KR101251023B1 - 신규한 단일클론항체를 포함하는 박테리아 감염 검출용 키트 - Google Patents

신규한 단일클론항체를 포함하는 박테리아 감염 검출용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 펩티도글리칸 인식 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 펩티도글리칸과 펩티도글리칸 인식 단백질과의 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 박테리아 감염 검출용 키트를 제공한다. 상기 키트는 박테리아를 현저하게 높은 특이성 및 민감도로 검출할 수 있으며, 구체적으로는 약 20 pg/mL 수준으로 존재하는 펩티도글리칸도 선택적으로 검출할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 박테리아 감염 검출용 키트에 유용하게 사용되는 단일클론항체, 즉 펩티도글리칸 인식 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 펩티도글리칸과 펩티도글리칸 인식 단백질의 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
박테리아, 펩티도글리칸, 펩티도글리칸 인식단백질, 단일클론항체

Description

신규한 단일클론항체를 포함하는 박테리아 감염 검출용 키트{Kit for detecting bacterial infection comprising novel monoclonal antibodies}
본 발명은 박테리아 감염 검출용 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 검체 중 박테리아의 펩티도글리칸 검출에 유용한 신규의 단일클론항체를 포함하는 박테리아 감염 검출용 키트에 관한 것이다.
최근의 유전공학 연구를 통해, 초파리(Drosophila melanogaster)의 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN)을 인식하는 단백질인 Drosophila PGRP-SA 및 Drosophila PGRP-SD가 Toll 경로를 활성화시키며(Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. & Royet, J. (2001) Nature 414, 756-759 및 Bischoff, V., Vignal, C., Boneca, I. G., Michel, T., Hoffmann, J. A. & Royet, J. (2004) Nat Immunol 5, 1175-1180), Drosophila PGRP-LC 및 Drosophila PGRP-LE가 Imd 경로에 대한 수용체임이 보고된 바 있다 (Gottar, M., Gobert, V., Michel, T., Belvin, M., Duyk, G., Hoffmann, J. A., Ferrandon, D. & Royet, J. (2002) Nature 416, 640-644; Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D. & Anderson, K. V. (2002) Science 296, 359-362; 및 Takehana, A., Katsuyama, T., Yano, T., Oshima, Y., Takada, H., Aigaki, T. & Kurata, S. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99, 13705-13710). 한편, Drosophila 그람 음성균 결합 단백질 1 (Drosophila GNBP1)의 기능-소실 돌연변이(loss-of-function mutant)의 면역 표현형은 Drosophila PGRP-SA와 구분할 수 없으며, 이는 두 개의 단백질이 그람 양성균의 감염에 대한 반응에 있어서 Toll 경로를 활성화시키기 위하여 필요하다는 것을 나타낸다 (Gobert, V., Gottar, M., Matskevich, A. A., Rutschmann, S., Royet, J., Belvin, M., Hoffmann, J. A. & Ferrandon, D. (2003) Science 302, 2126-2130; Pili-Floury, S., Leulier, F., Takahashi, K., Saigo, K., Samain, E., Ueda, R. & Lemaitre, B. (2004) J Biol Chem 279, 12848-12853; 및 Wang, L., Weber, A. N., Atilano, M. L., Filipe, S. R., Gay, N. J. & Ligoxygakis, P. (2006) EMBO J 25, 5005-5014). 그러나, 그람 음성균 인식에 있어서의 Toll 경로의 상류(upstream) 부분의 분자수준에서의 기전은 아직 확실하게 밝혀지지 않았다.
침습하는 병원균의 멜라닌화를 유도하는 프로-페놀옥시다아제 (pro-phenoloxisase, pro-PO) 활성화 캐스캐이드는 무척추 동물에 있어서 또 다른 중요한 고유의 면역 방어 기전이며, 이는 PGN 및 β-1,3-글루칸에 의해 유발된다 (Cerenius, L. & Soderhall, K. (2004) Immunol Rev 198, 116-126 및 Kanost, M. R., Jiang, H. & Yu, X. Q. (2004) Immunol Rev 198, 97-105). 척추 동물의 보체 시스템과 유사하게, pro-PO 캐스캐이드는 혈장내 단백질분해(proteolytic) 캐스캐이드이다. 그러므로, 상기 pro-PO 시스템은 세포가 포함이 되지 않은(cell-free) 조건에서 PGN 및 β-1,3-글루칸 인식 및 이어지는 신호전달에 대한 생화학적 연구 를 위한 좋은 연구 모델계이다.
본 발명자들은 Drosophila PGRP-SA와 높은 서열 상동성을 나타내는 갈색거저리(Tenebrio molitor)의 펩티도글리칸 인식 단백질(peptidoglycan recognition protein, PGRP)을 동정한 바 있으며, Tenebrio PGRP-SA로 명명한 상기 PGRP가 Tenebrio 곤충에서 Lys-PGN-의존성 pro-PO 시스템을 활성화시킨다는 것을 밝힌 바 있다(국제특허공개 제WO2007/081067호). 또한, 본 발명자들은 생체 내 초파리(Drosophila) Toll 경로, 시험관 내 pro-PO 시스템, 및 재조합 PGRP-SA를 이용한 생화학적인 접근을 통하여, pro-PO 시스템에 관여하는 신규 단백질들을 분리하였으며, 이를 이용할 경우 혈액 등의 검체 중 박테리아 감염을 검출할 수 있다는 것을 밝힌 바 있고, 또한, Lys-PGN의 표준물질로서 사용가능한 수용성의 선형 라이신-형 펩티도글리칸(soluble linearized Lys-type peptidoglycan, SLPG)의 제조방법을 개발한 바 있다(국제특허 공개 제WO2008/096994호).
본 발명자들은 기존에 보고한 바 있는 수용성의 선형 라이신-형 펩티도글리칸(SLPG) 및 펩티도글리칸 인식 단백질(PGRP)을 사용하여, 검체 중의 박테리아 감염을 정확하고 신속하게 판별할 수 있는 검출용 키트를 제작하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, PGRP 및 PGN-PGRP 복합체를 현저하게 높은 특이성 및 민감도로 검출할 수 있는 단일클론항체들을 분리하였으며, 상기 단일클론항체들을 면역크로마토그래피법(immunochromatographic assay) 혹은 효소면역법(Enzyme-Linked immnuo-sorbent Assay, ELISA)에 적용할 경우, 검체 중의 박테리아 감염을 신속하고 정확하게 검출할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 단일클론항체의 항원 결합부위 즉, 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 분석하였으며, 이들로부터 상보성 결정부위를 분석하였다.
따라서, 본 발명은 상기 PGRP에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체(항-PGRP 항체) 및 PGN-PGRP 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체(항-PGN-PGRP 복합체 항체)를 포함하는 박테리아 감염 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 박테리아 감염 검출용 키트에 유용한 단일클론항체 즉 항-PGRP 항체 및 항-PGN-PGRP 복합체 항체, 상기 단일클론항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 염기서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자가 삽입된 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 21의 펩티도글리칸 인식 단백질(PGRP); 펩티도글리칸 인식 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체(항-PGRP 항체); 및 펩티도글리칸과 펩티도글리칸 인식 단백질과의 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체(항-PGN-PGRP 복합체 항체)를 포함하는 박테리아 감염 검출용 키트가 제공된다.
바람직하게는, 본 발명의 박테리아 감염 검출용 키트는 서열번호 21의 펩티도글리칸 인식 단백질(PGRP); 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 6, 7, 및 8의 아미노산 서열인 항-PGRP 항체; 및 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 11, 12, 및 13의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 16, 17, 및 18의 아미노산 서열인 항-PGN-PGRP 복합체 항체를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 항-PGRP 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 4의 아미노산 서열이고, 상기 항-PGRP 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 9의 아미노산 서열이다. 또한, 다른 구현예에서, 상기 항-PGN-PGRP 복합체 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 14의 아미노산 서열이고, 상기 항-PGN-PGRP 복합체 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 19의 아미노산 서열이다.
본 발명에 따른 박테리아 감염 검출용 키트에 있어서, 검체 중의 펩티도글리 칸은 면역크로마토그래피법(immunochromatographic assay) 또는 효소-면역법(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)에 의해 검출될 수 있다. 일 구현예에서, 검체 중의 펩티도글리칸은 면역크로마토그래피법에 의해 검출되고, 상기 키트의 형태는 스트립 형태일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 6, 7, 및 8의 아미노산 서열인, 펩티도글리칸 인식 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체(항-PGRP 항체)가 제공된다. 상기 항-PGRP 항체는 중쇄 가변영역이 서열번호 4의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역이 서열번호 9의 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 상기 항-PGRP 항체는 중쇄 가변영역이 서열번호 5의 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역이 서열번호 10의 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 11, 12, 및 13의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 16, 17, 및 18의 아미노산 서열인, 펩티도글리칸과 펩티도글리칸 인식 단백질과의 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체(항-PGN-PGRP 복합체 항체)가 제공된다. 상기 항-PGN-PGRP 복합체 항체는 중쇄 가변영역이 서열번호 14의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역이 서열번호 19의 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 상기 항-PGN-PGRP 복합체 항체는 중쇄 가변영역이 서열번호 15의 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역이 서열번호 20의 cDNA에 의해 코딩되는 아미노 산 서열일 수 있다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 재조합 벡터로서, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pC1120-VH; 서열번호 10의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pC1120-VL; 서열번호 15의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pC2172-VH; 및 서열번호 20의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pC2172-VL이 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체로서, 재조합 벡터 pC1120-VH로 형질전환된 형질전환체 E. coli DH5α/pC1120-VH (수탁번호: KCTC 11572BP); 재조합 벡터 pC1120-VL로 형질전환된 형질전환체 E. coli DH5α/pC1120-VL (수탁번호: KCTC 11571BP); 재조합 벡터 pC2172-VH로 형질전환된 형질전환체 E. coli DH5α/pC2172-VH (수탁번호: KCTC 11574BP); 및 재조합 벡터 pC2172-VL로 형질전환된 형질전환체 E. coli DH5α/pC2172-VL (수탁번호: KCTC 11573BP)가 제공된다.
본 발명에 따른 단일클론항체 즉, 항-PGRP 항체 및 항-PGN-PGRP 복합체 항체는 PGRP 및 PGN-PGRP 복합체를 현저하게 높은 특이성 및 민감도로 검출할 수 있으며, 구체적으로는 약 20 pg/mL 수준으로 존재하는 PGN도 선택적으로 검출할 수 있다. 따라서, 상기 단일클론항체들을 사용하여 면역크로마토그래피법(immunochromatographic assay) 혹은 효소면역법(Enzyme-Linked immnuo-sorbent Assay, ELISA)에 적용할 경우, PGN이 극히 낮은 농도로 존재하는 수혈용 혈액 등의 검체에 있어서도 박테리아 감염을 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.
본 발명은 박테리아 세포벽 성분인 PGN을 선택적으로 인식함으로써, 박테리아 감염의 검출에 사용할 수 있는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명자들은 본 발명자들이 개발한 바 있는 SLPG(국제특허공개 제WO2008/096994호) 및 PGRP(국제특허공개 제WO2007/081067호)를 사용하여, 다수의 혼성화 세포주(hybridized cellines)를 제조한 후, 이들로부터 다수의 단일클론항체를 분리하였다. 본 발명자들은 분리된 단일클론항체들 중 PGRP 및 PGN-PGRP 복합체에 대한 반응성이 높은 약 10 종의 단일클론항체 분비 세포주를 선별하였으며, 이 중, PGRP 또는 PGN-PGRP 복합체에 민감도 및 특이성이 특히 우수한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 얻었다. 본 발명자들은 상기 하이브리도마 세포주로부터 RNA를 추출하여 중쇄 및 경쇄 유전자의 cDNA를 합성한 후, 이를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여, 가변영역의 중쇄 및 경쇄 cDNA 유전자를 분리하고, 이로부터 항원 즉, PGN 또는 PGN-PGRP 복합체를 인식하는 상보성 결정부위(complementarity determining regions, CDR)의 아미노산 및 염기 서열을 분석하였다.
따라서, 본 발명의 일 태양에서, 본 발명은 PGRP에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역, 이를 코딩하는 유전자, 및 이들을 포함하는 단일클론항체를 제공한다.
즉, 본 발명은 상보성 결정부위로서 서열번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열을 갖는, PGRP에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄 가변영역을 제공한다. 바람직하게는, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자, 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상보성 결정부위로서 서열번호 6, 7, 및 8의 아미노산 서열을 갖는, PGRP에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 경쇄 가변영역을 제공한다. 바람직하게는, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자, 바람직하게는 서열번호 10의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 6, 7, 및 8의 아미노산 서열인 PGRP에 특이적으로 결합하는 단일클론항체(항-PGRP 항체)를 제공하며, 바람직하게는 상기 항-PGRP 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 4의 아미노산 서열이고, 상기 항-PGRP 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 9의 아미노산 서열이다.
또한, 본 발명의 일 태양에서, 본 발명은 PGN-PGRP 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역, 이를 코딩하는 유전자, 및 이들을 포함하는 단일클론항체를 제공한다.
즉, 본 발명은 상보성 결정부위로서 서열번호 11, 12, 및 13의 아미노산 서 열을 갖는, PGN-PGRP 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄 가변영역을 제공한다. 바람직하게는, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 14의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자, 바람직하게는 서열번호 15의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상보성 결정부위로서 서열번호 16, 17, 및 18의 아미노산 서열을 갖는, PGN-PGRP 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 경쇄 가변영역을 제공한다. 바람직하게는, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 19의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자, 바람직하게는 서열번호 20의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 11, 12, 및 13의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 16, 17, 및 18의 아미노산 서열인 PGN-PGRP 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체(항-PGN-PGRP 복합체 항체)를 제공하며, 바람직하게는 상기 항-PGN-PGRP 복합체 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 14의 아미노산 서열이고, 상기 항-PGRP 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 19의 아미노산 서열이다.
본 발명의 일 태양에서, 상기 PGRP 및 PGN-PGRP 복합체를 특이적으로 인식하는 단일클론항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 가변영역을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 벡터가 제공된다. 상기 재조합 벡터는 공지의 플라스미드 벡터, 예를 들어 pCR2.1-TOPO(인비트로젠사, 미국) 등의 플라스미드 벡터에 상기 유전자를 삽입하여 제조할 수 있다. 구체적으로는 상기 제조합 백터는 pCR2.1-TOPO(인비트로젠사, 미국)의 플라스미드 벡터에 상기 유전자들을 각각 삽입하여 얻어진 재조합 벡터로서, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pC1120-VH; 서열번호 10의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pC1120-VL; 서열번호 15의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pC2172-VH; 및 서열번호 20의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pC2172-VL일 수 있다.
상기 재조합 벡터들은 예를 들어, DH5α T1(인비트로젠사, 미국) 등의 대장균을 형질전환시켜 형질전환체를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 재조합 벡터들로 각각 형질전환된 대장균 형질전환체를 제공하며, 구체적으로는 재조합 벡터 pC1120-VH로 형질전환된 형질전환체 E. coli DH5α/pC1120-VH (수탁번호: KCTC 11572BP); 재조합 벡터 pC1120-VL로 형질전환된 형질전환체 E. coli DH5α/pC1120-VL (수탁번호: KCTC 11571BP); 재조합 벡터 pC2172-VH로 형질전환된 형질전환체 E. coli DH5α/pC2172-VH (수탁번호: KCTC 11574BP); 재조합 벡터 pC2172-VL로 형질전환된 형질전환체 E. coli DH5α/pC2172-VL (수탁번호: KCTC 11573BP)을 제공한다.
상기 형질전환체로부터 재조합 벡터의 회수는 위저드 플러스 DNA 정제시스템 (Wizard plus SV minipreps DNA purification system, Promega)을 이용하여 회수하였다. 그러나 재조합벡터는 다른 공지의 방법을 사용하여 회수할 수 있다.
상기한 본 발명에 따른 단일클론항체의 상보성 결정부위, 즉 PGRP를 특이적으로 인식하는 단일클론항체의 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정부위; 및 PGN-PGRP 복합체를 특이적으로 인식하는 단일클론항체의 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정부위(예를 들어, 서열번호 1, 2, 3, 6, 7 및 8; 또는 서열번호 11, 12, 13, 16, 17 및 18)는 인간의 항체에 융합하여 사용할 수 있다(CDR grafting). 또한 상기 본 발명에 따른 단일클론항체에 있어서, 상보성 결정부위 이외의 프레임워크 영역(framework region)은 적절하게 변형 또는 치환하여 사용할 수 있다.
상기한 본 발명에 따른 가변영역을 포함하는 단일클론항체, 즉 PGRP를 특이적으로 인식하는 단일클론항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 포함하는 단일클론항체; 및 PGN-PGRP 복합체를 특이적으로 인식하는 단일클론항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 포함하는 단일클론항체는, 상기 가변영역을 코딩하는 유전자(예를 들어, 서열번호 5 및 10; 또는 서열번호 15 및 20)를 인간의 항체 유전자에 융합시키거나, 인간 항체의 가변영역과 치환함으로써 각각의 단일클론항체를 얻을 수 있다. 또한, 필요에 따라 상기 가변영역이 포함된 항체 단편 형태로도 활용될 수 있다.
상기한 PGRP를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및/또는 PGN-PGRP 복합체를 특이적으로 인식하는 단일클론항체는 면역크로마토그래피법(immunochromatographic assay) 혹은 효소면역법(Enzyme-Linked immnuo-sorbent Assay, ELISA)에 사용되어, 박테리아 감염 검출용 키트로서 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 박테리아 감염 검출용 키트를 제공하며, 상기 검출용 키트는 서열번호 21의 펩티도글리칸 인식 단백질(PGRP); 펩티도글리칸 인식 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체(항-PGRP 항체); 및 펩티도글리칸과 펩티도글리칸 인식 단백질과의 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체(항-PGN-PGRP 복합체 항체)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 박테리아 감염의 검출용 키트는 서열번호 21의 펩 티도글리칸 인식 단백질(PGRP); 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 6, 7, 및 8의 아미노산 서열인 항-PGRP 항체; 및 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 11, 12, 및 13의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 16, 17, 및 18의 아미노산 서열인 항-PGN-PGRP 복합체 항체를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 항-PGRP 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 4의 아미노산 서열이고, 상기 항-PGRP 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 9의 아미노산 서열이다. 또한, 다른 구현예에서, 상기 항-PGN-PGRP 복합체 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 14의 아미노산 서열이고, 상기 항-PGN-PGRP 복합체 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 19의 아미노산 서열이다. 필요할 경우, 민감도 및 특이성 향상을 위하여, 검체를 전처리하는 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 검출용 키트는 트리클로로아세트산, NaOH 등으로 검체를 전처리함으로써, 검체 중에 존재하는 펩티도글리칸의 유효한 결합 부위의 노출 및/또는 결합을 용이하게 하는 시약을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 검출용 키트는 면역크로마토그래피법에 의한 검출 키트로 구성될 수 있으며, 이 경우 상기 (i)의 서열번호 21의 펩티도글리칸 인식 단백질은 별도의 용기에 용액, 분말 혹은 감작 패드(sensitization pad) 등의 형태로 존재할 수 있고, 상기 (i) 및 (ii)는 각각 착색 미립자 패드 및 항체 점적 맴브레인을 포함하는 스트립 형태의 검출 키트로 제작될 수 있다. 상기 스트립 형태의 검출용 키트의 모식도는 도 1과 같으며, 도 1을 참조로, 본 발명의 검출용 키트를 설 명하면 다음과 같다: 시료 패드; 상기 시료 패드가 고정된 미립자 패드로서, 상기 시료 패드의 일부가 상기 미립자 패드의 일측 단부상에 겹쳐저 고정된 미립자 패드; 및 상기 미립자 패드, 2 종의 항체 점적 맴브레인, 및 흡수 패드가 고정된 지지판으로서, 상기 시료 패드가 겹쳐지지 않은 부위의 미립자 패드의 반대면이 상기 지지판의 일측 단부에 겹쳐져 고정되고, 상기 흡수 패드는 지지판의 다른 쪽 단부 상에 겹쳐져 고정되며, 상기 2 종의 항체 점적 맴브레인이 상기 지지판 상의 중간에 위치하는 지지판으로 구성된다. 상기 시료 패드는 검체에 PGRP를 가하여 얻어지는 시료가 점적되는 부위로서, 시료 패드의 재질로는 유리섬유(Millipore, 미국) 등을 사용할 수 있다. 상기 미립자 패드는 항-PGRP 항체(즉, (i)의 항체)를 착색 미립자와 결합하여 지지판의 일측 단부에 고정시켜 형성된다. 상기 착색 미립자는 항체와 결합하여 항체의 반응성을 저해하지 않고 반응 결과를 육안으로 식별할 수 있는 착색 미립자를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 콜로이달 골드를 사용할 수 있다. 상기 지지판은 맴브레인과 패드 등의 접합이 가능한 접착제가 포함된 폴리에틸렌 재질 등을 사용할 수 있으며, 상기 미립자 패드 고정 부위의 반대 쪽의 지지판 단부 상에는 흡수 패드가 고정된다. 상기 흡수 패드는 모세관 현상에 시료의 흡수를 유도하며, 셀룰로오스 재질(Pall, 미국)을 사용하여 구성될 수 있다. 상기 지지판에 형성된 2종의 항체 점적 맴브레인 중 시료 패드 쪽 맴브레인에는 항-PGN-PGRP 복합체 항체(즉, (ii)의 항체)가 점적 및 고정되어 PGN 검출 여부를 확인하는 데 사용된다. 나머지 1종의 항체 점적 맴브레인에는 예를 들어 항-마우스 면역글로불린 항체를 점적하여 시험의 종료 판정 또는 대조 결과선이 나타나도록 구 성된다. 검체 중에 PGN이 존재할 경우, 해당 시료를 PGRP로 처리하게 되면, PGN-PGRP 복합체가 형성되고, 복합체가 형성된 상기 시료가 시료 패드에 로딩되면, PGN-PGRP 복합체는 모세관 현상에 의해 이동하게 되며, 패드에 고정된 착색 미립자가 결합된 단일클론항체와 반응한다. 상기 결합체는 계속해서 고정상(즉, 멤브레인)을 통해 이동하게 되고, 멤브레인 상에 고정되어 있는 항-PGN-PGRP 복합체 항체에 샌드위치 형태로 결합하여 결과선이 나타난다. 검체 중에 PGN이 존재하지 않을 경우, 해당 시료를 PGRP로 처리하더라도 PGN-PGRP 복합체가 형성되지 않으며, 따라서, 상기 시료가 시료 패드에 로딩되면, 착색미립자가 결합된 단일클론항체와 결합하지 않고, 검출선을 통과하게 되며, 항-마우스 면역글로불린 항체가 점적된 종료선에만 착색 미립자 선이 관찰된다.
또한, 본 발명의 검출용 키트는 효소면역법(Enzyme-Linked immnuo-sorbent Assay, ELISA)에 의한 검출 키트로 구성될 수 있다. 이 경우에도 상기 (i)의 서열번호 21의 펩티도글리칸 인식 단백질은 별도의 용기에 용액, 분말 등의 형태로 존재할 수 있으며, 상기 항-PGN-PGRP 복합체 항체[즉, (ii)의 항체]는 분석용 플레이트에 고정되어 제작될 수 있다. 상기 형태의 검출용 키트의 모식도는 도 2과 같으며, 도 2를 참조로, 본 발명의 검출용 키트를 설명하면 다음과 같다: 항-PGN-PGRP 복합체 단일클론항체는 분석용 플레이트에 고정되며, 상기 분석용 플레이트는 통상의 ELISA 검출용 플레이트일 수 있다. 검체 중에 PGN이 존재할 경우, 해당 시료를 PGRP로 처리하게 되면, PGN-PGRP 복합체가 형성되고, 복합체가 형성된 상기 시료를 상기 플레이트에 가하게 되면, 상기 플레이트 상에 고정된 단일클론항체와 결합하 게 되고, 고정된 항체와는 다른 결합부위를 갖는 발색 기질이 결합된 항체(예를 들어, 발색 기질이 결합된 항-PGRP 항체)를 사용하여, 발색시킴으로써 검체 중의 펩티도글리칸을 검출할 수 있다. 그러나 시료 내에 PGN이 존재하지 않는 경우, 항체의 결합 반응이 일어나지 않으므로 발색이 나타나지 않게 된다. 상기 발색기질은 ELISA 검출에 통상적으로 사용되는 발색기질을 사용할 수 있으며, 예를 들어 서양고추냉이 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP) 등의 발색 기질을 사용할 수 있다. 또한, 상기 ELISA 검출방법은 PGN 표준검량선을 통하여 검체 중의 PGN의 정량분석도 가능하다.
본 발명의 검출용 키트에 있어서, 검체는 수혈용 혈액, 사람을 포함한 포유동물의 혈액, 채소, 육류, 과일 등의 식품, 조리 또는 비조리된 식품, 수돗물, 지하수, 빗물을 포함하는 물, 무균제품 등을 포함하며, 기타 미생물 검출이 필요한 모든 검체를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 검출용 키트는 수혈용 혈액 또는 사람을 포함한 포유동물의 혈액 중 박테리아 감염의 검출에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 단일클론 항체의 제조
(1) 면역 및 세포 융합
PGN으로서 SLPG(국제특허공개 제WO2008/096994호) 100 ug; 및 서열번호 21의 PGRP(국제특허공개 제WO2007/081067호) 100 ug을 인산 완충액(phosphate buffered saline, PBS) 150 uL에 혼합하고, 동량의 완전 프론즈 어쥬번트 (complete Freund's adjuvant, Sigma F5881)와 혼합하여 유화시킨 혼합액을, 7주령 Balb/c 마우스의 복강에 1차 주사하였다. 2주일 후, PGN과 PGRP 각각 100 ug이 혼합된 PBS 150 uL를 동량의 불완전 프론즈 어쥬번트 (incomplete Freund's adjuvant, Sigma F5506)와 섞어 유화시킨 혼합액을 복강 내로 2차 주사하였다.
3일 후 마우스로부터 채혈하여 항체 형성 여부를 다음과 같이 ELISA로 확인하였다: ELISA 분석용 96-웰 플레이트 (Nunc 469949) 각 소공에 1 ug/mL 농도의 PGRP를 100 uL 넣은 후, 4℃에서 15시간 이상 반응시켜 고정시켰다. 이 후 0.5% 카세인-PBS 완충액 350 μL를 상기 각 소공에 넣은 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 마우스로부터 채혈한 혈액을 37℃에서 20분간 정치한 뒤 원심분리하여 상층액 즉 혈청을 회수하여 1,000배, 혹은 10,000배로 희석된 시료를 제조하고 준비된 상기 ELISA 플레이트의 각 소공에 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 후, 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)가 표지된 산양 항-쥐 면역글로블린 지(goat anti-mouse IgG-HRP, Bio-rad 170-6516)를 1,000배 희석하여 100 μL씩 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 각 소공에 HRP 기질 용액 (horseradish peroxidase substrate kit, Bio-rad 172-1064)을 100 μL씩 첨가하여 상온에서 3분 동안 발색시킨 후에, ELISA 측정기를 이용하여 405 nm의 파장에서 광학밀도(optical density, OD)를 측정하였다. 반응성을 확인된 마우스는 마지 막 면역 10일 후, PGN과 PGRP 각각 100 ug이 혼합된 PBS 200 uL를 꼬리정맥으로 투여하였다. 3일 뒤 마우스의 비장 세포를 적출하여 Sp2/O (ATCC CRL-1581) 세포와 50% 폴리에틸렌글리콜 (Polyethylene glycol 1500, Roche 783641)을 이용하여 융합시켰다.
(2) 항체 생산 세포주의 선별과 단일클론항체의 정제
HAT (0.1 mM sodium hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, 16 μM thymidine, Invitrogen 31062-037)가 첨가되어 마우스의 비장세포와 융합된 세포만을 선별할 수 있는 선택배지를 이용하여 융합된 세포를 선별하고, ELISA를 이용하여 PGRP와 PGN-PGRP 복합체에 대한 항체를 분비하는 세포를 선별하여, 단일클론으로 분리하였다.
면역을 통해 얻어진 2.5 x 108개의 비장세포로부터 제조된 융합세포군으로부터 PGN-PGRP 복합체에 대한 반응성을 다음과 같이 측정하였다: ELISA 분석용 96-웰 플레이트 (Nunc 469949) 각 소공에 1 μg/mL 농도의 PGN을 100 uL 넣은 후, 4℃에서 15시간 이상 반응시켜 고정시켰다. 이 후 0.5% 카세인-PBS 완충액 350 μL를 상기 각 소공에 넣은 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. PGN이 고정된 플레이트에 1 ug/mL 농도의 PGRP를 100 uL 넣은 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 PGN-PGRP 복합체가 고정된 플레이트를 준비하였다. 선택배지에서 집락을 형성하며 성장하는 세포가 확인된 각 소공의 배양액 100 uL를 채취하여 준비된 상기 ELISA 플레이트의 각 소공에 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 후, HRP가 표지된 산양 항-쥐 면역글로블린 지(goat anti-mouse IgG-HRP, Bio-rad 170-6516)를 1,000배 희석하여 100 μL씩 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 각 소공에 HRP 기질 용액 (horseradish peroxidase substrate kit, Bio-rad 172-1064)을 100 μL씩 첨가하여 상온에서 3분 동안 발색시킨 후에, ELISA 측정기를 이용하여 405 nm의 파장에서 광학밀도(optical density, OD)를 측정하였다.
상기와 같이 반응성 측정 결과, 높은 활성을 나타내는 10 여종의 단일클론 항체 분비 세포주를 선별하였으며, 이 중 다른 세포주와 달리 현저하게 높은 활성을 나타내는 세포주 2종을 분리하였으며, 이들은 각각 항-PGRP 및 항-PGN-PGRP 복합체 활성을 나타내었다.
분리된 항체 분비 세포주들의 배양액을 6,000 x g로 원심분리하여 세포와 침전물을 제거하고 상층액을 회수하였다. Protein A sepharose 4 (Amersham 17-0974-02) 수지를 충진한 컬럼을 이용하여 배양 상층액으로부터 항체를 분리 정제하였다.
실시예 2: 단일클론항체의 반응 특이성 분석
실시예 1에서 얻어진 항체에 대한 결합 특이성(specificity) 및 반응성을 ELISA를 통하여 분석하였다.
(i) PGN 고정 플레이트 : ELISA 분석용 96-웰 플레이트 (Nunc 469949) 각 소공에 1 μg/mL 농도의 PGN을 100 uL 넣은 후, 4℃에서 15시간 이상 반응시켜 고정 시켰다. 이 후 0.5% 카세인-PBS 완충액 300 μL를 상기 각 소공에 넣은 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켜, PGN이 고정된 플레이트를 제조하였다.
(ii) PGRP 고정 플레이트 : 상기 (i)와 같은 방법으로, 96-웰 플레이트에 0.001∼1 ug/mL 농도로 희석된 PGRP 100 uL를 넣은 후, 4℃에서 15시간 이상 반응시켜 고정시켰다. 이 후 0.5% 카세인-PBS 완충액 275 μL를 상기 각 소공에 넣은 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켜, PGRP가 고정된 플레이트를 제조하였다.
(iii) 결합특이성 측정
상기 (i)에서 카제인-PBS 완충액을 처리한 PGN 고정 플레이트에 PGRP를 0.001∼1 ug/mL 농도로 넣은 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 상기 실시예1에서 선별되어 정제된 항체 10종을 각각 1 ug/mL 농도로 100 μL씩 상기 준비된 플레이트의 각 소공에 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음, HRP가 표지된 산양 항-쥐 면역글로블린지(goat anti-mouse IgG-HRP, Bio-rad 170-6516)를 1,000배 희석하여 100 μL씩 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 각 소공에 HRP 기질 용액 (horseradish peroxidase substrate kit, Bio-rad 172-1064)을 100 μL씩 가하여 상온에서 3분 동안 발색시킨 다음, ELISA 측정기를 이용하여 405 nm의 파장에서 광학밀도(optical density, OD)를 측정하여, PGN-PGRP 복합체와 결합력이 우수한 항-PGN-PGRP 복합체 단일클론항체를 선별하였다.
상기 (ii)에서 카제인-PBS 완충액을 처리한 PGRP 고정 플레이트에 상기 실시 예1에서 선별되어 정제된 항체 10종을 각각 1 ug/mL 농도로 100 μL씩 상기 준비된 플레이트의 각 소공에 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음, HRP가 표지된 산양 항-쥐 면역글로블린지(goat anti-mouse IgG-HRP, Bio-rad 170-6516)를 1,000배 희석하여 100 μL씩 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 각 소공에 HRP 기질 용액 (horseradish peroxidase substrate kit, Bio-rad 172-1064)을 100 μL씩 가하여 상온에서 3분 동안 발색시킨 다음, ELISA 측정기를 이용하여 405 nm의 파장에서 광학밀도(optical density, OD)를 측정하여, PGRP와 결합력이 우수한 항-PGRP 단일클론항체를 선별하였다.
PGN-PGRP 복합체와 결합하는 항-PGN-PGRP 복합체 항체는 C2-172라고 명명하였으며, PGRP와 결합하는 항-PGRP 항체는 C1-120 이라고 명명하였고, 그 결과는 다음 표 1과 같다.
항-PGN-PGRP 복합체 항체(C2-172) 및 항-PGRP 항체(C1-120)의 민감도
PGRP
(ug/mL)		 항-PGN-PGRP 복합체 항체
(C2-172)		 항-PGRP 항체
(C1-120)
PGN 전처리
(PGN 고정 플레이트)		 PGN 비처리
(PGRP 고정
플레이트)		 PGN 전처리
(PGN 고정
플레이트)		 PGN 비처리
(PGRP 고정
플레이트)
1.000 0.931 0.010 0.794 0.286
0.500 0.871 0.010 0.918 0.218
0.250 0.732 0.007 0.788 0.152
0.125 0.591 0.014 0.573 0.105
0.063 0.439 0.004 0.476 0.060
0.031 0.259 0.000 0.290 0.043
0.016 0.145 0.000 0.153 0.013
0.008 0.077 0.000 0.093 0.015
0.004 0.034 0.000 0.035 0.000
0.002 0.011 0.000 0.012 0.000
0.001 0.000 0.000
상기 표 1의 결과로부터, 본 발명에 따라 얻어진 항-PGN-PGRP 복합체(C2-172) 항체는 PGRP만 존재하는 플레이트에서는 반응성을 나타내지 않았으며, PGN이 전처리되고 여기에 PGRP가 첨가된 플레이트에서만 반응성을 나타냈다. 이를 통하여, 본원 발명에 따른 항-PGN-PGRP 복합체 항체(C2-172)는 PGN-PGRP 복합체에 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있다.
항-PGN-PGRP 복합체 항체(C2-172)와 항-PGRP 항체(C1-120)는 PGN과 결합하지 않았으며, 항-PGRP항체는 단독 혹은 복합체로 존재하는 형태의 PGRP 모두와 반응하는 결합 특이성을 나타냈다.
(iv) PGRP의 PGN 결합 반응성 확인
본 발명의 PGRP의 PGN 결합여부 및 그람 양성/음성 유래의 PGN과의 결합특징을 상기 항-PGRP 단일클론항체(C1-120)를 이용한 ELISA로 확인하였다. 국제특허공개 제 WO2008/096994호에 개시된 PGN 시료의 제조방법에 따라, 그람양성균 유래의 PGN 시료로서 스타필로코쿠스 아우리우스(Staphylococcus aureus)를 사용하였고, 그람음성균 유래의 PGN 시료로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)로부터 추출한 PGN(Invivogen, 미국)을 사용하였다.
그람양성균 및 그람음성균 유래의 각각 1 μg/mL 농도의 PGN을 ELISA 분석용 96-웰 플레이트 (Nunc 469949) 각 소공에 100 uL 넣은 후, 4℃에서 15시간 이상 반응시켜 고정시켰다. 이 후 0.5% 카세인-PBS 완충액 275 μL를 상기 각 소공에 넣은 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켜, PGN이 고정된 플레이트를 제조하였다. 이후 각 소공에 1 ug/mL 농도의 PGRP를 100 uL 넣은 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 실시예1에서 정제된 항-PGRP 단일클론항체(C1-120)를 1 ug/mL 농도로 100 μL씩 상기 준비된 플레이트의 각 소공에 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음, HRP가 표지된 산양 항-쥐 면역글로블린지(goat anti-mouse IgG-HRP, Bio-rad 170-6516)를 1,000배 희석하여 100 μL씩 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 각 소공에 HRP 기질 용액 (horseradish peroxidase substrate kit, Bio-rad 172-1064)을 100 μL씩 가하여 상온에서 3분 동안 발색시킨 다음, ELISA 측정기를 이용하여 405 nm의 파장에서 광학밀도(optical density, OD)를 측정하여 반응성 여부를 확인하였고, 그 결과는 다음 표 2과 같다.
PGRP의 PGN 반응성
PGN 반응성
유래 구분
스타필로코쿠스 아우리우스
(Staphylococcus aureus)		 그람 양성 있음
에스케리치아 콜라이
(Escherichia coli)		 그람 음성 있음
상기 표 2의 결과로부터, 본 발명에 따라 얻어진 PGRP는 그람 양성 및 그람 음성 유래의 PGN과 모두 결합하는 것으로 확인되었다.
실시예 3: ELISA를 이용한 PGN 검출
ELISA를 이용한 PGN 검출을 위해서, 분석 플레이트 (Nunc 469949)의 각 소공에 실시예 1에서 얻어진 항-PGN-PGRP 복합체 항체(C2-172) 0.5 ug을 4℃에서 15시간 이상 반응시켜 분석 플레이트에 고정시킨 다음, 0.5% 카제인-PBS 완충액 300 μL를 넣어 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 400 ng의 PGRP를 희석한 PBS 50 uL와 10 ∼ 320 pg의 SLPG(국제특허공개 제WO2008/096994호에 따라 얻어진 수용성의 중합성 라이신-형 펩티도글리칸)가 혼합된 50 uL의 PBS를 각각 혼합하여 상온에서 30분간 반응시킨 뒤, 상기에서 준비한 플레이트의 각 소공에 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응 후 0.05% 트리톤 X-100이 포함된 PBS로 소공을 3회 세척하여 반응하지 않은 물질을 제거하고, 1 ug의 HRP가 표지된 항-PGN-PGRP 복합체 항체 또는 항-PGRP 항체를 각각 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 각 항체의 HRP 표지는 Peroxidase labeling Kit(Dojindo, 일본)를 이용하였으며, 제조사의 매뉴얼에 따라 제조하였다. 반응 후 각 소공에 HRP 기질 용액 (horseradish peroxidase substrate kit, Bio-rad 172-1064)을 100 μL씩 가하여 상온에서 3분 동안 발색시킨 다음, ELISA 측정기를 이용하여 405 nm의 파장에서 광학밀도(optical density, OD)를 측정하였다. 또한, PGRP와 PGN의 반응물 대신, 스타필로코쿠스 아우리우스(Staphylococcus aureus), 엣스케리치아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 그람 양성, 그람 음성 박테리아를 통상적인 배양용 배지에서 12∼24시간 배양한 다음, 박테리아 세포벽의 PGN 성분을 추출하였다. 10,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 회수한 박테리아 침전물에 멸균증류수 50 uL를 가하여 현탁하고 50 uL의 40% 트리클로로아세트산을 가하여 90℃에서 15분간 열처리하였다. 열처리 후 동일한 조건으로 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 회수된 침전물에 0.1 mL의 0.1 N NaOH를 첨가하여 90℃에서 15분간 열처리하였다. 열처리 후 10 uL의 0.1 M 인산화나트륨 용액을 이용하여 시료의 pH를 중화하였다. 이와 같은 방식으로 얻어진 미생물 추출물을 농도별로 처리하여, 상기와 동일한 방법으로 광학밀도를 측정하였다. 그 결과는 표 3 및 표 4와 같으며, 하기 표에서 반응성은 PGRP 단독처리군의 결과를 기준으로 산출된 상대측정치이다.
ELISA를 이용한 PGN 검출법에 의한 정제된 PGN 반응성
정제된 PGN(pg) 반응성
C1-120-HRP C2-172-HRP
320 1.86 1.87
80 0.48 0.64
40 0.19 0.23
20 0.10 0.15
10 0.00 0.04
PGRP 단독 처리 0.00 0.00
ELISA를 이용한 PGN 검출법의 미생물 추출물 반응성
미생물 추출물(CFU) 반응성
C1-120-HRP C2-172-HRP
1 x 106 7.47 5.05
1 x 105 0.86 0.22
1 x 104 0.40 0.00
1 x 103 0.00 0.00
PGRP 단독 처리군 0.00 0.00
표 3 및 표 4의 결과로부터, 적용된 PGN 농도 구간에서 농도에 비례적으로 반응성을 나타냈으며, 20 pg PGN 수준에서도 검출이 가능함을 알 수 있다.
실시예 4: 면역크로마토그래피법을 이용한 검출 장치의 제조
(1) 단일클론항체 결합 착색미립자 고정 패드의 제조
단일클론항체 결합 착색미립자를 제조하기 위하여 약 40 nm 크기의 콜로이달 골드를 사용하였다. 최대흡광도 광학밀도(O.D.)가 약 1에 해당하는 콜로이달 골드 100 mL을 교반하면서 실시예 1에서 얻어진 항-PGRP 항체를 콜로이달 골드 1 mL 당 6 ug이 되도록 첨가하여 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 최종농도 0.2%가 되도록 카제인 용액을 첨가하고 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 9,000 rpm, 15분간 원심분리하였고, 상등액을 제거하고 침전물을 취하여 안정액(1% 카제인, 3% 슈크로오스, 50 mM 트리스 완충액(pH 9), 50 mM 보레이트 완충액(pH 9), 0.5% 트라이톤 엑스-100, 0.5% 트윈-20)에 현탁하였다. 현탁액을 400nm∼800nm 구간 중 최대흡광도를 기준으로 5로 농도를 조정하고 용액을 착색미립자 패드에 충분히 적신 뒤 동결건조하였다.
(2) 항체 고정 멤브레인의 제조
반응 결과를 육안으로 관찰할 수 있는 결과선을 만들기 위하여 실시예 1에서 얻어진 항-PGN-PGRP 복합체 항체를 2 mg/mL의 농도로 만들어, 고정 지지판 상에 형성시킨 멤브레인 상에 0.8 uL/cm가 되도록 점적하여 고정하였다. 고정 지지판은 PVC/PE 재질의 지지판을 사용하였다. 점적항체 용액에는 0.5%의 슈크로오스를 포함한 PBS를 사용하였다. 결과선의 상단에는 반응의 종료를 나타내는 종료선을 점적하였다. 종료선의 점적에는 2 mg/mL의 염소 항-마우스 면역글로불린 항체를 사용하였으며, 점적조건은 결과선의 항체 점적과 동일하게 적용하였다.
(3) 검출 장치의 제조
본 발명의 검출 장치에는 시료가 적용되는 시료 패드와 시료의 흡수를 유도, 유지시키는 흡수 패드가 포함되었다. 시료 패드에는 유리섬유(Millipore, 미국)가 사용되었고, 흡수패드는 셀룰로오스 재질(Pall, 미국)이 사용되었다. 상기 (2)에서 제조된 항체 점적 멤브레인이 고정된 지지판에 (1)에서 제조된 항체 결합 착색미립자 패드를 겹치도록 접착시키고, 시료 패드를 길이방향으로 착색미립자 패드와 겹쳐 접착하였다. 흡수 패드는 멤브레인의 상단에 멤브레인과 겹치도록 접착시켜 검출 장치를 제조하였다.
실시예 5: 면역크로마토그래피를 이용한 PGN 검출
실시예 4에서 제조된 PGN 검출 장치를 사용하여 정제된 PGN을 검출하였다. 일정량의 정제된 PGN이 포함된 90 uL의 PBS에 100 ng의 PGRP 10 uL를 혼합하여 반응 시료를 제조하고 검출 장치의 시료 패드에 적용하였다. 시험 결과, 약 40 ng의 정제된 PGN이 포함된 시료가 평가된 장치에서 육안으로 관찰할 수 있는 결과선이 확인되었다.
정제된 PGN 외에 미생물 유래의 PGN에 대한 검출 장치의 반응성을 평가하기 위하여, 시험균으로서 그람 양성균 및 그람 음성균 각각의 희석액을 제조한 뒤, 1 mL을 취하여 원심분리(13,400 rpm, 10분)하고 상등액을 제거하였다. 회수한 침전물에 트리클로로아세트산 100 uL를 첨가하여 90℃에서 15분간 열처리하였다. 열처리 후 동일한 조건으로 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 회수된 침전물에 0.1 mL의 0.1 N NaOH를 첨가하여 90℃에서 15분간 열처리하였다. 열처리 후 10 uL의 0.1 M 인산화나트륨 용액을 이용하여 시료의 pH를 중화한 뒤 실시예 4에서 제조된 검출 장치에 로딩하였다. 실시예 4에서 제조된 검출 장치는 미생물 유래의 PGN에 대하여 그람 양성 및 그람 음성균 모두 105 cfu/mL 이하 수준에서도 반응성이 확인되었다.
실시예 6: 미생물 오염된 농축 혈소판 시료의 PGN 검출
미생물로 오염된 시료의 그람 양성 또는 그람 음성균 유래 PGN에 대한 검출 유무를 확인하기 위하여, 농축 혈소판 제제에 그람 양성 또는 그람 음성균을 인위적으로 혼합하여 검출 장치의 반응성을 확인하였다.
(1) 시료의 전처리
농축 혈소판 제제 0.5 mL에 그람 양성 및 그람 음성균을 포함한 시험균 희석액을 0.1 mL 혼합하여 시료를 준비하였으며, 각 시료의 균주 농도가 104, 105, 및 106 cfu/mL가 되도록 준비하였다. 사용된 시험균은 표 5와 같다.
시험균
시험균 KCTC 번호 그람염색
바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 3135 양성
스타필로코쿠스 아우리우스(Staphylococcus aureus) 3881
스타필로코쿠스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis) 3958
스타필로코쿠스 피오젠스(Streptococcus pyogenes) 3984
엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) 2361 음성
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 2441
클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae) 2208
클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) 1686
슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 1750
세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 12457
준비된 검체에 0.4 mL의 혈소판 용해액(0.1 N NaOH, 4% Triton X-100)과 0.1 mL의 메탄올을 첨가하여 교반한 뒤, 원심분리(13,400 rpm, 10분)하여 상등액을 제거하였다. 회수한 침전물에 멸균증류수 50 uL를 가하여 현탁하고 50 uL의 40% 트리클로로아세트산을 가하여 90℃에서 15분간 열처리하였다. 열처리 후 동일한 조건으로 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 회수된 침전물에 0.1 mL의 0.1 N NaOH를 첨가하여 90℃에서 15분간 열처리하였다. 열처리 후 10 uL의 0.1 M 인산화나트륨 용액을 이용하여 시료의 pH를 중화하였다.
(2) PGN 검출
상기 (1)에서 전처리된 시료 110 uL에 100 ng의 PGRP를 혼합하여 검출장치의 시료패드에 로딩하고 시료를 전개시켜 검출선의 출현 유무를 판정하였다. 시료의 전개 유무는 종료선의 출현 유무로 판단하였으며, 시료 적용 후 30분과 60분 후 검출선의 출현 유무를 확인하였다. 그 결과, 60분 이내에 105 cfu/mL 이하 수준에서 시험균의 오염이 검출되었으며, 그람 양성 및 그람 음성균 모두에서 동일한 결과를 나타냈다. 도 4는 대표적인 그람 양성 균주인 스타필로코쿠스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis) 및 그람 음성 균주인 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 검출 결과를 나타낸다. 다른 균주도 모두 105 cfu/mL 이하 수준에서 시험균의 오염이 검출되었다. 따라서 실시예 4에서 제조된 검출 장치가 정제된 PGN 뿐만 아니라 농축 혈소판 제제와 같은 검체에서도 분석이 가능하다는 것을 알 수 있다.
실시예 7: 항체 유전자의 분석
실시예 1에서 항체를 생산하는 것으로 확인된 각각의 하이브리도마 클론을 배양하여 1 x 107 의 세포를 회수하고 트리졸 플러스 알엔에이 정제 키트 (TRIzol plus RNA purification kit, Invitrogen 12183-555)를 이용하여 전체 핵산으로부터 총 RNA를 분리하였다. 전체 cDNA 합성은 cDNA 합성 키트 (Cloned AMV first-strand cDNA synthesis kit, Invitrogen 12328-040)를 사용하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 중합효소반응 (PCR, polymerase chain reaction)을 수행하였다. 중합효소반응을 위한 프라이머는 Ig-Primer sets (mouse Ig-primer set, Novagen 69831-3)를 사용하였다. 중합효소반응액은 cDNA 2.5 μl에 5 pmol의 프라이머와 중합효소(Ex Tag, Takara RR01AM), 1.5 mM MgCl2, 1 mM dNTP 혼합액, 중합효소반응 완충액을 혼합하여 준비하였다. 중합효소반응은 첫 번째로 94℃에서 5분 동안 반응시키고, 두 번째로 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분간 반응시키는 조건으로 35회를 반복하여 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응을 수행하였다.
증폭된 PCR 산물에 대하여 사이비알(SYBR, Invitrogen S-33102)이 포함된 1% 아가로스 젤 전기영동을 수행하였으며, 100bp 표준 DNA (1Kb plus ladder, Invitrogen 10787)를 기준으로 중쇄와 경쇄 각각 400bp의 위치에 증폭된 유전자 단편의 존재를 확인하였다.
상기 과정에서 얻어진 중쇄와 경쇄 유전자 단편을 포함하는 아가로스 겔 부위를 절단하여 악시프렙 DNA 젤 추출키트 (AxyPrep DNA gel extraction kit, Axygen AP-GX-250)를 이용하여 유전자 단편을 회수하였다. 정제된 유전자 단편을 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen)에 서브클로닝한 후, 대장균 DH5α-T1 (Invitrogen)에 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 50 μg/ml의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 하룻밤 배양한 후, 위저드 플러스 DNA 정제시스템 (Wizard plus SV minipreps DNA purification system, Promega)을 이용하여 플라스미드를 회수하였다. 회수된 플라스미드는 제한효소 EcoR I(NEB)으로 절단하여 동일한 크기의 유전자 단편이 삽입된 클론들을 확보하였다.
상기 각 클론의 플라스미드를 순수 정제한 후, 염기서열 분석회사인 제노텍(대한민국)에 의뢰하여 각 클론의 염기서열을 분석하였다. 가변영역 아미노산의 상보성 결정 부위(CDR, complementary determining region)의 분석은 H. Linda and B. Jurgen, Profiles for the analysis of immunoglobulin sequences: comparion of V gene subgroups, Protein Science 4:306-310, 1995에 따라 수행하였다.
실시예 1에서 얻어진 항-PGRP 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 상보성 결정 부위는 다음 표 6과 같으며, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 cDNA 유전자의 염기서열은 각각 서열번호 4 및 5와 같고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 cDNA 유전자의 염기서열은 각각 서열번호 9 및 10과 같다. 또한, 실시예 1에서 얻어진 항-PGN-PGRP 복합체 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 상보성 결정 부위는 다음 표 7과 같으며, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 cDNA 유전자의 염기서열은 각각 서열번호 14 및 15와 같고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 cDNA 유전자의 염기서열은 각각 서열번호 19 및 20과 같다.
실시예 1에서 얻어진 항-PGRP 항체 및 항-PGN-PGRP 복합체 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열, 염기서열, 및 상보성 결정 부위는 다음 표 6 및 표 7과 같다.
항-PGRP 항체의 상보성 결정 부위 서열
서열번호 서열
중쇄 CDR1 1 DYYMD
CDR2 2 YINPNDGGTIYNQKFKG
CDR3 3 ERADGYSYSFDY
경쇄 CDR1 6 LASQTIGTWLA
CDR2 7 AATSLAD
CDR3 8 RQFYSTPW
항-PGN-PGRP 복합체 항체의 상보성 결정 부위 서열
서열번호 서열
중쇄 CDR1 11 ECYMH
CDR2 12 WIDPASGNTIFDPKFQG
CDR3 13 YYDDYDEGFTY
경쇄 CDR1 16 SASSSVSYMY
CDR2 17 STSNLAS
CDR3 18 QQRSTYPY
상기에서 분석된 염기서열 즉, 서열번호 5, 10, 15, 및 20의 염기서열을 NCBI의 Blast(Basic Local Alignment Search Tool)를 통하여 검색한 결과, 신규한 유전자인 것으로 확인되었다.
실시예 8: 단일클론항체의 아이소타이핑
상기 항-PGRP 항체 및 항-PGN-PGRP 복합체 항체에 대한 아이소타입(isotype)은 효소면역측정방법을 통하여 확인하였다. PGN-PGRP 복합체가 코팅된 분석 플레이트의 각 웰에 1 μg/ml의 항체 용액 100 μl를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 각 웰에 마우스 단일항체 아이디 키트 (mouse MonoAb ID kit, Zymed 90-6550) 용액 100 μl를 가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시키고 HRP 기질 용액 100 μl를 첨가하여 상온에서 3분 동안 발색시킨 후, ELISA-reader를 이용하여 405 nm 파장에서 광학밀도를 측정하였다. 그 결과, 항-PGRP 항체 및 항-PGN-PGRP 복합체 항체 모두 중쇄는 IgG1 타입이며, 경쇄는 카파타입으로 나타났다. 반면에 항-PGRP 항체의 pI 값(등전점, Isoelectirc point)은 6.5 내지 7.0으로 나타났으며, 항-PGN-PGRP 복합체 항체의 pI 값은 5.9 내지 6.2로 나타났다.
도 1은 면역크로마토그래피법에 의한 검출 키트의 일 예 및 검출 메커니즘의 모식도이다. 도 1에서 항체 G는 발색단이 결합된 항-PGRP 항체를 나타내고, 적색 항체는 항-PGN-PGRP 복합체 항체를 나타내고, 청색 항체는 산양 항-마우스 항체항체를 나타낸다.
도 2는 효소면역법에 의한 검출 키트의 일 예 및 검출 메커니즘의 모식도이다. 도 2에서 적색 항체는 항-PGN-PGRP 복합체 항체를 나타내고, 녹색 항체는 발색단이 결합된 항-PGRP 항체를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 제작한 면역크로마토그래피법에 의한 검출 키트로 대표적인 그람 양성 균주인 스타필로코쿠스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis)(A) 및 그람 음성 균주인 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(B)를 포함하는 시료에서 균주 감염을 검출한 결과를 나타낸다.
<110> YUHAN CORPORATION <120> Kit for detecting bacterial infection comprising novel monoclonal antibodies <130> PN0281 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Asp 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 2 Tyr Ile Asn Pro Asn Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 3 Glu Arg Ala Asp Gly Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of heavy chain <400> 4 Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Glu Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Ala Asp Gly Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of heavy chain <400> 5 gaggtcctgc tgcaacagtc tggacctgag gtggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactactaca tggactgggt gaaacagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggatat attaatccta acgatggtgg aactatctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaga agtcctccag cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct atttctgtgc aagagagagg 300 gctgatggtt actcttactc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 6 Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 7 Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 8 Arg Gln Phe Tyr Ser Thr Pro Trp 1 5 <210> 9 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of light chain <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Arg Gln Phe Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of light chain <400> 10 gacattcaga tgacccagtc tcctgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc 60 atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag cgtggtatca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct 240 gaagattttg taagttatta ctgtcgacaa ttttatagta ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 11 Glu Cys Tyr Met His 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 12 Trp Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asn Thr Ile Phe Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 13 Tyr Tyr Asp Asp Tyr Asp Glu Gly Phe Thr Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of heavy chain <400> 14 Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 1 5 10 15 Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Glu 20 25 30 Cys Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Trp Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asn Thr Ile Phe Asp Pro Lys 50 55 60 Phe Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Leu Tyr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 15 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of heavy chain <400> 15 tcagaggttc agctgcagca gtctggggct gagcttgtga ggccaggggc cttagtcaag 60 ttgtcctgca aagcttctgg cttcaacatt aaagagtgtt atatgcactg ggtgaagcag 120 aggcctggac aaggcctgga gtggattgga tggattgatc ctgcgagtgg taatactata 180 tttgacccga agttccaggg caaggccagt ctaacatcag acacatcctc caacacagcc 240 tacctgcagc tctacagcct gacatctgag gacactgccg tctattactg tgctagatac 300 tatgattacg acgagggctt tacttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 360 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 16 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 17 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary determining region <400> 18 Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Tyr 1 5 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of light chain <400> 19 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 20 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of light chain <400> 20 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggttccacca gaagccaggc 120 acttctccca agctctggat ttatagtaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctgacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtacttacc cgtacacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaacg g 321 <210> 21 <211> 193 <212> PRT <213> Tenebrio molitor <400> 21 Met Leu Leu Ala Thr Ile Ala Arg Gly Val Tyr Gln Ile Ser Ala Leu 1 5 10 15 Ser Gly Ser Thr Ile Pro Arg Ile Cys Pro Glu Ile Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Arg Trp Gly Ala Arg Thr Pro Leu Glu Val Asp Tyr Ser Leu Ile Pro 35 40 45 Ile Glu Asn Val Val Val His His Thr Val Thr His Thr Cys Asp Ser 50 55 60 Glu Ser Glu Cys Ala Thr Leu Leu Arg Asn Val Gln Asn Phe His Met 65 70 75 80 Glu Asn Leu Glu Phe His Asp Ile Gly Tyr Asn Phe Leu Val Ala Gly 85 90 95 Asp Gly Gln Ile Tyr Glu Gly Ala Gly Trp His Lys Val Gly Ala His 100 105 110 Thr Arg Gly Tyr Asn Thr Arg Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Gly Asn 115 120 125 Phe Thr Ser Gln Leu Pro Val Gln Lys Gln Leu Lys Val Ala Lys Asp 130 135 140 Phe Leu Gln Cys Gly Val Glu Leu Gly Glu Leu Ser Lys Asn Tyr Lys 145 150 155 160 Leu Phe Gly Ala Arg Gln Val Ser Ser Thr Ser Ser Pro Gly Leu Lys 165 170 175 Leu Tyr Arg Glu Leu Gln Asp Trp Pro His Phe Thr Arg Ser Pro Pro 180 185 190 Lys

Claims (12)

  1. 서열번호 21의 펩티도글리칸 인식 단백질(PGRP); 펩티도글리칸 인식 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체(항-PGRP 항체); 및 펩티도글리칸과 펩티도글리칸 인식 단백질과의 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체(항-PGN-PGRP 복합체 항체)를 포함하는 박테리아 감염 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 21의 펩티도글리칸 인식 단백질(PGRP); 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 6, 7, 및 8의 아미노산 서열인 항-PGRP 항체; 및 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 11, 12, 및 13의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 16, 17, 및 18의 아미노산 서열인 항-PGN-PGRP 복합체 항체를 포함하는 박테리아 감염 검출용 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-PGRP 항체의 중쇄 가변영역이 서열번호 4의 아미노산 서열이고, 상기 항-PGRP 항체의 경쇄 가변영역이 서열번호 9의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 박테리아 감염 검출용 키트.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-PGN-PGRP 복합체 항체의 중쇄 가변영역이 서열번호 14의 아미노산 서열이고, 상기 항-PGN-PGRP 복합체 항체의 경쇄 가변 영역이 서열번호 19의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 박테리아 감염 검출용 키트.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 검체 중의 펩티도글리칸이 면역크로마토그래피법(immunochromatographic assay) 또는 효소-면역법(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 박테리아 감염 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 검체 중의 펩티도글리칸이 면역크로마토그래피법에 의해 검출되고, 상기 키트의 형태가 스트립 형태인 것을 특징으로 하는 박테리아 감염 검출용 키트.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 11, 12, 및 13의 아미노산 서열이고, 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위가 서열번호 16, 17, 및 18의 아미노산 서열인 펩티도글리칸과 펩티도글리칸 인식 단백질과의 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역이 서열번호 14의 아미노산 서열이고, 상기 경쇄 가변영역이 서열번호 19의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역이 서열번호 15의 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이고, 상기 경쇄 가변영역이 서열번호 20의 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
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