KR101258456B1 - Pharmaceutical composition comprising peptide having inhibitory activities against transendothelial migration of leucocytes and degranulation of mast cells - Google Patents

Abstract

본 발명은 막횡단 단백질의 일종인 allergin-1에서 유래한 펩타이드 단편, 즉 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 알레르기의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. The present invention provides a peptide fragment derived from allergin-1, a kind of transmembrane protein, that is, prevention of an inflammatory disease or allergy comprising a peptide consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a peptide consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient. Or it provides a pharmaceutical composition for treatment.

Description

백혈구의 혈관외유출 억제 활성 및 비만세포 탈과립 억제 활성을 갖는 펩타이드를 포함하는 약학 조성물{Pharmaceutical composition comprising peptide having inhibitory activities against transendothelial migration of leucocytes and degranulation of mast cells}Pharmaceutical composition comprising peptide having inhibitory activities against transendothelial migration of leucocytes and degranulation of mast cells}

본 발명은 allergin-1에서 유래한 펩타이드 단편(peptide fragment 또는 small peptide)을 포함하는 염증 질환 또는 알레르기의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 펩타이드는 백혈구의 혈관외유출 억제 활성 및 비만세포 탈과립 억제 활성을 갖는다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease or allergy, including a peptide fragment (small peptide or small peptide) derived from allergin-1. The peptide has an extravasation inhibitory activity and leukocyte degranulation inhibitory activity of leukocytes.

감염, 외상 등에 의해 손상된 조직의 구조와 기능을 복원하기 위한 생체의 방어 반응을 통칭하여 염증 반응이라 한다. 염증 부위로의 백혈구 세포의 이동(mobilization)은 감염에 대한 신속한 해결(resolution) 및 다양한 외상으로부터 발생하는 조직 손상을 복구하는데 중요하다. 그러나, 잘못되거나 지속적인 염증 반응은 인체 조직의 손상과 질환을 야기한다. 예를 들어, 염증 질환은 뇌척수막염, 장염, 피부염, 포도막염, 뇌염, 성인성 호흡곤란 증후군 등과 같이 세균이나 바이러스에 의한 감염이나, 외상, 자가면역질환과 장기이식 거부 등과 같은 비감염 요인에 의하여 발생한다. 염증 질환은 증상이나 병리학적 특징이 구분되는 급성 및 만성 염증 질환으로 분류된다. 알레르기나 세균과 바이러스의 감염과 같은 급성 염증의 국소적 증상은 혈류 및 혈관 크기의 변화, 혈관 투과성의 변화 및 백혈구의 침윤 등으로 나타난다. 이에 반하여 류마티스 관절염, 죽상 동맥경화증. 만성 신장염, 간경화증 등을 비롯한 만성 염증의 주요 병리학적 특징은 염증 유발 요인이 제거가 되지 않아 염증부위로 단핵구, 호중구, 림프구, 형질세포들이 지속적으로 침윤하는 것으로, 그 결과 염증 반응이 만성화된다.The protective response of the living body to restore the structure and function of tissues damaged by infection, trauma, etc. are collectively called an inflammatory response. Mobilization of leukocytes to the site of inflammation is important for rapid resolution of infection and repairing tissue damage resulting from various traumas. However, faulty or persistent inflammatory reactions cause damage and disease of human tissue. For example, inflammatory diseases are caused by bacterial or viral infections such as meningitis, enteritis, dermatitis, uveitis, encephalitis, adult respiratory distress syndrome, or non-infectious factors such as trauma, autoimmune diseases, and organ transplant rejection. Inflammatory diseases are classified into acute and chronic inflammatory diseases in which symptoms or pathological features are distinguished. Local symptoms of acute inflammation, such as allergies or bacterial and viral infections, are manifested by changes in blood flow and blood vessel size, changes in vascular permeability, and infiltration of white blood cells. In contrast, rheumatoid arthritis, atherosclerosis. The main pathological features of chronic inflammation, including chronic nephritis and cirrhosis, are the infiltration of monocytes, neutrophils, lymphocytes, and plasma cells into the site of inflammation, resulting in chronic inflammation.

염증 반응이 일어나기 위하여서는 백혈구의 염증 부위로의 침윤이 필수적이며, 이는 여러 세포 유착 분자들(cell adhesion molecules)이 관여하는 단계를 포함한다. 즉, 염증 부위에서 분비되는 케모카인(chemokine)의 유도에 의하여 염증부위의 혈관으로 이동한 백혈구들이 이동속도를 줄이면서 혈관 내피 세포 표면에서 회전하는 단계 (Rolling stage), 백혈구들이 회전을 멈추고 내피세포벽에 견고히 부착하는 단계 (Adhesion stage), 모세혈관과 바닥막을 침윤하는 단계 (Transmigration stage)로 구분할 수 있다. 상기 마지막 단계 즉 침윤하는 단계(Transmigration stage)는 혈구누출(diapedesis)로 지칭된다.Infiltration of leukocytes into the site of inflammation is essential for an inflammatory response to occur, which involves the involvement of several cell adhesion molecules. That is, the leukocytes moved to the blood vessels of the inflammation site by the induction of chemokine secreted from the inflammation site rotates on the surface of the vascular endothelial cells while reducing the movement speed, and the white blood cells stop the rotation and endothelial cell wall. It can be divided into an adhesion stage and a transmigration stage of infiltration of capillaries and bottom membranes. This last step, or transmigration stage, is called diapedesis.

한편, allergin-1은 면역글로불린-유사 수용체(immunoglobulin-like receptor)로서, 비만세포, 수지상세포나 대식세포와 같은 골수성 세포들에서 주로 발현되며 림프구에서는 발현이 되지 않는 것으로 알려져 있으며, 비만세포의 탈과립을 억제하는 기능을 함으로써, 즉시과민반응을 조절하는 데에 중요한 역할을 한다 (Hitomi K, Tahara-Hanaoka S, Someya S, Fujiki A, Tada H, Sugiyama T, Shibayama S, Shibuya K, Shibuya A. 2010. An immunoglobulin-like receptor, Allergin-1, inhibits immunoglobulin E-mediated immediate hypersensitivity reactions. Nat Immunol. 11:601).On the other hand, allergin-1 is an immunoglobulin-like receptor, which is mainly expressed in myeloid cells such as mast cells, dendritic cells or macrophages and is not known to be expressed in lymphocytes. Play an important role in regulating immediate hypersensitivity (Hitomi K, Tahara-Hanaoka S, Someya S, Fujiki A, Tada H, Sugiyama T, Shibayama S, Shibuya K, Shibuya A. 2010). An immunoglobulin-like receptor, Allergin-1, inhibits immunoglobulin E-mediated immediate hypersensitivity reactions. Nat Immunol. 11: 601).

본 발명자들은 allergin-1로부터 유래된 특정 서열을 갖는 펩타이드 단편(peptide fragment 또는 small peptide)이 백혈구의 혈관외 유출을 억제함으로써 염증 반응을 억제할 수 있으며, 또한 비만세포의 탈과립을 억제함으로써 알레르기의 예방 또는 치료 활성을 갖는다는 것을 발견하였다.The present inventors can suppress an inflammatory response by inhibiting extravasation of leukocytes by a peptide fragment having a specific sequence derived from allergin-1, and also preventing allergy by inhibiting degranulation of mast cells. Or have therapeutic activity.

따라서, 본 발명은 allergin-1로부터 유래된 특정 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 알레르기의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases or allergies comprising a specific peptide derived from allergin-1 as an active ingredient.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.According to an aspect of the present invention, a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient, and for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising a pharmaceutically acceptable carrier Pharmaceutical compositions are provided.

상기 염증 질환은 특히 과민반응(hypersensitivity)에 의해 유발된 염증일 수 있다.The inflammatory disease may in particular be inflammation caused by hypersensitivity.

본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 알레르기의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.According to another aspect of the present invention, a pharmaceutical for the prevention or treatment of allergies comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient, and comprising a pharmaceutically acceptable carrier A composition is provided.

본 발명의 펩타이드, 즉 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 백혈구의 혈관외유출을 억제함으로써, 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 비만세포의 탈과립을 억제함으로써, 알레르기의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.The peptide of the present invention, that is, the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be usefully applied to the pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases by inhibiting extravasation of leukocytes. . In addition, the peptide may be usefully applied to a pharmaceutical composition for preventing or treating allergy by inhibiting degranulation of mast cells.

도 1은 생쥐 단핵구 세포주 WEHI293에 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때, WEHI247.1 세포의 혈관외 유출도를 측정한 결과이다.
도 2는 생쥐 단핵구 세포주 WEHI293에 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리하였을 때, WEHI247.1 세포의 혈관외 유출도를 측정한 결과이다.
도 3은 쥐 호중구세포주 RBL-2H3에 본 발명의 펩타이드를 처리하고 탈과립을 유도하였을 때, 분비된 β-헥소스아미니다아제(β-hexosaminidase)의 양을 측정한 결과이다.
도 4는 IgE-매개 즉시과민반응이 유발된 생쥐에 본 발명의 펩타이드를 주입하였을 때 귀두께의 변화를 측정한 결과이다.1 is a result of measuring the extravascular leakage of WEHI247.1 cells when the mouse monocyte cell line WEHI293 was treated with the peptide of the present invention.
Figure 2 is the result of measuring the extravascular leakage of WEHI247.1 cells when treated with a concentration of the peptide of the present invention in the mouse monocyte cell line WEHI293.
Figure 3 shows the result of measuring the amount of β-hexosaminidase secreted when the peptide of the present invention to the mouse neutrophil cell line RBL-2H3 and induces degranulation.
Figure 4 is the result of measuring the change in the thickness of the ear when the peptide of the present invention is injected into the IgE-mediated immediate hypersensitivity mice.

본 명세서에서, "염증" 또는 "염증 질환"이라 함은 급성 및/또는 만성 염증 질환을 포함하며, 예를 들면, 류마티스성관절염(rheumatoid arthritis), 유착관절낭염(adhesive capsulitis), 윤활막염(sinovitis), 고관절염(coxarthritis), 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 관절주위염(periarthritis), 다발성경화증(multiple sclerosis), 골수염(osteomyelitis), 전신홍반성낭창(systemic lupus erythematosus), 류마티스성다발근육통(polymyalgia rheumatica, PMR), 소그렌증후군(Sjogren's Syndrome), 진행성전신경화증(progressive systemic sclerosis, scleroderma), 강직척추염(ankylosing spondylitis), 다발근육염(polymyositis), 피부근육염(dermatomyositis), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 제1형 당뇨병(Type I diabetes mellitus), 중증근육무력증(myasthenia gravis), 하시모도갑상선염(Hashimoto's thyroditis), 그레이브스병(Graves' disease), 그드페스추어증후군(Goodpasture's disease), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease), 경화쓸개관염(sclerosing cholangitis), 크론병(Crohn's Disease)이나 궤양성대장염(ulcerative colitis)과 같은 염증성창자병(inflammatory bowel disease), 염증성피부병(inflammatory dermatoses), 간질성폐렴(usual interstitial pneumonitis, UIP), 림프성간질폐렴(lymphoid interstitial pneumonia), 거대세포간질폐렴(giant cell interstitial pneumonia), 세포성간질폐렴(cellular interstitial pneumonia), 호흡결핵박리성간질폐렴(desquamative interstitial pneumonia) 석면증(asbestosis), 규폐증(silicosis), 베림륨중독증(berylliosis), 활석증(talcosis), 진폐병(pneumoconiosis), 성인성호흡곤란증후군(Adult Respiratory Distress Syndrome), 외인성알레르기폐포염(extrinsic allergic alveolitis) 등을 비롯한 염증성호흡기도질환(inflammatory respiratory diseases), 천식(asthma), 아토피피부염(atopic dermatitis), 알레르기비염(allergic rhinitis), 음식 알레르기(food allergy)와 같은 즉시과민반응(immediate hypersensitivity reactions), 사코이드병(sarcoidosis), 베게너육아종(Wegener's granulomatosis), 다양한 혈관염(angiitis), 만성활동간염(chronic active hepatitis), 옻과민반응(poison ivy dermatitis)과 같은 지연형과민증(delayed-type hypersensitivity reactions), 건선관절염(psoriatic arthritis), 라이터증후군(Reiter's syndrome), 류마티스열(rheumatic fever), 급성 또는 만성 사구체신염(acute or chronic glomerulonephritis), 급성증오(acute exacerbations), 신우신염(pyelonephritis), 연조직염(cellulitis), 방광염(cystitis), 급성담관염(acute cholecystitis), 염증성동맥류(inflammatory aortic aneurysm), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 스틸씨병(Still's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 염증 질환을 수반하는 질환, 예를 들어 재관류손상(reperfusion injury), 자가면역질환(autoimmune diseases), 조직이식 거부반응(organ transplantation rejection or tissue allograft organ rejection) 등의 환자에게도 투여될 수 있으므로, 본 명세서에서 상기 "염증" 또는 "염증 질환"은 상기한 염증 질환을 수반하는 질환을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. As used herein, "inflammatory" or "inflammatory disease" includes acute and / or chronic inflammatory diseases, for example, rheumatoid arthritis, adhesive capsulitis, sinovitis ), Osteoarthritis, osteoarthritis, osteoporosis, periarthritis, multiple sclerosis, osteomyelitis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid polyps rheumatica (PMR), Sjogren's Syndrome, progressive systemic sclerosis (scleroderma), ankylosing spondylitis, polymyositis, dermatomyositis, pemphigus (pemphigoid), Type I diabetes mellitus, myasthenia gravis, Hashimoto's thyroditis, Graves' disease, Gdfe Inflammatory bowel such as Goodpasture's disease, mixed connective tissue disease, sclerosing cholangitis, Crohn's disease or ulcerative colitis disease, inflammatory dermatoses, usual interstitial pneumonitis (UIP), lymphoid interstitial pneumonia, giant cell interstitial pneumonia, cellular interstitial pneumonia ), Desquamative interstitial pneumonia, asbestosis, silicosis, berylliosis, talcosis, pneumoconiosis, adult respiratory distress syndrome (Adult) Inflammatory respiratory diseases, asthma, atopic dermatitis, including Respiratory Distress Syndrome and extrinsic allergic alveolitis immediate hypersensitivity reactions, such as matitis, allergic rhinitis, food allergy, sarcoidosis, Wegener's granulomatosis, various angiitis, chronic hepatitis (chronic active hepatitis), delayed-type hypersensitivity reactions, such as poison ivy dermatitis, psoriatic arthritis, Reiter's syndrome, rheumatic fever, acute or Acute or chronic glomerulonephritis, acute exacerbations, pyelonephritis, cellulitis, cystitis, acute cholecystitis, inflammatory aortic aneurysm, atherosclerosis Atherosclerosis, Still's disease, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and the like. In addition, the peptides of the present invention can be used in patients with inflammatory diseases, such as reperfusion injury, autoimmune diseases, tissue transplantation rejection or tissue allograft organ rejection. As used herein, the term "inflammatory" or "inflammatory disease" should be understood to include diseases involving the above-described inflammatory disease.

본 발명의 펩타이드는 상기 염증 질환 중 바람직하게는 과민반응, 자가면역질환, 및/또는 류마티스성관절염에 적용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 과민반응과 자가면역질환에 적용될 수 있다. 특히 바람직하게는, 과민반응(hypersensitivity)에 의해 유발된 염증일 수 있으며, 상기 과민반응은 천식(asthma)과 같은 즉시과민반응(immediate hypersensitivity reactions)과 옻과민반응(poison ivy dermatitis)과 같은 지연형과민증(delayed-type hypersensitivity reactions) 등을 포함한다.The peptide of the present invention may be preferably applied to hypersensitivity reactions, autoimmune diseases, and / or rheumatoid arthritis among the above inflammatory diseases, and more preferably to hypersensitivity reactions and autoimmune diseases. Especially preferably, it may be inflammation caused by hypersensitivity, which may be delayed type such as immediate hypersensitivity reactions such as asthma and poison ivy dermatitis. And delayed-type hypersensitivity reactions.

또한, 본 명세서에서 "알레르기(allergy)"라 함은 환경 항원에 대한 제1형 과민반응(IgE에 의해 매개되는 즉시과민반응)을 말한다. 본 발명의 펩타이드는 천식(asthma), 알레르기비염(allergic rhinitis), 아토피성피부염(atopic dermatitis), 음식 알레르기(food allergy)와 같은 즉시과민반응과 옻과민반응과 같은 지연형과민증의 예방 또는 치료에 바람직하게 적용될 수 있으며, 특히 바람직하게는 천식, 알레르기비염, 아토피성피부염, 음식 알레르기에 적용될 수 있다.In addition, the term "allergy" as used herein refers to type 1 hypersensitivity to the environmental antigen (immediate hypersensitivity reaction mediated by IgE). The peptides of the present invention are used for the prevention or treatment of immediate hypersensitivity reactions such as asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, food allergy and delayed type hypersensitivity such as lacquer hypersensitivity. It may be preferably applied, and particularly preferably may be applied to asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, food allergy.

본 발명자들은 allergin-1로부터 다양한 길이의 단편을 제조하여, 그 활성을 검색하였다. 놀랍게도, allergin-1로부터 유래한 펩타이드로서, 3개 또는 6개의 아미노산으로 구성된 짧은 길이를 갖는 특정 펩타이드 단편들이 백혈구의 내피세포횡단이동을 억제함으로써 항-염증 활성을 가질 뿐만 아니라, 비만세포의 탈과립을 억제함으로써, 항-알레르기 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 상기 펩타이드 단편들은 다음 표 1과 같다.We made fragments of various lengths from allergin-1 and searched for their activity. Surprisingly, as a peptide derived from allergin-1, short peptides consisting of three or six amino acids have anti-inflammatory activity by inhibiting endothelial transmembrane migration of leukocytes, as well as degranulation of mast cells. By inhibiting it was found to have anti-allergic activity. The peptide fragments are shown in Table 1 below.

펩타이드명칭Peptide name 서열번호SEQ ID NO: 아미노산 서열Amino acid sequence allergin-1-pep1allergin-1-pep1 서열번호 1SEQ ID NO: 1 Ile-Thr-Tyr-Ser-Leu-PheIle-Thr-Tyr-Ser-Leu-Phe allergin-1-pep2allergin-1-pep2 서열번호 2SEQ ID NO: 2 Ile-Thr-TyrIle-Thr-Tyr

따라서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 염증 질환은 특히 과민반응(hypersensitivity)에 의해 유발된 염증을 포함한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of an inflammatory disease comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, including a pharmaceutically acceptable carrier to provide. The inflammatory disease particularly includes inflammation caused by hypersensitivity.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 알레르기의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of allergy comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient, and includes a pharmaceutically acceptable carrier. do.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, and may include, for example, excipients such as lactose and corn starch, lubricants such as magnesium stearate, known and usable emulsifiers, suspensions, buffers, and isotonic agents. Topics, and the like. The pharmaceutical compositions of the invention may be formulated in oral or parenteral dosage forms, preferably parenteral dosage forms. In the case of intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous and intravenous dosage forms, a sterile solution of the active ingredient is usually prepared and may comprise a buffer which can suitably adjust the pH of the solution, and for intravenous administration isotonic in the formulation. May be included to impart this. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of an aqueous solution containing a pharmaceutically acceptable carrier such as saline having a pH of 7.4, and may be locally introduced into the patient's intramuscular blood flow in the form of a solution. have.

본 발명의 약학 조성물은 다양한 염증 질환 또는 알레르기를 앓고 있는 환자에게 1일 약 1 내지 2000 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 환자의 연령, 체중 및 증상에 따라 일반적으로 변경될 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered to a patient suffering from various inflammatory diseases or allergies at a dose of about 1 to 2000 mg / kg per day. Appropriate dosages will generally vary depending on the age, weight and symptoms of the patient.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrating the present invention, and the present invention is not limited to these examples.

실시예 1. 펩타이드의 합성Example 1 Synthesis of Peptides

서열번호 1 및 2의 펩타이드(상기 표 1 참조)는 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)을 이용하여 FMOC solid-phase method로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 analytical RP 컬럼 (Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.
Peptides of SEQ ID NO: 1 and 2 (see Table 1 above) were synthesized by the FMOC solid-phase method using an automated synthesizer (PeptrEx-R48, Peptron, Daejeon, Korea). The synthesized peptide was purified and analyzed by reverse-phase HPLC using a C18 analytical RP column (Shiseido capcell pak) (Prominence LC-20AB, Shimadzu, Japan), and mass spectrometry (HP 1100 Series LC). / MSD, Hewlett-Packard, Roseville, USA).

실시예 2. 펩타이드를 포함하는 조성물의 제조Example 2. Preparation of a Composition Comprising a Peptide

서열번호 1 및 2의 펩타이드를 인산완충식염수(PBS)에 용해시켜, 1 M의 농도가 되도록 제조하였다. 얻어진 단백질 용액을 PBS로 희석하여 하기 시험예에서 사용하였다.
Peptides of SEQ ID NO: 1 and 2 were dissolved in phosphate buffered saline (PBS) to prepare a concentration of 1 M. The obtained protein solution was diluted with PBS and used in the following test example.

시험예 1. 단핵구의 시험관 내(Test Example 1. In vitro of monocytes ( in vitroin vitro ) 혈관외유출 억제 시험Extravasation inhibition test

생쥐 뇌내피세포인 bEND3 (ATCC사, 미국)를 보이덴 챔버(Boyden chamber)의 위칸에서 배양하였다. 배양 상층액을 제거하고, 실시예 2에서 제조한 서열번호 1 및 3의 펩타이드 용액(100 μM)으로 1시간 동안 전처리하거나 전처리하지 않은 생쥐 단핵구 WEHI247.1 (ATCC사, 미국)를 각 처리구에 5 x 10⁵ 개씩 가하였다. 이때 아래칸에는 생쥐 섬유모세포인 NIH/3T3를 0.005% 비타민 C와 0.1% 소혈청알부민이 첨가된 DMEM 무혈청배지에서 16시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 상등액이 포함된 배양액을 넣어서 단핵구의 침윤을 유도하였다. 6 시간 동안 배양하면서 아래칸으로 침윤하여 이동한 세포수를 측정하였다. 상기 시험은 5회 반복하였으며, 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 Control(대조군)은 펩타이드 용액으로 전처리하지 않은 생쥐 단핵구 WEHI247.1를 5 x 10⁵ 개 가하였다.BEND3 (ATCC, USA), a rat brain stem cell, was cultured in a wicker chamber of a Boyden chamber. The culture supernatant was removed and mouse monocytes WEHI247.1 (ATCC, USA) not pretreated or pretreated for 1 hour with the peptide solutions of SEQ ID NOS: 1 and 3 (100 μM) prepared in Example 2 were added to each treatment. x 10 ⁵ each was added. In the lower compartment, incubation of monocytes was performed by adding a culture solution containing the supernatant obtained by centrifugation of NIH / 3T3, a mouse fibroblast, in a DMEM serum-free medium containing 0.005% vitamin C and 0.1% bovine albumin. Induced. The number of cells infiltrated into the lower cell while incubating for 6 hours was measured. The test was repeated 5 times and the results are shown in Fig. In FIG. 1, Control added 5 x 10 ⁵ mouse monocytes WEHI247.1 not pretreated with peptide solution.

또한, 서열번호 2의 펩타이드를 PBS에 용해하여 각각 25, 50, 100, 및 200μM의 용액을 제조한 후, 상기와 동일한 방법으로 단핵구의 침윤을 유도하였다. 6 시간 동안 배양하면서 아래칸으로 침윤하여 이동한 세포수를 측정하였다. 상기 시험은 5회 반복하였으며, 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 Control(대조군)은 펩타이드 용액으로 전처리하지 않은 생쥐 단핵구 WEHI247.1를 5 x 10⁵ 개 가하였다.In addition, the peptide of SEQ ID NO: 2 was dissolved in PBS to prepare solutions of 25, 50, 100, and 200 μM, respectively, and the infiltration of monocytes was induced in the same manner as described above. The number of cells infiltrated into the lower cell while incubating for 6 hours was measured. The test was repeated five times, and the results are shown in FIG. 2. In FIG. 2, Control added 5 x 10 ⁵ mouse monocytes WEHI247.1 not pretreated with peptide solution.

도 1 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드를 처리한 경우, 혈관 외로 유출된 단핵구의 갯수가 대조군의 약 40% 수준으로 유의성있게 감소되었으며, 혈관외유출 억제 활성은 농도의존적이었다. 백혈구가 혈관을 따라 이동하다가 염증 부위로 이동하기 위해서는 혈관 밖으로 유출되는 과정이 수반됨을 감안할 때, 본 발명의 펩타이드는 효과적인 염증반응 억제 활성을 가질 것으로 기대된다.
As can be seen in Figures 1 and 2, when treated with the peptides according to the present invention, the number of monocytes leaked out of the vessel significantly decreased to about 40% of the control group, the extravasation inhibitory activity is concentration-dependent It was. Given that the leukocytes move along the blood vessels and then flow out of the blood vessels to move to the inflammatory site, the peptides of the present invention are expected to have an effective inflammatory inhibitory activity.

시험예 2. 시험관 내(in vitro) 비만세포 탈과립 억제능 시험Test Example 2 In Vitro Mast Cell Degranulation Inhibition Test

본 발명의 펩타이드가 비만세포의 탈과립에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 쥐 호염기구 RBL-2H3 (한국세포주은행, 한국)에 항체인 항-디니트로페닐 면역글로불린 E(Anti-Dinitrophenyl Immunoglobulin E, anti-DNP-IgE)와 항원인 DNP-human albumin(HSA)을 처리하여 탈과립을 유도한 후, 분비된 β-헥소스아미니다아제(β-hexosaminidase)를 시험관 내(in vitro)로 다음과 같이 측정하였다. To investigate the effect of the peptide of the present invention on the degranulation of mast cells, anti-Dinitrophenyl Immunoglobulin E (anti-Dinitrophenyl Immunoglobulin E, anti-) antibody to the rat basophils RBL-2H3 (Korea Cell Line Bank, Korea) DNP-IgE) and the antigen DNP-human albumin (HSA) were treated to induce degranulation, and then secreted β-hexosaminidase was measured in vitro as follows. .

2% 소혈청알부민으로 96 웰 플레이트를 37℃에서 도포한 후, RBL-2H3 세포(1X10⁵)를 96 웰에 분주하였다. 24시간 배양한 세포를 anti-DNP-IgE (100 ng/ml)로 14-16시간 동안 감작시켰다. PBS로 2회 세척 후 DMEM 무혈청배지에 희석한 서열번호 2의 펩타이드 (25, 50, 100, 및 200 μM)로 한 시간 동안 처리하였다. 이후, Tyrode's 완충액(119 mM NaCl, 4.74 mM KCl, 2.54 mM CaCl_2,1.19 mM MgSO₄, 1.19 mM KH₂PO₄, 10 mM HEPES, 5 mM 글루코오즈, 0.1% (w/v) BSA)에 희석시킨 DNP-HSA(100 ng/ml)로 한 시간 동안 처리하였다. 상등액(80 ㎕)을 걷어 기질용액(0.05 M 트리소듐 시트레이트(pH 4.5): 0.05 M 시트르산(pH 4.5)을 1:1로 섞은 용액에 니트로페닐 N-아세틸-베타-D-글루코스아미니다아제(Nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosaminidase)를 1.3 mg/ml 농도로 녹인 용액) 80 ㎕과 빛을 차단한 조건에서 한 시간 동안 반응시켰다. 세포는 용해완충액(Tyrode's 완충액 + 1% Triton-X100)으로 용해한 후 원심분리(13,000 rpm, 4℃, 5분)하였다. 그리고 상등액을 걷어 기질 용액과 암소(dark condition)에서 한 시간 동안 반응시켰다. 정지용액(0.05 M 탄산나트륨(pH10): 0.05 M 중탄산나트륨(pH10) = 6:4)을 넣은 후 OD₄₀₅에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 NC는 음성 대조군(negative control)으로서, anti-DNP-IgE로 감작하되 항원인 DNP-HSA를 처리하지 않은 세포를 이용하였으며, PC는 양성 대조군(positive control)로서 anti-DNP-IgE와 DNP-HSA로 처리하되 본 발명의 펩타이드를 가하지 아니한 세포를 이용하였다96 well plates with 2% bovine serum albumin were applied at 37 ° C., and then RBL-2H3 cells (1 × 10 ⁵ ) were dispensed into 96 wells. Cells cultured for 24 hours were sensitized with anti-DNP-IgE (100 ng / ml) for 14-16 hours. After washing twice with PBS, it was treated with peptides of SEQ ID NO: 2 (25, 50, 100, and 200 μM) diluted in DMEM serum-free medium for one hour. Then diluted in Tyrode's buffer (119 mM NaCl, 4.74 mM KCl, 2.54 mM CaCl _2, 1.19 mM MgSO ₄ , 1.19 mM KH ₂ PO ₄ , 10 mM HEPES, 5 mM glucose, 0.1% (w / v) BSA) Treated with DNP-HSA (100 ng / ml) for 1 hour. The supernatant (80 μl) was removed to give a solution of substrate solution (0.05 M trisodium citrate (pH 4.5): 0.05 M citric acid (pH 4.5) in a 1: 1 mixture of nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosaminidase. 80 μl of a solution in which 1.3 mg / ml of nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosaminidase was dissolved was reacted for 1 hour under light blocking conditions. Cells were lysed with lysis buffer (Tyrode's buffer + 1% Triton-X100) and centrifuged (13,000 rpm, 4 ° C, 5 minutes). The supernatant was then allowed to react for one hour in a substrate solution and dark (dark condition). A stop solution (0.05 M sodium carbonate (pH10): 0.05 M sodium bicarbonate (pH10) = 6: 4) was added and the absorbance was measured at OD ₄₀₅ . The results are shown in FIG. In Figure 3 NC is a negative control (negative control), using the cells sensitized with anti-DNP-IgE but not treated with the antigen DNP-HSA, PC was used as anti-DNP-IgE as a positive control (positive control) Cells treated with DNP-HSA but without the peptide of the present invention were used.

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드를 처리한 경우, RBL-2H3 세포로 부터 분비된 β-헥소스아미니다아제가 대조군에 비해서 유의성 있게 감소되며, 그 감소 활성은 농도 의존적이었다. 즉시성과민반응의 초기에 비만세포의 탈과립이 개시됨을 감안할 때, 본 발명의 펩타이드는 효과적인 알레르기 억제 활성을 가질 것으로 기대된다.
As can be seen in Figure 3, when treated with the peptides according to the present invention, β-hexosaminidase secreted from RBL-2H3 cells was significantly reduced compared to the control, the reduction activity was concentration dependent . Given that degranulation of mast cells is initiated early in the immediate hypersensitivity reaction, the peptides of the present invention are expected to have an effective allergic inhibitory activity.

시험예 3. IgE-매개 즉시과민반응(IgE-mediated immediate hypersensitivity reactions) 억제 시험Test Example 3 Inhibition of IgE-mediated immediate hypersensitivity reactions

생후 6주 숫컷 Balb/c 생쥐의 꼬리 정맥에 5 ㎍의 IgE 항체를 주사하여 감작시켰다. 24시간 후, 실시예 1에서 얻어진 서열번호 2의 펩타이드 단편을 생리식염수 100 ㎕에 녹여 생쥐 1마리 당 10 mg/kg의 농도로 복강 투여하였다. 아세톤 및 올리브 오일의 혼합물(4:1, v/v) 중에 0.15%의 농도로 용해시킨 2,4-디니트로플루오로벤젠(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)의 용액을 항원으로서 사용하여, 상기 용액을 귀에 바름으로써 IgE-매개 즉시과민반응을 유도하였다. 음성대조군 생쥐에는 생리식염수 100 ㎕를 주입하고 DNFB를 처리하지 않았으며, 양성대조군 생쥐에는 생리식염수 100 ㎕를 주입하고 DNFB를 처리하였다. 이후 3시간과 6시간 후 디지털측경양각기(digital caliper)를 이용하여 귀두께의 변화를 측정하였다. 펩타이드 처리 1일 후부터 매일 시험군 생쥐에게는 서열번호 2의 펩타이드 단편을 10 mg/kg 농도로 복강주사하고, 대조군 생쥐에게는 생리식염수만 복강주사하고, 3일 간 귀두께의 변화를 비교하였다. The tail vein of six - week - old male Balb / c mice was sensitized by injecting 5 ㎍ of IgE antibody. After 24 hours, the peptide fragment of SEQ ID NO: 2 obtained in Example 1 was dissolved in 100 쨉 l of physiological saline and was administered peritoneally at a concentration of 10 mg / kg per mouse. Using a solution of 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) dissolved at a concentration of 0.15% in a mixture of acetone and olive oil (4: 1, v / v) as an antigen, IgE-mediated immediate hypersensitivity by applying the solution to the ear Respectively. Negative control mice were injected with 100 μl of physiological saline and treated with DNFB. Positive control mice were injected with 100 μl of physiological saline and treated with DNFB. After 3 and 6 hours, digital calipers were used to measure changes in ear thickness. From day 1 after the peptide treatment, the test mice were intraperitoneally injected with peptide fragment of SEQ ID NO: 2 at a concentration of 10 mg / kg, and the control mice were intraperitoneally injected with physiological saline only, and the change in ear thickness was compared for 3 days.

도 4는 음성대조군에 비하여 DNFB처리에 의하여 증가한 시험군과 양성대조군 생쥐의 귀두께의 변화를 측정한 결과이다. 도 4의 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드 단편을 주입한 경우에 귀두께가 양성대조군에 비해서 현저하게 감소되는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 IgE-매개 즉시과민반응을 효과적으로 억제할 수 있으며, 또한 과민반응에 의해 유발된 염증을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 기대된다.
4 is a result of measuring the change in ear thickness of the test and positive control mice increased by DNFB treatment compared to the negative control. From the results of Figure 4, it can be seen that the ear thickness is significantly reduced compared to the positive control group when the peptide fragment according to the present invention is injected. Therefore, the peptide of the present invention is expected to effectively inhibit the IgE-mediated immediate hypersensitivity reaction and effectively inhibit the inflammation induced by hypersensitivity reaction.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition comprising peptide having inhibitory activities against transendothelial migration of leucocytes and degranulation of mast cells <130> PN0451 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 1 Ile Thr Tyr Ser Leu Phe 1 5 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 2 Ile Thr Tyr 1 <110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition comprising peptide having inhibitory          activities against transendothelial migration of leucocytes and          degranulation of mast cells <130> PN0451 <160> 2 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 1 Ile Thr Tyr Ser Leu Phe   1 5 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 2 Ile Thr Tyr   One

Claims (3)

삭제delete 삭제delete 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 알레르기의 예방 또는 치료용 약학 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating allergies comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and comprising a pharmaceutically acceptable carrier.

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