KR101254004B1 - A composition containing cell-transducing sulfiredoxin fusion protein for preventing and treating inflammatory disorders - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Srx 단백질과 단백질 수송도메인이 공유결합된 Srx 융합 단백질을 형성함으로써 세포에 적용시킬 때 용이하게 세포 내로 투과 가능한 Srx 융합 단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 본 발명의 단백질 수송 도메인은 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성되어 있으며, 대조군과 비교할 때 원활히 세포 내로 침투하여 염증 유발된 피부의 염증을 완화하고, 부종을 완화하는 효과를 거두었으며, 과산화수소에 의한 세포 사멸을 억제하였다.The present invention relates to an Srx fusion protein that is easily permeable into cells when applied to cells by forming a covalently bonded Srx fusion protein between the Srx protein and the protein transport domain. It consists of a amino acid, non-hydrophobic domain (hydrophobic domain) containing five or more tryptophan, a hydrophilic domain containing a large number of lysine (spacer) separating the two domains, and a control group Compared to the cells, the cells penetrated into the cells smoothly to alleviate inflammation of the skin, and to reduce edema, and inhibited cell death by hydrogen peroxide.

Description

세포 투과성 설피레독신 융합 단백질을 포함하는 염증 예방 및 치료용 조성물{A composition containing cell-transducing sulfiredoxin fusion protein for preventing and treating inflammatory disorders}A composition containing cell-transducing sulfiredoxin fusion protein for preventing and treating inflammatory disorders}

본 발명은 세포 투과성 설피레독신 융합 단백질을 포함하는 염증 예방 및 치료용 약학 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition and a cosmetic composition for preventing and treating inflammation comprising a cell permeable sulfyredoxin fusion protein.

활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)은 산소를 이용하여 에너지를 얻는 모든 생명체에서 여러 가지 세포 내 대사과정의 부산물로 필연적으로 생성된다. 활성 산소종은 세포 내 단백질, 핵산 및 지방과 같은 생체고분자에 손상을 입히며, 인체의 여러 질병 진행과정과 깊게 관련되어 있다. 활성산소종은 특히 발암과정, 뇌졸중, 관절염, 동맥경화, 방사선 손상 및 염증반응에 관여하며 정상적인 노화과정에서도 노화를 촉진하는 중요한 요인으로 작용한다. 또한, 파킨슨병, 알츠하이머, 헌팅턴병, 치매, 간질에 이르기까지 다양한 뇌 관련 질환이 활성 산소종과 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.Reactive oxygen species (ROS) are inevitably produced as by-products of various intracellular metabolism in all living organisms that use oxygen to obtain energy. Reactive oxygen species damage biopolymers such as proteins, nucleic acids and fats in cells and are deeply involved in the progress of various diseases in the human body. Reactive oxygen species are particularly involved in carcinogenesis, stroke, arthritis, arteriosclerosis, radiation damage, and inflammatory reactions. In addition, various brain-related diseases, such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, dementia and epilepsy, are known to be closely related to reactive oxygen species.

피부는 자외선(UV), 공기 오염 등의 유해한 환경에 지속적으로 노출된다. 활성 산소종은 아토피 피부염, 피부 자가면역질환 등의 염증성 피부질환, 피부암, 광독성, 감광성, 피부노화 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.
Skin is constantly exposed to harmful environments such as ultraviolet light (UV) and air pollution. Reactive oxygen species are known to be involved in inflammatory skin diseases such as atopic dermatitis and skin autoimmune diseases, skin cancer, phototoxicity, photosensitivity, and skin aging.

최근 그 기능에 대하여 활발히 연구되고 있는 항산화 효소 2-Cys 퍼옥시데이즈(Peroxidase; Prx)는 티오레독신(thioredoxin), 티오레독신 환원효소(thioredoxin reductase)와 전자 전달 시스템을 형성하는 퍼옥시데이즈(peroxidase)이다. 지금까지 포유류에서 다섯 종류의 2-Cys 퍼옥시데이즈가 밝혀졌고, 공통적으로 시스테인(cysteine) 잔기를 갖고 있다. H2O2 농도를 조절하는 것으로 알려져 있는 퍼옥시데이즈는 과도한 활성 산소에 의하여 시스테인 잔기가 과산화되어 시스테인 설핀산(cysteine sulfinic acid; -SO2) 형태의 비가역적인 불활성 상태로 가게 되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 2-Cys 퍼옥시데이즈는 최근에 알려진 단백질 설피레독신(sulfiredoxin; Srx)에 의하여 환원되어 그 기능을 회복하는 것으로 알려져 있다[S.G. Rhee, Chae HZ, Kim K. (2005) Free Radic. Biol. Med. 38, 1543-1552, Wood ZA, Schrder E, Robin Harris J, Poole LB. (2003) Trends Biochem. Sci. 28, 32-40, Biteau B, Labarre J, Toledano MB. (2003). Nature 425, 980-984.]. 이러한 퍼옥시데이즈의 산화는 염증, 암 등 다양한 질병에 관여하는 것으로 알려져 있다[Cordray P, Doyle K, Edes K, Moos PJ, Fitzpatrick FA. (2007). J. Biol. Chem. 9, 32623-9].
The antioxidant enzyme 2-Cys Peroxidase (Prx), which has been actively studied for its function in recent years, is known as peroxidase which forms an electron transfer system with thiorredoxin and thioredoxin reductase. peroxidase). To date, five kinds of 2-Cys peroxidases have been identified in mammals and have a common cysteine residue. Peroxidases, known to control H 2 O 2 concentrations, are known to overoxidize cysteine residues due to excessive active oxygen, leaving them in an irreversible inert state in the form of cysteine sulfinic acid (-SO 2 ). However, 2-Cys peroxidases are known to be reduced by the recently known protein sulfiredoxin (Srx) to restore its function [SG Rhee, Chae HZ, Kim K. (2005) Free Radic. Biol. Med. 38, 1543-1552, Wood ZA, Schrder E, Robin Harris J, Poole LB. (2003) Trends Biochem. Sci. 28, 32-40, Biteau B, Labarre J, Toledano MB. (2003). Nature 425, 980-984.]. Oxidation of such peroxidases is known to be involved in various diseases such as inflammation and cancer [Cordray P, Doyle K, Edes K, Moos PJ, Fitzpatrick FA. (2007). J. Biol. Chem. 9, 32623-9.

생체 내 고분자들은 자유 라디칼의 해로운 작용에 항상 노출되어 있기 때문에 다양한 질환에 설피레독신을 치료목적으로 이용하려는 관심이 매우 높아지고 있다. 현재 가장 주목을 받고 있는 것은 유전자 치료이다. 그러나 유전자 치료는 유전자의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현이 낮고, 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧고, 인위적으로 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 가지 문제점이 있다.
Since in vivo polymers are always exposed to the harmful action of free radicals, there is a great interest in using sulfyredoxin for therapeutic purposes in various diseases. At the moment the most attention is on gene therapy. However, gene therapy is not easy to carry genes, low expression in target cells, short duration of protein expression in cells, and very difficult to artificially control the amount of protein expressed in target cells. There are several problems.

치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어서 목표 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 단백질은 크기나 여러 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600 달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.
In moving drugs or proteins for treatment into cells, a method of directly delivering a target protein through a cell membrane may be considered. However, proteins are difficult to cross through cell membranes due to their size and biochemical properties. In general, it is known that substances having a molecular weight of 600 daltons or more are almost impossible to pass through cell membranes.

최근, 단백질의 운반 방법 중 하나로 Pep-1 펩타이드를 이용하여 자연상태의 이형 단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것이 밝혀졌다. Pep-1 펩타이드는 21개의 아미노산 (KETWWETWWTEW SQP KKKRKV)으로 이루어졌고, 3개의 도메인 (hydrophobic, spacer, hydrophilic domain)을 갖고 있다. 지금까지, Pep-1 펩타이드를 이용한 연구에서는 Pep-1 펩타이드와 외부 단백질을 동시에 세포에 투여하였을 경우 자연상태로 단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 치료 단백질을 비롯한 모든 종류의 단백질이 Pep-1에 의해 세포 내로 운반되는지는 아직까지 정확히 밝혀지지 않았다.
Recently, it has been found that Pep-1 peptides can be used to transport natural heterologous proteins into cells as one of the methods of protein transport. Pep-1 peptide consists of 21 amino acids (KETWWETWWTEW SQP KKKRKV) and has three domains (hydrophobic, spacer, hydrophilic domain). Thus far, studies using Pep-1 peptides have shown that when Pep-1 peptides and foreign proteins are simultaneously administered to cells, the proteins can be transported into the cells in a natural state. However, it is not yet clear exactly whether all kinds of proteins, including therapeutic proteins, are carried into cells by Pep-1.

본 발명의 목적은 활성 산소종에 의하여 발생하는 염증 등의 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 제시하려는 것이다.
An object of the present invention is to provide a method that can prevent or treat diseases such as inflammation caused by reactive oxygen species.

본 발명자들은 Pep-1 펩타이드가 여러 가지 질병과 관련성을 갖는다고 알려진 2-Cys 퍼옥시레독신의 환원에 관여하는 설피레독신 단백질을 세포 내로 운반시킬 수 있는지, 운반된 설피레독신(Srx) 융합 단백질이 세포 내에서 단백질의 기능(항염증 및 세포 보호 기능)을 나타내는지를 실험하였다.The present inventors have found that the sulpyredoxin (Srx) fusion can be carried into the cell whether or not the Pep-1 peptide is capable of transporting sulfidoredoxin proteins involved in the reduction of 2-Cys peroxyredoxin, which is known to be associated with various diseases. It was tested whether the protein exhibited its function (anti-inflammatory and cell protective function) in the cell.

본 발명자들은 먼저 Srx 융합 단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 Srx 융합 단백질 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 인간 Srx cDNA, Pep-1 펩타이드 (21 아미노산) 그리고 6개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 Srx 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켜 자연상태로 Ni2 +-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. Srx 융합 단백질의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이런 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다. 또한, 웨스턴 블랏 방법으로 정제된 Srx 융합 단백질을 배양된 PC12 세포에 투여하는 경우 농도 및 시간 의존적으로 세포 내로 운반되는 것을 확인하였다. 세포 내로 투과된 Srx 융합 단백질은 세포 내에서 최장 24시간 지속적으로 유지되었다. 또한 세포 내로 투과된 Srx 융합 단백질은 H2O2에 의한 세포사멸과 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha)에 의하여 유도되는 염증관련 인자인 MCP-1(Monocyte chemotactic protein-1), IL-6(Interleukin-6), MMP-9(Matrix metalloproteinase-9)의 발현 억제 및 LPS(Lipopolysaccharides)에 의한 산화질소(Nitric oxide, NO) 생성을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한 동물 수준에서도 염증 억제의 효능이 있음을 밝혀낼 수 있었다.We firstly overexpress and easily purify the Srx fusion protein. Fusion protein Expression vectors were developed. This expression vector is a human Srx cDNA, Pep-1 peptide (21 amino acids) and six histidines are connected in series. Using this expression vector to over-express a fusion protein in E. coli Srx Ni 2 + in the natural state were purified using an affinity chromatography column. Overexpression of the Srx fusion protein was significantly higher, resulting in a higher amount of purified protein. In addition, when the Srx fusion protein purified by Western blot method is administered to the cultured PC12 cells, it was confirmed that the concentration and time-dependent transport into the cells. The Srx fusion protein permeated into cells was maintained for up to 24 hours in the cells. In addition, the Srx fusion protein permeated into cells was apoptosis induced by H 2 O 2 and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), IL-6, an inflammation-related factor induced by TNF-α (Tumor necrosis factor-alpha). (Interleukin-6), MMP-9 (Matrix metalloproteinase-9) and inhibited the expression of LPS (Lipopolysaccharides) was found to effectively inhibit the production of nitric oxide (Nitric oxide, NO). In addition, it was found that there is an effect of inhibiting inflammation at the animal level.

이러한 결과는 단백질 수송 도메인과 결합한 Srx 융합 단백질이 세포 및 조직 내로 투과가 잘 일어나고, 세포와 조직 내에서 설피레독신 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명은 Srx 융합 단백질이 다양한 암 및 염증 질환 예방, 치료 분야 및 화장료에 응용될 가능성을 제시해 준다.
These results indicate that the Srx fusion protein bound to the protein transport domain is well permeable into cells and tissues, and exhibits sulfidoredxin function in cells and tissues. Accordingly, the present invention offers the possibility of application of the Srx fusion protein to various cancer and inflammatory diseases prevention, treatment fields and cosmetics.

세포 투과성 Srx 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 주사형태, 경구투여, 도포제 형태 등으로 제형화할 수 있다. 예를 들면 액제, 시럽제, 캡슐제, 과립제, 분말, 연고, 에멀젼, 겔, 크림 등으로 제제화할 수 있으며, 이를 여러 경로로 투여할 수 있다. 여러 가지 제형 중 예컨대, 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체에는 유당, 포도당, 자당, 소르비톨, 마니톨, 전분, 검 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미세결정 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등이 포함된다. 상기 조성물에는 또한 윤활제, 웨팅제, 풍미제, 유화제 및 방부제 등이 더 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는 것은 아니다.Pharmaceutical compositions containing the cell-permeable Srx fusion protein as an active ingredient can be formulated in injection form, oral administration, coating form, etc. by conventional methods in combination with a carrier generally acceptable in the pharmaceutical field. For example, it may be formulated as a liquid, syrup, capsule, granule, powder, ointment, emulsion, gel, cream, and the like, which may be administered by various routes. In various formulations, for example, the injectable compositions are preferably aqueous isotonic solutions or suspensions, and the compositions mentioned are sterile and / or adjuvants (e.g. preservatives, stabilizers, wetting or emulsifier solution promoters, salts or buffers for osmotic control). ). In addition, they may contain other therapeutically valuable substances. Pharmaceutically acceptable carriers include lactose, glucose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, Methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like. The composition may also further include lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers, and preservatives. The composition of the present invention can be formulated into parenteral formulations, such as oral preparations such as granules, powders, solutions, tablets, capsules or dry syrups, or injections, but is not limited to such formulations.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 피하 투여, 근육 투여 또는 경구투여, 정맥 투여, 피부 도포 등으로 투여할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~100㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.The pharmaceutical preparation thus prepared may be administered by subcutaneous administration, intramuscular administration or oral administration, intravenous administration, skin application, etc. as desired, and the dosage may be from 0.001 µg to 100 mg / kg in daily dosages of 1 to 100 mg / kg. It can be divided into several doses. Dosage levels for a particular patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, time of administration, method of administration, severity of the disease, and the like.

본 발명자들은 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 피부 세포에 침투실험한 결과, 세포에 원활하게 침투하고, 염증을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 약제 조성물의 주요성분으로 이용할 수 있음을 밝혔다.The present inventors confirmed that the cell-permeable Srx fusion protein penetrated into the skin cells smoothly penetrated the cells and suppressed inflammation. Therefore, it was found that the cell-permeable Srx fusion protein of the present invention can be used as a main component of the pharmaceutical composition.

본 발명은 Srx 단백질을 피부 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 Srx 단백질 분자의 세포내 전달은 Srx에 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 세포투과성 수송도메인이 공유결합된 형태의 융합 단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 21개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 3과 같은 아미노산 서열로 이루어진 Pep-1 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 Pep-1 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, Pep-1의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Pep-1 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합 단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.The present invention provides a method for efficiently delivering Srx protein into skin cells. Intracellular delivery of Srx protein molecules according to the present invention comprises 15-30 amino acids in Srx, a hydrophilic domain containing 5 or more tryptophans, and a hydrophilic domain containing 4 or more lysines. cell permeable transport domain consisting of a domain) and a spacer separating the two domains. An example of the transport domain of the present invention includes a Pep-1 peptide consisting of 21 amino acids and consisting of an amino acid sequence such as SEQ ID NO: 3. However, the protein transport domain of the present invention is not limited only to the Pep-1 peptide of SEQ ID NO: 3, and the production of a peptide having a function similar to Pep-1 peptide by partial substitution, addition or lack of the amino acid sequence of Pep-1 Since it is easy for those skilled in the art to which the present invention pertains, a hydrophilic domain consisting of 15 to 30 amino acids, including 5 or more tryptophans, and a hydrophilic domain including 4 or more of lysine (fusion protein using a protein transport domain consisting of a hydrophilic domain and a spacer separating the two domains and a protein transport domain that performs the same or similar protein transport function by substituting a partial amino acid therefrom is also included in the scope of the present invention. Belonging will be self-evident.

구체적으로, 본 발명은 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증 질환 치료, 예방 목적의 약학 조성물에 관한 것이다.Specifically, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating and preventing inflammatory diseases, which contains a cell-permeable Srx fusion protein as an active ingredient and includes a pharmaceutically acceptable carrier.

또한, 본 발명은 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 비롯한 피부 외용제 조성물을 제공한다. 본 발명의 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.The present invention also provides a composition for external application to the skin, including a cosmetic composition containing the cell-permeable Srx fusion protein as an active ingredient. The coating agent comprising the cell-permeable Srx fusion protein of the present invention as an active ingredient can be easily prepared in any form according to a conventional manufacturing method. As an example, in preparing a cream coating agent, the cell-based permeable Srx fusion protein of the present invention is contained in a creamy oil-in-water (O / W) or water-in-oil (W / O) cream base, which contains perfume, chelating agent, pigment, and oxidation. Anti-preservatives, preservatives and the like may be used as necessary, and synthetic or natural materials such as proteins, minerals and vitamins may be used in combination for the purpose of improving physical properties.

뿐만 아니라, 본 발명의 세포 투과성 Srx 융합 단백질은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화할 수 있다.
In addition, the cell-permeable Srx fusion protein of the present invention can be used as a cosmetic, by adding a pH adjuster, fragrance, emulsifier, preservatives, etc. as needed, in a conventional cosmetic preparation method, lotion, gel, water-soluble powder, fat-soluble powder, water-soluble It may be formulated as a liquid, cream or essence.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.Definitions of main terms used in the detailed description of the present invention are as follows.

" 세포 투과성 Srx 융합 단백질"이란 단백질 수송 도메인과 Srx 단백질을 포함하며, 수송 도메인과 화물 분자(cargo molecule, 즉 본 발명에서는 Srx를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "Pep-1-Srx", "Srx 융합 단백질" , "세포 투과성 Srx 융합 단백질" 또는 "PEP-Srx"와 혼용하였다. 또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다."Cell permeable Srx fusion protein" means a covalent complex formed by genetic fusion or chemical bonding of a transport domain and a cargo molecule (cargo molecule, ie, Srx in the present invention), comprising a protein transport domain and a Srx protein. do. In the present specification, "Pep-1-Srx", "Srx fusion protein", "cell permeable Srx fusion protein" or "PEP-Srx" was mixed. In addition, the "genetic fusion" means a linear, covalent linkage formed through the genetic expression of the DNA sequence encoding the protein.

또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다. 구체적으로 본 발명에서는 피부 세포를 의미한다.In addition, "target cell" means a cell to which a cargo molecule is delivered by a transport domain, and a target cell refers to a cell in or outside the body. That is, a target cell is meant to include cells in the body, that is, cells constituting organs or tissues of a living animal or human, or microorganisms found in a living animal or human. In addition, target cells are meant to include extracellular cells, ie cultured animal cells, human cells or microorganisms. Specifically, in the present invention, it means skin cells.

본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 펩타이드, 단백질과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 펩타이드나 단백질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말하며, 예를 들면 Pep-1 펩타이드(서열번호 3)를 말한다.As used herein, the term "protein transport domain" refers to a covalent bond with a peptide or a protein, which may introduce the peptide or protein into a cell without the need for a separate receptor, carrier, or energy. For example, Pep-1 peptide (SEQ ID NO: 3).

본 명세서의 "목표 단백질"은 Pep-1 단백질 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 분자를 의미하며, 구체적으로는 Srx를 의미한다.As used herein, "target protein" refers to a molecule that is covalently bound to a Pep-1 protein transport domain and introduced into a cell to exhibit activity, specifically, Srx.

또한, 본 명세서에서는 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "형질도입", "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.In addition, the present specification is interchangeable with the expressions "transduction", "transport", "penetration", "transport", "transfer", "transmission", "pass" for "introducing" a protein or peptide into a cell. It was.

본 발명은 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인이 Srx 단백질의 N 말단 및 C 말단 중 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 투과성(cell-transducing) Srx 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.The present invention is composed of 15 to 30 amino acids, a protein transport domain consisting of a non-hydrophilic domain including five or more tryptophan, a hydrophilic domain including a large number of lysine and a spacer separating the two domains is N terminal of the Srx protein And a cell-transducing Srx fusion protein covalently bonded to at least one end of the C terminus. In addition, silent changes may result in one or more amino acids in the sequence being substituted with other amino acid (s) of similar polarity that function functionally equivalently. Amino acid substitutions in the sequence may be selected from other members of the class to which the amino acid belongs. For example, hydrophobic amino acid classifications include alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, valine, tryptophan, proline and methionine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. Positive basic amino acids include arginine, lysine and histidine. Negative charged acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid. Also included within the scope of the invention are fragments or derivatives thereof having the same similar biological activity within a range of homology between the fusion protein and amino acid sequence of the invention, such as 85-100%.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 Srx 융합 단백질이 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the cell-permeable Srx fusion protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11.

또한, 본 발명은 상기 단백질 수송도메인이 Srx 단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 공유결합된 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the protein transport domain is covalently bonded to one or both sides of the carboxy terminal and the amino terminal of the Srx protein.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 염증 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating skin inflammatory diseases, which comprises the cell-permeable Srx fusion protein as an active ingredient and comprises a pharmaceutically acceptable carrier.

또한, 본 발명은 Srx cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포 투과성 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 6번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 6번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.In addition, the present invention relates to a recombinant polynucleotide including SEQ ID NO: 6, wherein the protein transport domain peptide coding DNA sequence is coupled to Srx cDNA encoding the cell permeable fusion protein. The scope of the present invention extends not only to recombinant polynucleotides of SEQ ID NO: 6 but also to nucleic acid molecules having sequences by the codon degeneracy of the genetic code.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 융합 단백질을 발현시키는 벡터에 관한 것이다.
In addition, the present invention relates to a vector expressing a cell permeable fusion protein, characterized in that it comprises the recombinant polynucleotide to express the fusion protein.

본 발명의 설피레독신 융합 단백질은 시간 및 농도 의존적으로 세포 내로 운반되었으며, 운반된 융합 단백질은 최장 24시간 동안 유지되었다. Sulpyredoxin fusion proteins of the invention were transported into cells in a time and concentration dependent manner, and the transported fusion proteins were maintained for up to 24 hours.

또한, 본 발명의 설피레독신 융합 단백질은 과산화수소에 의한 세포 사멸을 억제하였고, 뿐만 아니라, 동물 실험에서 염증을 억제 및 개선하는 효과를 나타내었다.
In addition, the sulfyredoxin fusion protein of the present invention inhibited cell death by hydrogen peroxide, as well as inhibiting and improving inflammation in animal experiments.

도 1은 Pep-1-Srx 융합 단백질 제조를 위한 발현 벡터의 모식도이다. Pep-1-Srx 발현 벡터 구축은 벡터 pET-15b를 기반으로 하였다. 합성 Pep-1 올리고머를 pET-15b 벡터의 Nde Ｉ 및 Xho Ｉ 제한부위 사이에 클론하고, 사람 Srx cDNA는 Xho Ｉ 및 BamH Ｉ 제한부위 사이에 클론하였다.
도 2는 발현된 Pep-1-Srx 융합 단백질을 발현, 정제 및 웨스턴 블랏팅한 결과이다. 세포에서 추출한 단백질 추출물 및 정제한 단백질을 12% SDS-PAGE로 전개하여 쿠마시 브릴리언트 블루로 단백질 염색하였고(A), 항-래빗 폴리히스티딘 항체로 웨스턴 블랏팅하였다(B). A와 B에서 각 레인은 다음과 같다. 레인 1: 유도되지 않은 pPep-1-Srx 융합 단백질, 레인 2: 유도된 pPep-1-Srx 융합 단백질, 레인 3: 정제된 pPep-1-Srx 융합 단백질.
도 3은 농도별, 시간별 Pep-1-Srx 융합 단백질의 세포 도입을 나타내는 사진이다. (A) 0.5~5μM의 Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질을 배양 배지에 한 시간 동안 가하였다. (B) 5μM의 Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질을 5~60분 동안 배양배지에 가하였다. (C) 3μM의 Pep-1-Srx 융합 단백질로 미리 처리한 세포를 1~48시간 동안 배양한 다음 웨스턴 블랏 분석하였다.
도 4는 PC12 세포 생존률에 미치는 세포 도입 Pep-1-Srx 융합 단백질의 영향을 나타내는 그래프이다. 1-5μM Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 5μM Srx 단백질로 한 시간 동안 미리 처리한 PC12 세포에 800μM H2O2를 24시간 동안 처리하였다. 세포 생존률은 MTT를 이용한 발색 어세이로 측정하였다.
도 5는 LPS로 처리한 RAW 264.7 세포에서 Pep-1-Srx 융합 단백질이 산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다. Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질 한 시간 선처리 수행 또는 선처리 없이 RAW 264.7 세포를 LPS(100ng/ml)로 18시간 동안 자극한 다음 RAW 264.7 세포 배양 배지를 수확하였다. 배양 배지의 산화질소 수준은 그리스 반응(Griess reactions)에 기반한 방법을 이용하여 결정하였다.
도 6은 HaCaT 세포에서 TNF-α에 의해 유도되는 MCP-1, IL-6 및 MMP-9 발현에 미치는 Pep-1-Srx 융합 단백질의 영향을 나타내는 그래프이다. HaCaT 세포는 각각 1, 2 및 5M Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 5M Srx 단백질로 한 시간 동안 처리한 다음 TNF-α로 24시간 처리하였다. 배양 배지 일부를 채취하여 MCP-1(A), IL6(B) 및 MMP-9(C)의 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다.
도 7은 TPA에 의해 유도된 귀 염증에 대한 Pep -1- Srx 융합 단백질의 영향을 나타내는 그래프이다. ICR 마우스(각 그룹별로 다섯 마리씩)의 귀를 TPA(1㎍/귀)로 하루에 한 번씩 3일간 처리했다. TPA 처리 한 시간 후 PBS(phosphate buffered saline) 또는 Pep-1-Srx 융합 단백질을 3일간 국부 처리하였다. 마우스는 최종 처리 24시간 후 희생되었다. TPA에 의해 유도된 귀 부종에 대한 Pep-1-Srx 융합 단백질 국부 처리 효과는 귀 두께(A) 및 귀 중량(B) 변화를 측정하여 분석하였다.1 is a schematic diagram of an expression vector for preparing Pep-1-Srx fusion protein. Pep-1-Srx expression vector construction was based on the vector pET-15b. Synthetic Pep-1 oligomers were synthesized from Nde I and pET-15b vectors. Cloned between Xho I restriction sites, human Srx cDNA It was cloned between Xho I and BamH I restriction sites.
2 shows the results of expression, purification and western blotting of the expressed Pep-1-Srx fusion protein. Protein extracts and purified proteins extracted from cells were developed with 12% SDS-PAGE and protein stained with Coomassie Brilliant Blue (A) and Western blotted with anti-rabbit polyhistidine antibody (B). Each lane in A and B is Lane 1: uninduced pPep-1-Srx fusion protein, lane 2: induced pPep-1-Srx fusion protein, lane 3: purified pPep-1-Srx fusion protein.
Figure 3 is a photograph showing the cell introduction of Pep-1-Srx fusion protein by concentration and time. (A) 0.5-5 μM Pep-1-Srx fusion protein or Srx protein was added to the culture medium for one hour. (B) 5 μM of Pep-1-Srx fusion protein or Srx protein was added to the culture medium for 5 to 60 minutes. (C) Cells pretreated with 3 μM Pep-1-Srx fusion protein were incubated for 1 to 48 hours and then subjected to Western blot analysis.
4 shows the introduction of Pep-1-Srx fusion proteins into cells on PC12 cell viability. It is a graph showing the effect. PC12 cells pretreated with 1-5 μM Pep-1-Srx fusion protein or 5 μM Srx protein for one hour were treated with 800 μM H 2 O 2 for 24 hours. Cell viability was determined by color assay using MTT.
5 is a graph showing the effect of Pep-1-Srx fusion protein on nitric oxide (NO) generation in RAW 264.7 cells treated with LPS. RAW 264.7 cells were stimulated with LPS (100 ng / ml) for 18 hours with or without Pep-1-Srx fusion protein or Srx protein one hour pretreatment followed by harvesting RAW 264.7 cell culture medium. Nitric oxide levels in the culture medium were determined using a method based on Greries reactions.
FIG. 6 is a graph showing the effect of Pep-1-Srx fusion proteins on TNF-α induced MCP-1, IL-6 and MMP-9 expression in HaCaT cells. HaCaT cells were treated with 1, 2 and 5M Pep-1-Srx fusion proteins or 5M Srx protein for one hour and then with TNF-α for 24 hours. A portion of the culture medium was taken and the concentrations of MCP-1 (A), IL6 (B) and MMP-9 (C) were measured by ELISA method.
7 is a graph showing the effect of Pep -1- Srx fusion protein on ear inflammation induced by TPA. Ears of ICR mice (five in each group) were treated with TPA (1 μg / ear) once daily for three days. One hour after TPA treatment, PBS (phosphate buffered saline) or Pep-1-Srx fusion protein was topically treated for 3 days. Mice were sacrificed 24 hours after the final treatment. The effect of Pep-1-Srx fusion protein localization on ear edema induced by TPA was analyzed by measuring ear thickness (A) and ear weight (B) changes.

이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 실시예의 기재범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 세포 투과성 Srx 융합 단백질로서 "Pep-1-Srx" 융합 단백질을 위주로 실시예 및 그 결과를 기재하였으나, Srx 단백질의 C-말단에 Pep-1이 공유결합된 Srx-Pep-1 융합 단백질(서열번호 9) 및 Srx 단백질의 N-말단과 C-말단에 Pep-1이 공유결합된 Pep-1-Srx-Pep-1 융합 단백질(서열번호 11)도 "Srx 융합 단백질" 범주에 속하며, 각 실시예에서 "Pep-1-Srx" 융합 단백질과 거의 유사한 정도(71~93%)의 결과를 나타내었다.
Hereinafter, the configuration of the present invention in more detail through specific embodiments. It is to be understood, however, that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, is intended to cover various modifications and equivalent arrangements included within the spirit and scope of the appended claims. In particular, the embodiment of the present invention described the examples and the results mainly on the "Pep-1-Srx" fusion protein as cell-permeable Srx fusion protein, Srx- covalently bonded to Pep-1 at the C-terminus of the Srx protein The Pep-1 fusion protein (SEQ ID NO: 9) and the Pep-1-Srx-Pep-1 fusion protein (SEQ ID NO: 11) covalently linked to the N-terminus and C-terminus of the Srx protein are also "Srx fusion proteins. Belonging to the category, and in each example, the results were almost similar (71-93%) to the "Pep-1-Srx" fusion protein.

<재료> <Material>

제한 효소와 T4 DNA 라이게이즈(ligase)는 Promega (USA)에서 구입하였고, Pfu 폴리머레이즈(polymerase)는 stratagene(USA)에서 구입하였다. Pep-1 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer (USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa (Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni2 +-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우(nitrilotriactic acid sepharose superflow)는 Qiagen (Germany)에서 구입하였다. 사람 설피레독신(Srx) cDNA는 PCR 방법으로 사람 간 cDNA 라이브러리에서 분리하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.
Restriction enzymes and T4 DNA ligase were purchased from Promega (USA) and Pfu polymerase was purchased from stratagene (USA). Pep-1 oligonucleotides were synthesized in Gibco BRL custom primer (USA). IPTG was purchased from Duchefa (Netherland). pET-15b and BL21 (DE3) plasmids were purchased from Novagen (USA), Ni 2 + - to three seconds acid Sepharose Super flow (nitrilotriactic acid superflow sepharose) nitrile was purchased from Qiagen (Germany). Human sulfiradoxin (Srx) cDNA was isolated from human liver cDNA library by PCR method. All other reagents were used as express products.

<실시예 1: 설피레독신 융합 단백질 발현벡터 제조 및 형질변환> < Example 1: Preparation and transformation of sulfiradoxin fusion protein expression vector>

기능을 가진 단백질을 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 세포 내로 목표 단백질을 전달할 수 있는 융합 단백질 발현벡터를 제조하였고, 목표 단백질로서 인간 설피레독신(Sulfiredoxin; Srx) 단백질을 선택하였다.In order to develop a technique of infiltrating a protein having a function into a cell, a fusion protein expression vector capable of delivering a target protein into a cell was prepared, and a human sulfidodoxin (Srx) protein was selected as a target protein.

먼저, Pep-1-Srx 융합 단백질을 생산하기 위해 Pep-1 펩타이드 (KETWWE TWWTEW SQP KKKRKV; 21 amino acid; 서열번호 3)가 포함된 pET-PEP 발현벡터를 제조하였다. Pep-1 펩타이드에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드 {위쪽 사슬, 5'-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3'(서열번호 1); 아래쪽 사슬(bottom strand), 5'-TCGAGCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGACACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3'(서열번호 2)}를 Nde Ｉ-Xho Ｉ 제한효소로 자른 pET-15b에 결찰(ligation)하여 삽입하였다. 이어, 사람 설피레독신 cDNA 서열을 기본으로 하여 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머는 5'-CTCGAGGGGCTGCGTGCAGGAGGAACGCTGGGC-3'(서열번호 4)로 Xho Ｉ 제한부위를 지니고 있으며 역방향 프라이머는 5'-GGATCCCTACTGCAAGTCTGGTGTGGATGCTCC-3'(서열번호 5)로 BamH Ｉ 제한부위를 포함한다.First, Pep-1-Srx To produce a fusion protein, a pET-PEP expression vector containing Pep-1 peptide (KETWWE TWWTEW SQP KKKRKV; 21 amino acid; SEQ ID NO: 3) was prepared. Two kinds of oligonucleotides corresponding to the Pep-1 peptide {top chain, 5'-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3 '(SEQ ID NO: 1); The bottom strand, 5'-TCGAGCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGACACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3 '(SEQ ID NO: 2)} was ligated into pET-15b cut with Nde I - Xho I restriction enzyme. Subsequently, two kinds of oligonucleotides were synthesized based on the human sulfidoxin cDNA sequence. The forward primer has the Xho I restriction site at 5'-CTCGAGGGGCTGCGTGCAGGAGGAACGCTGGGC-3 '(SEQ ID NO: 4) and the reverse primer contains the BamH I restriction site at 5'-GGATCCCTACTGCAAGTCTGGTGTGGATGCTCC-3' (SEQ ID NO: 5).

중합효소 연쇄반응 (PCR)은 온열 순환반응기 (Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였다. 반응 혼합액을 50㎕ 실리콘 반응 튜브에 넣고 94℃에서 5분간 가열하였다. PCR 반응을 수행하였다. PCR 수행 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하여 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터 (Invitrogen, Sandiego, USA)에 연결한 다음, 세포에 형질변환시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균법으로 분리하였다. 사람 Srx cDNA가 포함된 TA 벡터를 Xho Ｉ과 BamH Ｉ으로 절단한 다음 Srx 발현 벡터에 삽입하였다. Pep-1-Srx로 형질변환된 E. coli BL21 (DE3)를 선택한 다음, 콜로니를 100㎖ LB 배지에 접종하고 IPTG (0.5 mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 Pep-1-Srx의 과대발현을 유도하였다. 과대발현된 Pep-1-Srx은 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.
Polymerase chain reaction (PCR) was performed in a thermal cycle reactor (Perkin-Elmer, model 9600). The reaction mixture was placed in a 50 μl silicon reaction tube and heated at 94 ° C. for 5 minutes. PCR reactions were performed. After PCR, the reaction was separated by agarose gel electrophoresis to separate the reactions, which were then linked to a TA cloning vector (Invitrogen, Sandiego, USA), transformed into cells and plasmids isolated from the transformed bacteria by alkaline lysis. . TA vectors containing human Srx cDNA were identified by Xho I and Cleavage with BamH I and insertion into the Srx expression vector. E. coli BL21 (DE3) transformed with Pep-1-Srx was selected, and colonies were inoculated in 100 ml LB medium and IPTG (0.5 mM) was added to the medium to overexpress the recombinant Pep-1-Srx. Induced. Overexpressed Pep-1-Srx was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis.

<< 실시예Example 2:  2: 설피레독신Sulfiradoxin 융합 단백질 발현 및 정제> Fusion Protein Expression and Purification>

본 발명자들이 제조한 인간 Srx cDNA가 포함되어 있는 E. coli BL21 (DE3) 세포 (Pep-1-Srx)를 암피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200 rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D600 = 0.5~1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 각각 0.5와 1mM 되게 한 다음 30℃에서 12시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 5㎖ 결합 완충액 (5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)을 넣고 초음파 분쇄기로 분쇄(sonication)하였다. 원심분리하여 상층액을 즉시 Ni2 +-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼 플로우 (Ni2 +-nitrilotriacetic acid sepharose super flow) 컬럼에 부하하고 10배 부피의 결합완충액과 6배 부피의 세척완충액 (60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 세척한 다음 용출완충액 (1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 융합 단백질을 용출하였다. 이어, 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다. E. coli BL21 (DE3) cells (Pep-1-Srx) containing human Srx cDNA prepared by the present inventors were put in LB medium containing ampicillin and cultured at 37 ° C. at 200 rpm. When the bacterial concentration in the culture medium was OD 600 = 0.5-1.0, IPTG was added to the medium to bring the final concentration to 0.5 and 1 mM, respectively, and then further incubated at 30 ° C for 12 hours. The cultured cells were collected by centrifugation, and 5 ml of binding buffer (5 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) was added and then sonicated by an ultrasonic mill. The supernatant was immediately centrifuged Ni 2 + - acrylonitrile three seconds acid Sepharose Super flow (Ni 2 + -nitrilotriacetic acid sepharose super flow) load to the column, washed with buffer, binding buffer and 6 times the volume of 10-fold volume (60mM already The fusion protein was washed with dozol, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9) followed by elution buffer (1M imidazole, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9). Subsequently, the fractions containing the fusion protein were collected and PD-10 column chromatography was performed to remove salts contained in the fractions.

정제된 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드 방법으로 측정하였다.
Purified protein concentration was determined by Bradford method using bovine serum albumin as a standard.

<< 실시예Example 3: 세포배양 및  3: cell culture and 설피레독신Sulfiradoxin 융합 단백질의 세포 내 투과> Intracellular Permeation of Fusion Proteins>

PC12, Raw 264.7 그리고 HaCaT 세포는 37℃에서 95% 공기와 5% CO2를 공급해주며 20mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 5mM NaHCO3, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 항생제(100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였다.PC12, Raw 264.7 and HaCaT cells provide 95% air and 5% CO 2 at 37 ° C with 20 mM HEPES / NaOH (pH 7.4), 5 mM NaHCO 3 , 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics (100 µg / ml). Incubated in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium containing streptomycin, 100 U / ml penicillin).

Pep-1-Srx 융합 단백질의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여, PC12 세포를 6-웰 플레이트에서 12시간 동안 키운 뒤 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 배양액으로 교체하고, 재조합 Pep-1-Srx을 농도 및 시간별로 배양액 내에 처리하였다. 처리 후 세포를 트립신-EDTA (Gibco BRL)로 처리하고 인산 완충액 생리식염수 (phosphate buffered saline; PBS)로 충분히 세척하고 세포를 분쇄한 다음 세포 내로 투과된 설피레독신의 양을 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다.
To observe the intracellular penetration of Pep-1-Srx fusion protein, PC12 cells were grown in 6-well plates for 12 hours, then replaced with fresh DMEM culture containing 10% FBS, and recombinant Pep-1-Srx was concentrated in concentration. And treated in culture medium by time. After treatment, the cells were treated with trypsin-EDTA (Gibco BRL), thoroughly washed with phosphate buffered saline (PBS), the cells were ground, and the amount of sulfyredoxine permeated into the cells was measured by Western blotting. .

<< 실시예Example 4:  4: 웨스턴Western 블랏Blot >>

Pep-1-Srx 융합 단백질의 세포내 투과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 방법을 수행하였다. 먼저 단백질은 자연상태로 정제하였다. 준비된 피부 세포에 Pep-1-Srx 융합 단백질(5μM)을 처리한 다음 1시간 후, 세포들만 모아서 웨스턴블랏을 수행하였다. 세포 분쇄액 내의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 나이트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이동시켰다. 단백질이 이동된 나이트로셀룰로스 막을 5% 탈분유(non-dry milk)가 들어 있는 TBST로 블로킹하였다. 이어 막은 래빗 항-히스티딘 폴리클론 항체(Santacruze, USA, 1:1,000)로 1시간 처리하였다. 세척 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 마우스 항-래빗 IgG 항체 (1:10,000 희석)와 1시간 반응시켰다. 최종적으로 ECL kit (ECL; Amersham) 을 이용하여 사람 설피레독신 단항체에 반응하는 단백질 띠를 확인하였다.
Western blot methods were performed to confirm intracellular penetration of the Pep-1-Srx fusion protein. First, the protein was purified in its natural state. Pep-1-Srx fusion protein (5μM) was treated to the prepared skin cells, and after 1 hour, cells were collected and Western blots were performed. Proteins in the cell mill were separated by 12% SDS polyacrylamide gel electrophoresis and the proteins in the gels were then transferred to nitrocellulose membranes (Amersham, UK). Protein-transferred nitrocellulose membranes were blocked with TBST containing 5% non-dry milk. The membrane was then treated with rabbit anti-histidine polyclonal antibody (Santacruze, USA, 1: 1,000) for 1 hour. After washing, the cells were reacted with horseradish peroxidase-bound mouse anti-rabbit IgG antibody (1: 10,000 dilution) for 1 hour. Finally, ECL kit (ECL; Amersham) was used to identify protein bands in response to human sulfiradoxin monoantibodies.

<< 실시예Example 5:  5: 피부세포로Into skin cells 투과된  Transmitted 설피레독신Sulfiradoxin 융합 단백질의 안정성> Stability of Fusion Proteins>

세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질의 세포내 안정성을 측정하기 위하여, 피부 세포를 6-웰 플레이트에서 12시간 동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1㎖의 신선한 배양액으로 교체하고 Pep-1-Srx 융합 단백질을 배양액 내에 처리하였다. 처리 1시간 후 세포를 트립신-EDTA로 처리하고 PBS로 충분히 세척하였다. 이어 FBS가 포함된 배지를 넣고 계속 배양하면서, 시간별로 세포를 모아 세포 내에 남아 있는 융합 단백질의 양을 웨스턴 블랏으로 측정하였다.
To measure the intracellular stability of the Pep-1-Srx fusion protein permeated into cells, skin cells were grown in 6-well plates for 12 hours and then replaced with 1 ml fresh culture medium without FBS and Pep-1- Srx fusion proteins were treated in culture. One hour after treatment cells were treated with trypsin-EDTA and washed well with PBS. Subsequently, the medium containing the FBS was added thereto, followed by continuous incubation. The cells were collected over time and the amount of fusion protein remaining in the cells was measured by Western blot.

<< 실시예Example 6:  6: MTTMTT 분석> Analysis>

H2O2에 의한 세포독성에 있어서 설피레독신 단백질의 효능을 확인하기 위하여 MTT 어세이를 수행하기 하였다. PC12 세포를 24웰에 7X104으로 깔아 준 후 37℃, 7.0 % CO2 배양기에서 오버나잇 하였다. 다음날 PBS로 세척한 후 10% FBS( fetal bovine serum)가 함유된 배지 1㎖에 H2O2을 각 농도에 맞게 처리하여 준 후 18시간 동안 배양하였다. 다음날 배지를 제거한 후 1mg/ml 농도의 MTT가 포함된 RPMI 0.5ml를 넣어 준 후 3시간 배양하였다. 배양 후 색이 변한 세포에 아이소프로판올(iso-propanol)을 첨가하여 1분 동안 가볍게 흔들어 준 후 100㎕의 시료를 ELISA 판독기를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
The MTT assay was performed to confirm the efficacy of sulfiradoxin protein in cytotoxicity by H 2 O 2 . PC12 cells were placed in 24 wells at 7 × 10 4 , then at 37 ° C., 7.0% CO 2. Overnight in incubator. The next day, the cells were washed with PBS and treated with H 2 O 2 in a concentration of 1 ml of medium containing 10% FBS (fetal bovine serum), followed by incubation for 18 hours. The next day, after removing the medium and put 0.5ml RPMI containing MTT concentration of 1mg / ml and incubated for 3 hours. After incubation, isopropanol (iso-propanol) was added to the changed color cells, and gently shaken for 1 minute, and then 100 μl of the sample was measured for absorbance at 570 nm using an ELISA reader.

<< 실시예Example 7: 산화질소( 7: nitric oxide ( NONO ) ) 어세이Assay >>

5X105으로 깔린 Raw 264.7 세포에 Pep-1-Srx 융합 단백질을 처리한 후 한 시간 뒤에 LPS를 처리하여 18시간 동안 배양하였다. Griess reagent system을 이용하여 얻어진 상층액 내의 산화질소(Nitrite)를 측정하였다.
After treatment with Pep-1-Srx fusion protein on Raw 264.7 cells cultivated with 5 × 10 5 , the cells were incubated for 18 hours by treatment with LPS. Nitric oxide (Nitrite) in the supernatant obtained by using the Griess reagent system was measured.

<< 실시예Example 8:  8: ELISAELISA >>

5X105으로 깔린 HaCaT 세포에 PEP-Srx를 처리한 후 1시간 뒤에 TNF-α를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 얻어진 상층액에서 존재하는 염증관련 분자(MCP-1, IL-6 및 MMP-9)의 양을 샌드위치 ELISA 방법 (ELISA, R&D system Inc, USA)을 이용하여 실험을 수행하였다. 먼저 캡처 항체(capture Ab; mouse anti-human MCP-1, mouse anti-human IL-6 및 mouse anti-human MMP-9)를 96웰에 2㎍/㎖ 되게 넣었고 37℃에서 2시간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였다. 블로킹 용액(1% BSA in PBS)을 400㎕씩 넣어준 후 37℃에서 1시간 배양한 후 Srx 또는 Pep-1-Srx 융합 단백질을 처리하고 TNF-α를 처리하여 얻은 배지를 각 웰에 넣어준 후 37℃에서 2시간 배양하였다. PBST로 3회 세척한 후, detection antibody (biotinylated goat anti-human MCP-1, biotinylated goat anti-human IL-6 and biotinylated goat anti-human MMP-9)를 각 웰 당 100ng/ml 넣고, 37℃에서 2시간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였고 스트렙타비딘(streptavidin)이 결합된 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)를 200:1로 희석하여 각 웰에 50㎕씩 넣었다. 37℃에서 30분간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였다. TMB 용액을 50㎕ 넣고 상온에서 30분간 배양한 후 정지 용액(stop solution)을 TMB 용액과 1:1이 되게 넣어 주었다. 이후 450nm에서 흡광도를 ELISA 판독기로 측정하였다.
HaCaT cells incubated with 5 × 10 5 were treated with PEP-Srx 1 hour later and treated with TNF-α for 24 hours. The amount of inflammation-related molecules (MCP-1, IL-6 and MMP-9) present in the obtained supernatant was tested using a sandwich ELISA method (ELISA, R & D system Inc, USA). First, capture antibodies (capture Ab; mouse anti-human MCP-1, mouse anti-human IL-6, and mouse anti-human MMP-9) were put in 96 웰 2 ㎍ / ㎖ and incubated for 2 hours at 37 ℃ PBST Washed three times. 400 μl of blocking solution (1% BSA in PBS) was added thereto, followed by incubation at 37 ° C. for 1 hour, followed by treatment with Srx or Pep-1-Srx fusion proteins and TNF-α-treated medium into each well. Then incubated for 2 hours at 37 ℃. After washing three times with PBST, 100ng / ml of detection antibody (biotinylated goat anti-human MCP-1, biotinylated goat anti-human IL-6 and biotinylated goat anti-human MMP-9) was added to each well, and then at 37 ° C. After incubation for 2 hours, the cells were washed three times with PBST, and streptavidin-bound horseradish peroxidase (HRP) was diluted 200: 1 and 50 µl was added to each well. After incubation for 30 minutes at 37 ℃ washed three times with PBST. After 50 μl of TMB solution was incubated at room temperature for 30 minutes, a stop solution was added to be 1: 1 with the TMB solution. Absorbance at 450 nm was then measured with an ELISA reader.

<< 실시예Example 9: 동물 처리> 9: animal treatment>

자성(Female) ICR 마우스(4-5주령)는 한림대학교 실험동물센터로부터 공급받았다. 마우스는 23℃ 온도와 습도 60%, 12시간 빛/어둠 싸이클 조건에서 사육되었다. TPA와 프레드니졸론(prednisolone)은 20㎕의 아세톤에 녹여 마우스 귀에 처리하였다. TPA에 의한 마우스 귀 부종에 있어서 Pep-1-Srx 융합 단백질의 효능을 확인하기 위하여 귀 두께 및 무게를 측정하였다. 마우스 귀에 TPA(1 ㎍/ear)를 1시간 동안 처리 후 Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질을 하루에 한 번 3일 동안 처리하였다. 4일째 되는 날에 귀 부종 정도를 측정하였다.
Female ICR mice (4-5 weeks old) were supplied from Hallym University Laboratory Animal Center. Mice were bred at 23 ° C. temperature and 60% humidity for 12 hours light / dark cycle conditions. TPA and prednisolone were dissolved in 20 μl of acetone and treated in mouse ears. Ear thickness and weight were measured to confirm the efficacy of the Pep-1-Srx fusion protein in mouse ear edema by TPA. Mouse ears were treated with TPA (1 μg / ear) for 1 hour and then treated with Pep-1-Srx fusion protein or Srx protein once a day for 3 days. Ear edema was measured on the fourth day.

결과 1) 재조합 Result 1) Recombination PepPep -1--One- SrxSrx 융합단백질의Of the fusion protein 과대발현 및 정제 Overexpression and Refining

Pep-1-Srx 융합 단백질을 과대발현시키기 위해 사람 Srx cDNA, Pep-1 펩타이드(KETWWETWWTEW SQP KKKRKV; 21개 아미노산) 및 6개의 히스티딘이 연속적으로 포함되어 있는 Pep-1-Srx 발현 벡터를 개발하였다(도 1).To overexpress the Pep-1-Srx fusion protein, a Pep-1-Srx expression vector was developed that contains human Srx cDNA, Pep-1 peptide (KETWWETWWTEW SQP KKKRKV; 21 amino acids) and 6 histidines in succession ( 1).

IPTG로 융합 단백질의 과대발현을 유도한 대장균 세포를 4℃에서 초음파 분쇄기로 파쇄한 다음 원심분리하여 상층액의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 도 2는 Pep-1-Srx 융합 단백질을 과대발현시켜 정제된 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 단백질 띠(도 2A)와 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다(도 2B). 도 2A의 레인 2는 0.5mM IPTG를 처리하여 과대발현된 융합 단백질을 나타내고 있다.E. coli cells, which induced overexpression of the fusion protein with IPTG, were disrupted by an ultrasonic grinder at 4 ° C. and centrifuged to separate supernatant proteins by 12% SDS-PAGE. 2 is a result of overexpressing the Pep-1-Srx fusion protein and confirming the purified protein stained with Coomassie Brilliant Blue (FIG. 2A) and Western blot (FIG. 2B). Lane 2 of FIG. 2A shows the fusion protein overexpressed by treatment with 0.5 mM IPTG.

Pep-1-Srx 융합 단백질은 N-말단에 여섯 개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피 (immobilized metal-chelate affinity chromatography) 단일 단계로 융합 단백질을 자연상태로 순수하게 정제하였다.Since the Pep-1-Srx fusion protein contained six histidines at the N-terminus, the fusion protein was purified purely in a single step by immobilized metal-chelate affinity chromatography.

과대발현 및 정제된 Pep-1-Srx 융합 단백질을 웨스턴 블랏으로 다시 한 번 확인하였다. 도 2B에 나타낸 바와 같이 6x 히스티딘 항체에 반응하는 Pep-1-Srx 융합 단백질 띠는 도 2A의 단백질 띠와 동일한 위치에서 관찰되었다.
Overexpressed and purified Pep-1-Srx fusion protein was once again confirmed by Western blot. As shown in FIG. 2B, the Pep-1-Srx fusion protein band in response to 6x histidine antibody was observed at the same position as the protein band of FIG. 2A.

결과 2) Result 2) PC12PC12 세포 내로  Into the cell PepPep -1--One- SrxSrx 융합 단백질의 투과 Permeation of Fusion Proteins

자연 상태(native form)에서 정제한 Pep-1-Srx 융합 단백질의 피부 세포내 투과가 시간 및 농도에 따라 어떻게 변화되는지를 관찰하였다. 도 3에 나타낸 것처럼 자연 상태의 Pep-1-Srx 융합 단백질은 시간 및 농도 의존적으로 피부 세포 내로 투과되는 것을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 도 3A는 농도에 따라 Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질을 1시간 동안 세포배양액 내에 처리하였을 때의 결과이고, 도 3B는 5μM Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질을 시간에 따라 처리한 결과이다. Pep-1-Srx 융합 단백질의 세포내 투과 정도를 농도별로 관찰했을 때, 농도 의존적으로 세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질의 양이 증가하는 반면 세포 투과성 도메인이 없는 Srx 단백질의 경우 세포 내로 투과되지 않음을 확인하였다(도 3A). 또한, 시간별로 관찰하였을 경우 처리 시간에 비례하여 세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질의 양이 증가함을 확인하였다(도 3B). 이러한 결과로부터 Pep-1-Srx 융합 단백질은 시간 및 농도 의존적으로 세포내 투과가 일어남을 알 수 있었다.It was observed how the intracellular permeation of the purified Pep-1-Srx fusion protein in native form changes with time and concentration. As shown in FIG. 3, Western blotting confirmed that the natural Pep-1-Srx fusion protein was permeated into skin cells in a time and concentration-dependent manner. FIG. 3A shows the results of treatment with Pep-1-Srx fusion protein or Srx protein in cell culture medium for 1 hour, and FIG. 3B shows treatment with 5 μM Pep-1-Srx fusion protein or Srx protein over time. The result is. Intracellular permeation of Pep-1-Srx fusion protein was observed by concentration, whereas the amount of Pep-1-Srx fusion protein permeated into the cell increased in concentration-dependent manner, whereas Srx protein without cell permeable domain was introduced into the cell. It was confirmed that it did not permeate (FIG. 3A). In addition, when observed over time, it was confirmed that the amount of Pep-1-Srx fusion protein permeated into cells increased in proportion to the treatment time (FIG. 3B). From these results, it was found that intracellular permeation of Pep-1-Srx fusion protein occurred in a time and concentration-dependent manner.

PC12 세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질은 상당한 기간 동안 세포 내에서 안정성을 유지해야만 효과적으로 단백질 치료에 응용할 수 있다. 도 3C에 나타낸 바와 같이 세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질은 시간에 따라 분해되어 단백질의 양이 점차 감소하였으나, 최대 24시간 동안 세포 내에서 존재함을 알 수 있었다. 따라서, 세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질은 최대 24 시간은 안정성을 유지하고 있기 때문에 유용하게 단백질 치료에 응용할 수 있으리라 사료된다.
Pep-1-Srx fusion proteins permeated into PC12 cells must remain stable in cells for a significant period of time before they can be effectively applied to protein therapy. As shown in FIG. 3C, the Pep-1-Srx fusion protein permeated into the cell was degraded with time, and the amount of protein gradually decreased, but the protein was present in the cell for up to 24 hours. Therefore, the Pep-1-Srx fusion protein permeated into cells is useful for protein treatment because it maintains stability for up to 24 hours.

결과 3) Result 3) PC12PC12 세포에서  In a cell HH 22 OO 22 에 의한 세포 사멸에 대한 For cell death by SrxSrx 융합 단백질의 효과 Effect of Fusion Proteins

여러 가지 요인에 의하여 활성산소의 생성이 증가하거나 항산화효소의 작용 감소 또는 항산화 효소가 감당할 수 없을 정도의 과도한 활성 산소의 증가는 산화적 스트레스로 작용하여 생체 내의 고분자 물질인 불포화 지방산, 단백질, DNA 등과 반응하여 다양한 기전을 통해 세포의 노화와 변형을 유도하거나 세포 사멸을 일으키는 것으로 알려져 있다. 특히 과도한 산화적 스트레스는 염증 관련 질병이나 신경세포 사멸 등에 관련된 여러 가지 질병에 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그리하여 H2O2에 의한 신경세포 사멸에 있어서 Pep-1-Srx 융합 단백질의 효능을 확인하여 보았다. 도 4와 같이, H2O2에 의한 신경세포 사멸에 있어서 Srx 단백질은 세포사멸 억제 효능을 나타내지 않는 반면, Pep-1-Srx 융합 단백질의 경우 농도 의존적으로 세포사멸 억제 효능이 있음을 MTT 어세이를 통하여 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 Pep-1-Srx 융합 단백질이 신경세포에서 H2O2 에 의한 세포 사멸을 억제하고 신경세포를 보호하는 효능이 있음을 알 수 있었다.
Increased production of free radicals, decreased activity of antioxidant enzymes, or excessive increase of free radicals that antioxidant enzymes cannot afford due to various factors act as oxidative stresses, resulting in unsaturated fatty acids, proteins, DNA, etc. In response, various mechanisms are known to induce aging and transformation of cells or to cause cell death. In particular, excessive oxidative stress is known to be closely related to various diseases related to inflammation-related diseases and neuronal cell death. Thus, the effect of Pep-1-Srx fusion protein on neuronal cell death by H 2 O 2 was confirmed. As shown in FIG. 4, in the neuronal cell death by H 2 O 2 , the Srx protein did not show apoptosis inhibitory effect, whereas in the case of Pep-1-Srx fusion protein, there was a concentration-dependent inhibition of apoptosis in the MTT assay. It was confirmed through. These results suggest that Pep-1-Srx fusion protein is a H 2 O 2 neuron. It was found that there is an effect of inhibiting cell death by and protecting neurons.

결과 4) Result 4) RawRaw 264.7 세포에서  In 264.7 cells LPSLPS 에 의해 유도된 Induced by NONO 의 생성에 대한 For the creation of PepPep -1-Srx 융합 단백질의 효과Effect of -1-Srx Fusion Proteins

잘 알려진 바와 같이 NO 및 TNF-a, IL-6, MCP-1, MMP-9 등과 같은 염증 관련 분자들은 다양한 염증관련 질병에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 염증 관련 질병의 예방 및 치료에 있어서 상기 염증관련 분자의 억제가 매우 핵심적인 요소라 할 수 있다. 많은 연구 결과에 의하면 LPS에 의해 유도되는 산화질소(NO)의 생성에는 활성산소종이 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, LPS에 의해서 유도된 산화질소 생성에 있어서 Pep-1-Srx 융합 단백질의 효능을 확인하기 위하여 Raw 264.7 세포에 Srx 단백질 또는 Pep-1-Srx 융합 단백질을 농도별로 처리한 후 LPS를 18시간 동안 처리하여 NO 생성을 확인하였다. 도 5와 같이 LPS에 의한 NO 생성에 있어서 Srx 단백질은 NO 생성 억제 효능이 없는 반면 Pep-1-Srx 융합 단백질의 경우 농도 의존적으로 NO 생성을 감소시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 Pep-1-Srx 융합 단백질이 신경세포에서 H2O2에 의한 세포 사멸억제 효능뿐만 아니라 LPS에 의한 염증관련 분자 생성을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
As is well known, inflammation and related molecules such as NO and TNF-a, IL-6, MCP-1, MMP-9 and the like are known to be involved in various inflammation-related diseases. Therefore, the suppression of the inflammation-related molecules in the prevention and treatment of inflammation-related diseases is a very important factor. Many studies have shown that reactive oxygen species are involved in the production of nitric oxide (NO) induced by LPS. Therefore, in order to confirm the efficacy of Pep-1-Srx fusion protein in LPS-induced nitric oxide production, LPS was treated for 18 hours after treatment with Srx protein or Pep-1-Srx fusion protein in concentrations in Raw 264.7 cells. Treatment confirmed NO production. As shown in FIG. 5, the Srx protein had no inhibitory effect on NO production by LPS, whereas the Pep-1-Srx fusion protein reduced NO production in a concentration-dependent manner. These results suggest that Pep-1-Srx fusion protein can regulate the formation of inflammation-related molecules by LPS as well as the inhibitory effect of H 2 O 2 on neuronal cell death.

결과 5) Result 5) HaCaTHaCaT 세포에서  In a cell TNFTNF -α에 의해 유도된 induced by -α 친염증성Proinflammatory 유전자( gene( propro -inflammatory -inflammatory genegene ; ; ILIL -6, -6, MCPMCP -1, -One, MMPMMP -9) 발현에 있어서 -9) in expression SrxSrx 융합 단백질의 억제 효과 Inhibitory Effect of Fusion Proteins

아토피 질환이나 천식 등과 같은 염증 관련 질환들은 다양한 친염증성 유전자들이 과도한 활성산소종에 의해 발현 유도되는 것으로 알려져 있으며, 이에 대한 방어 기작으로 세포 내 다양한 항산화 효소들이 작용하는 것으로 알려져 있다. 각질세포(keratinocytes)의 경우 다양한 염증 관련 분자를 생성할 수 있는 주요 세포로 알려져 있으므로 TNF-α에 의해 유도된 친염증성 유전자인 IL-6, MCP-1 및 MMP-9 발현에 있어서 Pep-1-Srx 융합 단백질의 효능을 확인해 보았다. 도 6에서 보듯이 TNF-α에 의해 유도된 친염증성 유전자 (IL-6, MCP-1, MMP-9) 발현 증가에 있어서 Pep-1-Srx 융합 단백질을 1시간 전처리한 것에서는 친염증성 유전자 (IL-6, MCP-1, MMP-9)의 발현이 Pep-1-Srx 융합 단백질 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었으며, 세포 침투성이 없는 Srx 단백질은 TNF-α에 의해 증가된 친염증성 유전자의 발현을 감소시키지 못했다. 이러한 결과를 통하여 Raw 264.7 세포에서 LPS에 의한 NO의 생성 억제뿐만 아니라 HaCaT 세포에서 TNF-α에 의한 친염증성 유전자 (IL-6, MCP-1, MMP-9)의 발현이 세포 침투성 Pep-1-Srx 융합 단백질에 의해 조절됨을 확인하였다.
Inflammation-related diseases such as atopic disease and asthma are known to be induced by the expression of various proinflammatory genes by excessive reactive oxygen species, and various antioxidant enzymes in cells are known to act as a defense mechanism. Since keratinocytes are known to be the major cells that can produce various inflammation-related molecules, Pep-1- is expressed in the expression of IL-6, MCP-1 and MMP-9, pro-inflammatory genes induced by TNF-α. The efficacy of the Srx fusion protein was confirmed. As shown in FIG. 6, 1 hour pretreatment of Pep-1-Srx fusion protein in expression of TNF-α-induced pro-inflammatory genes (IL-6, MCP-1, MMP-9) was performed. The expression of IL-6, MCP-1, MMP-9) decreased in a Pep-1-Srx fusion protein concentration-dependent manner, and Srx protein without cell permeability was found to have an increased proinflammatory effect on TNF-α. It did not reduce expression. These results indicate that the expression of pro-inflammatory genes (IL-6, MCP-1, MMP-9) by TNF-α in HaCaT cells, as well as inhibition of NO production by LPS in Raw 264.7 cells, is a cellular invasive Pep-1-. It was confirmed that it is regulated by the Srx fusion protein.

결과result 6) 6) TPATPA (12- (12- OO -- tetradecanoylphorboltetradecanoylphorbol -13--13- acetateacetate ) 에 의해 유도된 마우스 귀 부종에 있어서 In mouse ear edema induced by SrxSrx 융합 단백질의 억제 효과 Inhibitory Effect of Fusion Proteins

앞선 결과에서 보듯이, 세포 수준에서 Srx 융합 단백질의 염증 관련 분자 발현 억제 효능을 확인한바 있다(도 5 및 도 6). 이러한 Srx 융합 단백질의 염증 억제 효과가 동물 수준에서도 나타나는지를 확인하기 위하여 귀 두께 및 무게를 측정하여 마우스의 귀 부종에 미치는 영향을 실험하였다. 도 7과 같이, TPA에 의해 유도된 귀 부종에 Srx 융합 단백질을 처리한 결과, Srx 융합 단백질에 의해 유의성 있게 귀의 두께와 무게 모두 낮아져 Srx 융합 단백질이 귀 염증을 회복시키는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 Srx 융합 단백질이 인비보(in vivo) 수준에서도 염증 억제의 효과가 있음을 알 수 있었다.
As shown in the previous results, the inhibitory effect of Srx fusion protein on inflammation-related molecular expression was confirmed at the cellular level (FIGS. 5 and 6). In order to confirm whether the inflammatory inhibitory effect of the Srx fusion protein appears at the animal level, the effect on the ear edema of the mouse was measured by measuring the thickness and weight of the ear. As shown in FIG. 7, as a result of treating the Srx fusion protein to the ear edema induced by TPA, the thickness and weight of the ear were significantly lowered by the Srx fusion protein, indicating that the Srx fusion protein restored ear inflammation. These results show that Srx fusion protein has an inhibitory effect on inflammation at the in vivo level.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> A composition containing cell-transducing Srx fusion protein for preventing and treating inflammatory disorders <130> inipat-hallym-pep-srx <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 1 tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60 taaagtgc 68 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bottom strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 2 tcgagcactt tacgtttttt tttcggctga caccattcgg tccaccaggt ttcccaccag 60 gtttctttcc 70 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein transducing domain called PEP-1 <400> 3 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of human sulfiredoxin <400> 4 ctcgaggggc tgcgtgcagg aggaacgctg ggc 33 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University <120> A composition containing cell-transducing Srx fusion protein for          preventing and treating inflammatory disorders <130> inipat-hallym-pep-srx <160> 11 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 1 tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60 taaagtgc 68 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bottom strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 2 tcgagcactt tacgtttttt tttcggctga caccattcgg tccaccaggt ttcccaccag 60 gtttctttcc 70 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein transducing domain called PEP-1 <400> 3 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys   1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val              20 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of human sulfiredoxin <400> 4 ctcgaggggc tgcgtgcagg aggaacgctg ggc 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> 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Ser Thr Pro Asp Leu Gln Lys Glu Thr 145 150 155 160 Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg                 165 170 175 Val    

Claims (8)

9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 설피레독신의 최소한 일측 말단에 공유결합되며, 그 아미노산 서열이 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11과 같은 것을 특징으로 하는 세포침투 효율이 향상된 설피레독신 융합 단백질.A transport domain consisting of 9 to 15 amino acid residues and containing at least 3/4 of an arginine or lysine residue is covalently linked to at least one end of the sulfiredoxin, and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 Sulpyredoxin fusion protein with improved cell permeation efficiency, such as characterized in that. 삭제delete 삭제delete 염기 서열이 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10과 같은 것을 특징으로 하는, 상기 제1항의 설피레독신 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.Recombinant polynucleotide encoding the sulfidoredxin fusion protein of claim 1, characterized in that the base sequence is the same as SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10. 삭제delete 제4항의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 설피레독신 융합 단백질 발현벡터.Sulpyredoxin fusion protein expression vector comprising the recombinant polynucleotide of claim 4. 제1항의 설피레독신 융합 단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 염증성 피부질환 또는 피부암의 예방 및 치료제로서 사용되는 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition comprising the sulfyredoxin fusion protein of claim 1 as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier, and used as an agent for preventing and treating inflammatory skin disease or skin cancer. 제1항의 설피레독신 융합 단백질을 유효성분으로 하며, 피부노화 및 피부염증 개선용 화장료 조성물.The sulfyredoxin fusion protein of claim 1 as an active ingredient, a cosmetic composition for improving skin aging and skin inflammation.
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