KR101261872B1 - A intestinal microbial enzyme mixture and it's preparation thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 소화관내 대사계를 대신하여 시험관 내에서 의약품/식품성분 등의 독성 평가 또는 생리활성 평가를 위해 사용되는 분변 효소액(Fecalase)을 대체할 수 있는 사람의 소화관내에서 분리한 장내 미생물로 제조한 장내 미생물 효소복합체(intestinal microbial enzyme mixture, enzyme mix)및 이의 제조방법에 관한 것으로, p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드, p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드, 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드 및 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드에 대해 기질 활성을 갖는 장내 미생물 효소복합체를 에임즈 시험에 대사 활성계로 적용하였을 때, 기존에 소화관내 대사계로 사용되어 왔던 피칼라제를 적용했을 때와 유의적으로 복귀돌연변이원 수가 증가함을 확인하였으므로, 본 발명의 장내 미생물 복합체를 소화관내 대사계에 대한 대사 활성계로 이용하여, 유전독성 평가시험인 시험관 내 염색체이상시험(In vitro Chromosomal Aberration Assay), 시험관 내 소핵시험(In vitro Micronucleus Assay), 쥐 임파종 분석(Mouse Lymphoma Assay, MLA), 시험관 내 포유류 세포 소핵시험(In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test), 코멧 분석(Comet Assay), 포유류 정원세포 염색체 이상 분석(Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Assay), SOS 크로모테스트(SOS chromotest) 및 복귀돌연변이 시험인 에임즈 시험(Bacterial Reverse Mutation Test, Ames Test)법, 또는 생리 활성 평가인 전자공여능(Electron donating ability)평가, SOD(Superoxide dismutase) 유사 활성 평가, 아질산염 분해 작용 측정(Nitrite scavenging ability)을 통한 항산화 활성 평가 및 항알러지 효과 평가에 적용할 수 있다. The present invention is made of intestinal microorganisms isolated from the digestive tract of a person that can replace fecal enzymes used for the toxicity evaluation or physiological activity evaluation of drugs / food components, etc. in vitro in place of the digestive tract metabolic system. Intestinal microbial enzyme mixture (intestinal microbial enzyme mixture, enzyme mix) and a method for producing the same, p-nitrophenyl-β-D-glucolonide, p-nitrophenyl-β-D-xylpy When enteric microbial enzyme complexes having substrate activity against lanoxide, nitrophenyl-α-L-rampranopyranoside and p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside were applied as metabolic activity to the Ames test In addition, since it was confirmed that the number of reverse mutations increased significantly when applying the picalase, which has been previously used as a metabolic system in the digestive tract, the intestinal microbial complex of the present invention was applied to the metabolic system in the digestive tract. In vitro Chromosomal Aberration Assay, In vitro Micronucleus Assay, Mouse Lymphoma Assay (MLA), In vitro Mammalian Cells In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test, Comet Assay, Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Assay, SOS Chromotest, and Bacterial Reverse Test Evaluation of the donor ability (mutation test, Ames test) method, or physiological activity, evaluation of superoxide dismutase (SOD) -like activity, evaluation of antioxidant activity through nitrite scavenging ability and evaluation of anti-allergic effect Applicable to
Description
본 발명은 시험관 내에서 의약품 또는 식품성분 등의 독성 평가 또는 생리 활성 평가시 소화관내 대사계에 대한 대사 활성계로 사용되는 분변 효소액(fecalase)을 대체할 수 있는 사람의 소화관에서 분리된 장내 미생물로 제조한 장내 미생물 효소복합체(intestinal microbial enzyme mixture, enzyme mix) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention is prepared by intestinal microorganisms isolated from the digestive tract of a human who can replace fecal enzyme used as a metabolic activity system for the metabolic system in the digestive tract when evaluating toxicity or physiological activity of drugs or food components in vitro. Intestinal microbial enzyme complex (intestinal microbial enzyme mixture, enzyme mix) and its preparation method.
경구 투여되는 의약품과 식품의 구성 성분 중에서 비극성도가 높은 알카로이드 및 소화관 벽내의 특수한 운반체(transporter)에 의해 운반되는 포도당과 같은 구성성분들은 위 또는 소장에서 쉽게 흡수된다. 그러나 극성이 높은 다당체와 배당체들은 소화관내에서 잘 흡수되지 않는다. 다당체와 배당체 성분들은 소화관 안에 서식하고 있는 미생물들에 의해 대사되며, 그 결과 생성되는 대사체들은 비극성도가 높아지므로 소화관 내로 흡수될 수 있다. 또한, 소화관내 미생물에 의해 대사를 받는 과정에서 생산되는 대사체들은 원래의 물질에 비해 생리 활성 또는 독성이 높은 경우가 많다. 따라서 경구 투여되는 식품과 의약품의 독성과 약리 평가에 있어서 소화관내 대사계는 간장 대사계 만큼이나 중요하다고 할 수 있다. 시험관에서 독성 물질의 활성화와 분해 정도를 평가하기 위해, 간장 대사계를 대신해서 간 세포분쇄액인 S9 복합체(S9 mixture)가, 소화관내 대사계를 대신해서는 분변효소액인 피칼라제(fecalase)가 개발된 바 있다. Among the components of medicines and foods to be administered orally, components such as alkaloids with high polarity and glucose carried by special transporters in the wall of the digestive tract are easily absorbed in the stomach or small intestine. However, highly polar polysaccharides and glycosides are poorly absorbed in the digestive tract. Polysaccharides and glycosides are metabolized by the microorganisms inhabiting the digestive tract, and the resulting metabolites can be absorbed into the digestive tract due to their high nonpolarity. In addition, metabolites produced during metabolism by microorganisms in the digestive tract are often more physiologically active or toxic than the original substance. Therefore, the metabolic system in the digestive tract is as important as the hepatic metabolic system in the toxicity and pharmacological evaluation of orally administered foods and drugs. In order to assess the degree of activation and degradation of toxic substances in vitro, the S9 mixture, a liver cell pulverization solution instead of the hepatic metabolic system, and the fecalase, a fecal enzyme solution, instead of the metabolic system in the digestive tract, It was developed.
유전독성시험 및 생리활성 평가는 식품과 의약품의 구성 성분 중 생체내에 유입되어 돌연변이를 일으킬 가능성이 있는 물질을 탐색하는데 쓰이며, DNA나 염색체에 직접적으로 손상을 주어서 형태적 변화나 기능적 이상을 일으키는 현상을 관찰하는 시험분야이다. 따라서 유전독성시험은 새로운 신약이나 화학물질 개발시 물질 스크리닝 단계에서 반드시 수행해야 한다. 유전독성시험에는 시험관 내 염색체이상시험(In vitro Chromosomal Aberration Assay), 시험관 내 소핵시험(In vitro Micronucleus Assay), 쥐 임파종 분석(Mouse Lymphoma Assay, MLA), 시험관 내 포유류 세포 소핵시험(In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test), 코멧 분석(Comet Assay), 포유류 정원세포 염색체 이상 분석(Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Assay), SOS 크로모테스트(SOS chromotest) 및 복귀돌연변이 시험인 에임즈 시험(Bacterial Reverse Mutation Test, Ames Test)등이 있다. Genotoxicity tests and bioactivity assays are used to detect substances in food and pharmaceuticals that may enter the body and cause mutations, and may cause morphological changes or functional abnormalities by directly damaging DNA or chromosomes. It is the field of test to observe. Therefore, genotoxicity testing must be performed at the screening phase of a new drug or chemical. Genotoxicity tests include in vitro chromosomal aberration assays, in vitro micronucleus assays, mouse lymphoma assays (MLA), and in vitro mammalian cell micronucleus tests (In vitro Mammalian Cells). Micronucleus Test, Comet Assay, Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Assay, SOS Chromotest, and Bacterial Reverse Mutation Test, Ames Test There is this.
시험관 내 염색체이상시험은 시험물질에 의한 염색체의 구조적 이상을 측정하기 위한 시험법으로써 일반적으로 포유동물세포인 차이니즈 햄스터 폐(Chinese Hamster Lung, CHL)세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO)세포를 사용한다. 시험관 내 소핵시험은 소핵을 가진 다염성 적혈구의 증가를 확인함으로써, 시험물질이 염색체나 세포분열장치에 주는 손상을 평가한다. 쥐 임파종 분석은 포유동물세포인 L5178Y tk+/- 세포를 이용하여 티미딘 키나제(thymidine kinase, tk) 유전자에서 전진 돌연변이(forward mutation)을 측정하는 시험법으로 시험물질의 유전자 돌연변이와 염색체 이상(chromosomal aberration) 모두를 측정할 수 있는 시험법이다. 상기 시험법은 복귀돌연변이 시험과 HPRT 돌연변이 시험에 비해 다양한 유전자 변이를 측정할 수 있다. 시험관 내 포유류 세포 소핵시험은 포유동물세포를 이용하여 염색체의 구조적이상(clastogenic) 및 수적이상(aneugenic)을 일으키는 물질을 측정하는 시험법으로써 간기(interphase) 세포의 세포질에 존재하는 소핵을 측정한다. 코멧 분석은 현재 DNA 손상 측정시험법으로써 각광받고 있는 시험법이다. 포유류 정원세포 염색체 이상 분석은 마우스의 정자세포에서 염색체이상시험을 수행하는 시험법으로써 다음 세대로 전이될 수 있는 생식세포(germ cell)에서 발생하는 유전독성을 검사한다. SOS 크로모테스트는 이스케리치아 콜라이(Escherichia coli , E. coli) PQ37/plasmid pKM 101 균주를 사용하여 시료의 항돌연변이 효과를 검토하는 시험법이다.In vitro chromosomal aberration test is a test method for measuring structural abnormality of chromosome by test substance. Chinese Hamster Lung (CHL) cells and Chinese Hamster Ovary (CHO) cells are generally mammalian cells. Use An in vitro micronucleus test evaluates the damage to a chromosome or cell division device by identifying an increase in polyinflammatory red blood cells with micronuclei. Murine lymphoma analysis is a test for measuring forward mutations in thymidine kinase (tk) genes using L5178Y tk +/- cells, a mammalian cell, and genetic and chromosomal aberrations of test substances. ) It is a test method that can measure all. The assay can measure a variety of gene mutations as compared to the back mutation test and the HPRT mutation test. The in vitro mammalian cell micronucleus test is a test for measuring substances causing mammalian cells to cause clastogenic and ananegenicity of microorganisms in the cytoplasm of interphase cells. Comet analysis is currently a popular method for measuring DNA damage. Mammalian garden cell chromosomal aberration assay is a test for chromosomal aberration in sperm cells of mice that tests for genotoxicity in germ cells that can be transferred to the next generation. SOS chromotest is Escherichia coli , E. coli ) PQ37 / plasmid pKM 101 strain is used to examine the antimutagenic effects of samples.
유전독성시험 중 상기 에임즈 시험법은 히스티딘 합성이 저해된 미생물을 이용하여 시험물질에 의해 히스티딘 합성 균주로 전환되는지를 확인함으로써, 유전독성을 측정하는 시험법으로 1970년대 초반 Dr. Bruce Ames에 의해 개발되어 에임즈 시험법이라고 명명되었다. 이 시험법은 5 균주 이상을 이용하여 DNA의 단일 염기 수준에서 유전적 손상을 측정한다. 일반적으로 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium, S. typhimurium) TA98, TA100 및 TA1537, 및 E. coli WP2uvrA 등의 5 균주를 사용하고, 시험물질의 특성에 따라 S. typhimurium TA102 균주를 사용하기도 한다. 에임즈 시험법은 유전독성시험법 중 빠르고 간편하면서도 발암성 시험결과와 매우 밀접한 상관관계를 보이는 시험법으로써 신약 개발의 초기 선별 단계 및 의약품, 식품첨가물, 농약, 일반화학물질 등의 안전성 시험에서 널리 사용한다. 1975년 발암 물질로 알려진 300개의 화학물질에 대한 연구를 시작으로 거의 모든 화학물질에 대해 연구가 이루어졌으며 예전에 음성으로 판정되었던 화학물질에 대해서도 신규한 균주를 만들어서 재시험하고 있다. 전세계에서 발암물질을 검색하고자 할 때 가장 먼저 수행되어지는 기본적인 시험법으로서, 광범위한 화학물질에 대하여 수행되어졌고, 많은 수정된 방법들이 개발되고 있다.In the genotoxicity test, the Ames test is a test method for measuring genotoxicity by checking whether the histidine synthesis is converted to a histidine-synthetic strain by a test substance using a microorganism inhibited by the early 1970s. Developed by Bruce Ames and named Ames Test Method. This assay uses more than 5 strains to determine genetic damage at the single base level of DNA. In general, five strains such as Salmonella typhimurium (S. typhimurium ) TA98, TA100 and TA1537, and E. coli WP2uvrA are used, and S. typhimurium TA102 strain may be used depending on the characteristics of the test substance. The Ames test is a quick and simple genotoxicity test that is closely related to the carcinogenicity test results. It is widely used in the initial screening stage of drug development and safety testing of medicines, food additives, pesticides and general chemicals. do. Beginning in 1975 with nearly 300 chemicals known as carcinogens, almost all chemicals have been studied, and new strains have been tested and tested against previously negative chemicals. It is the first basic test to be performed when searching for carcinogens around the world. It has been performed on a wide range of chemicals and many modified methods are being developed.
생리활성 평가에는 전자공여능(Electron donating ability)평가, SOD(Superoxide dismutase) 유사 활성 평가 및 아질산염 분해 작용 측정(Nitrite scavenging ability)을 통한 항산화 활성 평가 또는 항알러지 효과 평가가 있다. 전자공여능(Electron donating ability)시험은 Blois(1958)의 방법에 준하여 각 시료의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)에 대한 전자공여 효과로써 시료의 환원력을 측정하는 시험법이고, SOD(Superoxide dismutase)유사 활성 시험은 Marklund의 방법에 따라 H2O2로 전환시키는 반응을 촉매하는 파이로갈롤(pyrogallol)의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성을 확인하는 시험법이며, 아질산염 분해 작용(Nitrite scavenging ability)은 각 시료 추출물을 이용하여 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 통해 잔존하는 아질산염의 백분율(%)로 나타낸다. 또한, 항알러지 효과는 알러지 항원이 호흡이나 피부를 통해서 사람에 유입되어 유도된 Th2세포로부터 생성되어 고농도로 존재하는 싸이토카인(cytokines)(Th2 cytokines: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13)의 측정을 통해 확인한다.
Physiological activity evaluation includes electron donating ability evaluation, superoxide dismutase (SOD) -like activity evaluation and antioxidant activity evaluation through nitrite scavenging ability or anti-allergic effect evaluation. Electron donating ability test is a test method to measure the reducing power of the sample by the electron donating effect on DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) of each sample according to the method of Blois (1958), SOD (Superoxide dismutase) -like activity test is a test method for confirming SOD-like activity by measuring the amount of pyrogallol that catalyzes the conversion to H 2 O 2 according to Marklund's method. Scavenging ability is expressed as the percentage of nitrite remaining on the spectrophotometer using each sample extract. In addition, the anti-allergic effect is caused by high concentrations of cytokines (Th2 cytokines: IL-4, IL-5, IL-10, IL) generated from Th2 cells induced by allergens introduced into humans through respiration or skin. -13) to confirm.
N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘(N-methy1-N'-nitro-N-nitroso guanidine, MNNG)는 체내의 대사 활성계를 거치지 않고도 유전독성 시험평가에 쓰이는 균주에 직접적으로 돌연변이를 유발하는 직접돌연변이원이며, 아플라톡신(aflatoxin)은 직접적으로 돌연변이를 일으키진 않지만, 간장 대사 활성계를 거치면서 돌연변이원으로 작용하므로 간접돌연변이원으로 분류된다. 이와 같이 시험관에서 간접돌연변이원의 독성을 활성화시키기 위해 에임즈 시험법에서는 인체내 대사 활성계 중 하나인 간장 대사계를 대신하여 S9 복합체가 쓰인다. 상기에 기재한 바와 같이 천연물, 한약, 식품 기능성 식품에 함유하고 있는 배당체와 다당체의 경우 장내 미생물의 대사를 받으나, S9 복합체에 의해 쉽게 분해되지 않는다. 그러므로 S9 복합체를 사용한 에임즈 시험법에서 배당체와 다당체와 같은 시험물질의 돌연변이성을 정확히 확인할 수 없는 단점이 있다. 그러므로 간장대사계인 S9 복합체와 함께 소화관내 대사계를 대신하여 분변 효소액(fecalase)이 개발된 바 있으나(GLEN TAMURA, CHERYL GOLD, ANNA FERRO-LUZZI*, AND BRUCE N. AMES. Fecalase:A model for activation of dietary glycosides to mutagens by intestinal flora. Proc Natl. Acad Sci USA Vol. 77, No. 8, pp. 4961-4965), 개인 간의 차이가 크고, 안정성이 낮고, 상시 이용이 어려운 단점이 있다.
N-methyl-N'-nitro-N-nitroso guanidine (MNNG) is directly used for strains used for genotoxicity assays without going through the metabolic activity system of the body. It is a direct mutagen that causes mutations, and aflatoxin does not directly mutate, but is classified as an indirect mutagen because it acts as a mutagen through the hepatic metabolic activity system. Thus, in order to activate the toxicity of indirect mutants in vitro, the Ames test uses the S9 complex in place of the hepatic metabolic system, which is one of the human metabolic systems. As described above, glycosides and polysaccharides contained in natural products, herbal medicines, and functional foods are metabolized by the intestinal microorganisms, but are not easily degraded by the S9 complex. Therefore, in the Ames test using the S9 complex, there is a disadvantage in that the mutagenicity of test substances such as glycosides and polysaccharides cannot be accurately identified. Therefore, fecalase has been developed in place of the metabolic system in the digestive tract with the S9 complex, a hepatic metabolic system (GLEN TAMURA, CHERYL GOLD, ANNA FERRO-LUZZI *, AND BRUCE N. AMES.Fecalase: A model for activation of dietary glycosides to mutagens by intestinal flora.Proc Natl.Acad Sci USA Vol. 77, No. 8, pp. 4961-4965), have a large difference between individuals, low stability, and difficulty in regular use.
이에, 본 발명자들은 시험관에서 소화관내 대사계를 대신하여 의약품 또는 식품성분등의 유전독성 평가 또는 생리활성 평가를 위해 사용되는 분변 효소액(fecalase)을 대체할 수 있는 사람의 소화관에서 분리한 장내 미생물로 구성된 장내 미생물 효소복합체(intestinal microbial enzyme mixture, enzyme mix)를 제조하여 에임즈 시험법에 적용하였을 때, 간접돌연변이원 물질에 대하여 상기 피칼라제와 동일한 효소 활성의 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors are intestinal microorganisms isolated from the digestive tract of a person who can replace fecal enzymes used for the evaluation of physiological toxicity or physiological activity of medicines or food components in place of the metabolic system in the gut in vitro. When the prepared intestinal microbial enzyme mixture (enzyme mix) was prepared and applied to the Ames test method, the present invention was completed by confirming the effect of the same enzyme activity as the picalase on the indirect mutant material.
장내 미생물 효소복합체(intestinal microbial enzyme mixture, enzyme mix) 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
It is to provide an intestinal microbial enzyme mixture (enzyme mix) and a method for preparing the same.
본 발명은 메가스페라 엘스데니(Megasphaera elsdenii), 파라박테로이즈 디스타소니스(Parabacteroides distasonis), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 및 유박테리움 렉테일(Eubacterium rectale)을 1:1:1:1의 비율로 포함하는 장내 미생물 효소복합체를 제공한다.The present invention is Megasphaera elsdenii ), Parabacteroides distasonis distasonis ), Klebsiella pneumoniae and Eubacterium rectale are provided in an intestinal microbial enzyme complex comprising a ratio of 1: 1: 1: 1.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 메가스페라 엘스데니, 파라박테로이즈 디스타소니스, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일을 각각 배양하는 단계;1) culturing megagaspera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and eubacterium rectail, respectively;
2) 상기 단계 1)의 배양물을 초음파 분리하여 상등액을 수득하는 단계;및2) ultrasonically separating the culture of step 1) to obtain a supernatant; and
3) 상기 단계 2)에서 수득한 메가스페라 엘스데니, 파라박테로이즈 디스타소니스, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일의 상등액을 각각 1:1:1:1의 비율로 혼합하는 단계를 포함하는 장내 미생물 효소복합체의 제조방법을 제공한다. 3) The supernatant of the megaspera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and eubacterium rectail obtained in the step 2) were respectively 1: 1: 1: 1. It provides a method for producing an intestinal microbial enzyme complex comprising the step of mixing.
또한, 본 발명은 상기 장내 미생물 효소복합체를 유효성분으로 포함하는 검체의 유전 독성 평가용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for evaluating the genotoxicity of a sample comprising the intestinal microbial enzyme complex as an active ingredient.
아울러, 본 발명은 상기 장내 미생물 효소복합체를 유효성분으로 포함하는 검체의 생리활성 평가용 약학적 조성물을 제공한다.
In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for evaluating the biological activity of a sample comprising the intestinal microbial enzyme complex as an active ingredient.
본 발명의 장내 미생물 효소복합체(intestinal microbial enzyme mixture, enzyme mix)는 p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드(p-nitrophenyl-β-D-glucuronide), p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside), 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드(nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside) 또는 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)기질에 대해 효소 활성을 가지며, 에임즈 시험법에 대사 활성계로 적용하였을 때, 기존에 소화관내 대사계로 사용되어 왔던 분변 효소액인 피칼라제(fecalase)를 적용했을 때와 유사하게 복귀돌연변이원 수가 유의적으로 증가함을 확인하였으므로, 본 발명의 장내 미생물 효소복합체를 소화관내 대사계에 대한 대사 활성계로 이용하여, 유전독성 평가시험인 시험관 내 염색체이상시험, 시험관 내 소핵시험, 쥐 임파종 분석, 시험관 내 포유류 세포 소핵시험, 코멧 분석, 포유류 정원세포 염색체 이상 분석, SOS 크로모테스트 및 복귀돌연변이 시험인 에임즈 시험법, 또는 생리 활성 평가인 전자공여능 평가, SOD 유사 활성 평가 및 아질산염 분해 작용 측정을 통한 항산화 활성 평가 및 항알러지 효과, 항염증 효과, 항암 효과, 항노화 효과의 효능을 시험관내(in vitro)에서 적용할 수 있다.
Intestinal microbial enzyme mixture (enzyme mix) of the present invention is p-nitrophenyl-β-D-glucuronide (p-nitrophenyl-β-D-glucuronide), p-nitrophenyl-β P-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside or p-nitrophenyl-β- Picalar, a fecal enzyme solution that has been used as a metabolic system in the digestive tract when it has an enzymatic activity against p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside substrate and is applied as a metabolic activity system to the Ames test Similarly to the application of fecalase, it was confirmed that the number of reverse mutations was significantly increased. Thus, the in vitro microbial enzyme complex of the present invention was used as a metabolic activity system for the metabolic system in the gastrointestinal tract, which was a genotoxicity test. Chromosome aberration test, in vitro micronucleus test, mouse lymphoma Seats, in vitro mammalian cell micronucleus test, comet analysis, mammalian garden cell chromosome aberration analysis, AOS test with SOS chromotest and reverse mutation test, or electron donating ability test with physiological activity evaluation, SOD-like activity evaluation and nitrite degradation activity measurement The evaluation of antioxidant activity and the efficacy of anti-allergic, anti-inflammatory, anticancer and anti-aging effects can be applied in vitro.
도 1은 분변 효소액인 피칼라제(fecalase)를 4℃상태에서 보관하였을 때 시간의 변화에 따른 효소활성측정을 나타낸 도이다:
x축: 저장 일자(day);및
y축: 효소 활성.
도 2는 β-자일로시다제(β-xylosidase), β-글루커로니다제(β-Glucuronidase), α-람노시다제(α-Rhamnosidase) 및 β-글루코시다제(β-Glucosidase)의 저장방법에 따른 각 해당 기질에 대한 효소활성측정을 나타낸 도이다:
x축: 저장 일자(day);및
y축: 효소 활성.
도 3은 루틴(Rutin)과 대사 활성계로 작용하는 피칼라제(fecalase), 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체를 따로 또는 함께 처리하였을 때, 살모넬라 타이피뮤리움(S. typhimurium) TA98의 복귀돌연변이 원수를 나타낸 도이다:
NC : 음성 대조군;
M : 루틴 처리군;
M+EM : 루틴 및 장내 미생물 효소복합체를 함께 처리한 군;
M+S9 : 루틴 및 S9 복합체를 함께 처리한 군;
M+EM+S9 : 루틴, 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체를 함께 처리한 군;
M+F : 루틴 및 피칼라제를 함께 처리한 군;및
M+F+S9 : 루틴, 피칼라제 및 S9 복합체를 함께 처리한 군.
도 4는 루틴과 대사 활성계로 작용하는 피칼라제, 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체를 따로 또는 함께 처리하였을 때, S. typhimurium TA100의 복귀돌연변이 원수를 나타낸 도이다.
도 5는 루틴과 대사 활성계로 작용하는 피칼라제, 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체를 따로 또는 함께 처리하였을 때, S. typhimurium TA102의 복귀돌연변이 원수를 나타낸 도이다.
도 6은 루틴과 대사 활성계로 작용하는 피칼라제, 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체를 따로 또는 함께 처리하였을 때, S. typhimurium TA1535의 복귀돌연변이 원수를 나타낸 도이다.
도 7은 루틴과 대사 활성계로 작용하는 피칼라제, 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체을 따로 또는 함께 처리하였을 때, S. typhimurium TA1537의 복귀돌연변이 원수를 나타낸 도이다.
도 8은 괴화(Sophorae Flos)와 대사 활성계로 작용하는 피칼라제, 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체을 따로 또는 함께 처리하였을 때, S. typhimurium TA98의 복귀돌연변이 원수를 나타낸 도이다.
도 9는 괴화와 대사 활성계로 작용하는 피칼라제, 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체를 따로 또는 함께 처리하였을 때, S. typhimurium TA100의 복귀돌연변이 원수를 나타낸 도이다.
도 10은 괴화와 대사 활성계로 작용하는 피칼라제, 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체를 따로 또는 함께 처리하였을 때, S. typhimurium TA102의 복귀돌연변이 원수를 나타낸 도이다.
도 11은 괴화와 대사 활성계로 작용하는 피칼라제, 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체를 따로 또는 함께 처리하였을 때, S. typhimurium TA1535의 복귀돌연변이 원수를 나타낸 도이다.
도 12는 괴화와 대사 활성계로 작용하는 피칼라제, 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체를 따로 또는 함께 처리하였을 때, S. typhimurium TA1537의 복귀돌연변이 원수를 나타낸 도이다.
도 13은 선별된 균주들을 1:1:1:1로 혼합하여 제조한 장내 미생물 효소복합체및 피칼라제의 효소활성을 비교한 결과를 나타낸 도이다. 1 is a diagram showing the measurement of enzyme activity according to the change of time when the fecal enzyme (fecalase) stored at 4 ℃ state:
x-axis: storage day; and
y-axis: enzyme activity.
FIG. 2 shows β-xylosidase, β-glucuronidase, β-glucuronidase, α-rhamnosidase and β-glucosidase. Figure shows the enzyme activity measurement for each relevant substrate according to the storage method:
x-axis: storage day; and
y-axis: enzyme activity.
Figure 3 is the blood color claim (fecalase), intestinal microbial enzyme complex when the complex and S9 were treated separately or together, S. typhimurium (S. typhimurium) reverse mutation of TA98 raw water that acts routine (Rutin) and metabolic activity to step Is shown:
NC: negative control;
M: routine processing group;
M + EM: group treated with routine and enteric microbial enzyme complexes together;
M + S9: group treated with Rutin and S9 complex together;
M + EM + S9: group treated with Rutin, enteric microbial enzyme complex and S9 complex together;
M + F: group treated with routine and picalase; and
M + F + S9: group treated with Rutin, Picalase and S9 complex together.
Figure 4 is a diagram showing the reverted mutated raw water of S. typhimurium TA100 when treated separately or together with the picalase, intestinal microbial enzyme complex and S9 complex acting as a routine and metabolic active system.
Figure 5 is a diagram showing the raw back mutations of S. typhimurium TA102 when treated separately or together with the picalase, intestinal microbial enzyme complex and S9 complex acting as a routine and metabolic active system.
Figure 6 is a diagram showing the return mutation of S. typhimurium TA1535 when treated separately or together with the picalase, enteric microbial enzyme complex and S9 complex that acts as a routine and metabolic active system.
Figure 7 is a diagram showing the reverted mutant raw water of S. typhimurium TA1537 when treated separately or together with the picalase, intestinal microbial enzyme complex and S9 complex acting as a routine and metabolic active system.
Figure 8 is a diagram showing the reverted mutant raw water of S. typhimurium TA98 when treated with Sophorae Flos and picalase, enteric microbial enzyme complex and S9 complex that acts as a metabolic active system separately or together.
Figure 9 is a diagram showing the raw back mutation of S. typhimurium TA100 when treated separately or together with the picalase, intestinal microbial enzyme complex and S9 complex that acts as a metabolic and metabolic active system.
Figure 10 is a diagram showing the reverted mutant water of S. typhimurium TA102 when treated separately or together with picalase, intestinal microbial enzyme complex and S9 complex that acts as a metabolic and metabolic active system.
Figure 11 is a diagram showing the reverted mutant water of S. typhimurium TA1535 when treated separately or together with picalase, intestinal microbial enzyme complex and S9 complex that acts as a metabolic and metabolic active system.
Figure 12 is a diagram showing the reverted mutant raw water of S. typhimurium TA1537 when treated separately or together with picalase, intestinal microbial enzyme complex and S9 complex that acts as a metabolic and metabolic active system.
Figure 13 is a diagram showing the results of comparing the enzyme activity of the intestinal microbial enzyme complex and picalase prepared by mixing the selected strains 1: 1: 1: 1.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
Hereinafter, terms used in the present invention will be described.
본 발명에서 사용되는 용어“대사 활성계”란 인체 내의 간장 대사계 및 소화관내 대사계를 의미하며, 각 대사계에 대해 시험관 내에서 의약품 또는 식품성분 등의 독성 평가 또는 생리활성 평가를 위해 사용되는 대사 활성계로서 간장 대사계를 대신해서는 S9 복합체가 있고, 소화관내 대사계를 대신해서는 피칼라제(fecalase)가 있다. 시험물질에 따라 간장 대사계 및 소화관내 대사계에 의한 분해 정도, 활성화 정도가 상이하며, 대사 활성계에 의해 독성이 발생하는 경우도 있다.
The term "metabolic active system" used in the present invention means the liver metabolic system and the digestive tract metabolic system in the human body, and for each metabolic system used for evaluating toxicity or physiological activity of drugs or food ingredients in vitro. As a metabolic activity system, there is an S9 complex in place of the hepatic metabolic system, and a pecalase in place of the metabolic system in the digestive tract. Depending on the test substance, the degree of degradation and activation by the hepatic metabolic system and the digestive tract is different and the toxicity may be generated by the metabolic activity system.
본 발명에서 사용되는 용어 “장내 미생물 복합체(intestinal microbial enzyme mixture, enzyme mix)”란 인간의 분변에서 분리하고 동정한 메가스페라 엘스데니(Megasphaera elsdenii), 파라박테로이즈 디스타소니스(Parabacteroides distasonis), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 및 유박테리움 렉테일(Eubacterium rectale)을 1:1:1:1의 비율로 포함할 수 있다. 상기 복합체는 p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드(p-nitrophenyl-β-D-glucuronide), p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside), 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드(nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside) 및 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)에 대해 기질 활성을 가지며 소화관내 대사계로서 작용하는 것을 특징으로 하는 조성물이다.
The term "intestinal microbial enzyme mixture (enzyme mix)" used in the present invention is Megasphaera isolated and identified from human feces. elsdenii ), Parabacteroides distasonis , Klebsiella pneumoniae ) and Eubacterium rectale may be included in a ratio of 1: 1: 1: 1. The complex is p-nitrophenyl-β-D-glucuronide (p-nitrophenyl-β-D-glucuronide), p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside (p-nitrophenyl-β -D-xylopyranoside), nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside and p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (p-nitrophenyl-β-D -glucopyranoside) has a substrate activity and acts as a metabolic system in the digestive tract.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은, 메가스페라 엘스데니, 파라박테로이즈 디스타소니스, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일을 1:1:1:1의 비율로 포함하는 장내 미생물 효소복합체를 제공한다.The present invention provides an intestinal microbial enzyme complex comprising megaspera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and eubacterium rectail in a ratio of 1: 1: 1: 1. do.
상기 메가스페라 엘스데니, 파라박테로이즈 디스타소니스, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일은 인간 분변으로부터 분리된 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다.The megaspera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and yubacterium rectail is characterized in that it is separated from human feces, but is not limited thereto.
상기 장내 미생물 복합체는 p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드, p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드, 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드 및 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기질에 대해 효소 활성을 갖는 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다. The intestinal microbial complexes include p-nitrophenyl-β-D-glucuronide, p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, nitrophenyl-α-L-rhampyranoranoside and p It is characterized by having an enzyme activity against any one or more substrates selected from the group consisting of nitrophenyl-β-D-glucopyranoside, but not limited thereto.
상기 메가스페라 엘스데니, 파라박테로이즈 디스타소니스, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일은The megasfera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and yubacterium rectail
1) 인간의 분변 시료를 배양하여 균주를 수득하는 단계; 및1) culturing a human fecal sample to obtain a strain; And
2) 상기 단계 1)에서 수득한 균주로부터 p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드, p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드, 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드 및 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기질에 대한 효소 활성을 나타내는 균주를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 분리된 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다.2) p-nitrophenyl-β-D-glucolonide, p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, nitrophenyl-α-L- from the strain obtained in step 1) Isolating by a method comprising the step of selecting a strain that exhibits enzymatic activity against any one or more substrates selected from the group consisting of rhamnopyranoside and p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside. One, but not limited to.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 메가스페라 엘스데니, 파라박테로이즈 디스타소니스, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일을 각각 배양하는 단계;1) culturing megagaspera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and eubacterium rectail, respectively;
2) 상기 단계 1)의 배양물을 초음파 분리하여 상등액을 수득하는 단계;및2) ultrasonically separating the culture of step 1) to obtain a supernatant; and
3) 상기 단계 2)에서 수득한 메가스페라 엘스데니, 파라박테로이즈 디스타소니스, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일의 상등액을 각각 1:1:1:1의 비율로 혼합하는 단계를 포함하는 장내 미생물 효소복합체의 제조방법을 제공한다. 3) The supernatant of the megaspera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and eubacterium rectail obtained in the step 2) were respectively 1: 1: 1: 1. It provides a method for producing an intestinal microbial enzyme complex comprising the step of mixing.
상기 단계 1)에서 메가스페라 엘스데니 및 파라박테로이즈 디스타소니스는 35 ~ 39℃에서 10 ~ 14시간 배양하고, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일은 35 ~ 39℃에서 22 ~ 26시간 배양하는 것이 바람직하고, 상기 메가스페라 엘스데니 및 파라박테로이즈 디스타소니스는 37℃에서 12시간 배양하고, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일은 37℃에서 24시간 배양하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.In step 1), the megaspera elsdeni and parabacteroids distasonis were incubated at 35 to 39 ° C for 10 to 14 hours, and the Klebsiella pneumoniae and yubacterium rectail were 22 to 35 to 39 ° C. It is preferable to incubate for ~ 26 hours, the megaspera elsdeni and parabacteroids distasonis incubated for 12 hours at 37 ℃, Klebsiella pneumoniae and yubacterium rectail 24 hours at 37 ℃ Cultivation is most preferred but not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 분변의 효소에 대한 활성을 측정하고자, 건강한 성인의 신선한 분변을 채취하여 희석된 분변 추출물에 해당 기질을 첨가하여 효소의 활성을 측정하였다. 결과적으로, 100인의 분변 평균 효소활성은 개개인 사이에 상당한 차이를 보였으나 남녀간 및 나이에 따른 차이를 보이지는 않았다. In a specific embodiment of the present invention, in order to measure the activity of the fecal enzyme, fresh feces from healthy adults were collected and the activity of the enzyme was measured by adding the substrate to the diluted fecal extract. As a result, the fecal mean enzyme activity of 100 persons showed a significant difference between individuals, but not between men and women and age.
장내 미생물을 분리 및 동정하기 위해 분변을 희석하고, 희석된 용액을 배양하였다. 배양된 균주에, 기질인 p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드, p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드, 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드 및 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드를 처리하여 상기 기질들 중 한 개 이상의 효소 활성이 0.5 μmol/min/mg 이상인 균주를 선별하고, 선별균의 염색체(chromosomal) DNA를 추출하고, 원핵생물 16S RNA 보편적 프라이머(universal primer)로 PCR을 실시하고 서열분석하였으며, NCBI Blast검색으로 균주를 동정하였다. 동정한 균주에서 p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드 효소활성이 우수했던 균주는 메가스페라 엘스데니였고, 팔미타제(Palmitase) 및 스테아라제(stearase) 효소활성이 우수한 균주는 파라박테로이즈 디스타소니스, p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드 효소활성이 우수했던 균주는 클렙시엘라 뉴모니애, p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드 효소활성이 우수했던 균주는 유박테리움 렉테일이었다.Fecal was diluted to isolate and identify intestinal microorganisms and the diluted solution was incubated. In cultured strains, substrates were p-nitrophenyl-β-D-glucuronide, p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, nitrophenyl-α-L-lamnopyranoside And p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside to treat strains having one or more enzyme activities of at least 0.5 μmol / min / mg, and extracting the chromosomal DNA of the selected bacteria. PCR was performed using prokaryotic 16S RNA universal primers and sequenced, and strains were identified by NCBI Blast search. In the identified strains, the strain having excellent p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside enzyme activity was megaspera elsdeni, and the strain having excellent palmitase and stearase enzyme activities. P. nitrophenyl-β-D-glucopyranoside enzymes were the most active strains of Klebsiella pneumoniae, p-nitrophenyl-β-D-glucer. The strain that had excellent ronide enzyme activity was Eubacterium rectail.
상기 균주를 배양하여 효소활성이 가장 높은 시간을 측정하였다. 측정한 결과를 기초로 하여 메가스페라 엘스데니 및 파라박테로이즈 디스타소니스 균주는 37℃에서 12 시간 배양하였고, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일 균주는 37℃에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 각각의 상기 균주를 집균하고 배지를 제거한 균체는 무게를 측정한 후, 각 균체에 혐기성 희석액을 넣어 현탁액을 만들고 현탁액을 초음파 처리하였다. 초음파 처리한 상등액을 원심분리한 후 상등액만 수집하였다. 수집된 상등액을 메가스페라 엘스데니 : 파라박테로이즈 디스타소니스 : 클렙시엘라 뉴모니애 : 유박테리움 렉테일 = 1:1:1:1로 섞은 후 0.2 ㎛ 셀룰로스(cellulose) 필터로 여과 멸균한 액을 장내 미생물 효소복합체 (enzyme mix)로 사용하였다. 그 결과, 상기 장내 미생물 효소복합체는 p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드, p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드, 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드 및 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드의 기질을 사용했을 때 모두 0.1 μmol/min/mg 이상인 것을 확인하였다. 또한, 기존의 분변효소액으로 잘 알려진 피칼라제를 4℃ 상태에서 보관하였을 때 시간의 변화에 따른 효소활성을 측정한 결과, β-자일로시다제(β-Xylosidase), β-글루커로니다제(β-Glucuronidase), α-람노시다제(α-Rhamnosidase) 및 β-글루코시다제(β-Glucosidase)의 경우 2주일 내에 효소활성이 현저히 저하되는 것을 확인하였으나(도 1 참조), 본 발명의 장내 미생물 효소복합체의 경우, β-자일로시다제, β-글루커로니다제, α-람노시다제 및 β-글루코시다제의 각 해당 기질에 대한 효소활성을 4℃, -20℃, 10% 글리세롤(glycerol), -80℃ 또는 동결건조 조건에서 확인하였을 때, β-자일로시다제 및 β-글루커로니다제는 온도조건과 10% 글리세롤조건에 관계없이 효소 활성이 일정하였고, α-람노시다제 및 β-글루코시다제의 경우 조건에 따라 효소 활성이 급격히 변하는 것을 확인하였다. 가장 안정한 조건은 동결건조하여 보관하는 조건이었다(도 2 참조). 또한, 장내 미생물 효소복합체 및 피칼라제(fecalase)의 활성을 비교하였을 때, β-글루커로니다제, β-자일로파이라노시다제, α-람노파이라노시다제, 아릴설파타제(Arylsulfatase) 및 β-글루코파이라노시다제에 대해 서로 유사한 활성을 보이는 것을 확인하였다(도 13 참조). The strain was cultured to determine the highest enzyme activity time. On the basis of the measured results, the Megagasella elsdeni and Parabacteroids distasonis strains were incubated at 37 ° C for 12 hours, and the Klebsiella pneumoniae and Eubacterium rectail strains at 37 ° C for 24 hours. Incubated. After incubation, each of the above strains was collected and the cells removed from the medium were weighed, and each cell was added with an anaerobic diluent to make a suspension, and the suspension was sonicated. The supernatant sonicated was centrifuged and only the supernatant was collected. The collected supernatant was mixed with Megasfera elsdeni: Parabacteroids distasonis: Klebsiella pneumoniae: Eubacterium lectile = 1: 1: 1: 1, and then mixed with a 0.2 μm cellulose filter. Filtration sterilized solution was used as enteric microbial enzyme complex (enzyme mix). As a result, the enteric microbial enzyme complex is p-nitrophenyl-β-D-glucolonide, p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, nitrophenyl-α-L-lamnopa When the substrates of iranoside and p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside were used, it was confirmed that both were 0.1 μmol / min / mg or more. In addition, as a result of measuring enzyme activity over time when picalase, well known as a fecal enzyme solution, was stored at 4 ° C., β-Xylosidase and β-gluker were found. In the case of (β-Glucuronidase), α-Rhamnosidase and β-glucosidase (β-Glucosidase), the enzyme activity was significantly reduced within 2 weeks (see FIG. 1). In the intestinal microbial enzyme complex, the enzyme activities of β-xylosidase, β-glucuronidase, α-lamnosidase and β-glucosidase on the respective substrates were 4 ° C, -20 ° C, When confirmed at 10% glycerol, -80 ° C or lyophilized conditions, β-xylosidase and β-glucuronidase had constant enzyme activity regardless of temperature and 10% glycerol conditions. In the case of α-lamnosidase and β-glucosidase, the enzyme activity changes rapidly depending on the conditions. It was cut. The most stable condition was lyophilized storage (see Fig. 2). In addition, when comparing the activity of the intestinal microbial enzyme complex and pecalase, β-glucuronidase, β-xylopyranosidase, α-lamnopyranosidase, and arylsulfatase ) And β-glucopyranosidase showed similar activity to each other (see FIG. 13).
에임즈 시험법에 상기 장내 미생물 효소복합체를 소화관내 대사계로 적용하였을 때, 피칼라제를 소화관내 대사계로 적용한 경우와 마찬가지로 돌연변이원으로 쓰인 시료 루틴 및 괴화에 대하여 S . typhimurium 균주에서 복귀돌연변이원수가 유의적으로 증가하였다(도8 내지 도12 참조).When the intestinal microbial enzyme complex was applied to the digestive tract metabolic system in the Ames test method, the sample routines and lumps used as mutagens in the same manner as the case where picalase was applied to the digestive tract metabolism S. typhimurium There was a significant increase in the number of back mutations in the strain (see Figures 8-12).
본 발명의 장내 미생물 효소복합체를 소화관내 대사계에 대한 대사 활성계로 이용하여, 유전독성 평가시험 또는 생리활성 평가에 적용할 수 있으므로, 상기 메가스페라 엘스데니, 파라박테로이즈 디스타소니스, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일 균주를 포함하는 장내 미생물은 장내 미생물 효소복합체로서 유용하게 사용할 수 있다.
Since the intestinal microbial enzyme complex of the present invention can be applied to genotoxicity evaluation test or physiological activity evaluation by using as a metabolic activity system for the digestive tract metabolic system, Intestinal microorganisms including Klebsiella pneumoniae and Eubacterium lectile strains can be usefully used as enteric microbial enzyme complexes.
또한, 본 발명은 상기 장내 미생물 효소복합체를 유효성분으로 포함하는 검체의 유전 독성 평가용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for evaluating the genotoxicity of a sample comprising the intestinal microbial enzyme complex as an active ingredient.
상기 유전 독성 평가는 시험관 내 염색체이상시험, 시험관 내 소핵시험, 쥐 임파종 분석, 시험관 내 포유류 세포 소핵시험, 코멧 분석, 포유류 정원세포 염색체 이상 분석, SOS 크로모테스트 및 복귀돌연변이 시험인 에임즈 시험법으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다The genotoxicity test is an in vitro chromosome aberration test, in vitro micronucleus test, mouse lymphoma analysis, in vitro mammalian cell micronucleus test, comet analysis, mammalian garden cell chromosome aberration analysis, SOS chromotest and reversion mutation test by Ames test. Characterized in that selected from the group consisting of, but not limited to
아울러, 본 발명은 상기 장내 미생물 효소복합체를 유효성분으로 포함하는 검체의 생리활성 평가용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for evaluating the biological activity of a sample comprising the intestinal microbial enzyme complex as an active ingredient.
상기 생리 활성 평가는 전자공여능 평가, SOD 유사 활성 평가, 아질산염 분해 작용 측정을 통한 항산화 활성 평가 및 항알러지 효과 평가로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다. The physiological activity evaluation is selected from the group consisting of electron donating ability evaluation, SOD-like activity evaluation, antioxidant activity evaluation through the measurement of nitrite decomposition activity and anti-allergic effect evaluation, but is not limited thereto.
상기 검체는 의약품 또는 식품인 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다. The sample is characterized in that the drug or food, but is not limited thereto.
상기 장내 미생물 효소 복합체는 소화관내 대사계로서 작용하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다. The intestinal microbial enzyme complex is characterized by acting as a metabolic system in the digestive tract, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 소화관내 대사계를 대신하여 기존에 사용되어왔던 분변 효소액(fecalase)를 제조하였다. 피칼라제, 장내 미생물 효소복합체 및 S9 복합체를 대사 활성계로 사용하여 살모넬라 타이피뮤리움(S. typhimurium) 균주의 복귀돌연변이원 수를 계수하였다. 구체적으로, 한약 및 식품의 성분인 루틴(Rutin) 또는 한약인 괴화(Sophorae Flos)에 대해 장내 미생물 효소복합체가 대사 활성계로 작용할 수 있는지 확인하기 위하여 루틴 또는 괴화를 분변으로부터 분리한 피칼라제, S9 복합체 및 장내 미생물 효소복합체를 따로 또는 함께 처리하여 S. typhimurium 균주의 복귀돌연변이원 수를 계수하였다. 그 결과, 상기 시료를 분변으로부터 분리한 피칼라제와 S9 복합체를 함께 처리하였을 때, 유의적으로 S. typhimurium TA98에서 복귀돌연변이원수가 유의적으로 증가하였고, 장내 미생물 효소복합체를 사용함에 따라서도 유의적으로 증가하였다(도3 내지 도12 참조). In a specific embodiment of the present invention, fecal enzyme liquid (fecalase) that has been used in the past was prepared in place of the metabolic system in the digestive tract. The number of back mutations in S. typhimurium strains was counted using picalase, enteric microbial enzyme complex and S9 complex as metabolic activity systems. Specifically, picalase, S9, isolated from feces, to determine whether the intestinal microbial enzyme complex can act as a metabolic activity against rutin, a component of Chinese medicine and food, or Sophorae Flos , a herb. The complex and enteric microbial enzyme complex were treated separately or together to count the number of back mutations in the S. typhimurium strain. As a result, when the sample was treated with picalase and S9 complexes isolated from feces, the number of mutants in S. typhimurium TA98 was significantly increased, and the intestinal microbial enzyme complex was also significantly increased. Increased (see FIGS. 3-12).
본 발명의 장내 미생물 효소복합체는 p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드, p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드, 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드 및 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드에 대해 기질 활성을 가지며, 에임즈 시험에 대사 활성계로 적용하였을 때, 기존에 소화관내 대사계로 사용되어 왔던 피칼라제를 적용했을 때와 유의적으로 복귀돌연변이원 수가 증가함을 확인하였으므로, 본 발명의 장내 미생물 효소복합체를 소화관내 대사계에 대한 대사 활성계로 이용하여, 유전독성 평가시험인 시험관 내 염색체이상시험, 시험관 내 소핵시험, 쥐 임파종 분석, 시험관 내 포유류 세포 소핵시험, 코멧 분석, 포유류 정원세포 염색체 이상 분석, SOS 크로모테스트 및 복귀돌연변이 시험인 에임즈 시험법 또는 생리 활성 평가인 전자공여능 평가, SOD 유사 활성 평가, 아질산염 분해 작용 측정을 통해 항산화 활성 평가 및 항알러지 효과 평가에 적용할 수 있다. Intestinal microbial enzyme complexes of the present invention include p-nitrophenyl-β-D-glucuronide, p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, nitrophenyl-α-L-lamnopyrano It has a substrate activity against the seed and p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside, and when applied to the Ames test as a metabolic activity system, and when applying a picalase that has been used as a metabolic system in the digestive tract, Since it was confirmed that the number of reverse mutations significantly increased, using the intestinal microbial enzyme complex of the present invention as a metabolic activity system for the digestive tract, in vitro chromosomal aberration test, in vitro micronucleus test, rat Lymphoma analysis, in vitro mammalian cell micronucleus test, comet analysis, mammalian garden cell chromosomal aberration analysis, SOS chromotest and reversion mutation test, Ames test or physiological activity evaluation It can be applied to evaluate the antioxidant activity and anti-allergic effect evaluated by the SOD-like activity evaluation, nitrite disintegration measurements.
따라서, 상기 메가스페라 엘스데니, 파라박테로이즈 디스타소니스, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일 균주를 포함하는 장내 미생물은 장내 미생물 효소복합체는 검체의 유전독성평가용 또는 생리활성 평가용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.
Therefore, the intestinal microorganisms including the megaspera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and Eubacterium rectail strains, the intestinal microbial enzyme complexes for the genotoxicity assessment or physiology of the sample It can be usefully used as a composition for activity evaluation.
이하, 본 발명은 하기의 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples.
단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are merely to illustrate the content of the present invention is not limited to the scope of the invention.
<< 실시예Example 1> 1> 분변효소Fecal enzyme 제조 및 활성 측정 Manufacture and activity measurement
분변의 효소에 대한 활성을 측정하고자, 건강한 성인의 신선한 분변 1~10 g 이상 채취하여 4℃상태에서 신속하게 3배의 혐기성 희석액을 넣어 현탁액을 만든다. 혐기성 배지 희석액의 조성은 다음과 같다.To measure the activity of enzymes in feces, 1 ~ 10 g of fresh feces from healthy adults are collected and rapidly added 3 times anaerobic dilution at 4 ° C to form a suspension. The composition of the anaerobic medium dilution is as follows.
분변시료 현탁액을 500×g에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 추출한 후 상등액을 1분 간격으로 10회 초음파처리 하였다. 초음파처리 현탁액을 10,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 상등액 추출하였다.The fecal sample suspension was centrifuged at 500 × g for 10 minutes, the supernatant was extracted, and the supernatant was sonicated 10 times at 1 minute intervals. The sonicated suspension was centrifuged at 10,000 x g for 10 minutes to extract the supernatant.
희석된 분변 추출물에 β-글루커로니다제(β-glucuronidase), α-아라비노파이라노시다제(α-arabinopyranosidase), β-갈락토파이라노시다제(β-galactopyranosidase), β-자일로파이라노시다제(β-xylopyranosidase), Β-glucuronidase, α-arabinopyranosidase, β-galactopyranosidase, β-xylopy in diluted fecal extract Ranosidase (β-xylopyranosidase),
리파제(팔미타제)(lipase(palmitase)), 리파제(스테아라타제)(lipase(stearatase)), β-아라비노파이라노시다제(β-arabinopyranosidase), β-셀로비오시다제(β-cellobiosidase), α-퍼코파이라노시다제(α-fucopyranosidase), β-퍼코파이라노시다제(β-fucopyranosidase), β-말토시다제(β-maltosidase), α-람노시다제(α-rhamnosidase), N-아세틸-α-갈락토스아미다제(N-acetyl-α-galactosamidase), N-아세틸-β-갈락토스아미다제(N-acetyl-β-galactosamidase), N-아세틸-β-글루코스아미다제(N-acetylβ-glucosamidase), α-아라빈퍼라노시다제(α-arabinfuranosidase), α-갈락토파이라노시다제(α-galactopyranosidase), α-자일로파이라노시다제(α-xylopyranosidase), β-만노파이라노시다제(β-mannopyranosidase), 설파제(Sulfatase) 및 β-글루코파이라노시다제(β-glucopyranosidase)에 해당하는 기질을 첨가하여 효소의 활성을 측정하였다. 결과적으로, 100인의 분변 평균 효소활성은 개개인 사이에 상당한 차이를 보였으나 남녀간 및 나이에 따른 차이를 보이지는 않았다.
Lipase (palmitase), lipase (stearatase), β-arabinopyranosidase, β-cellobiosidase, α-fucopyranosidase, β-fucopyranosidase, β-maltosidase, α-rhamnosidase, N- N-acetyl-α-galactosamidase, N-acetyl-β-galactosamidase, N-acetyl-β-glucosamidase (N-acetylβ- glucosamidase), α-arabinfuranosidase, α-galactopyranosidase, α-xylopyranosidase, β-mannopyrano The activity of the enzyme was measured by adding the substrates corresponding to beta-mannopyranosidase, sulfatase and beta-glucopyranosidase. As a result, the fecal mean enzyme activity of 100 persons showed a significant difference between individuals, but not between men and women and age.
<< 실시예Example 2> 장내 미생물( 2> intestinal microorganisms ( intestinalintestinal microorganismmicroorganism ) 동정 ) Sympathy
장내 미생물을 분리 및 동정하기 위해 건강한 성인 신선한 분변 1~10 g 이상 채취하여 신속하게 2~20배의 희석용 혐기성배지로 10-5, 10-6 또는 10- 7 의 농도로 희석하였다. 희석된 용액을 GAM(Gifu anaerobic medium) 배지, 혈액함유 GAM 배지, 혈액첨가 BL(Glucose-blood liver agar) 배지, TS(tryptic soy) 배지에 접종하고 TS 배지는 호기적 조건에서 24시간 배양하고, 나머지 배지는 혐기적 조건에서 72시간 배양하였다. 배양된 균주를 각 평판배지에서 10개씩 선택하여 혈청함유 반유동 GAM 배지에 이식하여 보관하였다. 기질인 p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드, p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드, 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드 및 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드를 사용하여 상기 기질들 중 한 개 이상의 효소 활성이 0.5 μmol/min/mg 이상인 균주를 선별하고 그람 염색하였다. 이어서 선별균의 염색체(chromosomal) DNA를 추출하고, 원핵생물 16S RNA 보편적 프라이머(universal primer)로 PCR를 실시하고 서열분석하였으며, NCBI Blast검색으로 균주를 동정하였다. Adult healthy in order to separate and identify the intestinal microflora fresh fecal 1 ~ 10 g taken quickly from 2 to 20
동정한 균주에서 p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드 효소활성이 우수했던 균주는 메가스페라 엘스데니였고, 팔미타제(Palmitase) 및 스테아라제(stearase) 효소활성이 우수한 균주는 파라박테로이즈 디스타소니스, p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드 효소활성이 우수했던 균주는 클렙시엘라 뉴모니애, p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드 효소활성이 우수했던 균주는 유박테리움 렉테일이었다.
In the identified strains, the strain having excellent p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside enzyme activity was megaspera elsdeni, and the strain having excellent palmitase and stearase enzyme activities. P. nitrophenyl-β-D-glucopyranoside enzymes were the most active strains of Klebsiella pneumoniae, p-nitrophenyl-β-D-glucer. The strain that had excellent ronide enzyme activity was Eubacterium rectail.
<< 실시예Example 3> 장내 미생물 효소복합체 ( 3> intestinal microbial enzyme complex ( intestinalintestinal microbialmicrobial enzymeenzyme mixturemixture , enayme , enayme mixmix )의 제조Manufacturing
상기 <실시예 1> 에서 분리된 각각의 균주를 배양하여 효소활성이 가장 높은 시간을 측정하였다. 측정한 결과를 기초로 하여 메가스페라 엘스데니 및 파라박테로이즈 디스타소니스 균주는 37℃에서 12 시간 배양하였고, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일 균주는 37℃에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 각각의 상기 균주를 4℃에서 8000 × g 로 30분간 집균하고 배지를 제거한 균체는 무게를 측정한 후 사용전까지 -80℃에서 보관하였다. 각 균체 1 g에 혐기성 희석액 9 ml를 넣어 현탁액을 만들고 현탁액을 1분 간격으로 10회 초음파 처리하였다. 초음파 처리한 상등액을 10,000 × g에서 20분간 원심분리한 후 상등액만 수집하였다. 수집된 상등액을 메가스페라 엘스데니 : 파라박테로이즈 디스타소니스 : 클렙시엘라 뉴모니애 : 유박테리움 렉테일 = 1:1:1:1로 섞은 후 0.2 ㎛ 셀룰로스(cellulose) 필터로 여과 멸균한 액을 장내 미생물 효소복합체 (enzyme mix)로 사용하였다. Each strain isolated in <Example 1> was cultured to determine the highest enzyme activity time. On the basis of the measured results, the Megagasella elsdeni and Parabacteroids distasonis strains were incubated at 37 ° C for 12 hours, and the Klebsiella pneumoniae and Eubacterium rectail strains at 37 ° C for 24 hours. Incubated. After incubation, each of the above strains was collected at 4 ° C. at 8000 × g for 30 minutes, and the cells removed from the medium were weighed and stored at −80 ° C. until use. 1 g of each cell was added with 9 ml of anaerobic dilution to make a suspension, and the suspension was sonicated 10 times at 1 minute intervals. The supernatant sonicated was centrifuged at 10,000 x g for 20 minutes and only the supernatant was collected. The collected supernatant was mixed with Megasfera elsdeni: Parabacteroids distasonis: Klebsiella pneumoniae: Eubacterium lectile = 1: 1: 1: 1, and then mixed with a 0.2 μm cellulose filter. Filtration sterilized solution was used as enteric microbial enzyme complex (enzyme mix).
그 결과, 상기 장내 미생물 효소복합체는 p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드, p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드, 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드 및 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드의 기질을 사용했을 때 모두 0.1 μmol/min/mg 이상인 것을 확인하였다. 또한, β-자일로시다제(β-Xylosidase), β-글루커로니다제(β-Glucuronidase), α-람노시다제(α-Rhamnosidase) 및 β-글루코시다제(β-Glucosidase)의 각 해당 기질에 대한 효소활성을 4℃, -20℃, 10% 글리세롤(glycerol), -80℃ 또는 동결건조 조건에서 확인하였을 때, β-자일로시다제 및 β-글루코시다제는 온도조건과 10% 글리세롤조건에 관계없이 효소 활성이 일정하였으나, β-글루커로니다제 및 α-람노시다제의 경우 조건에 따라 효소 활성이 급격히 변하는 것을 확인하였다. 가장 안정한 조건은 동결건조하여 보관하는 조건이었다(도 2). 또한, 장내 미생물 효소복합체 및 피칼라제(fecalase)의 활성을 비교하였을 때, β-글루커로니다제, β-자일로파이라노시다제, α-람노파이라노시다제, 아릴설파제(Arylsulfatase) 및 β-글루코파이라노시다제에 대해 유사한 활성을 보이는 것을 확인하였다(도 13).
As a result, the enteric microbial enzyme complex is p-nitrophenyl-β-D-glucolonide, p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, nitrophenyl-α-L-lamnopa When the substrates of iranoside and p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside were used, it was confirmed that both were 0.1 μmol / min / mg or more. In addition, β-Xylosidase, β-glucuronidase, β-Glucuronidase, α-Rhamnosidase and β-glucosidase, respectively When the enzyme activity on the substrate was confirmed at 4 ° C, -20 ° C, 10% glycerol, -80 ° C, or lyophilized conditions, β-xylosidase and β-glucosidase were determined to Although enzyme activity was constant regardless of% glycerol conditions, it was confirmed that the enzyme activity rapidly changed depending on the conditions of β-glucuronidase and α-lamnosidase. The most stable conditions were those stored in lyophilized (Fig. 2). In addition, when comparing the activity of the intestinal microbial enzyme complex and pecalase, β-glucuronidase, β-xylopyranosidase, α-lamnopyranosidase, and arylsulfatase And it was confirmed that showing similar activity for β-glucopyranosidase (Fig. 13).
<< 비교예Comparative example 1> 1> 피칼라제Picalase 제조 Produce
건강한 성인 분변 10 g 이상 채취하여 질소가스를 채워 냉장(4℃)로 신속하게 운반한다. 분변 무게 3배 혐기성 배지 희석액을 넣어 현탁액을 만든 후 500 × g 에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 수득하였다. 혐기성 배지 희석액의 조성은 상기 표 1과 같다.Collect more than 10 g of healthy adult feces and fill it with nitrogen gas and quickly deliver it to refrigeration (4 ° C). Fecal weight 3-fold anaerobic medium diluent was added to form a suspension, followed by centrifugation at 500 x g for 10 minutes to obtain a supernatant. The composition of the anaerobic medium dilution is shown in Table 1 above.
상등액을 1분 간격으로 10회 초음파처리한 후, 초음파처리 현탁액을 10,000 × g에서 10분간 원심분리하여 상등액 5 ㎖을 취한 후 세파크릴 S-300 컬럼 크로 마토그래피(Sephacryl S-300 column chromatography(2 ×10 cm))를 하여 분획을 수집하였다. 이 때의 분획량은 1.5 ㎖이다. 각 분획에 대해, 기질인 p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드(p-nitrophenyl-β-D-glucuronide), p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside), 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드(nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside) 및 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)을 사용하여 효소활성을 측정하였다. 상기 네 가지 기질에 대해 0.1 μmol/min/mg 이상의 값을 나타내는 두 개의 분획을 모아 0.2 ㎛ 필터로 여과멸균하여 얻은 액을 분변 효소액(fecalase)으로 사용하였다.After the supernatant was sonicated 10 times at 1 minute intervals, the sonicated suspension was centrifuged at 10,000 x g for 10 minutes to take 5 ml of the supernatant, followed by Sephacryl S-300 column chromatography (2). Fractions were collected. The fraction amount at this time is 1.5 ml. For each fraction, p-nitrophenyl-β-D-glucuronide, p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside (p) -nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside and p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (p-nitrophenyl -β-D-glucopyranoside) was used to measure the enzyme activity. Two fractions having a value of 0.1 μmol / min / mg or more for the four substrates were collected and filtered and sterilized with a 0.2 μm filter to use fecal enzyme solution.
그 결과, 피칼라제를 4℃상태에서 보관하였을 때 시간의 변화에 따른 효소활성을 측정 한 결과, β-글루커로니다제, β-자일로파이라노시다제, α-람노파이라노시다제 및 β-글루코파이라노시다제의 경우 시간이 지남에 따라 효소 활성이 현저히 저하되는 것을 확인하였다(도 1).
As a result, when the enzyme was stored at 4 ° C., the enzyme activity was measured according to the time change. As a result, β-glucuronidase, β-xylopyranosidase, and α-lamnopyranosidase were observed. And β-glucopyranosidase, it was confirmed that the enzyme activity is significantly reduced over time (Fig. 1).
<< 실시예Example 4> 4> 에임즈Ames 시험법 Test method
효소 활성 측정 후에 기준에 적합한 피칼라제 또는 상기 장내 미생물 효소복합체를 이용하여 살모넬라 타이피뮤리움(S. typhimurium) TA98, TA100, TA102, TA1535 및 TA1537 균주에 대해 에임즈 시험을 실시하였다. 구체적으로, pKM101 플라스미드를 가지고 있는 S. typhimurium 균주 (TA98, 100 및 102)는 앰피실린(ampicillin)을 25 ㎍/㎖를 포함하는 멸균 영양 브로스(nutrient broth)에서 배양하였고, pAQ1 플라스미드를 가지는 S. typhimurium 균주(TA102)는 테트라사이클린(tetracycline) 2 ㎍/㎖을 포함하는 멸균 영양 브로스에서 배양하였다. R-플라스미드를 가지지 않는 S. typhimurium 균주(TA 1535 및 TA1537)는 항생제를 포함하지 않는 멸균 영양 브로스에서 배양하였다. 배지 10 ㎖에 동결 보관하였던 균주 10 ㎕를 접종하고, 접종 후 37℃ 에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양시간은 각 균주의 생장속도에 맞추어 TA100은 10~12시간, TA102 및 TA1535은 12~16시간, TA98 및 TA1537은 14~16 시간 배양하였다. 시험관(5 ㎖)을 45℃의 항온수조에서 10분간 예열시킨 후 탑 아가(top agar) 2 ㎖를 넣었고, 0.5 mM L-히스티딘·HCl(L-histidine·HCl) 및 0.5 mM 비오틴(biotin) 용액을 각각 0.2 ㎖씩 넣었다. 상기 배양된 S. typhimurium TA98 또는 TA100, TA102, TA1535 및 TA1537의 세균현탁액 0.1 ㎖에 시료인 루틴 또는 괴화(Sophorae Flos)를 첨가하고, S9 복합체 0.5 ㎖ 및 피칼라제(fecalase) 0.5 ㎖, 또는 S9 복합체 0.5 ㎖ 및 장내 미생물 효소복합체 0.5 ㎖을 첨가하여 아가가 고루 섞이도록 잘 흔들어 주었다. 상기 제작된 Vogel-Bonner 한천평판배지 위에 배양혼합액을 부어 넣고 고루 퍼지도록 하였다. 접종된 평판배지는 37℃에서 48시간 배양한 후 집락(colony)을 계수하였다. After enzyme activity measurement, Salmonella typhimurium ( S. typhimurium ) using a suitable picalase or the intestinal microbial enzyme complex The Ames test was performed on the TA98, TA100, TA102, TA1535 and TA1537 strains. Specifically, S. typhimurium strains (TA98, 100 and 102) with pKM101 plasmid were cultured in sterile nutrient broth containing 25 μg / ml ampicillin, and S. typhimurium strains with pAQ1 plasmid . typhimurium Strain (TA102) was incubated in sterile nutrient broth containing 2 μg / ml tetratracycline. S. typhimurium without R-plasmid Strains (TA 1535 and TA1537) were incubated in sterile nutrient broth containing no antibiotics. 10 μl of the strain that was stored frozen in 10 ml of the medium was inoculated, followed by shaking culture at 150 ° C. at 37 ° C. after inoculation. Incubation time was incubated for 10 to 12 hours for TA100, 12 to 16 hours for TA102 and TA1535, and 14 to 16 hours for TA98 and TA1537 according to the growth rate of each strain. After preheating the test tube (5 ml) for 10 minutes in a 45 ° C. water bath, 2 ml of top agar was added, and 0.5 mM L-histidine-HCl and 0.5 mM biotin solution. 0.2 ml each. The cultured S. typhimurium Rutin or Sophorae as a sample in 0.1 ml of bacterial suspension of TA98 or TA100, TA102, TA1535 and TA1537 Flos ) was added, and 0.5 ml of the S9 complex and 0.5 ml of the pecalase, or 0.5 ml of the S9 complex and 0.5 ml of the intestinal microbial enzyme complex were added to shake the agar well. The culture mixture was poured onto the prepared Vogel-Bonner agar plate medium to spread evenly. The inoculated plate medium was incubated at 37 ° C. for 48 hours to count colonies.
그 결과, 한약 및 식품의 성분인 루틴은 쿼세틴(quercetin)을 투여한 경우와 같이 유의적으로 S. typhimurium TA98에서 복귀돌연변이원수가 유의적으로 증가하였고, 장내 미생물 효소복합체를 사용함에 따라서도 유의적으로 증가하였다(도3 내지 도7). 또한 괴화의 경우 피칼라제와 마찬가지로 장내 미생물 효소복합체를 사용함에 따라 복귀돌연변이원수가 유의적으로 증가하였다(도8 내지 도12). As a result, rutin, which is a component of Chinese medicine and food, increased significantly in S. typhimurium TA98 as in the case of quercetin administration, and also significantly in accordance with the use of intestinal microbial enzyme complex. Increased to (FIGS. 3-7). In addition, in the case of agglutination, as in the case of picalase, the use of intestinal microbial enzyme complexes significantly increased the number of return mutations (FIGS. 8 to 12).
Claims (13)
Megasphaera elsdenii ), Parabacteroides distasonis distasonis ), Klebsiella Intestinal microbial enzyme complex comprising pneumoniae ) and Eubacterium rectale in a ratio of 1: 1: 1: 1.
The method of claim 1, wherein the megaspera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and yubacterium rectail Intestinal microbial enzyme complex, characterized in that it is isolated from human feces.
According to claim 1, wherein said intestinal microbial complex is p-nitrophenyl-β-D-glucuronide (p-nitrophenyl-β-D-glucuronide), p-nitrophenyl-β-D-xylpy P-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside and p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside Intestinal microbial enzyme complex characterized in that it has an enzyme activity against any one or more substrates selected from the group consisting of (p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside).
1) 인간의 분변 시료를 배양하여 균주를 수득하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 수득한 균주로부터 p-나이트로페닐-β-D-글루커로니드, p-나이트로페닐-β-D-자일로파이라노시드, 나이트로페닐-α-L-람노파이라노시드 및 p-나이트로페닐-β-D-글루코파이라노시드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기질에 대한 효소 활성을 나타내는 균주를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 분리된 것을 특징으로 하는 장내 미생물 효소복합체.
The method of claim 1, wherein the megaspera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and yubacterium rectail
1) culturing a human fecal sample to obtain a strain; And
2) p-nitrophenyl-β-D-glucolonide, p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, nitrophenyl-α-L- from the strain obtained in step 1) Isolating by a method comprising the step of selecting a strain that exhibits enzymatic activity against any one or more substrates selected from the group consisting of rhamnopyranoside and p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside. Intestinal microbial enzyme complex.
2) 상기 단계 1)의 배양물을 초음파 분리하여 상등액을 수득하는 단계;및
3) 상기 단계 2)에서 수득한 메가스페라 엘스데니, 파라박테로이즈 디스타소니스, 클렙시엘라 뉴모니애 및 유박테리움 렉테일의 상등액을 각각 1:1:1:1의 비율로 혼합하는 단계를 포함하는 장내 미생물 효소복합체의 제조방법.
1) culturing megagaspera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and eubacterium rectail, respectively;
2) ultrasonically separating the culture of step 1) to obtain a supernatant; and
3) of megaspera elsdeni, parabacteroids distasonis, Klebsiella pneumoniae and eubacterium rectail obtained in step 2) Method for producing an intestinal microbial enzyme complex comprising mixing the supernatant in a ratio of 1: 1: 1: 1, respectively.
The method according to claim 5, wherein in step 1) the megagasella elsdeny and parabacteroids distasonis incubated for 10 to 14 hours at 35 ~ 39 ℃ , Klebsiella pneumoniae and yubacterium rectail is Method for producing an intestinal microbial enzyme complex, which is incubated for 22 to 26 hours at 35 ~ 39 ℃.
The method according to claim 6, wherein the megaspera elsdeni and parabacteroids distasonis incubated for 12 hours at 37 ℃ , Klebsiella pneumoniae and yubacterium rectail is incubated for 24 hours at 37 ℃ A method for producing an intestinal microbial enzyme complex.
Claim 1 composition for the evaluation of genotoxicity of a drug or food comprising the intestinal microbial enzyme complex as an active ingredient.
The method of claim 8, wherein the genotoxicity assessment is performed in vitro Chromosomal Aberration Assay, In vitro Micronucleus Assay, Mouse Lymphoma Assay (MLA), In vitro Mammalian Cells In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test, Comet Assay, Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Assay, SOS Chromotest, and Bacterial Reverse Test Mutation Test, Ames Test) composition for the evaluation of genotoxicity, characterized in that any one selected from the group consisting of.
Claim 1 microbial enzyme complex of the enteric microorganism complex as an active ingredient or composition for evaluation of biological activity of food.
The method of claim 10, wherein the evaluation of physiological activity consists of an electron donating ability evaluation, a superoxide dismutase (SOD) -like activity evaluation, an antioxidant activity evaluation through nitrite scavenging ability, and an antiallergic effect evaluation. The composition for evaluation of physiological activity, characterized in that any one selected from the group.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110084225A KR101261872B1 (en) | 2011-08-23 | 2011-08-23 | A intestinal microbial enzyme mixture and it's preparation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020110084225A KR101261872B1 (en) | 2011-08-23 | 2011-08-23 | A intestinal microbial enzyme mixture and it's preparation thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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