ± 25 nm).
Figure 6 is a picture taken under natural light (left picture) and fluorescence (right picture) of the body and organs of a non-transgenic cat (left) and a stillborn transgenic cat (right) (a and a': hair, b And b': muscle, c and c': brain, d and d': heart, e and e': kidney, f and f': stomach and intestine, g and g': bronchi and lungs, h and h': liver , i and I': spleen, j and j': tongue, k and k': feces).
7 is a result of measuring RFP expression on the surface of donor cells, (A) visible light image, (B) red fluorescence emission of donor cells, (C) Non-RFP TG cat cell line (negative control), (D) First RFP TG cat cell line (donor cells). (E) It shows the RFP gene transformed cell line (positive control).
8 shows RFP expression in Re-RFP TG (left) and non-TG control (right) cats. (A) Visible light image and (B) Fluorescent image
9 shows the results of PCT analysis of Re-RFP TG cats. The genomic DNA used for PCR amplification was isolated from various organs (a) testis, (b) liver, (c) large intestine, (d) spleen, (e) kidney, (f) heart, (g) duodenum, ( h) stomach, (i) pancreas, (j) lung, (k) skin, (l) placenta, (m) non-TG control cat, (n) negative control II: Re-RFP TG cat (Re-TG) , non Re-RFP TG control cat (non Re-TG), and negative control (negative).
10 is a visible light image and a fluorescence image of the RFP expression of F-1 cats.
11 is a PCR result showing that the F1 progeny-RFP transformant inherits the RFP transgene into RFP transgenic male cats (1) to (6) (M) marker, (a) non-TG, (b) negative , (c) liver, (d) muscle, (e) brain, (f) large intestine, (g) bladder, (h) spleen, (i) reproductive organs, (j) small intestine, (k) kidney, (l) Heart, (m) stomach, (n) pancreas, (o) liver, (P) skin.
FIG. 12 shows the proliferation of retinal progenitor cells and the degree of RFP expression as the date elapses after the first isolation culture.
13 shows a state in which brain progenitor cells are proliferating and the degree of RFP expression as the date elapses after the first isolation culture.
14 is a fluorescence photograph 2 weeks after implantation of MSCs derived from bone marrow of RFP-transformed cats into adult rat right striatum. A, general picture. B, Transplanted cells expressing RFP. C, III-tubulin positive fluorescence picture. D, DAPI nuclear staining picture. Composite photo of E, B and C, D
Fig. 15 is a fluorescence picture 2 weeks after implantation of MSCs derived from bone marrow of RFP-transformed cats into adult rat right striatum. A, general picture. B, Transplanted cells expressing RFP. C, NF-M positive fluorescence picture. D, DAPI nuclear staining picture. Composite picture of E, B and C, D.
Fig. 16 is a fluorescence photograph 2 weeks after implantation of MSCs derived from bone marrow of RFP-transformed cats into the right striatum of adult mice. A, general picture. B, Transplanted cells expressing RFP. C, GFAP positive fluorescence picture. D, DAPI nuclear staining picture. Composite photo of E, B and C, D
Fig. 17 is a fluorescence photograph 2 weeks after implantation of MSCs derived from bone marrow of RFP-transformed cats into the right striatum of adult mice. A, general picture. B, Transplanted cells expressing RFP. C, MOSP positive fluorescence picture. D, DAPI nuclear staining picture. Composite photo of E, B and C, D
Fig. 18 is a fluorescence photograph 3 weeks after implantation of MSCs derived from bone marrow of RFP-transformed cats into the right striatum of adult mice. A, general picture. B, Transplanted cells expressing RFP. C, III-tubulin positive fluorescence picture. D, DAPI nuclear staining picture. Composite photo of E, B and C, D
Fig. 19 is a fluorescence photograph 3 weeks after implantation of MSCs derived from bone marrow of RFP-transformed cats into the right striatum of adult mice. A, general picture. B, Transplanted cells expressing RFP. C, NF-M positive fluorescence picture. D, DAPI nuclear staining picture. Composite picture of E, B and C, D.
Fig. 20 is a fluorescence photograph 3 weeks after implantation of MSCs derived from bone marrow of RFP-transformed cats into the right striatum of adult mice. A, general picture. B, Transplanted cells expressing RFP. C, GFAP positive fluorescence picture. D, DAPI nuclear staining picture. Composite picture of E, B and C, D.
Fig. 21 is a fluorescence photograph 3 weeks after implantation of MSCs derived from bone marrow of RFP-transformed cats into the right striatum of adult mice. A, general picture. B, Transplanted cells expressing RFP. C, MOSP positive fluorescence picture. D, DAPI nuclear staining picture. Composite picture of E, B and C, D.
Fig. 22 is a fluorescence picture after 4, 5, and 6 weeks of implantation of MSCs derived from bone marrow of RFP-transformed cats into the right striatum of adult mice. A, D, G are general pictures. B, E, H are transplanted cells expressing RFP. C, F, I pictures of DAPI nuclear staining
Fig. 23 shows feline embryonic fibroblasts derived from feline fetuses (A) fetuses were obtained from female cats 4 weeks after gestation, and (B) cEF cell proliferation during culture was shown (100X).
Fig. 24 shows pseudoembryonic stem cells derived from blastocysts after growing in the cEF feeder layer. (A) In vivo-generated blastocyst (63X). (B) Blastocyst ICM (100X). (CF) It shows the formation of feline ES-like cell colonies in KSR-medium (C, 100X; D, 200X) or FBS-medium (E, 40X; F, 200X).
Figure 25 shows the non-differentiation characteristics in the 3rd generation ES-like cell colonies. (A) AP expression (100X). (D, G, J) Phase difference images of ES-like cells (B, E, H, K) Images stained with Hoechst33342 (C, F, I, L) Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 and Immunofluorescence staining for detection of SSEA-4 expression is shown (100X).
26 shows the differentiation of EBs into various cell types. (A) A simple EB (left) and cystic EB (right) (40X). (B) Epithelial cell-like cells (100X). (C) Neuron-like cells (200X). (D) Phase contrast images of feline ES-like cells (E and F) The same EB stained with Hoechst33342 (blue) and immunofluorescence stained with desmin, a mesoderm marker (G) Myocardiosite ( myocardiocytes) spontaneously differentiated into ES-like colonies (40X). (H and I) Identical colonies (40X) showing reverse staining with Hoechst33342 (blue) and immunofluorescence staining with α-actin (red).
Fig. 27 shows a comparison of amino acid sequences between homologs of cPOU5F1 (GenBank accession no. EU366914), human (GenBank accession no. NM_002701) and mouse (GenBank accession no. NM_013633). POU-specific and POU homeodomains are indicated in underlined and bold font. Linker regions connecting the two domain regions are underlined.
Fig. 28 shows a comparison of amino acid sequences of homologs of cNANOG (GenBank accession no. EU366913), human (GenBank accession no. NM_024865) and mouse (GenBank accession no. NM_028016). SMAD4 homologous domains and homeodomains are shown in underlined and bold typefaces and tryptophan (W) repeating domains are shown in boxes. Sequence alignment was performed using Clustal W.
29 shows cPOU5F1 and cNANOG mRNA expression in passage 3 ES-like cells and fibroblast Peter cells. cPOU5F1, cNANOG and GAPDH expression was measured by RT-PCT. The sizes of PCT products corresponding to cPOU5F1, cNANOG and GAPDH are 285, 271, and 246 bp, respectively. Li, liver; St, above; Sp, spleen; Ov, ovary; Lu, lung; Br, no brain; S, cat ES-like cells; F, fibroblast feeder cells; B, blastocyst; N, negative control.
30 shows the results of immunocytochemistry in in vivo-generated feline blastocysts and non-differentiated ES-like cell colonies. A and D, staining of the nucleus in the blastocyst with Hoechst33342 (blue) B and E, expression of POU5F1 and NANOG in ICM cells of the blastocyst as a positive control; C and F, stained with secondary antibody as negative control; Phase contrast images of G and J, ES-like cells; H and K, reverse staining with Hoechst33342 (blue); POU5F1 and NANOG expression in I and L, ES-like cells (red). Magnification, 200X.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for illustrative purposes only, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

시약 출처Reagent source

특별히 언급되지 않는 한 모든 시약은 Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Lorraine, MO, USA)로부터 구입하였다.
Unless otherwise noted, all reagents were purchased from Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Lorraine, MO, USA).

동물의 관리와 사용Animal care and use

난자 제공자로서 사용할 야생 고양이를 0.9 × 0.7 × 0.65m 스테인레스 철장 안에서 관리하였고, 사료와 물은 자유급여 하였다. 실험동물들은 06:00에 빛을 받도록 하여 하루 14(Light) : 10(Dark) 광주기로 조절되는 방에서 사육되었다. 실험동물들의 관리와 사용방법은 국립순천대학교 기관 동물관리사용위원회의 승인을 받았다.
Wild cats to be used as egg donors were managed in a 0.9 × 0.7 × 0.65 m stainless steel cage, and feed and water were freely fed. Experimental animals were reared in a room controlled by 14 (Light): 10 (Dark) photoperiods per day, with light at 06:00. The management and use of experimental animals was approved by the Animal Management and Use Committee of the National University of Sunchon National University.

통계 분석Statistical analysis

본 발명에서 실시된 각각의 실험은 적어도 3번 반복되었다. 활성화된 난자의 난할과 배반포까지의 발달의 다양한 배양액의 효과는 chi-square test로 분석되었다. 배반포의 수와 그룹들간의 차이는 student's t-test에 의하여 평가되었다. 유의 수준은 P < 0.05로 맞추었다.
Each experiment conducted in the present invention was repeated at least three times. The effects of various cultures on the development of activated oocytes to the ovary and blastocyst were analyzed by chi-square test. The number of blastocysts and differences between groups were assessed by student's t-test. The significance level was set to P <0.05.

[[ 실시예Example 1] One] 레트로바이러스 벡터 제작 및 바이러스 생산Retroviral vector construction and virus production

가. end. 레트로Retro 바이러스 벡터( Virus vector ( pLHCRWpLHCRW ) 제작) Production

도 1에 나타난 바와 같이, RFP 유전자가 포함된 pLHCRW 플라스미드는 다음과 같이 구축되었다. 즉, 상업적으로 시판되고 있는 pLNCX (Clontech Mountain View, CA, USA)에 제한효소 BamH I과 Hind III를 처리하여 CMV 프로모터를 분리하여, 이를 동일한 제한효소를 처리한 pRevTRE (Clontech Mountain View, CA, USA) 플라스미드와 결합시켜 pRevTRE-CMV를 구축하였다. 구축한 pRevTRE-CMV 플라스미드에 Xho I과 BamH I의 제한효소를 처리하여 TRE 부분을 제거하고 Klenow 반응을 완료한 후 self-ligation시켜 pLHCX를 제작하였다. 다음으로 pDsRed2-C1 (Clontech Mountain View, CA, USA)으로부터 DsRed2 유전자를, 그리고 woodchuck 간염 바이러스 2 게놈 DNA (GenBank Accession No. M11082) 로부터 WPRE (Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) 서열을 함유하는 프래그먼트를 PCR을 이용하여 클로닝한 후 몇가지의 중간 과정을 거친 후, pLHCX에 삽입[Zufferey et al ., Journal of Virology 1999; 73: 2886-2892]하여 최종적으로 pLHCRW 플라스미드를 구축하였다.
As shown in Figure 1, the pLHCRW plasmid containing the RFP gene was constructed as follows. That is, commercially available pLNCX (Clontech Mountain View, CA, USA) was treated with restriction enzymes BamH I and Hind III to isolate the CMV promoter, and this was treated with the same restriction enzyme pRevTRE (Clontech Mountain View, CA, USA). ) By combining with the plasmid, pRevTRE-CMV was constructed. The constructed pRevTRE-CMV plasmid was treated with restriction enzymes of Xho I and BamH I to remove the TRE portion, and after completing the Klenow reaction, self-ligation was performed to prepare pLHCX. Next, PCR a fragment containing the DsRed2 gene from pDsRed2-C1 (Clontech Mountain View, CA, USA) and WPRE (Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) sequence from woodchuck hepatitis virus 2 genomic DNA (GenBank Accession No. M11082). After cloning by using, after several intermediate processes, it is inserted into pLHCX [Zufferey et al ., Journal of Virology 1999; 73: 2886-2892] to finally construct the pLHCRW plasmid.

나. I. 바이러스 생산Virus production

레트로바이러스가 생산하는 세포들은 Koo et al.[FASEB Journal 2006; 20: 2251-2260]에 의해 설명된 방법에 따라서 제조하였다. 먼저, PT 67 세포(Clontech Mountain View, CA, USA)를 일시적으로 pLHCRW로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 PT 67세포로부터 수득한 바이러스를 GP2-293 세포(Clontech Mountain View, CA, USA)에 감염시켰다. PT 67은 레트로바이러스 패키징 세포로서, MoMLV(Moloney murine leukemia virus)의 gag 유전자 및 pol 유전자와 Gibbon ape leukemia 바이러스 막 유전자를 발현시키고, GP2-293 세포는 MoMLV의 gag 유전자 및 pol 유전자를 발현시킨다. LHCRW-감염된 GP2-293 세포를 2주 동안 하이그로마이신 (150μg/ml)을 이용하여 선별하였고, 이러한 HygR(hygromycin-resistant) 세포들을 pVSV-G(Clontech Mountain View, CA, USA)로 트랜스펙션 하여 VSV-G 단백질을 발현시켰다.Cells produced by retroviruses are Koo et al . [FASEB Journal 2006; 20: 2251-2260]. First, PT 67 cells (Clontech Mountain View, CA, USA) were temporarily transferred to pLHCRW. The virus obtained from transfected and transfected PT 67 cells was infected with GP2-293 cells (Clontech Mountain View, CA, USA). PT 67 is a retroviral packaging cell, expressing the gag gene and pol gene of MoMLV (Moloney murine leukemia virus) and the Gibbon ape leukemia virus membrane gene, and GP2-293 cells expressing the gag gene and pol gene of MoMLV. LHCRW-infected GP2-293 cells were selected using hygromycin (150 μg/ml) for 2 weeks, and these Hyg R (hygromycin-resistant) cells were transfected with pVSV-G (Clontech Mountain View, CA, USA). To express the VSV-G protein.

트랜스펙션 후 48시간 후에 VSV-G 단백질로 포장된 바이러스들을 수득하였다. 바이러스를 생산하는 세포를 포함한 모든 세포들을 4.5 g/l 글루코오스(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA), 소 태아 혈청(10%) 및 스트렙토마이신(100 μ/ml)을 함유하고 있는 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 상기의 감염 및 트랜스펙션된 GP2-293 세포로부터 수거한 바이러스-함유 배지는 0.45 ㎛ 포어(pore) 크기의 필터를 통해 여과한 후, 고양이의 섬유아세포들을 감염시키는데 사용하였다. 감염과정을 거친 섬유아세포는 하이그로마이신 (150 μg/ml)으로 6일간 선별하였다.
Viruses packaged with VSV-G protein were obtained 48 hours after transfection. All cells, including virus-producing cells, were 37 in DMEM medium containing 4.5 g/l glucose (GibcoBRL, Grand Island, NY, USA), fetal bovine serum (10%) and streptomycin (100 μ/ml). Incubated under conditions of ℃ and 5% CO 2. The virus-containing medium collected from the above infected and transfected GP2-293 cells was filtered through a 0.45 μm pore size filter, and then used to infect feline fibroblasts. Fibroblasts undergoing the infection process were selected for 6 days with hygromycin (150 μg/ml).

[[ 실시예Example 2] 2] 고양이 cat 섬유아Fibroblast 세포 수립 Cell establishment

흰색의 오드 아이 흰색 고양이에서 6 mm의 피부조직을 떼어 내어 몇개의 섬유아세포 라인을 만들었다. 멸균된 가위로 35 mm 페트리디쉬(Nunc, Denmark)에서 피부세포를 잘게 썰어 초기 배양을 10% FBS가 포함된 DMEM 배양액에 5% CO2 의 38℃ 배양기(incubator)에서 90%의 컨플루언스(confluence)가 보일 때까지 배양시켰다. 세포들을 트립신 처리하여 1x106 cells/ml에 맞춰 다시 배양하였고, 10% DMSO(dimethylsulfoxide)와 10% FBS가 첨가된 DMEM(Gibco, USA)에 있는 제로(zero) 단계에 있는 세포(1 vial/35 mm dish) 상태에서 동결하였다. 세포들을 녹인 후, RFP 유전자를 형질전환(transfection)하기 위해 배양하였다. 3일 동안 무혈청 배양액에서 배양한 후, 충분히 자란 RFP 형질전환된 세포들을 체세포 핵치환(SCNT)을 위해 사용하였다(Yin XJ et al., Theriogenology 2007; 67: 816-823). 개개의 RFP-transfect된 세포들은 G-2A filter (EX 510-560 nm, BA 590 nm)가 있는 inverted 현미경에서 선별하였다(도 3 참조).
A 6 mm of skin tissue was removed from a white Odd-Eye white cat to create several fibroblast lines. 35 mm Petri dishes with a sterile scissors (Nunc, Denmark) of 90% in 5% CO 2 38 ℃ incubator (incubator) in a finely sliced initial culturing skin cells in a DMEM culture medium containing 10% FBS at confluence ( confluence) was incubated. The cells were trypsinized and cultured again at 1x10 6 cells/ml, and cells in the zero stage (1 vial/35) in DMEM (Gibco, USA) to which 10% dimethylsulfoxide (DMSO) and 10% FBS were added. mm dish). After the cells were thawed, they were cultured for transfection of the RFP gene. After culturing in serum-free culture for 3 days, sufficiently grown RFP-transformed cells were used for somatic cell nuclear replacement (SCNT) (Yin XJ et al ., Theriogenology 2007; 67: 816-823). Individual RFP-transfected cells were selected in an inverted microscope with a G-2A filter (EX 510-560 nm, BA 590 nm) (see FIG. 3).

[[ 실시예Example 3] 3] 난소 회수와 난자 성숙Ovary recovery and egg maturation

200 IU의 말 융모성 성선자극호르몬(eCG; 대성, 한국)을 성체 고양이에 주사하여 난포 발달을 자극하였고, 4일 후 사람 융모 성선자극호르몬(hCG; 대성, 한국) 100 IU를 처리하여 난자 성숙을 유도하였다. hCG 주사 24시간 후, 보통의 난소절개술 방법으로 난소를 회수하였고, m-Tyrode's Hepes 배양액에서 난자들이 나올 수 있도록 메스날로 잘게 썰었다. 10% FBS (fetal bovine serum; Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 1% 페니실린 G (penicillin G)/스트렙토마이신(streptomycin) (P-4333)가 첨가된 TCM 199에서 골라낸 난자들을 5% 탄소가 포함되어 있는 38℃에 4시간 동안 성숙시켰다.
200 IU of horse chorionic gonadotropin (eCG; Daesung, Korea) was injected into adult cats to stimulate follicular development, and after 4 days, human chorionic gonadotropin (hCG; Daesung, Korea) was treated with 100 IU to mature the egg. Was induced. 24 hours after the injection of hCG, the ovaries were recovered by the usual oophorectomy method and chopped with a scalpel so that the eggs could come out of the m-Tyrode's Hepes culture. 5% of oocytes from TCM 199 supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum; Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and 1% penicillin G/streptomycin (P-4333) It was matured for 4 hours at 38° C. containing carbon.

[[ 실시예Example 4] 4] 체세포 핵치환(Somatic cell nuclear replacement ( SCNTSCNT ))

0.1% 히알루로니다제(hyaluronidase)가 포함된 TCM199에서 부드럽게 피펫팅을 해주어 성숙된 난자로부터 난구세포들을 제거하였다. 벗겨진 난자들을 0.2 μg/ml 디메콜신(demecolcine)이 함유된 TCM199에서 1시간 동안 배양한 후, 5 μg/ml 사이토칼라신 B(cytochalasin B) 및 0.2 μg/ml 디메콜신(demecolcine)이 함유된 TCM199에서 넣었다. 돌출된 제1극체와 염색질을 호프만(Hoffman) 조절식 대조 광학을 사용하는 inverted 현미경(Nikon, Japan)에서 관찰하면서 micromaipulator(Narishige, Japan)에 장착된 마이크로 피펫을 사용하여 제거하였다. 다음으로, Hoechst 33342(5 μg/ml)로 난자를 염색하고, 자외선 아래서 형광현미경으로 관찰함으로서, 탈핵이 성공적으로 이루어졌는지 여부를 확인하였다.
By gently pipetting in TCM199 containing 0.1% hyaluronidase, cumulus cells were removed from the mature egg. After incubating peeled eggs in TCM199 containing 0.2 μg/ml dimecolcine for 1 hour, TCM199 containing 5 μg/ml cytochalasin B and 0.2 μg/ml demecolcine I put it in. The protruding first polar body and chromatin were removed using a micropipette mounted on a micromaipulator (Narishige, Japan) while observing with an inverted microscope (Nikon, Japan) using Hoffman controlled control optics. Next, by staining the egg with Hoechst 33342 (5 μg/ml) and observing it with a fluorescence microscope under ultraviolet light, it was confirmed whether or not the nucleation was successful.

[[ 실시예Example 5] 5] 세포융합 및 활성화Cell fusion and activation

실시예 2에서 수립된 섬유아 도너 세포를 1% 트립신-EDTA을 사용하여 분리하였고, 0.3% BSA(fatty acid-free)가 첨가된 D-PBS(Ca2 + 및 Mg2 + free)에 넣었다. 중간 사이즈(20-25 μm)의 도너 핵세포를 현미조작(micromanipulation) 방법으로 각각의 탈핵된 난자의 위란강에 삽입시켰다. 난형질/세포(Cytoplast/cell couplets)를 0.1 mM Mg2 +이 함유된 0.3 M 마니톨에 평형시킨 후, 동일 배양액이 들어있는 전기융합 챔버에 옮겨넣은 후, 전기발전기(Nepagene, Ichikawa, Chiba, Japan)로 2.0 kV/cm의 직류전압에서 20 μsec의 시간으로 2회 통전시켜 세포융합을 수행하였다. 융합된 배아를 챔버에서 꺼내고, 몇차례 세척을 한 후, 0.3% BSA가 함유된 TCM199 배양액에 넣은 후, 38℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 전기융합 1시간 후, 융합된 배아는 0.1 mM Ca2 + 및 0.1 mM Mg2+가 포함된 0.3 M 마니톨에 평형시키고, 동일 배양액이 들어 있는 융합 챔버에 넣고, 1.0 kV/cm의 직류전압에서 20 μsec의 시간 및 0.1 sec의 시간으로 각각 통전시켜 활성화시켰다. 활성화된 배아를 세척시킨 후, 0.3% BSA 및 2 mM 6-DMAP가 추가된 TCM199 배양액에서 38℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.The fibroblast donor cells established in Example 2 were isolated using 1% trypsin-EDTA, and placed in D-PBS (Ca 2 + and Mg 2 + free) to which 0.3% BSA (fatty acid-free) was added. Medium-sized (20-25 μm) donor nuclear cells were inserted into the gastric cavity of each enucleated oocyte by micromanipulation. After equilibrating oocytes/cells (Cytoplast/cell couplets) in 0.3 M mannitol containing 0.1 mM Mg 2 + , they were transferred to an electrofusion chamber containing the same culture solution, and then electric generators (Nepagene, Ichikawa, Chiba, Japan) at a DC voltage of 2.0 kV/cm and energized twice for a time of 20 μsec to perform cell fusion. The fused embryos were taken out of the chamber, washed several times, placed in a TCM199 culture solution containing 0.3% BSA, and cultured in a 38°C, 5% CO 2 incubator. After 1 hour of electrofusion, the fused embryos were equilibrated in 0.3 M mannitol containing 0.1 mM Ca 2 + and 0.1 mM Mg2+, placed in a fusion chamber containing the same culture solution, and 20 μsec at a direct voltage of 1.0 kV/cm. It was activated by energizing at a time of and 0.1 sec, respectively. After washing the activated embryos, they were cultured in a TCM199 culture medium to which 0.3% BSA and 2 mM 6-DMAP were added, at 38° C. and in a 5% CO 2 incubator.

그 결과, 융합 후 1시간 내에 재건된 난자에서 강한 형광을 확인하였다. 이 형광은 도너 세포 지놈(genome)에서 전사되어 발현되거나 RFP 단백질처럼 RFP mRNA를 포함하는 도너 세포질 내에서 발현된 것으로 유추된다. 또한, 돼지[Lai L. et al.,Molecular Reproduction & Development 2002; 62: 300-306]에서 보고된 것과 비슷하게 4cell 및 상실배(morula) 단계에서 형광발현이 NT(Nuclear Transfer) 배아에서 약하게 검출되었다. 융합 후 2시간째에, 재건된 난자에서 강한 형광발현이 지속되었으며, 융합 후 15-48시간이 지나면, NT 배아에서 형광발현은 약해지거나 사라졌다. 3일 후, 2~4 cell 단계의 난할된 배아에게서 RFP가 다시 발현되기 시작하는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, strong fluorescence was confirmed in the reconstructed egg within 1 hour after fusion. It is inferred that this fluorescence is transcribed and expressed in the donor cell genome, or expressed in the donor cytoplasm containing RFP mRNA like the RFP protein. In addition, pig [Lai L. et al ., Molecular Reproduction & Development 2002; 62: 300-306], fluorescence expression was weakly detected in NT (Nuclear Transfer) embryos at the 4cell and morula stage. At 2 hours after fusion, strong fluorescence was maintained in the reconstructed egg, and after 15-48 hours after fusion, the fluorescence was weakened or disappeared in NT embryos. After 3 days, it was confirmed that RFP began to be re-expressed in the embryos of the 2-4 cell stage.

[[ 실시예Example 6] 6] RFPRFP 형질전환 섬유아세포들로부터 유래한 복제배아의 체외 및 체내 발달 In vitro and in vivo development of cloned embryos derived from transformed fibroblasts 확인Confirm

가. end. 체외(In vitro ( inin vitrovitro ) 배양) Culture

실시예 5에서 수립된 활성화된 배아를 1% MEM 비필수 아미노산(non-essential amino acid) 151 (NEAA) 및 3 mg/ml BSA(Tyrode's 1)가 첨가된 m-Tyrode's medium(50 μl×150 droplets)[Gomez MC et al ., Biol Reprod ., 2003; 69: 1032-1041]에서 3일간 배양시키고, 1% NEAA, 2% MEM BME amino acids (EAA) 및 10% FBS (Tyrode's 2)가 첨가된 m-Tyrodes 배양액에서 4일간 더욱 배양시켰다. 3일 이후 분할을 확인하였고, 7일째 되는 날 배반포로의 발달 여부를 눈으로 확인하였다. 다음으로, 배반포를 3.7% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 및 0.1% BSA가 포함된 PBS에서 15분동안 실온에서 고정시킨 후, Hoechst 33342 (20 ㎍/ml)로 염색시켰다. 염색된 배아들을 슬라이드 위에 있는 글리세롤 drop에 올려놓은 후, 커버유리로 덮고, 형광형미경으로 염색된 핵을 관찰하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.The activated embryos established in Example 5 were m-Tyrode's medium (50 μl×150 droplets) to which 1% MEM non-essential amino acid 151 (NEAA) and 3 mg/ml BSA (Tyrode's 1) were added. )[Gomez MC et al ., Biol Reprod . , 2003; 69: 1032-1041] for 3 days, and further cultured for 4 days in m-Tyrodes culture solution to which 1% NEAA, 2% MEM BME amino acids (EAA) and 10% FBS (Tyrode's 2) were added. After 3 days, the division was confirmed, and on the 7th day, the development of blastocysts was visually confirmed. Next, the blastocyst was fixed in PBS containing 3.7% paraformaldehyde and 0.1% BSA for 15 minutes at room temperature, and then stained with Hoechst 33342 (20 μg/ml). The stained embryos were placed on a glycerol drop on the slide, covered with a cover glass, and the stained nuclei were observed with a fluorescent microscope, and the results are shown in Table 1 below.

나. I. 체내(In the body ( inin vivovivo ) 배양) Culture

체내 배아를 수집하기 위해 3마리의 암고양이에 eCG와 hCG를 처리하였다. eCG 및 hCG 처리 36시간 후, 활성화된 배아를 수술을 통하여 대리모 난관에 이식시켰다. 이식 7일 후, 0.3% BSA (A-9647)가 포함된 TALP-Hepes buffered saline으로 절개한 자궁에서 배반포를 관류해 내었다. 다음으로, 배반포를 3.7% 파라포름알데하이드 및 0.1% BSA가 포함된 PBS에서 15분 동안 실온에서 고정시킨 후, Hoechst 33342 (20 ㎍/ml)로 염색시켰다. 염색된 배아들을 슬라이드 위에 있는 글리세롤 drop에 올려놓은 후, 커버 유리로 덮고, 형광형미경으로 염색된 핵을 관찰하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.To collect embryos in the body, 3 female cats were treated with eCG and hCG. After 36 hours of eCG and hCG treatment, the activated embryo was implanted into the surrogate oviduct through surgery. Seven days after transplantation, blastocysts were perfused from the uterus incised with TALP-Hepes buffered saline containing 0.3% BSA (A-9647). Next, the blastocyst was fixed in PBS containing 3.7% paraformaldehyde and 0.1% BSA for 15 minutes at room temperature, and then stained with Hoechst 33342 (20 μg/ml). The stained embryos were placed on a glycerol drop on the slide, covered with a cover glass, and the stained nuclei were observed with a fluorescent microscope, and the results are shown in Table 1 below.

Figure 112012046585544-pat00001
Figure 112012046585544-pat00001

Values in the same column with different superscripts differ significantly (P < 0.05). Values in the same column with different superscripts differ significantly ( P <0.05).

* 배양 7일째의 배반포에서 세포 수 (Mean ± S.E.M).* Number of cells in blastocysts on day 7 of culture (Mean ± S.E.M).

** 체내 배양 7일 후 총 이식된 배아 분의 회수된 복제 배아 수.
** Number of cloned embryos recovered for total transplanted embryos after 7 days of in vivo culture.

표 1로부터, 복제배아의 수가 통계적인 분석을 위해 충분하지는 않았으나, 각각의 배아들이 양성적으로 RFP(각각의 그룹에서 100%)를 발현시켰음을 알 수 있었다. 배반포까지의 발달율은 체외배양보다 체내 배양이 더 높게 나타났다(6.5% vs. 3.1%; P < 0.05). 체내 배반포의 평균 세포수 또한 체외 배반포의 평균 세포수 보다 높게 나타났다(508 ± 477.9 vs. 78.2 ± 45.5; P < 0.05). 따라서, 체외 배양 시스템은 고양이 배아를 배양시키는데 적합하지 않음을 알 수 있다.
From Table 1, the number of cloned embryos was not sufficient for statistical analysis, but it was found that each embryo positively expressed RFP (100% in each group). The rate of development to blastocyst was higher in in vitro culture than in in vitro culture (6.5% vs. 3.1%; P <0.05). The average cell number of blastocysts in vivo was also higher than that of blastocysts in vitro (508 ± 477.9 vs. 78.2 ± 45.5; P <0.05). Therefore, it can be seen that the in vitro culture system is not suitable for culturing feline embryos.

[[ 실시예Example 7] 7] 동기화된 대리모에 복제배아 이식Transplantation of cloned embryos into synchronized surrogate mothers

활성화된 배아들을 미네랄 오일로 덮여있는 4 mg/ml BSA가 포함된 TCM-199 50 μl drop에서 5% CO2가 있는 습한 조건에서 배양하였다. 2 cell에서 4 cell 단계에 있는 배아들의 수(176개)를 파악한 다음, 이들을 100 IU PMSG를 주사 하고, 배란 96시간 후 100 IU hCG 주사를 통해 동기화된 건강하고 성숙한 길들여진 암고양이(S1~S11)의 난관에 이식하였다. 복제된 배아의 이식은 약 hCG 주사 30시간 후 수행되었다. 대리모들은 개복술 전 아세프로마진 말레이트 (acepromazine maleate)(0.025 mg/kg, Sedaject; Samwoo, S. Korea) 및 케타민(ketamine)(5 mg/kg; Daesung, S. Korea)로 마취시켰으며, 난소에 새로운 배란 위치를 가지고 있는 고양이만을 대리모로 사용하였다. 이식 40 또는 45일 후, 7.0 MHz 선형 프로브(linear porbe)가 부착된 SONOACE 900 초음파 스캐너(Medison Co. LTD, Seoul, S. Korea)를 사용하여 임신여부를 진단하였다. 이 후에도 2주일 간격으로 초음파검사를 통하여 임신지속여부 및 태아의 발육상태 등을 확인하면서, 출산을 시켰으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. Activated embryos were cultured in a humid condition with 5% CO 2 in 50 μl drop of TCM-199 containing 4 mg/ml BSA covered with mineral oil. After determining the number of embryos (176) in the 4 cell stage from 2 cells, they were injected with 100 IU PMSG, and synchronized with 100 IU hCG injection 96 hours after ovulation, healthy and mature domesticated female cats (S1~S11). ) Was implanted in the fallopian tube. Transplantation of cloned embryos was performed approximately 30 hours after hCG injection. Surrogate mothers were anesthetized with acepromazine maleate (0.025 mg/kg, Sedaject; Samwoo, S. Korea) and ketamine (5 mg/kg; Daesung, S. Korea) before laparotomy, and ovarian Only cats with new ovulation positions were used as surrogate mothers. After 40 or 45 days of implantation, pregnancy was diagnosed using a SONOACE 900 ultrasound scanner (Medison Co. LTD, Seoul, S. Korea) attached with a 7.0 MHz linear probe. After this, the child was given birth while checking the continuation of pregnancy and the developmental state of the fetus through ultrasound examination at intervals of 2 weeks, and the results are shown in Table 2 below.

Figure 112012046585544-pat00002
Figure 112012046585544-pat00002

* ND, 발견 못함.* ND, not found.

표 2로부터, 40~50일째 초음파 검사에서 11마리의 대리모 중 3마리가 임신(27.3%) 되었음을 확인하였다. S-2 고양이는 임신 65일째 한마리의 생자와 한마리의 사산된 고양이(TG-A와 -B)를 생산하였고, S-3고양이는 임신 66일째 되는 날 한마리의 생자 고양이(TG-C)를 생산하였음을 알 수 있다.
From Table 2, it was confirmed that 3 out of 11 surrogate mothers were pregnant (27.3%) by ultrasound examination on days 40-50. The S-2 cat produced one live and one stillborn cat (TG-A and -B) on the 65th day of pregnancy, and the S-3 cat produced one live cat (TG-C) on the 66th day of pregnancy. It can be seen that it was done.

복제 고양의 들의 생시 체중 및 태반의 무게를 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.The birth weight and the placenta weight of the cloned cats were measured and shown in Table 3 below.

Figure 112012046585544-pat00003
Figure 112012046585544-pat00003

TG, 형질전환 ND, 확인 안됨.TG, transgenic ND, not identified.

TG-A, -B와 -C의 생시체중은 각각 110, 122 그리고 136 g이었다. TG-A와 -C고양이의 태반무게는 각각 20과 29 g이었으며, TG-B의 태반은 밤 중 자연출산으로 인하여 회수하지 못하였다. The live weights of TG-A, -B and -C were 110, 122 and 136 g, respectively. The placenta weights of TG-A and -C cats were 20 and 29 g, respectively, and the placenta of TG-B could not be recovered due to natural birth during the night.

[[ 실시예Example 8] 8] 복제고양이의 Cloned cat 초위성체Supersatellite (( MicrosatelliteMicrosatellite ) 분석) analysis

실시예 7에서 생산된 TG 고양이들의 친자감별을 실시하였다. 새끼, 대리모 그리고 도너 체세포의 조직으로부터 DNA를 추출하였다. 복제고양이와 도너 섬유아세포가 유전적으로 일치하는지를 확인하기 위해 9개의 고양이 특이적인 DNA 마이크로새털라이트(microsatellite) 마커(FCA229, FCA290, FCA305, FCA441, FCA078, FCA201, FCA224, FCA170 그리고 FCA304)들을 사용하였다[Yin XJ et al., Theriogenology 2007; 67: 816-823]. 지노믹 DNA는 HEX (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)를 이용하여 형광으로 붙여진 9개의 고양이 마이크로새털라이트 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 모든 PCR 산물은 3100 유전자 분석기로 분석되었고, 대립유전자형질(allele) 크기들은 Genescan 프로그램(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)으로 계산되었으며, 초위성체(Microsatellite) 분석 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
The TG cats produced in Example 7 were subjected to paternity. DNA was extracted from tissues of offspring, surrogate mothers, and donor somatic cells. Nine cat-specific DNA microsatellite markers (FCA229, FCA290, FCA305, FCA441, FCA078, FCA201, FCA224, FCA170 and FCA304) were used to confirm whether the cloned cat and donor fibroblasts were genetically matched [ Yin XJ et al., Theriogenology 2007; 67: 816-823]. Genomic DNA was amplified by PCR using 9 cat microsatellite primers labeled with fluorescence using HEX (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). All PCR products were analyzed by 3100 gene analyzer, allele sizes were calculated by Genescan program (Applied Biosystems, Foster, CA, USA), and the microsatellite analysis results are shown in Table 4 below.

Figure 112012046585544-pat00004
Figure 112012046585544-pat00004

S: 대리모, TG: 형질전환.S: surrogate mother, TG: transformation.

표 4로부터, 도너 고양이와 복제고양이는 서로 유전적으로 일치하다는 것을 확인하였다.
From Table 4, it was confirmed that the donor cat and the cloned cat were genetically matched with each other.

[[ 실시예Example 9] 9] 지노믹Genomic DNADNA 분석 analysis

가. end. PCRPCR 분석 analysis

복제된 고양이(TG-A, TG-B, TG-C)의 지노믹 DNA를 G-DEX Genomic DNA Extraction Kit(iNtRON 생물 공학(iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seoul, S. Korea)를 이용하여 추출하였다. PCR로 RFP 유전자를 증폭시키기 위해, pDsRed2-C1 클로닝 벡터(Clontech, Mountain View, CA; Cat. Number 632407)의 염기서열을 이용하여 804-827 및 1218-1241 위치에 있는 pDsRed2-C1의 염기서열과 상응하는 상부 프라이머(upstream primer)(서열번호 4: 5'GTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTA3') 및 하부 프라이머(downstream primer)(서열번호 5: 5'ATGGTGTAGTCCTCGTTGTGGGAG3')를 합성하였다(도 2 참조). The genomic DNA of cloned cats (TG-A, TG-B, TG-C) was extracted using the G-DEX Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seoul, S. Korea). By PCR To amplify the RFP gene, using the nucleotide sequence of the pDsRed2-C1 cloning vector (Clontech, Mountain View, CA; Cat. Number 632407), the nucleotide sequence corresponding to the nucleotide sequence of pDsRed2-C1 at positions 804-827 and 1218-1241 An upper primer (SEQ ID NO: 4: 5'GTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTA3') and a downstream primer (SEQ ID NO: 5: 5'ATGGTGTAGTCCTCGTTGTGGGAG3') were synthesized (see FIG. 2).

다음으로, 100 ng의 지노믹 DNA 추출물, 10 pmol 프라이머(서열번호 4, 5) 및 10 μl 2X GoTaq Green Master Mix(Promega, Madison, WI, USA)를 포함하는 반응혼합물(20 μl)을 제조하고, PCR을 수행하였다. 초기변성은 PCR 증폭 35 사이클 후, 94℃에서 5분 동안 진행하였다. 다음 3단계의 증폭조건은: 94℃ 30초 동안(변성), 58℃에서 30초 동안(풀림), 그리고 72℃ 30초 동안(증폭) 35 cycle 증폭 후, 증폭된 확실하게 하기 위해 72℃에서 7분 동안 유지하였다. 그 결과 438 염기쌍의 증폭 결과물을 얻었다(도 4 참조).
Next, a reaction mixture (20 μl) containing 100 ng of genomic DNA extract, 10 pmol primers (SEQ ID NOs: 4, 5) and 10 μl 2X GoTaq ® Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) was prepared. Then, PCR was performed. Initial denaturation was performed at 94° C. for 5 minutes after 35 cycles of PCR amplification. The following three amplification conditions are: 94°C for 30 seconds (denaturation), 58°C for 30 seconds (release), and 72°C for 30 seconds (amplification) After 35 cycles of amplification, at 72°C to ensure amplification. Hold for 7 minutes. As a result, an amplification result of 438 base pairs was obtained (see FIG. 4).

나. I. SouthernSouthern BlotBlot 분석 analysis

복제된 고양이(TG-A, TG-B, TG-C)의 지노믹 DNA (25 μg)를 Kpn I로 절단시키고, RFP유전자의 전체 서열를 포함하는 잘라진 단편들을 0.8% 아가로즈 젤에서 분리시켰다. 써던 블랏 분석에 이용되는 RFP 유전자 프로브(probe)를 합성하기 위하여, 606-623 및 1270-1287 위치에 있는 pDsRed2-C1의 염기서열에 상응하는 상부 프라이머 (upstream primer) (서열번호 6: 5'CGCCACCATGGCCTCCTC3') 및 하부 프라이머 (downstream primer) (서열번호 7: 5'CAGGAACAGGTGGTGGCG3')를 합성하였다(도 2 참조). 프로브(probe)는 PCR DIG Probe Synthesis kit (Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여 합성하였고, 합성된 프로브는 아가로즈 겔(agarose gel) 전기영동으로 정제하고, 다이곡시제닌(digoxigenin)으로 라벨링 한 후, 하이브리제이션(hybridization)에 이용하였다. 하이브리다이제이션 후, DIG luminescent 검출 키트(Roche, Mannheim, Germany)을 이용하여, 양성 전하를 가지는 나일론 막(positively-charged nylon membrane)에 위치한 라벨된 DNA를 검출하였다(도 4 참조).
Genomic DNA (25 μg) of cloned cats (TG-A, TG-B, TG-C) was digested with Kpn I, and cut fragments containing the entire sequence of the RFP gene were isolated on a 0.8% agarose gel. In order to synthesize the RFP gene probe used for Southern blot analysis, an upstream primer corresponding to the nucleotide sequence of pDsRed2-C1 at positions 606-623 and 1270-1287 (SEQ ID NO: 6: 5'CGCCACCATGGCCTCCTC3) ') and a downstream primer (SEQ ID NO: 7: 5'CAGGAACAGGTGGTGGCG3') were synthesized (see FIG. 2). The probe was synthesized using a PCR DIG Probe Synthesis kit (Roche, Mannheim, Germany), and the synthesized probe was purified by agarose gel electrophoresis and labeled with digoxigenin. Then, it was used for hybridization. After hybridization, a labeled DNA located on a positively-charged nylon membrane was detected using a DIG luminescent detection kit (Roche, Mannheim, Germany) (see FIG. 4).

[[ 실시예Example 10] 10] 적색 형광단백질 확인Confirmation of red fluorescent protein

생자(TG-A, TG-C)와 사산된 고양이(TG-B)의 적색 형광은 여기방출필터 셋(excitation-emission filter sets)을 사용하여 확인하였다. 빛은 여기 필터(excitation filter)(HQ 540/40; Chroma Technology Corp., Rockingham, VT, USA)가 장착된 70W 수술용 전등에서 공급받았다. 고양이와 내장들로부터 나오는 적색 형광방출을 카메라 렌즈 기부에 부착된 방사 필터(emission filters)(HQ 600/50; Chroma Technology Corp., Rockingham, VT, USA)가 장착된 삼성 디지털 카메라(GX10, Republic of Korea)를 사용하여 확인하였다. 필터는 백색광과 조명으로 이미지를 위해 쉽게 제거되었다(도 5 및 도 6 참조).The red fluorescence of live (TG-A, TG-C) and stillborn cats (TG-B) was confirmed using excitation-emission filter sets. Light was supplied from a 70W surgical lamp equipped with an excitation filter (HQ 540/40; Chroma Technology Corp., Rockingham, VT, USA). Samsung digital camera (GX10, Republic of Korea) equipped with emission filters (HQ 600/50; Chroma Technology Corp., Rockingham, VT, USA) attached to the base of the camera lens for red fluorescence emission from cats and intestines. Korea). The filter was easily removed for the image with white light and illumination (see Figs. 5 and 6).

도 5에 나타난 바와 같이, 형광 조명에서 형질전환 고양이는 적색을 표현하였고, 이는 일반고양이와 쉽게 구별할 수 있었다.As shown in FIG. 5, the transgenic cat expressed red under fluorescent lighting, which could be easily distinguished from a normal cat.

도 6에 나타난 바와 같이, RFP 형질전환 유전자의 발현 패턴은 사산된 TG고양이(TG-B)와 비-TG 고양이에서 채취한 몇몇 조직으로 판별하였다. 뇌, 심장, 간, 신장, 고환, 폐, 근육, 장, 흉선, 비장, 정낭, 피부, 털, 지방조직 및 형질전환 고양이의 제대혈을 분리한 후, 배양시킨 혈액세포에서 적색 형광발현을 확인할 수 있었으며, 이중 심장조직에서는 비교적 희미한 적색 형광발현이 확인되었다. 그러나 대조군으로 쓰인 고양이의 조직에서는 적색 형광의 발현을 보지 못하였다. 또한, 형질전환 고양이는 뇌와 근육의 발현을 포함하여 높은 RFP 발현을 하였음에도, RFP 형질전환 고양이는 겉으로 정상이었고 대조군 고양이와 비슷한 행위를 나타내었다.
As shown in Fig. 6, the expression pattern of the RFP transgene was determined by several tissues collected from stillborn TG cats (TG-B) and non-TG cats. Brain, heart, liver, kidney, testes, lungs, muscles, intestines, thymus, spleen, seminal vesicles, skin, hair, adipose tissue, and cord blood of a transgenic cat were isolated, and red fluorescence expression was confirmed in the cultured blood cells. Among them, relatively faint red fluorescence was observed in the heart tissue. However, red fluorescence was not seen in the tissues of cats used as controls. In addition, although the transgenic cat had high RFP expression, including brain and muscle expression, the RFP transgenic cat was apparently normal and showed similar behavior to the control cat.

제 1세대의 형질전환 복제 고양이의 체세포를 통해 2세대 (second generation cloned transgenic cat) 에서의 유전자 발현의 확인은 형질 전환 전환 되어진 복제 고양이의 유전자 전이가 정상적으로 이루어지는지 검증하고자 하였다. 제 1세대의 복제고양이의 피부 섬유아세포 라인을 설립하기위해 피부 조직에서 채취하여 섬유아 세포라인을 건립하였다. 건립 되어진 세포라인은 FACS 분석을 통해 유전자 발현 여부를 확인하였다 (도 7). 정상적으로 발현 되어진 제 1세대의 형질 전환 복제 고양이의 피부 섬유아세포는 제 2세대 복제 고양이 생산을 위해 도너 세포로 이용되어 핵치환에 사용하였다. 이와 같이 태어난 제 2세대 형질 전환 복제 고양이는 각 장기와 전 피부 조직에서의 발현 여부를 PCR 분석을 통해 지노믹 DNA 와 mRNA 에서의 발현 여부를 확인 할 수 있었으며, 정상적으로 제 2세대 복제 에서도 형질 전환 시킨 유전자가 전이되었음을 확인할 수 있었다 (도 8, 9). The verification of gene expression in second generation cloned transgenic cats through somatic cells of first-generation transgenic cloned cats was intended to verify whether gene transfer of transgenic cloned cats was normally performed. In order to establish the skin fibroblast line of the first-generation cloned cat, a fibroblast line was constructed by collecting it from skin tissue. The erected cell line was confirmed to have gene expression through FACS analysis (FIG. 7). Skin fibroblasts from the first-generation transgenic cloned cats, which were normally expressed, were used as donor cells for the production of second-generation cloned cats and used for nuclear replacement. The 2nd generation transgenic cloned cat born in this way was able to confirm the expression in genomic DNA and mRNA through PCR analysis of the expression in each organ and whole skin tissue. It was confirmed that the gene was transferred (FIGS. 8 and 9 ).

마지막으로, 제1세대의 형질 전환 복제 수고양이의 번식 능력과 함께 생식선 (germ-line transmission) 을 통해 다음 세대에 그 특정 유전자가 도입되었음을 확인 할 수 있었다. 이 연구에서는 제 1세대의 형질 전환 복제 숫 고양이와 일반 암 고양이와의 자연 교미를 시도 하였으며 한 대리모에서 건강한 6마리의 산자를 얻을 수 있었다. 6마리의 산자에서 유전자 발현 여부를 형광 필터를 이용하여 형광 발현을 확인(도 10) 하였으며 PCR 분석을 통해 각 장기의 지노믹 DNA 와 mRNA 에서의 발현 여부를 확인할 수 있었다 (도 11). Finally, it was confirmed that the specific gene was introduced in the next generation through germ-line transmission, along with the reproductive ability of the first generation of transgenic cloned male cats. In this study, natural mating was attempted between a first-generation transgenic male cat and a normal female cat, and six healthy livestock were obtained from one surrogate mother. Fluorescence expression was confirmed using a fluorescence filter in 6 litters (FIG. 10), and the expression in genomic DNA and mRNA of each organ could be confirmed through PCR analysis (FIG. 11).

RFP 유전인자들은 배아이식에 앞서 형질전환 핵치환 배아의 확인을 위해 유용한 마커이다. 이 보고된 유전자의 사용은 형질전환 동물을 효율적으로 생산하는데 현저하게 증대시킬 수 있을 것이다. 왜냐하면 이들 유전자의 발현은 대리모로 이식되기 전 양성반응을 보인 배아들을 선택할 수 있기 때문이다. 또한, RFP를 형질 전환 복제 연구는 세포로 필요로 하는 사람 임상 기초 연구에 중요하게 적용될 수 있다. 즉, 유전적으로 변형된 고양이를 생산하기 위한 SCNT 방법의 응용은 변형된 애완동물 생산뿐만 아니라 사람 질병의 임상모델 동물 생산에 가치를 둘 수 있음 제시한다.
RFP genetic factors are useful markers for the identification of transgenic nuclear transfer embryos prior to embryonic expression. The use of this reported gene could be significantly augmented in the efficient production of transgenic animals. This is because expression of these genes can select embryos that test positive before being transplanted into a surrogate mother. In addition, RFP transgenic and replication studies can be importantly applied to basic human clinical studies that require cells. In other words, it is suggested that the application of the SCNT method for producing genetically modified cats can place value not only in the production of modified pets, but also in the production of clinical model animals of human diseases.

[[ 실시예Example 11] 11] RFPRFP -형질전환고양이 망막과 뇌에서 분리한 망막전구세포와 -Transgenic cat retina and retinal progenitor cells isolated from the brain 뇌전구세포의Brain progenitor cells 건립과 분화 Erecting and differentiation

RFP 형질복제고양이의 산자로부터 망막전구세포와 뇌전구세포를 분리하여 망막과 관련된 질환을 앓고 있는 고양이에 이식하여 경과를 지켜보는 실험을 가져보고자 하였다.The purpose of this study was to have an experiment to observe the progress of retinal progenitor cells and brain progenitor cells separated from live births of RFP transgenic cats and transplanted into cats suffering from retinal-related diseases.

임신 45일 째 되는 RFP 형질전환 복제고양이의 산자를 임신 중인 대리모를 마취시킨 후 제왕절개를 통해 태아를 꺼내었다. 산자의 안구와 뇌 부분을 분리한 후, 페트리 디쉬에서 차가운 PBS로 헹군 후 1 ml 피펫으로 망막을 작은 조각으로 쪼개고, 뇌는 블레이드(blade)를 사용하여 최대한 조각낸 후 15 ml 튜브에 1000 rpm× 5분 동안 원심분리시켰다. 상층액 제거 후 1ml 트립신으로 1분 동안 방치하여 1ml 트립신 억제제(trypsin inhibitor)를 사용해 트립신 작용을 멈추게 한다. 파스퇴르 유리 피펫으로 15~20번 피펫팅한 후, 13 ml 차가운 PBS로 1,000 rpm× 4분 동안 원심분리하고, UL 배양액 + 5% FBS로 원심분리된 덩어리를 다시 부서뜨렸다. 세포수를 센 후 5~7× 106 cells/T75 양을 피브로넥틴(Fibronectin)으로 코팅 된 T75 플라스크에 배양시킨다. 약 하루가 지난 후 UL 배양액+5% FBS를 무혈청(serum-free) 배양액으로 완전히 교체하였다.The birth of an RFP transgenic cloned cat on the 45th day of pregnancy was anesthetized with a pregnant surrogate mother, and the fetus was removed through a cesarean section. After separating the eyeballs and brain parts of the living child, rinse with cold PBS in a Petri dish, split the retina into small pieces with a 1 ml pipette, and cut the brain into small pieces using a blade, and then use a blade at 1000 rpm in a 15 ml tube. Centrifuge for 5 minutes. After removing the supernatant, let stand for 1 minute with 1 ml trypsin, and stop the trypsin action with 1 ml trypsin inhibitor. After pipetting 15 to 20 times with a Pasteur glass pipette, centrifugation was performed with 13 ml cold PBS for 1,000 rpm x 4 minutes, and the mass centrifuged with UL culture solution + 5% FBS was broken again. After counting the number of cells, incubate 5~7×10 6 cells/T75 in a T75 flask coated with fibronectin. After about one day, the UL culture solution + 5% FBS was completely replaced with a serum-free culture solution.

망막전구세포와 뇌전구세포의 계대는 다음과 같이 행하였다. 배양 중인 세포가 들어 있는 플라스크에 있는 배양액을 모두 버려 4 ml 트립신을 플라스크에 넣은 후 5분 동안 인큐베이터에 방치시켰다. 4 ml DMEM + 5% FBS 배양액을 플라스크에 넣어 트립신 작용을 정지시킨 후 모두 15ml 뷰브에 옮겨 넣는다. 1,000 rpm× 5 min 동안 원심분리 한 후 상층액을 모두 제거하여 파스퇴르 유리 피펫으로 UL culture 배양액과 함께 원심분리된 덩어리를 부서뜨려 새로운 T75 플라스크에 배양에 필요하게 될 배양액을 10 ml 맞출 수 있도록 세포가 들어있는 15ml 튜브에 약 9 ml UL 배양액을 추가하여 피펫팅하여 모두 플라스크에 옮긴다. 37℃, 5% CO2, 95% 인큐베이터에서 배양시켰다.The retinal progenitor cells and brain progenitor cells were passaged as follows. All of the culture medium in the flask containing the cells being cultured was discarded, and 4 ml trypsin was added to the flask, and then left in the incubator for 5 minutes. Add 4 ml DMEM + 5% FBS culture solution to the flask to stop trypsin action, and then transfer all of them to 15 ml bub. After centrifugation for 1,000 rpm × 5 min, remove all the supernatant and crush the centrifuged mass with the UL culture medium with a Pasteur glass pipette, so that 10 ml of the culture medium required for culture can be added to a new T75 flask. Add about 9 ml UL culture solution to the included 15 ml tube, pipette, and transfer all to the flask. Incubated in 37° C., 5% CO 2 , and 95% incubator.

전구세포들의 동결은 위에 방법처럼 트립신 처리하여 세포들을 모은 후 동결 배양액 (UL culture medium + 10% DMSO)으로 동결 튜브에 옮겨 -80℃ 냉동고 (freezer)에 저장하고 해동시에 동결 튜브를 항온수조에 2~3분 정도 녹여, 15 ml 튜브에 옮겨 DMEM + 10% FBS 배양액 10 ml에 희석시켜 원심분리 후 UL 배양액과 함께 배양하였다.Freeze the progenitor cells by trypsin treatment as described above to collect the cells, transfer them to a freezing tube with a frozen culture medium (UL culture medium + 10% DMSO), and store them in a -80°C freezer. When thawing, place the freezing tube in a constant temperature water bath. After dissolving for about 2 to 3 minutes, transferred to a 15 ml tube, diluted in 10 ml of DMEM + 10% FBS culture solution, centrifuged, and incubated with UL culture solution.

배양되고 있는 망막전구세포의 특징은 2개월 전까지 증식 속도가 느리며 2개월 후 증식속도가 급작스럽게 올라간다는 것이 특징이다. 망막전구세포의 자라는 형태는 도 12와 같다. 뇌전구세포는 비교적 망막전구세포와 달리 증식과 다루기가 쉬운 편이다. 뇌전구세포의 자라는 형태는 신경들이 서로 가지같이 엉켜 자라는 것을 볼 수 있었다 (도 13). 두 세포 모두 처음 각 조직에서 분리하여 배양시킨 그 때는 RFP 발현이 현저히 낮은 것을 볼 수 있고 그것 역시 주로 조직들의 발현이고 배양되고 있는 세포의 발현은 없었다 (도 12의 F, 도 8의 F). 첫 분리 후 배양된지 5일 후 양 전구세포 모두 50~60% 이상의 세포들이 RFP를 발광하고 있는 모습을 볼 수 있었다(도 12의 H, I, J, 도 8의 H, I, J). 10여일 지나 거의 100% 가까운 세포들이 RFP 발현하고 증식도 안정적인 모습을 보였다 (도 12의 J, 도 13의 J).The characteristic of the retinal progenitor cells being cultured is that the proliferation rate is slow until 2 months and the proliferation rate rises abruptly after 2 months. The growth form of the retinal progenitor cells is shown in FIG. 12. Brain progenitor cells are relatively easy to proliferate and handle unlike retinal progenitor cells. In the growing form of the brain progenitor cells, it could be seen that nerves grow tangled like branches with each other (Fig. 13). When both cells were first isolated from each tissue and cultured, RFP expression was remarkably low, and it was also mainly expressed in tissues, and there was no expression of cells being cultured (FIG. 12F, FIG. 8F). After the first isolation and 5 days after cultivation, it could be seen that more than 50-60% of both progenitor cells emit RFP (H, I, J in Fig. 12, H, I, J in Fig. 8). After 10 days, nearly 100% of the cells expressed RFP and showed a stable proliferation (Fig. 12 J, Fig. 13 J).

실험동물로서의 고양이는, 고양이에서 나타나는 250여 종의 유전적 질병 중 많은 것이 인간의 유전적 질병과 유사해 고양이 유전자 연구로 인간의 난치성 질병의 원인을 밝히는데 크게 기여할 수 있다는 점이 있어, 사람을 대상으로 응용하기 전 임상실험 절차상의 대(大)동물 실험동물의 가치로서 많은 이점을 가지고 있다.Cats as experimental animals have the point that many of the more than 250 genetic diseases that appear in cats are similar to human genetic diseases, and can greatly contribute to clarifying the cause of intractable diseases in humans through feline genetic studies. It has many advantages as the value of large animals in clinical trial procedures before application.

더욱이 RFP 형질전환 복제고양이는 표지유전자인 RFP 유전자가 적색을 발현하고 있어 배아줄기세포, 성체줄기세포 등의 분화유도, 다른 개체에 이식 후 유전자적 추적은 물론 부가적인 처리 없이 광학상으로도 쉽게 추적이 가능해 다양한 인간의 질환동물로서 효율적으로 활용할 수 있다.Moreover, since the RFP gene, a marker gene, is expressing red in RFP transgenic cloned cats, it induces differentiation of embryonic stem cells, adult stem cells, etc., and is easily tracked by optical images without additional treatment as well as genetic tracking after transplantation into other individuals. This enables it to be effectively utilized as a variety of human diseased animals.

현재까지 진행은 망막전구세포와 뇌전구세포 구축과 확보이며, 이후 이식 실험은 다른 연구협력자와 공동연구 협력을 거쳐 망막성 질환을 가지고 있는 실제 질환모델, 현실적으로 실험이 용이하며 접근이 쉽고 인간과 가장 유전학적, 질병학적으로도 가까운 고양이에 적색 형광 단백질의 유전자를 가진 형질전환 복제고양이에서 뇌전구세포와 망막전구세포를 분리해 이식을 진행하여 시신경과 시세포를 원천적으로 치료할 수 있는 가능성을 이식된 세포의 증식, 발달, 분화 측면에서 적색 형광 단백질을 표시인자로 용이하게 확인·증명할 것 같다.
The progress to date has been the establishment and acquisition of retinal progenitor cells and brain progenitor cells, and the subsequent transplant experiments are a real disease model with retinal diseases through joint research and cooperation with other research partners. Transplanted cells that have the potential to fundamentally treat optic nerves and optic cells by separating brain progenitor cells and retinal progenitor cells from transgenic cloned cats with genes of red fluorescent protein to cats that are genetically and diseaseologically close to them. In terms of proliferation, development, and differentiation of the red fluorescent protein, it is likely to be easily identified and proved as a marker.

[[ 실시예Example 12] 12] RFPRFP -형질전환고양이 골수에서 분리한 -Transgenic cat isolated from bone marrow 중간엽세포의Mesenchymal 쥐 뇌에서의 생존과 신경분화 Survival and neuronal differentiation in the rat brain

RFP 형질복제고양이의 골수에서 MSC를 분리하여 내여 쥐 뇌 선조체 (striatum) 부위에 세포를 이종간 이식하여 향후 결과를 지켜봄으로써 이식된 세포가 어떻게 증식·분화되는지 지켜보고자 하였다. MSCs were isolated from the bone marrow of RFP-transfected cats, and cells were transplanted xenograft into the mouse brain striatum.

골수 채취와 이식 및 분석까지의 과정을 살펴보면, RFP-형질전환 고양이를 마취 시켜 대퇴골 상부의 돌기 주위를 블레이드(Blade)로 절개를 하였다. 주사기를 사용해 돌기에서 움푹 들어간 쪽을 향하여 찔러 넣어 조심스럽게 1 cc~2 cc정도 골수를 채취한 후 곧바로 헤파린이 포함되어 있는 혈액튜브에 옮긴다. PBS로 혈액을 모두 씻으면서 건져내어 15 ml 튜브로 옮기고 1800 rpm에서 10분 동안 원심분리 시킨다. 이후 밑에 가라앉은 혈액 층 전부를 DMEM + 10% FBS 배양액(이하 DMEM 배양액) 10 ml 양과 함께 T75 플라스크에 배양시킨다. 약 5일 후 배양액을 전액 새 배양액으로 교체 해 주고 다시 2일 배양시킨 후 약 1주일 째 되는 때에 계대배양을 거치면서 혈액 역시 조심스럽게 제거해 나갔다. MSC 계대는 다음과 같이 행하였다. 배양 중인 세포가 들어 있는 플라스크에 있는 배양액을 모두 버려 4 ml 트립신을 플라스크에 처리한 후 5분 동안 인큐베이터에 방치하였다. 4 ml DMEM + 10% FBS 배양액을 플라스크에 처리하여 트립신 작용을 정지시킨 후 모두 15ml 튜브에 옮겨 넣는다. 1,000rpm × 5 min 동안 원심분리 한 후 상층액을 모두 제거하여 1ml 피펫으로 배양액과 함께 원심분리된 덩어리를 부서뜨려 새로운 T75 플라스크에 배양에 필요하게 될 배양액을 10ml 맞출 수 있도록 세포가 들어있는15ml 튜브에 약 9 ml DMEM 배양액을 추가하여 피펫팅하여 모두 플라스크에 옮긴다. 37℃, 5% C02, 95% 인큐베이터에서 배양시켰다.Looking at the process of bone marrow collection, transplantation, and analysis, an RFP-transformed cat was anesthetized and an incision was made around the projection of the upper femur with a blade. Using a syringe, poke it from the protrusion toward the recessed side, carefully collect about 1 cc~2 cc of bone marrow, and immediately transfer it to a blood tube containing heparin. Washing all the blood with PBS, remove it, transfer it to a 15 ml tube, and centrifuge it at 1800 rpm for 10 minutes. Thereafter, the entire submerged blood layer is incubated in a T75 flask with an amount of 10 ml of DMEM + 10% FBS culture solution (hereinafter referred to as DMEM culture solution). After about 5 days, the whole culture solution was replaced with a new culture solution, and after 2 days of incubation, the blood was carefully removed while passing through subculture at about 1 week. MSC passage was performed as follows. All of the culture medium in the flask containing the cells being cultured was discarded, treated with 4 ml trypsin, and left in the incubator for 5 minutes. Treat the flask with 4 ml DMEM + 10% FBS culture solution to stop the trypsin action, and then transfer all of them to a 15 ml tube. After centrifugation for 1,000 rpm × 5 min, remove all the supernatant and crush the centrifuged mass with the culture medium with a 1 ml pipette, and a 15 ml tube containing cells so that 10 ml of the culture medium required for cultivation can be added to a new T75 flask. Add about 9 ml DMEM culture solution to the flask, pipette, and transfer all to the flask. Incubated in 37° C., 5% CO 2 , and 95% incubator.

전구세포들의 동결은 위에 방법처럼 트립신 처리하여 세포들을 모은 후 동결 배양액 (DMEM 배양액 + 10% DMSO)으로 동결 튜브에 옮겨 -80℃ 냉동고에 저장하고 해동시에 동결 튜브를 항온수조에 2~3분 정도 녹여, 15 ml 튜브에 옮겨 DMEM + 10% FBS 배양액 10ml에 희석시켜 원심분리 후 DMEM 배양액과 함께 배양하였다.To freeze the progenitor cells, collect the cells by trypsin treatment as described above, transfer them to a freezing tube with a freezing medium (DMEM medium + 10% DMSO) and store in a -80°C freezer, and place the freezing tube in a constant temperature water bath for 2-3 minutes when thawing. After dissolving about, transferred to a 15 ml tube, diluted in 10 ml of DMEM + 10% FBS culture solution, centrifuged, and incubated with DMEM culture solution.

이식에 쓰인 MSC는 계대배양 4번 째 단계의 세포들을 사용하였다. 36마리의 실험쥐들이 준비되었고, 이들을 6개 그룹과 1개의 대조군 그룹을 나누었다. 6개 그룹은 MSC를 이식한지 각각 2주, 3주, 4주, 5주, 6주가 되는 때에 각 그룹별로 이식되었던 부위를 단면절개를 목적으로 나뉘었고 각 그룹 6마리 중 3마리는 사이클로스포린 A(cyclosporine A) 면역억제제를 마지막 분석 날까지 투여하였다. 정해진 날이 지난 그룹의 쥐들에게서 뇌를 분리하여낸 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시켜 O.C.T. 화합물에 엠베딩(embedding) 후 표본들을 냉동보관하였다.MSCs used for transplantation were cells from the fourth step of subculture. 36 mice were prepared, and they were divided into 6 groups and 1 control group. Six groups were divided into sections that were transplanted for each group at 2, 3, 4, 5, and 6 weeks after MSC transplantation, respectively, and 3 of 6 animals in each group were cyclosporine A ( Cyclosporine A) immunosuppressants were administered until the day of the last analysis. Brains were separated from the rats of the group after the specified day, and then fixed with 4% paraformaldehyde and O.C.T. After embedding in the compound, the specimens were stored frozen.

냉동보관된 표본들을 슬라이드 글라스(slide glass)에 단면절편하여 부착하고, β III-튜불린 (1:400 dilution, mouse monoclonal; Sigma), NF-M (1:40 dilution, mouse monoclonal; Sigma), GFAP (1:1000 dilution, rabbit polyclonal; Chemicon), 그리고 미엘린/올리고덴드로사이트 특이적 단백질 (myelin/oligodendrocyte specific protein) (MOSP, 1:1000 dilution, mouse monoclonal; Chemicon)을 1시간 30분 동안 인큐베이터에 보관, 다시 FITC-콘쥬게이트된 항-마우스 IgG 또는 IgM (1:64 or 1:128; Sigma), anti-chicken IgG (1:320; Sigma), 그리고 항-래빗 IgG (1:80; Sigma)와 함께 1시간 동안 인큐베이터에 보관하여 항체 염색을 하였다. 핵 염색은 DAPI로 실온에서 염색하였다. The frozen specimens were sectioned and attached to a slide glass, and β III-tubulin (1:400 dilution, mouse monoclonal; Sigma), NF-M (1:40 dilution, mouse monoclonal; Sigma), GFAP (1:1000 dilution, rabbit polyclonal; Chemicon), and myelin/oligodendrocyte specific protein (MOSP, 1:1000 dilution, mouse monoclonal; Chemicon) were added to the incubator for 1 hour and 30 minutes. Storage, re-FITC-conjugated anti-mouse IgG or IgM (1:64 or 1:128; Sigma), anti-chicken IgG (1:320; Sigma), and anti-rabbit IgG (1:80; Sigma) And stored in the incubator for 1 hour to stain the antibody. Nuclear staining was stained with DAPI at room temperature.

이식 실험 결과 주 별로 이식된 세포들의 증식과 분화 관찰한 것을 보면, 이식된 세포들은 이식 후 생존률이 2주 째 (도 14~도 17)와 3주 째 (도 18~도 21)에서 높게 상승된 것을 알 수 있었다. 게다가 세포 모두 β III-튜불린, NF-M, GFAP, 그리고 MOSP 항체반응에 양성을 보여 고양이의 RFP-형질전환된 MSC가 뉴런, 아스트로사이트 그리고 올리고덴드로사이트로 분화된 것을 의미한다는 것을 알 수 있었다. 하지만 이식된 세포들은 4주에서 5주 후에 눈에 띄게 감소되는 것을 볼 수 있었고 6 주 후에는 모두 사라 졌었다 (도 22). 이식 후 이식된 세포들의 이동 역시 3주에서 4주 째 사이에서 관찰되었다. 면역억제제 사이클로스포린 A 처리 하였던 그룹의 쥐들은 이식 세포들의 생존과 신경 분화에 특별히 영향을 미치지는 않아 보였다. 본 연구는 쥐 뇌에 고양이에서 유래하여 이종 이식한 세포의 생존과 신경분화에 초점을 맞춘 것이다. 이식 후 2주에서 3주 사이에 생존된 세포들이 증식되는 것을 알 수 있었고 그리고 나서 4주를 시작으로 줄어드는 것을 알 수 있었다. 이는 이식된 세포가 이미 RFP라는 고유의 형광 표시인자를 가지고 있기 때문에 쉽게 뇌에서의 다른 세포 또는 신경과 구별이 가능했던 것이다. 이 결과는 이식된 부위의 영양인자들의 고갈과 혈관조직의 열악성이 이러한 결과를 가져온 것 같다. 이로부터 고양이의 RFP 형질전환 골수 유래 MSC가 쥐 선조체 (striatum) 부위에서 생존과 함께 신경세포로 분화되는 것을 알 수 있었고, 따라서 RFP-형질전환 MSC는 줄기세포 이식을 위한 유용한 대체수단으로 사용될 수 있을 것이라 생각된다.
As a result of the transplantation experiment, the proliferation and differentiation of the transplanted cells were observed for each week, and the survival rate after transplantation of the transplanted cells was highly elevated at 2 weeks (Figs. 14 to 17) and at 3 weeks (Figs. 18 to 21). I could see that. In addition, all cells were positive for β III-tubulin, NF-M, GFAP, and MOSP antibody responses, indicating that the cat's RFP-transformed MSCs were differentiated into neurons, astrosites and oligodendrosites. . However, the transplanted cells could be seen to be noticeably decreased after 4 to 5 weeks, and all disappeared after 6 weeks (FIG. 22). The migration of the transplanted cells after transplantation was also observed between the 3rd and 4th weeks. The mice in the group treated with the immunosuppressant cyclosporin A did not appear to have any particular effect on the survival and neuronal differentiation of the transplanted cells. This study focuses on the survival and neuronal differentiation of cat-derived and xenografted cells in the mouse brain. It was found that the surviving cells proliferated between 2 and 3 weeks after transplantation, and then decreased starting from 4 weeks. This is because the transplanted cells already have a unique fluorescent marker called RFP, so they could be easily distinguished from other cells or nerves in the brain. This result seems to be caused by depletion of nutrient factors in the transplanted site and poor vascular tissue. From this, it was found that MSCs derived from cat's RFP-transformed bone marrow survived and differentiated into neurons in the rat striatum, so RFP-transformed MSCs could be used as a useful alternative for stem cell transplantation. I think it is.

[[ 실시예Example 13] 13] RFPRFP 형질전환 복제고양이로부터 줄기세포 유도 Stem cell induction from transgenic cloned cats

고양이 배아줄기세포의 효율적인 분리유도 및 검증에 관한 연구를 진행하고자 아래와 같은 실험을 수행하였다.The following experiment was conducted to conduct a study on the efficient isolation induction and verification of feline embryonic stem cells.

고양이 배아줄기세포를 분리유도하기 위하여 체내유래 배반포로부터 기계적 방법으로 ICM(Inner cell mass)을 분리하여 (도 24 A,B) FBS 가 첨가된 배지와 KSR 이 첨가된 배지에서 각각 키워 비교하였다. 피더세포(feeder cell)는 고양이 배아섬유아세포(embryonic fibroblast cell) 로 하였다 (도 23). 결과 KSR 배지에서는 초기유사배아줄기세포 부착에서는 보다 좋은 성적을 보였으나 세포 증식속도 면에서는 FBS가 더 좋게 나타났다. 이렇게 유도한 유사배아줄기세포들은 핵이 크고 세포질이 적은 배아줄기세포의 형태학적 특징을 갖고 있었으며 (도 24) 미분화 상태의 배아줄기세포 검증은 AP(alkaline phosphatase), Oct4, SSEA-1, SSEA-3와 SSEA-4 등 줄기세포 특이성 마커들을 사용하여 검증하였으며 그 결과 미분화상태의 유사배아줄기세포에서 이러한 마커들이 명확히 발현됨을 확인하였다 (도 25). 유사배아줄기세포의 분화능력을 검증하기 위하여 우선 EB를 만들었고 EB를 조직배양접시에 배양시킨 결과 유사 상피세포, 유사 신경세포 등으로 분화된 것을 형태학적으로 확인을 하였으며 EB에서 중배엽 마커인 Desmin 의 발현을 확인하였고 FBS에서 배양시킨 유사배아줄기세포 콜로니 2개는 3번째 계대배양을 하였을때 자발적으로 자율적으로 박동하는 심근세포로 분화되였으며 이 또한 심근세포 특이성 마커인 α-actinin 의 발현으로 검증하였다 (도 26). 이러한 결과는 우리가 처음으로 고양이 배아줄기세포를 분리배양 하는데 성공했음을 시사한다. In order to separate and induce feline embryonic stem cells, ICM (Inner cell mass) was separated from the blastocyst derived from the body by a mechanical method (FIG. 24A,B) and grown in a medium to which FBS was added and a medium to which KSR was added, and compared. Feeder cells were made into feline embryonic fibroblast cells (FIG. 23). As a result, KSR medium showed better results in adhesion of early-like embryonic stem cells, but FBS showed better results in terms of cell proliferation rate. The induced pseudo-embryonic stem cells had the morphological characteristics of embryonic stem cells with large nuclei and low cytoplasm (Fig. 24), and verification of embryonic stem cells in an undifferentiated state was AP (alkaline phosphatase), Oct4, SSEA-1, SSEA- Stem cell-specific markers such as 3 and SSEA-4 were used to verify, as a result, it was confirmed that these markers were clearly expressed in pseudoembryonic stem cells in an undifferentiated state (FIG. To verify the differentiation ability of pseudoembryonic stem cells, EB was first made, and as a result of culturing EB in a tissue culture dish, it was confirmed morphologically that it was differentiated into pseudo-epithelial cells and pseudo-neural cells. The two colonies of pseudoembryonic stem cells cultured in FBS were differentiated into spontaneous and autonomously beating cardiomyocytes when subcultured for the third time, which was also verified by the expression of α-actinin, a cardiomyocyte-specific marker ( Fig. 26). These results suggest that we have succeeded in isolating and cultivating feline embryonic stem cells for the first time.

고양이 유사배아줄기세포를 유도 성공한 전제하에서 고양이에서 아직 배아줄기세포 검증에서 매우중요한 두 유전자인 POU5F1 와 NANOG 염기서열이 밝혀지지 않았기 때문에 이 두 유전자의 염기서열을 밝혀내고자 하였다. 고양이 POU5F1 와 NANOG의 CDSs(coding sequences)를 결정하였고 오르소로고우스 유전자(orthologous genes)를 분석한 결과 고양이 POU5F1 유전자는 뉴클레오타이드 수준에서 사람과 마우스와 각각 92%와 82%가 동일하였고 아미노산 수준에서는 각각 94%와 83%가 동일함을 확인하였다. 또한 POU5F1의 CDS에서 POU 특이성과 POU 호메오도메인 서열(homeodomain sequences)을 분석한 결과 사람과 마우스와 각각 69%와 68%가 동일하였고(도 27) 고양이 NANOG 유전자는 뉴클레오타이드 수준에서 사람과 마우스와 각각 69%아 68%가 동일하였고 아미노산 수준에서는 각각 69%와 58%가 동일하였다(도 28). 또한 호메오도메인인 NANOG의 CDS에서 SMAD4 도메인과 트립토판 반복 도메인(tryptophan repeat domain) (W/QXXXX) 을 확인하였다(도 28). 그리고 RT-PCR 방법으로 고양이 유사배아줄기세포와 배아섬유아세포에서 POU5F1 와 NANOG mRNA 의 발현을 검증한 결과 POU5F1 는 고양이 유사배아줄기세포에서는 높은 발현을 보인반면 배아섬유아세포에서는 발현되지 않았고 NANOG 는 유사배아줄기세포에서 배아섬유아세포에서 보다 많이 발현됨을 알 수 있었다(도 29). 또한 면역염색법으로 이두 유전자의 발현을 검증하였다. 그 결과 고양이 유사배아줄기세포에서는 높은 발현을 보였으면 배아섬유아세포에서는 검출되지 않았다(도 30). 이러한 결과로부터 볼 때 성공적으로 고양이 배아유사줄기세포를 분리해냈음을 알 수 있으며 이러한 고양이 유전자의 염기서열을 밝혀냄으로서 앞으로 고양이 줄기세포 검증을 위한 바이오마커에 사용되는 등 다양한 연구에 활용될 수 있다. Under the premise that feline-like embryonic stem cells were successfully induced, the nucleotide sequences of two genes, POU5F1 and NANOG, which are very important in the verification of embryonic stem cells in cats, have not been identified, so we tried to find out the nucleotide sequences of these two genes. The CDSs (coding sequences) of feline POU5F1 and NANOG were determined, and as a result of analyzing orthologous genes, the feline POU5F1 gene was 92% and 82% identical to human and mouse, respectively, at the nucleotide level, and at the amino acid level, respectively. It was confirmed that 94% and 83% were the same. In addition, as a result of analyzing POU specificity and POU homeodomain sequences in the CDS of POU5F1, 69% and 68% were identical to human and mouse, respectively (Figure 27). 69% and 68% were the same, and 69% and 58% were the same at the amino acid level, respectively (FIG. 28). In addition, the SMAD4 domain and the tryptophan repeat domain (W/QXXXX) were confirmed in the CDS of the homeodomain NANOG (FIG. 28). In addition, as a result of verifying the expression of POU5F1 and NANOG mRNA in feline-like embryonic stem cells and embryonic fibroblasts by RT-PCR, POU5F1 was highly expressed in feline-like embryonic stem cells, whereas it was not expressed in embryonic fibroblasts. NANOG was not expressed in embryonic fibroblasts. It was found that stem cells were more expressed in embryonic fibroblasts (FIG. 29). In addition, the expression of biceps genes was verified by immunostaining. As a result, if high expression was shown in feline-like embryonic stem cells, it was not detected in embryonic fibroblasts (FIG. 30). From these results, it can be seen that feline embryo-like stem cells have been successfully isolated, and by revealing the nucleotide sequence of these feline genes, they can be used in various studies, such as being used as biomarkers for verification of feline stem cells in the future.

그럼으로 우리가 현재 보유하고 있는 배아줄기세포 분리 및 배양 기술을 이용하여 우리 실험실에서 세계최초로 복제한 RFP 발현 형질전환 고양이로부터 추출한 배반포 또는 복제 배반포로부터 배아줄기세포를 분리 배양하여 RFP 표적 마커가 발현되는 배아줄기세포 또는 면역거부반응이 없는 특이한 배아줄기세포를 생산하여 임상 전실험에 적용하면 우리가 이식한 세포를 체내에서 쉽게 추적할수 있는 장점을 갖고 있다. 또한 ips (Induced pluripotent stem cell) 기술을 적용하여 RFP 형질전환 고양이 체세포로부터 전능성 줄기세포를 유도해냄으로서 임상 전실험에 사용할 수 있는 장점도 갖고 있다.
Therefore, using our current embryonic stem cell isolation and culture technology, the RFP target marker is expressed by separating and culturing embryonic stem cells from blastocysts or cloned blastocysts extracted from RFP-expressing transgenic cats cloned for the first time in the world in our laboratory. If we produce embryonic stem cells or unusual embryonic stem cells that do not have immune rejection reactions and apply them to pre-clinical experiments, we have the advantage of being able to easily trace the transplanted cells in the body. In addition, it has the advantage that it can be used in pre-clinical experiments by inducing pluripotent stem cells from RFP transgenic cat somatic cells by applying ips (Induced pluripotent stem cell) technology.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
As described above, a specific part of the present invention has been described in detail, and for those of ordinary skill in the art, it is obvious that this specific description is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Therefore, it will be said that the practical scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

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Claims (5)

(a) 고양이로부터 체세포를 분리하는 단계;
(b) 적색 형광단백질을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 도 2의 개열지도를 가지며, 서열번호 1의 CMV 프로모터, 서열번호 2의 DsRed유전자 및 서열번호 3의 WPRE를 포함하는 적색형광단백질 발현용 pLHCRW 벡터를 제조하는 단계;
(c) 상기 발현 벡터 pLHCRW를 레트로바이러스 패키징 세포에 트랜스펙션시켜 LHCRW바이러스를 수득, 배양하는 단계;
(d) 상기 수득, 배양한 LHCRW바이러스로 상기 (a)단계에서 분리된 체세포를 감염시켜, 적색형광단백질로 형질전환하고 배양하는 단계;
(e) 고양이로부터 채취한 난자의 핵을 제거한 후, 상기 (d)단계에서 형질전환된 체세포와 전기융합시켜 배아를 제조하고, 전기 통전으로 활성화 시키는 단계
(f) 적색형광 단백질의 발현여부로 형질전환된 배아를 분리하고 배반포 상태로 배양하는 단계; 및
(g) 상기 형질 전환된 배반포를 회수한 후, 대리모 고양이의 난관에 이식하여, 새끼를 생산하는 단계; 를 포함하는 적색형광 단백질을 발현하도록 형질전환한 후 체세포 복제한 고양이의 생산방법.
[도 2]
Figure 112012046585544-pat00005

(a) separating somatic cells from the cats;
(b) a pLHCRW for expression of a red fluorescent protein having a cleavage map of FIG. 2 comprising a nucleic acid sequence encoding a red fluorescent protein and comprising the CMV promoter of SEQ ID NO: 1, the DsRed gene of SEQ ID NO: 2, Producing a vector;
(c) transfecting the expression vector pLHCRW into retrovirus packaging cells to obtain and culture LHCRW virus;
(d) infecting the somatic cells isolated in step (a) with the obtained and cultured LHCRW virus, transforming and culturing with a red fluorescent protein;
(e) removing the nucleus of the oocyte collected from the cat, and (f) preparing an embryo by electrofusion with the transformed somatic cell in the step (d)
(f) isolating the transformed embryo by the expression of the red fluorescent protein and culturing it in a blastocyst state; And
(g) recovering the transformed blastocyst and then transplanting the transformed blastocyst into the tubal cavity of a surrogate mother cat to produce a litter; Lt; RTI ID = 0.0 &gt; red &lt; / RTI &gt; fluorescent protein.
[Figure 2]
Figure 112012046585544-pat00005

(a) 고양이로부터 체세포를 분리하는 단계;
(b) 적색 형광단백질을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 도 2의 개열지도를 가지며, 서열번호 1의 CMV 프로모터, 서열번호 2의 DsRed유전자 및 서열번호 3의 WPRE를 포함하는 적색형광단백질 발현용 pLHCRW 벡터를 제조하는 단계;
(c) 상기 발현 벡터 pLHCRW를 레트로바이러스 패키징 세포에 트랜스펙션시켜서 LHCRW바이러스를 수득, 배양하는 단계;
(d) 상기 수득, 배양한 LHCRW바이러스로 상기 (a)단계에서 분리된 체세포를 감염시켜, 적색형광단백질로 형질전환하고 배양하는 단계;
(e) 고양이로부터 채취한 난자의 핵을 제거한 후, 상기 (d)단계에서 형질전환된 체세포와 전기융합시켜 배아를 제조하고, 전기 통전으로 활성화 시키는 단계
(f) 적색형광 단백질의 발현여부로 형질전환된 배아를 분리하고, 배반포 상태로 배양하는 단계; 및 상기 배반포를 회수한 후, 배반포에서 배아줄기세포를 분리하는 단계; 를 포함하는 적색형광 단백질을 발현하도록 형질전환한 후 체세포 복제한 고양이의 배아줄기세포를 생산하는 방법.
[도 2]
Figure 112012046585544-pat00006

(a) separating somatic cells from the cats;
(b) a pLHCRW for expression of a red fluorescent protein having a cleavage map of FIG. 2 comprising a nucleic acid sequence encoding a red fluorescent protein and comprising the CMV promoter of SEQ ID NO: 1, the DsRed gene of SEQ ID NO: 2, Producing a vector;
(c) transfecting the expression vector pLHCRW into retrovirus packaging cells to obtain and culture LHCRW virus;
(d) infecting the somatic cells isolated in step (a) with the obtained and cultured LHCRW virus, transforming and culturing with a red fluorescent protein;
(e) removing the nucleus of the oocyte collected from the cat, and (f) preparing an embryo by electrofusion with the transformed somatic cell in the step (d)
(f) isolating the transformed embryo by the expression of the red fluorescent protein and culturing it in a blastocyst state; And recovering the blastocyst and then separating embryonic stem cells from the blastocyst; Wherein the transformed embryonic stem cell is transformed to express a red fluorescent protein comprising the cytoplasmic protein.
[Figure 2]
Figure 112012046585544-pat00006

제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 전기융합은 0.1mM의 Mg2 +가 함유된 0.3M 만니톨 배양액에서 2.0kV/cm의 직류전압으로 20μsec 동안 2회 통전시키고, 상기 활성화는 0.1mM의 Mg2 +가 함유된 0.3M 만니톨 배양액에서 1.0kV/cm의 직류전압으로 각각 20μsec 및 0.1 sec 동안 통전시키는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the electrofusion in step (e) is energized and for 20μsec 0.3M mannitol in the culture medium containing the Mg 2 + 0.1mM of a DC voltage of 2.0kV / cm 2 times, the activation of 0.1mM And a 0.3 M mannitol culture solution containing Mg 2 + is energized for 20 μsec and 0.1 sec respectively at a DC voltage of 1.0 kV / cm.
제1항에 있어서, 상기 (f) 단계에서 배아의 배반포 상태로의 배양은, eCG 및 hCG 처리 36시간 후, 상기 (e) 단계에서 활성화된 배아를 대리모 난관에 이식시켜 7일간 체내에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1, wherein culturing the embryo into a blastocyst state in step (f) comprises culturing the embryo activated in step (e) in the embryo transfer tube after 36 hours of eCG and hCG treatment for 7 days &Lt; / RTI &gt;
제1항에 있어서, 상기 (g) 단계에서 회수된 배반포를 대리모 고양이의 난관으로 이식하는 단계는, 대리모 고양이의 배란 96시간 후, 100 IU hCG 주사를 통해 동기화된 고양이를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.

The method according to claim 1, wherein the step of implanting the blastocyst recovered in step (g) into the fallopian tube catheter uses synchronized cats through 100 IU hCG injection after 96 hours of ovulation of the surrogate mother cat Way.

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