KR101250994B1 - 리포산 합성 관련 효소를 이용한 알파-리포산의 생산방법 - Google Patents

리포산 합성 관련 효소를 이용한 알파-리포산의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알파-리포산 생합성 관련 효소들을 이용한 알파-리포산(α-lipoic acid) 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 대사 재설계를 통하여 재조합 리포산 합성효소 (lipoic acid synthase)와 리포일 트래스퍼라제 (lipoyl transferase), 리포산 단백질 리가제A (lipoate protein ligase A)를 자체유전자의 대사 조절 없이 인위적으로 발현시킴으로서 알파-리포산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한 알파-리포산 합성과 관련이 있는 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 (Pyruvate Dehydrotenase Complex)와 철-황 클러스터 (Fe-S Cluster)의 재조합 균주를 제작하여, 알파-리포산의 생합성을 효과적으로 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

리포산 합성 관련 효소를 이용한 알파-리포산의 생산방법{Method for producing alpha-lipoic acid using lipoic acid synthesis associated enzymes}
본 발명은 리포산 합성 관련 효소와 리포산 합성과 관련 있는 조효소를 이용한 알파-리포산의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 리포산 합성효소, 리포일 트랜스퍼레이즈와 리포산 단백질 리가제A, 및 이들을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 이용한 알파-리포산의 제조방법에 관한 것이다. 또한 리포산 합셩과 관련 있는 조효소, 보다 상세하게는 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 (Pyruvate Dehydrotenase Complex)와 철-황 클러스터 (Fe-S Cluster), 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 이용하여 알파-리포산의 생합성을 효과적으로 증가시키는 방법에 관한 것이다.
알파-리포산은 간과 효모의 추출액에 함유된 미량성분으로 1951년 생화학자 리드 박사 (L.J. Reed)가 처음으로 이 미량의 성분을 간에서 분리하여 알파-리포산으로 명명한 이후 합성에 의해 그 구조가 확립되었으며, 젖산균의 발육인자라는 사실이 알려지면서 새로운 비타민으로 등장하였다.
알파-리포산은 피루베이트 및 기타 알파-케토산의 산화성 탈카르복실화에서 조효소(glucose-metabolizing pyruvate dehydrogenase)로서 작용하며(Packer L, et al. Medicine 19(2):227-250; 1995), 식물 및 동물의 모든 세포에 리포산염, 디하이드로리포산염으로 존재한다.
알파-리포산은 폐내에서도 미량 합성되기는 하는데, 그 양은 충분하지 않고 나이가 들어감에 따라 그 생산량은 감소한다. 또 일반식품 중에는 조금밖에 함유되어 있지 않기 때문에 건강식품 등으로 섭취하는 것이 바람직하다.
알파-리포산의 항산화작용이 밝혀진 이후 주로 다른 항산화제(비타민류, L-카르니틴 등)와 배합제품이 많고, 피부미용 및 항노화, 혈당치 저하, 다이어트 효과를 나타내는 제품들이 많이 개발되었다. 그 이유는 알파-리포산이나 비타민을 단독으로 사용하는 경우보다 알파-리포산과 비타민의 조합이 증가된 활성, 즉 상승효과를 나타내기 때문이다(EP-A 0 572 922, Drug Metab Rev 1998;30(2):245-275, Arch Biochem Biophys 1999;363(1):148-154).
연구에 따르면 항산화제가 활성산소를 없애는 과정에서 자신이 산화가 되고, 이는 다시 재활용되는 과정을 거쳐야 되는데 이 과정에서 다른 항산화제가 관여하다. 결국 항산화제 사이엔 상호작용과 시너지 효과를 갖고 있는 셈이고 복합제 복용이 치료 효율을 현저히 높여준다. 이러한 유용한 기능을 가지는 알파-리포산 및 그 염들은 오랜기간 식품에 첨가되거나 의약품에 많이 사용되고 있다. 뿐만 아니라 건강기능식품으로 사용되고 있으며, 음료 형태로도 사용되고 있다. 이러한 이유로 알파-리포산을 제조하기 위한 많은 연구가 진행되어 왔다.
알파-리포산은 열안정성이 낮아 주로 이들의 염이 개발되어 산업적으로 생산되고 있다(EP-B 702953, EP-A947194, EP-B 702953 등). 그러나 알파-리포산의 생물학적인 생산 방법에 대해서는 현재까지 개발된 된 적이 없다는 점에 착안하여 본 발명을 하기에 이르렀다.
본 발명자들은 알파-리포산의 생물학적인 생산을 효율적으로 증가시키는 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫 번째 목적은 리포일 트랜스퍼레이즈의 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 리포일 트랜스퍼레이즈효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 리포일 트랜스퍼레이즈를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 여섯 번째 목적은 대사 재설계를 통한 리포산 합성 효소를 모두 포함하고, 상기 유전자로부터 발현된 리포산 합성 효소를 모두 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 일곱 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 리포산 합성효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 여덟 번째 목적은 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터의 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 아홉 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 열 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 열한 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 열두 번째 목적은 상기 모든 효소를 이용하여 옥탄산(octanoic acid)로부터 알파-리포산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)리포산 합성효소; b) 리포산 단백질 리가제A 효소; 및 c)리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 이용한 알파-리포산 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 리포산 합성효소는 서열번호 17의 아미노산 서열을 가지고, 상기 리포산 단백질 리가제A 효소는 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지며, 상기 리포일 트랜스퍼레이즈 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 제조방법은 a)피루베이트 디하이드로게네이즈, 및 b)철-황 클러스터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조 효소를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 피루베이트 디하이드로게네이즈는 서열번호 9, 10, 또는 11의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 철-황 클러스터는 서열번호 15, 또는 16의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서 상기 제조방법은 옥탄산과 L-시스테인을 이용하여 알파-리포산을 생산하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 제공한다.
또 본 발명은 상기의 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 코딩하는 유전자를 제공하다. 상기의 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 유전자가 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 서열번호 9, 10, 또는 11의 아미노산 서열을 가지는 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 15, 또는 16의 아미노산 서열을 가지는 철-황 클러스터를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 제조방법은 옥탄산과 L-시스테인을 이용하여 알파-리포산을 생산하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 각각 서열번호 4; 서열번호 9, 10, 또는 11; 및 서열번호 15, 또는 16의 아미노산 서열 또는 그 기능적 단편을 가지는 리포일 트랜스퍼레이즈 효소, 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 및 철-황 클러스터를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 리포일 트랜스퍼레이즈 효소는 슈도모나스 플로로센스에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서 리포일 트랜스퍼레이즈 효소는 알파-리포산 생산에 특이적인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 리포일 트랜스퍼레이즈 효소의 분자량은 28 kDa인 것을 특징한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체는 대장균 K12에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 분자량은 각각, 100 kDa, 66 kDa, 또는 53 kDa인 것을 특징한다. 또한 본 발명은 본 발명의 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체를 코딩하는 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 철-황 클러스터는 대장균 K12에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 철-황 클러스터의 분자량은 각각, 45 kDa, 또는 14 kDa인 것을 특징한다. 또한 본 발명은 본 발명의 철-황 클러스터를 코딩하는 철-황 클러스터 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 리포산 합성효소 유전자들을 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 리포산 합성효소를 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 리포산 합성효소를 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 철-황 클러스터를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 리포산 합성효소를 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 리포산 합성 효소들과 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 모두를 이용하여 옥탄산으로부터 알파-리포산을 제조하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명의 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터는 각각 서열번호 4; 서열번호 9, 10, 또는 11; 및 서열번호 15, 또는 16으로 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 각각 서열번호 4; 서열번호 9, 10, 또는 11; 및 서열번호 15, 또는 16으로 표시되는 아미노산서열에 대해서, 이들 아미노산서열을 가진 단백질이 표시하는 트랜스퍼레이즈 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이 효소도 본 발명에 관한 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터에 포함된다.
또, 본 발명에는 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다.
또한, 본 발명에는 이 형질전환체를 배양하여 얻게 되는 배양물로부터 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터의 제조방법이 포함된다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자는 슈도모나스 플로로센스의 균체로부터 분리된 것이며, 본 발명의 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터는 대장균 K12의 균체로부터 분리된 것이다.
각각 서열번호 3와 서열번호 4에는 본 발명의 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자의 염기서열과 그 아미노산 서열을, 표시하나, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 활성을 가지는 한, 몇 가지의, 예를 들면 1 또는 수개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다.
각각 서열번호 9, 10, 또는 11에는 본 발명의 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체의 아미노산서열을 표시하나, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소 활성을 가지는 한, 몇 가지의, 예를 들면 1 또는 수개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다.
또, 재조합벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.
본 발명에 관한 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소의 제조는, 예를 들면, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소를 생성축적시켜, 배양물로부터 상기 효소를 취득함으로써 행하여진다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.
또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지,NB배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소를 균체 내에 축적시키고, 회수한다.
또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.
리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소의 취득은, 얻게 되는 배양물 중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.
얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동, 웨스턴블로팅등에 의해 행할 수 있다.
또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소의 생산과 균체내에의 축적, 및, 균체로부터의 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 효소의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자는 알파-리포산의 생물학적인 생산을 할 수 있는 효소를 개발하고자 슈도모나스 플로로센스로부터 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자를 클로닝하였고, 대장균 K12로부터 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 유전자를 클로닝하였다. 전기 유전자를 삽입한 재조합 균주가 옥탄산으로부터 알파-리포산을 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 부산물의 생성을 크게 감소시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 산업적으로 유용한 생물학적 생산을 하기 위하여 슈도모나스 플로로센스의 유전자로부터 리포일 트랜스퍼레이즈 효소 유전자를 클로닝하고, 대장균 K12로부터 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 유전자를 클로닝하였다. 상기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한다.
본 발명의 리포일 트랜스퍼레이즈 효소와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체와 철-황 클러스터 유전자는 옥탄산을 기질로 하여 알파-리포산을 형성하는 효소, 또는 조효소로서, 보다 바람직하게는 옥탄산을 알파-리포산으로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 리포일 트랜스퍼레이즈 효소와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터를 의미한다.
본 발명의 리포일 트랜스퍼레이즈 효소는 분자량이 약 28kDa이며, 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 분자량은 각각, 100 kDa, 66 kDa, 또는 53 kDa이고, 철-황 클러스터의 분자량은 각각, 45 kDa, 또는 14 kDa이다.
본 발명의 리포산 생합성 관련 효소와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 유전자를 함께 발현시켰을 때 알파-리포산의 생산이 효율적으로 증가하였다.
본 발명의 리포산 생합성 관련 효소와 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체, 철-황 클러스터 유전자는 옥탄산으로부터 알파-리포산 합성을 촉매한다. 따라서 알파-리포산 합성에 사용되는 상기 효소들은 매우 적합하다 할 것이며, 옥탄산으로부터 알파-리포산 생산에 유용하게 적용될 것이다.
본 발명의 리포산의 생물학적 합성방법에 의해 생산된 알파-리포산은 항산화제, 피부미용 및 항노화, 혈당치 저하 및 다른 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 중요하다. 알파-리포산은 유용한 당뇨병, 심장병 치료제로 쓰이고 있다. 따라서 대사 재설계와 리포산 합성에 관련된 조효소를 이용한 알파-리포산의 생산 방법은 생물학적인 생산을 위한 기본 단계로서 중요하게 작용할 것이다.
도 1은 슈도모나스 플로로센스 균주로부터 유래된 리포산 합성에 관련된 효소들의 기작을 나타내는 도면이다.
도 2는 슈도모나스 플로로센스 균주로부터 유래된 리포일 트랜스퍼레이즈 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 3은 대장균 K12 균주로부터 유래된 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체(pyruvate dehydrogenase complex)를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 4는 대장균 K12 균주로부터 유래된 철-황 클러스터(Fe-S cluster)를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 5는 슈도모나스 플로로센스 균주로부터 유래된 리포산 합성에 관련된 효소들의 대사 재설계 과정을 통하여 만들어진 각각의 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 리포일 트랜스퍼레이즈 효소의 유전자 클로닝
슈도모나스 플로로센스(ATCC BAA-447,American Type Culture Collection, 미국)를 30℃에서 배양하고, 원심분리(8000g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 슈도모나스 플로로센스 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 lipB-F-BamHI F-5'ATA TGG ATC CAT GCC ACA GAC GCT GGG -3'(서열번호 1)와 lipB-R-HindIII R-5'CGC TAA GCT TGT CGA TTC CGC CCG -3'(서열번호 2)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 슈도모나스 플로로센스에서 증폭된 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 포함한 유전자(서열번호 3)를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다.
실시예 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조와 효소의 발현
실시예 1에 따른 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 리포일 트랜스퍼레이즈 효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pQE80L(Qiagen, 미국) BamHⅠ과 HindⅢ 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 K12(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 2, 서열번호 4).
상기 실시예에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤, 웨스턴 블랏에서 발현된 단백질을 확인하였다.
실시예 3: 대사 재설계에 의한 리포산 합성 효소들의 유전자 클로닝 , 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조
슈도모나스 플로로센스에서의 알파-리포산 생산 관련 효소인 리포산합성 효소 (lipA), 리포일 트랜스퍼레이즈 (lipB), 리포산 단백질 라가제A(lplA)들을 대사 재설계 하기 위하여 각각 PCR을 행하였다. 서열번호 5은 리보솜 결합 위치(ribosomal binding site)를 포합한 프라이머다. 얻어진 DNA 단편은 상기 실시예2 와 같이 실시하고, 또한 상기 유전자를 이용하여, 리포산 생산 효소들을 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pQE80L(Qiagen, 미국)에 상기 효소 유전자인 리포산합성 효소 (lipA) 유전자(서열번호 19)와 리포산 단백질 라가제A(lplA)유전자(서열번호 20)를 삽입한 후 재조합 벡터 pQE80L lipB/lipA, pQE80L lplA/lipB, pQE80L lipA/lplA, pQE80L lplA/lipA, pQE80L lplA/lipB/lipA, pQE80L lplA/lipA/lipB를 제조하고, 대장균 K12(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다.
상기 실시예의 대표적인 내용은 도 3에 나타내었다.
실시예 4: 피루베이트 디하드로게네이즈 복합체 효소의 유전자 클로닝
대장균 K12(NEB, 영국)를 37℃에서 배양하고, 원심분리(8000g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 대장균 피루베이트 디하이드로게네이즈를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 PDC-F-NcoI F-5' ATA TCC ATG GAT GTC AGA ACG TTT CCC AAA -3'(서열번호 6)와 PDC-R-XhoI R-5' TAA TCT CGA GTT ACT TCT TCT TCG CTT TCG G -3'(서열번호 7)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 대장균 K12에서 증폭된 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 효소를 포함한 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다(서열번호 8).서열번호 8은 3가지 종류의 피루베이트 디하이드로게네이즈 단백질을 코딩하는 유전자[E1(서열번호 21), E2(서열번호 22) 및 E3(서열번호 23)]가 동시에 삽입되어 있는 것이다. 즉 유전자를 클로닝할 때 genome 내에 존재하는 3가지 종류의 단백질을 한꺼번에 얻어서 expression vector에 full로 넣은 뒤 발현시킨 것이다.
실시예 5: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조
실시예 4에 따른 피루베이트 디하드로게네이즈 복합체 효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 피루베이트 디하드로게네이즈 복합체 효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pCOLA duet(Novagen, 독일) NcoI과 XhoI 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 K12(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 4, 서열번호 9, 10, 11).
상기 실시예에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다.
실시예 6: 철-황 클러스터 효소의 유전자 클로닝
대장균 K12(NEB, 영국)를 37℃에서 배양하고, 원심분리(8000g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 대장균 철-황 클러스터를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 IscS-F-HindIII F-5' CGA CAA GCT TAT GAA ATT ACC GAT TTA TCT CGA C -3'(서열번호 12)와 IscU-R- ClaI R-5'AGA GAT CGA TTT TTG CTT CAC GTT TGC TTT TAT A -3'(서열번호 13)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 대장균 K12에서 증폭된 철-황 클러스터 효소를 포함한 유전자(서열번호 14)를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다. 서열번호 8번과 마찬가지로 서열번호 14는 2개의 유전자[iscS(서열번호 24)와 iscU(서열번호 25)]를 한번에 full로 genome으로부터 증폭하여 염기서열을 분석하였고, 이것을 발현벡터에 넣어 발현을 시키면 2종류의 철-황 클러스터 효소가 발현되게 된다.
실시예 7: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조
실시예 6에 따른 철-황 클러스터 효소를 암호화하는 유전자를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pPRO Lar. A122 (Takara, 일본) HindⅢ과 ClaⅠ 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 K12(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 5, 서열목록 15, 16).
상기 실시예에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다.
실시예 8: 대사 재설계를 한 리포산 합성 효소들을 이용한 알파-리포산 생산 방법
상기 실시예 3에서 발현시킨 리포산 생합성 관련 효소들을 이용하여 알파-리포산의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 리포산 생합성 관련 효소들을 이용하는 본 발명의 알파-리포산 생산방법에서, 초기 기질인 옥탄산의 농도 1mM, L-시스테인을 0.2mM로 사용하여 알파-리포산의 생산농도를 확인하였다.
600nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때, 0.1mM ITPG를 첨가하여 효소 생산을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 16℃로 유지하였다.
균 배양 방법은 실시예 3과 같이 수행하였으며, 그 결과는 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 바와 같이, 대사 재설계를 통해 리포산 생산효소를 같이 발현 시켰을 때, 알파-리포산 생산농도는 202.6㎍ g-cell- 1 이었다.
재조합 효소 LA content (㎍ g-cell-1 )
대장균 (wild type) 57.4 ± 1.67
pQE80L lipB/lipA 87.5 ± 3.18
pQE80L lplA/lipB 98.5 ± 3.83
pQE80L lipA/lipB 109.0 ± 3.91
pQE80L lipA/lplA 119.8 ± 2.83
pQE80L lplA/lipA 202.6 ± 5.29
pQE80L lplA/lipB/lipA 184.1 ± 2.96
pQE80L lplA/lipA/lipB 193.2 ± 1.38
실시예 9: 대사 재설계를 통한 리포산 합성 효소들과 피루베이트 디하이드로게네이즈를 이용한 알파-리포산 생산 방법
리포산 생합성 효소들과 리포산 생합성에 관련된 조효소를 이용하는 본 발명의 알파-리포산 생산방법에서, 피루베이트 디하이드로게네이즈 효소가 알파-리포산 생산에 미치는 영향에 대해서 확인하였다. 균 배양과 알파-리포산 생산 방법은 실시예 8과 같이 수행하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.
피루베이트 디하이드로게네이즈 효소는 리포일 트랜스퍼레이즈 효소의 조효소로서 작용하는데, 피루베이트 디하이드로게네이즈의 E2 도메인을 octanoyl-ACP에 부착시킴으로 다음 단계의 효소인 리포산 생산효소의 기질로 작용하게끔 도와준다.따라서 피루베이트 디하이드로게네이즈는 재조합 리포일 트랜스퍼레이즈가 존재할 때에 알파-리포산의 생산에 영향을 미친다.
표 2에 나타난 바와 같이, 알파-리포산의 생산은 피루베이트 디하이드로게네이즈를 같이 발현 시켰을 때에는 같이 발현시키지 않았을 때보다 최저 30% 정도 알파-리포산의 생산이 증가하였다. 피루베이트 디하이드로게네이즈를 같이 발현 시켰을 때 알파-리포산의 최고 생산농도는 231.4㎍ g-cell- 1 이었다. 이러한 최종 농도는 재조합 균주를 첨가하지 않은 대조군에 비해 알파-리포산의 생물학적 생산에서 우수한 수치이다.
LA content (ug g-DCW-1)
재조합 효소 + PDC
대장균 (wild type) 57.4 ± 1.67 76.1 ± 2.09
pQE80L lipB 64.8 ± 1.73 100.6 ± 4.17
pQE80L lipB/lipA 87.5 ± 3.18 117.3 ± 2.01
pQE80L lplA/lipB 98.5 ± 3.83 138.5 ± 1.96
pQE80L lipA/lipB 109.0 ± 3.91 141.9 ± 2.58
pQE80L lplA/lipB/lipA 184.1 ± 2.96 211.6 ± 4.83
pQE80L lplA/lipA/lipB 193.2 ± 1.38 231.4 ± 3.27
실시예 10: 리포산 합성 효소 및 철-황 클러스터를 이용한 대사 재설계에 의한 알파-리포산 생산 방법
리포산 생합성 효소들과 리포산 생합성에 관련된 조효소를 이용하는 본 발명의 알파-리포산 생산방법에서, 철-황 클러스터가 알파-리포산 생산에 미치는 영향에 대해서 확인하였다. 균 배양과 알파-리포산 생산 방법은 실시예 8과 같이 수행하였으며, 그 결과는 표 3에 나타내었다.
철-황 클러스터는 리포산 생산 효소의 조효소로서 작용하는데, 철-황 클러스터는 리포산 생산 효소의 작용 전자를 전달하는 과정에 관여하여, 최종적으로 알파-리포산 합성을 하게 한다. 따라서 철-황 클러스터는 재조합 리포산 생산 효소가 존재할 때에 알파-리포산의 생산에 영향을 미친다.
표 3에 나타난 바와 같이, 알파-리포산의 생산은 철-황 클러스터를 같이 발현 시켰을 때, 알파-리포산 생산농도는 560.2㎍ g-cell- 1 이었다. 이러한 최종 농도는 재조합 균주를 첨가하지 않은 대조군에 비해 알파-리포산의 생물학적 생산에서 우수한 수치이다.
LA content (㎍ g-cell-1)
재조합 효소 + IscS/U
대장균 (wild type) 57.4 ± 1.67 -
pQE80L lipA 87.5 ± 1.05 148.5 ± 3.95
pQE80L lipA/lipB 109.0 ± 3.91 230.0 ± 4.17
pQE80L lplA/lipA 202.6 ± 5.29 560.2 ± 3.52
실시예 11: 리포산 합성 효소, 피루베이트 디하이드로게네이즈 , 철-황 클러스터를 이용한 대사 재설계에 의한 알파-리포산 생산 방법
리포산 생합성 효소들과 리포산 생합성에 관련된 조효소를 이용하는 본 발명의 알파-리포산 생산방법에서, 피루베이트 디하이드로게네이즈, 철-황 클러스터가 함께 알파-리포산 생산에 미치는 영향에 대해서 확인하였다. 균 배양과 알파-리포산 생산 방법은 실시예 4와 같이 수행하였으며, 그 결과는 표 4에 나타내었다.
표 4에 나타난 바와 같이, 알파-리포산의 생산은 피루베이트 디하이드로게네이즈, 철-황 클러스터를 같이 발현 시켰을 때, 알파-리포산 생산농도는 677.5㎍ g-cell-1 이었다. 이러한 최종 농도는 알파-리포산의 생물학적 생산에서 우수한 수치이다. 따라서 본 발명의 알파-리포산 생산 방법은 기존의 화학 합성방법에 비해 우수한 농도로 알파-리포산의 생산이 가능하도록 한다.
LA content (㎍ g-cell-1)
재조합 효소 + PDC + IscS/U
대장균 (wild type) 57.4 ± 1.67 -
pQE80L lplA/lipB/lipA 184.1 ± 2.96 660.2 ± 5.93
pQE80L lplA/lipA/lipB 193.2 ± 1.38 677.5 ± 4.28
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 발현벡터의 프로모터 이후에 서열번호 20에 기재된 염기서열을 가지는 리포산 단백질 라가제A(lplA) 및 서열번호 19에 기재된 염기서열을 가지는 리포산합성효소(lipA) 유전자 및 서열번호 3의 염기 서열을 가지는 리포일 트랜스퍼레이즈(lipB)를 코딩하는 유전자를 기재된 순서대로 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고, 이를 대장균에 형질전환시키고,
    또 다른 발현벡터에 피루베이트 디하이드로게네이즈 복합체 효소를 코딩하는 서열번호 8의 유전자를 삽입하여 대장균에 형질전환시킨 후 상기 두 형질전환 균주를 동시 발현시키는 단계를 포함하는 알파-리포산 합성을 증가시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 리포산 합성효소는 서열번호 17의 아미노산 서열을 가지고, 상기 리포산 단백질 리가제A 효소는 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지며, 상기 리포일 트랜스퍼레이즈 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 알파-리포산 합성을 증가시키는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 옥탄산과 L-시스테인을 이용하여 알파-리포산을 생산하는 것을 특징으로 하는 알파-리포산 합성을 증가시키는 방법.
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