KR101252355B1 - Ｒｇｃ３２ 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물 및 이를 이용한 폐암 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RGC32 유전자 프로모터의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 RGC32 유전자 프로모터의 CpG 섬의 메틸화 여부에 따라 폐암을 진단하는 조성물 및 상기 메틸화 수준을 측정하여 폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 RGC32 유전자 프로모터의 CpG 섬이 메틸화는 폐암세포에서 특이적으로 나타나므로, 본 발명의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물은 폐암 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＲＧＣ３２ 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물 및 이를 이용한 폐암 진단방법{Composition for diagnosing lung cancer comprising an agent for determining level of methylation of RGC32 gene and a method for diagnosing lung cancer using the same}

본 발명은 RGC32 유전자 프로모터의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 RGC32 유전자 프로모터의 CpG 섬의 메틸화 여부에 따라 폐암을 진단하는 조성물 및 상기 메틸화 수준을 측정하여 폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

폐암은 흡연, 공해 등이 가장 큰 원인으로, 주로 발암물질에 의해 유발되며 발생률이 선진국을 중심으로 전 세계적으로 증가하고 있는 추세이다. 통계청 자료에 따르면, 2005년 우리나라에서 암으로 사망한 사람은 총 65,479명으로 전체 사망자의 26.7%가 암으로 사망하였는데, 폐암은 인구 10만 명당 28.4명(21.1%)로 암 중에서 가장 높은 사망률을 보이고 있으며 현재까지도 이러한 순위는 바뀌지 않고 있다.

폐암은 소세포암(small cell lung cancer, 이하 SCLC라고도 함)과 비소세포암(non-small cell lung cancer, 이하 NSCLC라고도 함)의 두 가지로 분류되며, 비소세포암은 다시 선암, 편평상피암, 대세포암, 선편평상피암 등의 조직형으로 분류되며, 이러한 서로 다른 종류의 조직형에 따라 발생하기 쉬운 부위, 진행형식과 속도 및 증상 등의 임상상이 다양하며 치료방법 또한 다양하다 (Brambilla et al., Eur Respir J.18(6):1059-68, 2001).

그러나, 폐암은 대부분의 다른 암과 마찬가지로 독특한 증세나 자각증상이 거의 없다. 따라서, 폐암 진단을 받은 환자 중 21%만이 전이되지 않은 상태이고, 50%는 이미 전이되어 수술이 불가능한 상태인 경우가 많아, 폐암 환자의 70%가 1년 내에 사망하며, 87%가 5년 내에 사망하는 등 예후가 좋지 않은 질병 중의 하나이다. 폐암의 80% 정도를 차지하는 비소세포 암은 암 덩어리의 크기, 주변조직 침투 여부, 림프선의 침범 정도, 및 멀리 떨어진 장기로의 전이 여부에 따라 병기를 정하고 치료방법을 결정하는데, 수술을 제외하고는 치료 효과가 낮아서 치유하기 힘든 암 중의 하나이다. 이렇게 나쁜 예후와 높은 치사율을 보이는 것은 폐암을 효과적으로 진단할 수 있는 제제 또는 방법이 부족하기 때문이다. 따라서, 난치병인 폐암에서는 조기 진단 및 치료가 매우 중요하다.

현재까지의 폐암의 검사 수단은 물리적인 것이 대부분이며, 흉부 X선 촬영과 함께 조직 검사, 기관지경 검사, 흉부진찰, 고전압촬영, 객담세포진 검사 등이 행해지고 있다. 그러나 이러한 진단 방법은 경제적으로 부담이 될 뿐만 아니라 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다. 따라서, 폐암의 발병 여부 및 진행단계의 정확한 판별이 가능하게 하는 폐암의 진단제의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 암세포가 어떠한 경로로 어떻게 생기게 되는가 하는 것은 아직 확실히 밝혀지지는 않고 있으나, 정상세포의 증식조절의 기능을 가진 유전자의 변형에 의해 증식조절이 되지 않는 세포가 생겨남으로써 암이 발생하는 것으로 보는 것이 일반적인 견해다. 따라서, 많은 암 연구자들은 암과 관련이 있다고 예상되는 유전자들을 대상으로 DNA 칩을 제작하여 암 조직과 정상 조직 간의 발현 정도를 비교하여 암 조직에서만 비정상적으로 과발현되는 유전자들을 종양 마커로 사용하여 암 선별 검사에 이용하고 있는 추세이다. 물론, 이와 같은 진단방법은 정확도에 한계가 있어서 암이 없을 때도 종종 양성으로 나타나서 혼란을 야기하기도 하지만, 여전히 암을 근원적으로 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준에서 접근할 필요가 있다.

수많은 질병들이 유전자 이상에 의하여 발생하고, 유전자 이상의 가장 빈번한 형태가 유전자 코드 서열의 변화이다. 이러한 유전자 변화를 돌연변이라고 한다. 어떠한 유전자에 돌연변이가 있으면, 상기 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 구조 및 기능이 변화하고, 이상 및 절단이 발생하며, 이러한 변이된 단백질은 질병을 일으킨다. 그러나, 특정 유전자에 변이가 없어도, 상기 유전자의 발현에 이상이 생겨 병을 유발할 수 있다. 전형적인 예가 유전자 전사조절부위, 예를 들면, CpG 섬의 사이토신 염기 부위에 메틸 그룹이 부착되는 메틸화이다. 이를 후생유전학적(epigenetic) 변화라고 하며, 돌연변이와 비슷한 방식으로 자손 세포에 전이되고, 예를 들면, 대응하는 단백질의 발현이 소실되는 것과 같은 동일한 효과를 나타낸다. 암 세포의 경우, 종양 억제 유전자의 발현이 프로모터 CpG 섬의 메틸화에 의하여 억제되고, 이러한 억제된 발현은 암을 유발하는 중요한 메카니즘의 하나로 인식되고 있다 (Robertson, K. and Jones, P., Carcinogen, 21, 461, 2000). 실제로 전립선암, 결장암, 자궁암, 유방암 등 다양한 암 세포에서 CpG 섬에서의 비정상적인 메틸화/탈메틸화가 보고되었으며, 이들이 암 형성 초기에 중요한 역할을 하고 있다는 점이 밝혀지고 있어서 DNA 메틸화 경향이 유력한 암 조기진단의 마커로서 주목받고 있다. 하지만, 암을 진단할 수 있을 정도로 충분한 수의 마커가 부족하여 암 특이적인 DNA 메틸화 경향을 보이는 마커의 지속적인 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자는 폐암에 특이적인 DNA 메틸화 마커를 개발하기 위하여 연구한 결과, RGC32(Response gene to complement 32)유전자의 프로모터 영역에 있는 CpG 섬에서 폐암 특이적인 메틸화 경향을 보이고, 이러한 메틸화 수준의 측정을 통해 폐암을 진단할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 RGC32 유전자 프로모터의 CpG 섬에서의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 RGC32 유전자 프로모터의 CpG 섬에서의 메틸화 수준을 측정하여 폐암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 RGC32(Response gene to complement 32) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "메틸화"는 특정 유전자의 프로모터 부위의 CpG 섬(CpG island)의 사이토신에서 일어나고, 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단되는 것으로서, 본 발명의 목적상, 메틸화 여부는 RGC32 유전자의 프로모터 부위의 CpG 섬에서의 메틸화를 의미한다.

본 발명에서 용어, "메틸화 수준의 측정"은 RGC32 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화 수준을 측정하는 것으로서, 메틸화 특이적인 PCR (methylation-specific polymerase chain reaction, 이하, MSP라고도 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사할 수 있다. 정상 폐 조직 세포에서는 RGC32 유전자의 프로모터에 메틸화 상태가 나타나지 않으나, 폐암 조직 세포에서는 RGC32 유전자의 프로모터에서의 메틸화가 특이적으로 나타나 RGC32 유전자의 낮은 수준의 발현을 보이는 것을 통해서, CpG 섬의 메틸화 여부에 따라 폐암 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어, "CpG 섬(CpG island)"은 CpG가 예외적으로 높은 빈도로 모여 있는 게놈 영역을 의미하며, C+G 함유량이 50%이상이고, CpG 비율이 3.75%이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 말한다. 상기 CpG에서, C는 사이토신을, G는 구아닌을 나타내며 p는 사이토신과 구아닌과의 사이에 있는 포스포디에스테르 결합을 의미한다. 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다. 실제로, 상기 CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다(Cross, S. and Bird, A., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995). 정상인의 체세포에서, 상기 하우스키핑 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬은 비메틸화되어 있으며, 임프린티드(imprinted) 유전자 및 비활성화 상태의 X 염색체 상의 유전자와 같이 발달과정 동안 발현되지 않는 유전자들은 메틸화되어 있다.

포유동물 세포의 게놈 DNA에서는 A, C, G 및 T에 더하여, 시토신 링(5-mC)의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸시토신(5-methylcytosine)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-mC는 CpG라고 불리는, CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에만 부착된다. CpG의 C는 메틸 그룹의 접촉에 의하여 대부분 메틸화된다. CpG의 메틸화는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다. 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문이다.

본 발명에서 용어, "RGC32(Response gene to complement 32, 최근에 염색체 13 열린해독특 15로 명명됨)"는 보체활성화(complement activation)에 의해 유도되는 유전자들 중에 하나로 세포주기 조절자로서 확인된 것이다.

RGC32의 과발현은 평활근의 S 기로의 빠른 진입과 연관이 있었으며, 주기 의존적인 키나아제 1(CDK1)(이전에 CDC2)에 대한 활성자 및 기질로서 RGC32 작용과 함께, RGC는 세포주기의 활성과 연관이 있음을 보여주는 것이다.

RGC32의 제시된 발암유전자의 역할과 비교할 때, RGC32는 결장암, 난소암, 유방암에서의 상향조절과 연관이 있음이 알려져 있다. 그러나 자궁내막암, 전이성 전립선암, 다발 골수증, 신경교아 세포종과 같은 많은 종양에서는 하향조절되는 것으로 보고되었으며, 이는 RGC32가 일정한 종류의 암들에서 종양 억제인자로 작용한다는 것을 의미하는 것이다. 덧붙여서, RGC32는 종양 억제인자 TP53에 의해 직접적으로 유도되며, polo-like 키나아제(Plk1)과 함께 상호작용을 통해 G2/M 세포 주기 정지를 매개하는 것으로 보고되었다. 즉, RGC32는 CDK1뿐만 아니라, Plk1과 함께 복합체를 형성할 수 있고, 세포 주기에서 RGC32의 영향은 결합하는 키나아제에 의존적이고, 종양 프로모터 또는 억제인자로서의 RGC32의 기능은 암들의 세포 종류에 의존한다.

본 발명자는, 폐암에서 RGC32의 역할을 이해하기 위해 비소세포암(NSCLCs)에서 MSP를 사용해 RGC32 유전자의 프로모터 부위의 메틸화 상태를 조사하고, RGC32 메틸화와 환자들의 임상병리학적 특징들 사이에 관계에 대해서 분석하였다.

본 발명자는 또한, 비정상적 프로모터 메틸화에 의한 RGC32의 비활성이 종양의 TP53 돌연변이적 상태에 따라서 생존에 다른 영향을 나타낸다는 것을 확인하였다. 특히, RGC32 메틸화는 TP53 돌연변이가 없는 환자들에서 악화된 전체생존(OS)와 관련이 있었고, 반면에 TP53 돌연변이가 있는 환자들에서 나아진 OS를 보였다(P_H for adjusted HRs across the two groups = 0.005). 이는 RGC32가 폐 종양형성에서 종양들의 TP53 돌연변이 상태에 의존하여 다른 역할을 가질 수도 있음을 시사하는 것이다.

본 발명에서는, 표 1에서 볼 수 있듯이, RGC32 메틸화가 남성보다 여성에서 더 빈번하다는 것을 확인하였으며, 흡연 유경험자보다 흡연 무경험자에서, SCC보다 ACs에서 더 빈번하다는 것을 확인했으나, 통계학적으로 의미있는 숫자는 아니다. 이러한 발견은 여성, 흡연 무경험자, ACs에 공통적인 EGFR 유전자의 티로신 키나아제 도메인에서의 돌연변이들처럼, RGC32 메틸화는 흡연보다는 다른 환경적인 요소들과 관련이 있을 것이라는 것을 시사한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, MSP를 이용하여 비소세포폐암 환자의 조직에서 RGC32 유전자 프로모터의 메틸화 여부를 조사하였으며, 상기 MSP는 각각 비메틸화-특이적 프라이머 및 메틸화-특이적 프라이머를 사용하여 수행하였다. 그 결과, RGC32 유전자의 메틸화는 종양 조직의 26%에서 검출되어, 상응하는 비종양 폐조직의 10.7%보다 유의미하게 높게 나타났다. 또한, 표본 조직 샘플에서 mRNA발현 수치를 평가한 결과, 메틸화된 대립 유전자를 가지는 악성 및 그에 상응하는 비악성 조직에서 RGC32 mRNA는 높은 수치로 발현됨을 확인할 수 있었다 (도 1A). 또한 열 개의 세포주 중 하나인 H226 세포는 탈메틸화 약품인 5'AzadC로 3일 동안 처리하였는데, 용액만 처리 시에는 RGC32 mRNA 전사를 유도하는데 실패했지만, 5'AzadC 처리 시에는 RGC32 mRNA 재발현을 유도했다. 이러한 결과는 RGC32 유전자의 프로모터 영역이 비소세포암(NSCLCs)에서 빈번하게 메틸화되고, 그의 메틸화는 RGC32 유전자 발현의 손실과 연관이 있음을 지시하는 것이다. 그리고 특이적인 프로모터 메틸화는 비소세포암에서 RGC32 유전자 발현의 하향조절에 중요한 역할을 함을 제안하는 것이다.

본 발명에서 용어, "비종양(nonmalignant)" 세포 또는 조직은 병증 조직의 일부이지만, 종양 부위는 아니라고 판단되는 세포 또는 조직을 의미한다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명의 진단 대상이 되는 폐암은 소세포폐암(SCLC) 또는 비소세포폐암(NSCLC)일 수 있으며, 바람직하게 비소세포폐암일 수 있다. 상기 비소세포폐암은 선암, 편평상피암, 대세포암, 또는 선편평상피암을 포함한다.

본 발명에서, 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, RGC32 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.

상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite)일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트이다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(Herman JG et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9821 - 9826; WO01/26536; US2003/0148326A1).

또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 섬의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당업계에 잘 알려져 있다.

폐암이 의심되는 환자의 RGC32 유전자의 프로모터 CpG 섬에서의 메틸화 수준은 환자의 생물학적 시료에서 게놈 DNA를 수득하고, 수득한 DNA에 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소를 처리한 후, 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고 그 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 것을 통해 측정할 수 있다.

따라서, 본 발명의 제제는 RGC32 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 CpG 섬의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다. 바람직하게, 상기 RGC32 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머는 실시예 4에서 나타낸 것과 같이 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열 한쌍으로 구성되는 프라이머이고, 상기 RGC32유전자의 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열 한쌍으로 구성되는 프라이머일 수 있다.

상기 폐암 진단용 조성물에는 상기 제제 이외에도, 중합효소 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 RGC32(Response gene to compleemnt 32) 유전자 프로모터의 CpG 섬 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG 섬 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 폐암은 비소세포폐암이다.

본 발명에서 용어 “생물학적 시료”란 폐암 발병에 의해 RGC32 유전자의 메틸화 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 생물학적 시료는 조직일 수 있다.

먼저, 폐암이 의심되는 환자로부터 게놈 DNA의 수득하여 메틸화 수준을 측정하는데, 게놈 DNA의 수득은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 유전자의 메틸화 수준의 측정 단계는 a) 수득된 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 b) 상기 처리된 DNA를 RGC32 유전자 프로모터의 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 a) 단계에서 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite)일 수 있으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트이다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(Herman JG et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9821 - 9826; WO01/26536; US2003/0148326A1).

또한, 상기 a) 단계에서 메틸화 민감성 제한효소는 상기에서 설명한 바와 같이, CpG 섬의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있으며, 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 b) 단계에서 증폭은 통상적인 PCR 방법에 의해 수행될 수 있다. 이때 사용되는 프라이머는 상기에서 설명한 바와 같이, 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 CpG 섬의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다. 바람직하게, 상기 RGC32 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열 한쌍으로 구성되는 프라이머이고, 상기 RGC32 유전자의 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열 한쌍으로 구성되는 프라이머일 수 있다.

상기 RGC32 (Response gene to compleemnt 32) 유전자 프로모터의 CpG 섬 메틸화 수준을 측정하는 단계는 c) 상기 b) 단계에서 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 c) 단계에서 증폭된 결과물의 존부는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기영동을 수행하여 원하는 위치의 밴드의 검출 여부에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들면, 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시키는 화합물을 사용한 경우 상기 a) 단계에서 사용한 두 종류의 프라이머쌍, 즉 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 의해 각각 증폭된 PCR 결과물의 존부에 따라 메틸화 여부를 판단할 수 있다. 바람직하게, 샘플 게놈 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리하고, RGC32 유전자의 CpG 섬의 모든 부위를 PCR로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 분석하는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 메틸화 여부를 판단할 수 있다.

또한, 제한효소를 이용한 경우에도 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 프로모터가 메틸화된 것으로 판단하고, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 프로모터가 비메틸화 것으로 판단하는 것에 따라 그 메틸화 여부를 판단할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다. 상기에서 mock DNA란 시료에서 분리되고 아무런 처리를 하지 않은 상태의 시료 DNA를 의미한다.

따라서, 상기 본 발명의 비소세포폐암 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법을 이용하면 RGC32 유전자 프로모터의 메틸화 여부를 효과적으로 확인하여 비소세포폐암 여부를 진단할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 RGC32 유전자 프로모터의 CpG 섬에 메틸화가 나타나면 폐암세포에서의 RGC32의 발현에 영향을 미치고, 본 발명의 RGC32 유전자 프로모터의 CpG 섬이 메틸화는 폐암세포에서 특이적으로 나타나므로, 본 발명의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물은 폐암 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 비소세포암 환자들(A) 및 인간 비소세포암 세포주(B) 에서 MSP(methylation specific PCR)와 RT-PCR 분석의 결과를 나타낸 것이다. A 및 B에서 왼쪽 판넬은 MSP에 의해서 분석된 RGC32 유전자의 메틸화 상태. CpGenome^TM Universal 메틸화 또는 비메틸화 DNA(Chemicon)은 메틸화 또는 비메틸화의 양성 대조군으로서 각각 사용되었다. 물은 음성 대조군으로서 사용되었다. A 및 B에서 아래쪽 판넬은 RGC32 mRNA의 발현은 RT-PCR에 의해 수행했다. β-엑틴의 증폭은 내부적 로딩 대조군으로서 사용되었다.(-)는 용액만 처리, (+)는 3일동안 5'-AzadC처리를 나타낸다.
도 2는 RGC32 메틸화 상태에 따른 NSCLC 환자들의 Kaplan-Meier 생존곡선을 나타낸 것이다. 총 NSCLC환자의 생존곡선(A), TP53 돌연변이가 없는 환자들(B), 및 TP53 돌연변이가 있는 환자들(C)을 나타낸 것이다. Cox proportional hazards model로부터 계산된 조작된 P 값을 표시하였다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

실시예 1: 환자 및 조직 샘플

종양 조직에 대응되는 비종양 폐 조직 샘플은 경북대학교 병원 (대구, 한국)에서 2003년 1월과 2007년 7월 사이에 치료 절제술을 받은 173명의 한국 비소세포폐암(NSCLC) 환자들로부터 얻었다. 상기 환자들은 수술 전에 화학치료와 방사선 치료를 받지 않은 상태이며 조직수거에 대한 사전 동의는 수술 전에 각 환자로부터 받았다. 본 발명의 연구는 경북대학교 의과대학병원의 임상시험심사위원회(Institutional Review Board)에 의해 승인된 것이다. 상기 환자들의 임상 병리학적 특징은 하기 표 1에 요약되어 있다. 상기 환자들은 평균나이 63.0±8.6세의 113명의 남성과 60명의 여성으로, 56명의 흡연-무경험자와 평균 26.4±25.4의 pack-years(하루담대 흡연량 X 흡연기간)를 가진 117명의 흡연-유경험자(현재 또는 이전의 흡연자)로 구성되었다. NSCLCs의 조직학적인 유형들은 56케이스의 편평세포암종(SCCs, squamous cell carcinomas)과 117 케이스의 선암종 (ACs, adenocarcinomas)였다. 병리학적 단계는 단계 Ⅰ은 109 케이스, 단계 Ⅱ는 29 케이스, 단계 ⅢA는 35 케이스였다. 종양과 육안상의 정상 폐 조직 모두는 수술시간에 얻어서, 액체질소로 급속 냉동시켜 게놈의 DNA가 준비될 때까지 -80℃에 보관했다. 육안상으로 정상 폐 조직은 헤마톡실린-에오신 염색을 통해 정상임을 확인했다. TP53 유전자의 엑손-인트론 경계들을 포함하는 전체 부호화 부위 (엑손 2-11)의 돌연변이는 PCR을 이용한 직접 시퀀싱(direct sequencing)을 이용하여 검출하였다. 체세포 TP53 돌연변이는 65 종양 (37.6%)에서 검출되었으며, TP53 돌연변이는 여성보다는 남성에서 (49.6% 대 13.1%), 흡연 무경험자보다 흡연 유경험자에서 (49.6% 대 10.5%), SCCs보다 ACs에서 (59.3% 대 25.6%: 모든 비교, P<0.001) 유의미하게 더 빈번했다.

실시예 2: 세포배양 및 5-aza-2'-deoxycytidine(5-AzadC)처리

열 개의 NSCLC 암 세포주는, 6개의 ACs (A549, H23, H522, H1373, H1793, H2009), 3개의 SCCs (H157, H226, H1703), 및 하나의 대세포암(large cell carcinoma, H1299)이며 American Type Culture collection (ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 얻었다. 모든 세포는 ATCC로부터 받은 설명서에 따라 증식시켰고, H226 세포는 20μM 5-AzadC를 3일 동안 처리했으며 배양배지는 매일 갈아주었다.

실시예 3: 전체 RNA 분리와 역 전사효소 PCR

역 전사효소- 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 을 위해서, 전체 RNA는 폐암과 상응하는 악성이 아닌 폐 조직 표본을 제품의 설명서에 따라 TRIzol (Invitrogen, Mt Waverly, VIC, Australia)을 사용하여 배양된 NSCLC 세포주로부터 추출하였다. 잔여 게놈의 DNA는 RNase-free DNase (Invitrogen) 로 정리되었다. 첫번째 가닥 cDNA는 oligo(dT)및 SuperScript preamplification kit (Invitrogen)을 사용하여 20 μL의 전체 부피에서 전체 RNA의 2㎍로부터 역전사되었다. 얻어진 cDNA는 Fosbrink M, Cudrici C, et al. Overexpression of RGC-32 in colon and other tumors. Exp Mol Pathol. 2005;78:116-22.,에서 기술된 것과 같은 상태하에서 정방향 (5`-GCCACTTCCACTACGAGGAG-3`)과 역방향 (5`-GTGGCCTGGTAGAAGGTTGA-3`) 프라이머를 사용해 증폭되었다.

실시예 4: 게놈 DNA 분리와 메틸화 분석

게놈의 DNA는 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, VALencia, CA, USA)를 이용하여 추출하였다. RGC32 유전자의 메틸화 상태는 메틸화에 특이적인 PCR (MSP)를 사용하여 결정하였다. 바이설파이트(bisulfite)를 처리한 DNA는 5’-GGGTAAATATTTGGGGTTGTAAT-3' 와 5’-TTCAACCCTACCAATCCCTTC-3’프라이머를 이용하여, RGC32 프로모터 부위 -69부터 +214까지 PCR-증폭에 사용되었다. 첫 번째 단계로부터 얻어진 PCR 결과물은 1:250으로 희석되었고, 그 후에 혼합한 메틸화되거나 비메틸화된 프라이머들을 MSP의 두 번째 단계에서 사용하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다: (메틸화된, 5’-TCGCGGTTTTAGGGCGGGCGC-3’ (서열번호 1, 정방향) 및 5’-CCGCTCCCAACACGATCCGCG-3’ (서열번호 2, 역방향)/ 비메틸화된, 5’-TTGTGGTTTTAGGGTGGGTGT-3’ (서열번호 3, 정방향) 및 5’-CCACTCCCAACACAATCC ACA-3’ (서열번호 4, 역방향). 모든 PCR 증폭은 PTC-100(MJ Research, Watertown, MA, USA)의 중합효소와 같은(PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), AmpliTaq Gold를 갖는 GeneAmp DNA Amplification Kit에서 제공한 시약을 이용하여 수행되었다. CpGenome^TM Universal 메틸화와 비메틸화 DNA (Chemicon, Temecula, CA, USA) 는 메틸화와 비메틸화 유전자의 양성 대조군으로 각각 사용되었다. 결과를 확인하기 위해 각 MSP는 최소 한번은 반복하였다.

실시예 5: 통계분석

메틸화와 임상병리학적 특징 사이의 관계는 범주에 속하는 변수를 위해 Chi-square test 또는 Fisher's exact test를 이용하여 분석하였다. P- value < 0.05 를 통계학적으로 유의미하다고 보았다. 전체생존은 수술일로부터 어떤 이유로든 사망일까지 또는 마지막 추적 조사일까지 측정하였다. 생존 평가는 Kaplan-Meier 방법을 이용하여 계산하였다. 전체 생존(OS)에서 다른 그룹들간에 전체 생존(OS)에 서의 차이점들은 log-rank 테스트를 이용하여 비교하였다.

Harzard ratios와 95% 신뢰구간 (CIs)은 나이 (≤ 63 vs. > 63 years), 성별 (남자 대 여자), 흡연상태 (무경험 대 유경험 흡연자), 병리학적 단계 (I vs. II-IIIA)에 관해서 multivariate Cox proportional hazards models을 이용하여 평가하였다. 모든 분석은 윈도우용 통계분석시스템 (SAS Institute, Cary, NC), 버전 9.1을 이용하여 실행하였다.

결과

NSCLCs의 조직샘플에서 RGC32 유전자의 MSP와 RT-PCR 분석

긴 CpG 섬 (CGIs)는 첫 번째 엑손(Accession no. AL354833)을 포함하는 RGC32 유전자의 1.1-kb 5` 플랭킹 영역에서 발견되었다. 흥미롭게도, 이 CGI는 여러개의 Sp1 결합위치를 및 TATAAT 신호들을 가지는 최소 프로모터의 5` 말단과 일치하는 것이다. 전사 시작 위치 / 최소 프로모터를 커버하는 부위의 메틸화는 발현과 관련이 되어 있기 때문에, 본 발명자는 인접하는 CGI를 커버하는 MSP 프라이머 한 쌍을 웹상에서 MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer/) 컴퓨터 프로그램을 통해서 디자인할 수 있었다.

각각의 특별한 프라이머 세트는 예상한 크기의 단일 밴드를 나타내었고; MSP 분석의 대표적 예는 도 1에 나타내었다. 모든 유전자에서, 비메틸화 밴드는 악성과 비종양 조직 모두에서 발견되었고, 따라서 이 샘플에서 DNA의 완전함을 확인하였다. 종양 표본은 종양과 비종양 조직 모두를 포함하는 육안으로 분리된 샘플이었고, 예상됐던 결과를 나타내었다. 표본 PCR 생성물의 바이설파이트-시퀀싱으로 그들의 메틸화 상태를 확인하였고, CpG가 아닌 위치에서 모든 사이토신은 티민으로 변환되는 것을 보여주었다. 이는 성공적인 증폭은 불완전한 바이설파이트 변환에 기인할 수 있는 가능성을 배제하였다. RGC32 유전자의 메틸화는 종양 조직의 26%에서 검출되어, 상응하는 정상 폐 조직의 10.7%(P=0.002)에서보다 유의미하게 높게 나타났다. 이는 RGC32의 메틸화가 발생과정상 프로그램화 된 사건이 아닐지도 모르나, 종양과 관련이 있는 새로운 사건일지도 모른다는 것을 제시한다.

본 발명자는 RGC32 mRNA 발현수치를 표본 조직 샘플에서 평가하였다. RT-PCR분석은 메틸화된 대립유전자를 가지는 조직에서 RGC32 mRNA 발현이 낮거나 검출되지 않았음을 나타내었고, 반면에 비메틸화 대립유전자를 가지는 악성 및 그에 상응하는 비악성 조직에서 RGC32 mRNA는 높은 수치로 발현되었다(도 1A). 본 발명자는 나아가 이러한 결과들을 10개의 인간 NSCLC 세포주에서 확인하였다. RT-PCR과 분석결과는 RGC32 mRNA가 오직 메틸화된 프로모터를 포함하는 H226 세포 주에서만 결여되는 것으로 나타내었고, 반면에 RGC32 mRAN는 비메틸화 대립유전자를 가지는 실험한 세포 주에서는 나타났다(도 1B). 그 후에, H226 세포는 탈메틸화 약품인 5'-AzadC로 3일 동안 처리하였다. 용액만 처리 시에는 RGC32 mRNA 전사를 유도하는데 실패했지만, 5'-AzadC를 처리 시에는 RGC32 mRNA 재발현을 유도했다(도 1B). 이러한 결과는 RGC32 발현에서 전사의 비활성은 RGC32 프로모터 메틸화에 의해 초래될 수도 있음을 제시하는 것이다.

RGC32 메틸화 상태와 임상병리학적 특징 사이의 상호 관련성

RGC32 메틸화는 남성보다는 여성에서(35.0% 대 21.2%, P<0.05) 더 빈번했다. 상기 표 1에서 보듯이, RGC32 메틸화가 나이, 흡연 상태, 조직학적 유형, 병리학적 단계, 및 TP53 돌연변이 상태와 같은 다른 임상병리학적 요소들과는 유의미한 상호관련성을 나타내지 않았다.

생존에 대한 RGC32 유전자 메틸화의 영향

환자들의 임상병리학적 특징에 따른 생존은 하기 표2에서 나타냈는데, 173명의 환자들 중에서 47명이 사망했다 (27.2%). 5년 생존율은 55.2%로 평가되었다. 임상병리학적 요소들 가운데 나이와 병리학적 단계는 유의미하게 전체생존과 관련이 있었다 : (adjusted HR for age > 63/≤ 63 years, 95% CI = 1.14-3.77, P = 0.02; adjusted HR for stage II-IIIA/I = 3.10, 95% CI = 1.72- 5.57, P < 0.0001, respectively).

RGC32 메틸화는 전체 환자들의 전체생존(OS)과 유의미하게 상호 관련되어 있지 않았다. 그러나, 환자들이 TP53 돌연변이 상태에 따라 분류하면, RGC32 메틸화는 TP53 돌연변이가 없는 환자들에서 악화된 OS와 관련이 있었고(adjusted OR = 2.52, 95% CI = 1.05-6.04, P = 0.04), 반면에 TP53 돌연변이가 있는 환자들에서 나아진 OS를 보였다(adjusted OR = 0.34, 95% CI = 0.12-1.00, P = 0.05; PH = 0.005; 표3 및 도 2). Cox' s proportional hazard model을 이용한 다변수의 생존 분석에서, 병리학적인 단계와 함께, RGC32 메틸화는 환자의 생존에 독립적인 예후의 요소였다(TP53 돌연변이가 없는 케이스에서; RGC32 메틸화에 대한 P=0.04, 및 병리학적 단계에 대한 P=0.002; 및 TP53 돌연변이가 있는 케이스에서; RGC 메틸화에 대한 P=0.05, 및 병리학적 단계에 대한 P=0.01)(표 4).

<110> Kyungpook national university industry-academic cooperation foundation <120> Composition for diagnosing lung cancer comprising an agent for determining level of methylation of RGC32 gene and a method for diagnosing lung cancer using the same} <130> PA100469KR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer specific to methylated sequence of RGC32 gene <400> 1 tcgcggtttt agggcgggcg c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer specific to methylated sequence of RGC32 gene <400> 2 ccgctcccaa cacgatccgc g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer specific to non-methylated sequence of RGC32 gene <400> 3 ttgtggtttt agggtgggtg t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer specific to non-methylated sequence og RGC32 gene <400> 4 ccactcccaa cacaatccac a 21

Claims (12)

1. RGC32 (Response gene to complement 32) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, RGC32 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 것인 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 폐암은 비소세포폐암인 조성물.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 RGC32 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열번호로 구성되는 프라이머쌍이고, 상기 RGC32 유전자의 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열번호로 구성되는 프라이머쌍인 조성물.
5. 제2항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 소듐 바이설파이트(sodium bisulfite)인 조성물.
   
6. 폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 RGC32 유전자 프로모터의 CpG 섬 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG 섬 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 수준의 측정 단계는
   a) 수득된 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
   b) 상기 처리된 DNA를 RGC32 유전자 프로모터의 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함하는 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열번호로 구성되는 메틸화 특이적인 프라이머쌍 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열번호로 구성되는 비메틸화 특이적인 프라이머쌍인 방법.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 소듐 바이설파이트(sodium bisulfite)인 방법.
   
10. 제6항에 있어서, 상기 메틸화 수준을 측정하는 방법은 메틸화 특이적 중합효소반응 (methylation-specific polymerase chain reaction)인 방법.
    
11. 제6항에 있어서, 상기 폐암은 비소세포폐암인 방법.
    
12. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 환자의 조직인 것을 특징으로 하는 방법.

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