KR101249340B1 - Aerococcus sp. lk7 having antibacterial activity and antimicrobial agent comprising same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항균활성을 갖는 에어로코커스 속(Aerococcus sp.) 균주 LK7 및 이를 포함하는 항균물질 제제에 관한 것으로, 어류의 위장관내에서 분리되고, 박테리오신 생산능을 가지며, 항균활성을 갖는 에어로코커스 속 균주 LK7을 포함하는 제제는 항균활성을 갖는 항균물질 제제, 특히 어류 및 가축 사료에 첨가되는 항균활성제로서 당분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to aerococcus sp. ( Aerococcus sp.) Strain LK7 having an antimicrobial activity and an antimicrobial agent comprising the same, isolated in the gastrointestinal tract of fish, has a bacteriocin production capacity, and aerococcus sp. Formulations containing LK7 are expected to be very useful in the art as antimicrobial agents having antimicrobial activity, particularly antimicrobial agents added to fish and livestock feed.

Description

항균활성을 갖는 에어로코커스 속 균주 ＬＫ７ 및 이를 포함하는 항균물질 제제{AEROCOCCUS SP. LK7 HAVING ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND ANTIMICROBIAL AGENT COMPRISING SAME}Aerococcus strain L77 with antimicrobial activity and antimicrobial preparations comprising the same [AEROCOCCUS SP. LK7 HAVING ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND ANTIMICROBIAL AGENT COMPRISING SAME}

본 발명은 항균활성을 갖는 에어로코커스 속(Aerococcus sp.) 균주 LK7 및 이를 포함하는 항균물질 제제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 어류장내에서 유래하는 균주로서 담수 및 해수에서 높은 활성과 생육을 나타내며 박테리오신 생산능을 갖는 에어로코커스 속 균주 LK7 및 이를 포함하는 항균물질 제제에 관한 것이다.
The present invention relates to aerococcus sp. ( Aerococcus sp.) Strain LK7 having an antimicrobial activity and to an antimicrobial agent comprising the same. More specifically, it is a strain derived from a fish farm and shows high activity and growth in fresh and seawater. It relates to aerobicus strain LK7 having a production capacity and an antimicrobial agent comprising the same.

계절 및 서식환경에 관계없이 발병하는 병원미생물로 인하여 어류의 감염피해 및 경제적 손실이 막대하며, 병원성 미생물에 의한 질병예방과 치료를 위해 여러 가지 항생제가 많이 사용되고 있으나, 이들 항생제가 어류나 최종소비자인 사람의 체내에 장기간 축적될 경우 항생제에 대한 내성과 그에 따른 알레르기 유발 등의 안전성에 문제가 발생하게 된다. 따라서 어류의 세균성질병을 일으키는 병원성세균에 대하여 항균작용을 나타내는 천연항균제 개발은 어류의 질병 예방은 물론 수산물 안정성 확보라는 차원에서 그 의의가 매우 크다. 이미 프로바이오틱스(Probiotics)의 개념이 등장하여 어류의 장내에 서식하며 숙주(HOST)에 소화분해, 영양소 합성 및 생체유지에 필요한 에너지 생성 등의 유익한 작용과 유해 미생물에 대한 1차 감염억제 역할을 하고 있는 유용 미생물에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 그러나 산업발전과 인구증가는 농수산물의 집약적 사육환경을 지속화시키고 더욱이 기후 온난화는 병원성 세균 감염률을 높이고 있다. 따라서 치료적인 개념에서 기존의 항생제와 농약을 대체할 수 있는 대안이 필요하게 되었다. Regardless of the season and habitat environment, the pathogenic microorganisms cause a great deal of damage to the fish and economic loss, and many antibiotics are used to prevent and treat diseases caused by pathogenic microorganisms. Long-term accumulation in the human body causes problems with safety, such as resistance to antibiotics and allergens. Therefore, the development of a natural antimicrobial agent that exhibits antimicrobial activity against pathogenic bacteria causing bacterial diseases of fish is very significant in terms of preventing fish disease and securing aquatic products. The concept of probiotics has already emerged, and it lives in the intestines of fish, and plays a role of primary infection control against harmful microorganisms and beneficial effects such as digestion, digestion of nutrients, and generation of energy required for maintaining the host. Many studies on useful microorganisms are in progress. However, industrial development and population growth continue to sustain the intensive breeding environment of agricultural and aquatic products, and moreover, climate warming is increasing the pathogenic bacterial infection rate. Thus, there is a need for alternatives to antibiotics and pesticides in therapeutic terms.

박테리오신(Bacteriocin)은 항균펩타이드(Antimicrobial peptide)로 불리는 살균제(Bacteriocide)에 속한다. 이 물질들은 매우 다양하며 그람양성세균과 그람음성세균 등의 대체적으로 근연종간의 항균활성을 가지는 단백질 또는 단백질과 탄수화물의 복합체로 구성된 물질이다. 특히 인체 소화기관의 단백질 가수 분해 효소에 의해 분해됨으로써, 인체에 무독하고 잔류성이 없다는 점에서 식품 등에서 천연 방부제로서의 그 효용성을 주목받고 있다. Bacteriocin belongs to a bactericidal agent called Antimicrobial peptide. These substances are very diverse and are composed of proteins or complexes of protein and carbohydrates, which generally have antimicrobial activity between gram-positive and gram-negative bacteria. In particular, since it is decomposed by the proteolytic enzymes of the human digestive system, its use as a natural preservative in foods and the like has been attracting attention because it is nontoxic to humans and has no residual.

이에 본 발명자들은 여러 박테리아들이 생산하는 단백질 또는 펩타이드계 항균물질로서 특정 생육환경에서 박테리오신 생산균과 다르거나 혹은 비슷한 미생물들의 생육을 저해할 목적으로 분비되는 것으로 알려진 박테리오신을 개발하기 위해 계속 연구를 진행하던 중 어류의 내장으로부터 항균활성이 우수한 균주를 분리한 후 이를 동정하고, 그 특성을 조사함으로써 동정된 균주가 박테리오신 생산 능력을 가져 항균활성을 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the inventors of the present invention continued to develop a bacteriocin known as a protein or peptide-based antimicrobial substance produced by various bacteria, which is known to be secreted for the purpose of inhibiting the growth of microorganisms different from or similar to bacteriocins in a specific growth environment. The present invention was completed by identifying a strain having excellent antimicrobial activity from the intestines of heavy fish, identifying it, and investigating its properties to find that the identified strain has antibacterial activity with bacteriocin production ability.

본 발명의 목적은 어류의 내장으로부터 분리된 박테리오신 생산능을 가지며 항균활성이 우수한 새로운 균주를 제공하기 위한 것이다.An object of the present invention is to provide a new strain having a bacteriocin production ability isolated from the intestines of fish and excellent antibacterial activity.

본 발명의 다른 목적은 상기 항균활성이 우수한 균주 또는 이로부터 유래된 박테리오신을 포함하는 미생물 유래의 항균물질 제제를 제공하기 위한 것이다.It is another object of the present invention to provide an antimicrobial agent derived from a microorganism comprising the bacteriocin derived from the strain or the strain excellent in the antimicrobial activity.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균물질 제제를 사용하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
Another object of the present invention is to provide a method of using the antimicrobial agent.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 어류의 위장관내에서 분리되고, 박테리오신 생산능을 가지며, 항균활성을 갖는 에어로코커스 속(Aerococcus sp.) 균주 LK7을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides an aerococcus sp. Strain LK7 isolated in the gastrointestinal tract of fish, having bacteriocin production ability, and having antibacterial activity.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 어류의 위장관내에서 분리되고, 박테리오신 생산능을 가지며, 항균활성을 갖는 에어로코커스 속 균주 LK7 또는 이로부터 생산된 박테리오신을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균물질 제제를 제공한다.In order to achieve the above another object, in the present invention, it is isolated in the gastrointestinal tract of the fish, has a bacteriocin production ability, and an antibacterial substance characterized in that it comprises a bacteriocin produced from the genus Aerococcus strain LK7 or an antimicrobial activity Provide formulations.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 항균물질 제제를 어류 또는 가축 사료 중에 첨가되는 항균활성제로서 사용하는 방법을 제공한다.
In order to achieve the above another object, the present invention provides a method for using the antimicrobial agent as an antimicrobial agent added in fish or animal feed.

본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7은 위장관내에서 분리되고, 박테리오신 생산능을 가지며, 항균활성을 가지므로 이를 포함하는 제제는 항균활성을 갖는 항균물질 제제, 특히 어류 및 일반 가축 사료에 첨가되는 항균활성제로서 뿐만 아니라 식품 방부제 또는 화장품 및 기타 항균 소독제로서 미생물 유래의 농약 및 가축의 우리 소독제로서 적용될 수 있어 당분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Aerococcus strain LK7 according to the present invention is isolated in the gastrointestinal tract, has a bacteriocin production capacity, and has an antimicrobial activity, so that the preparation comprising the antimicrobial agent having an antimicrobial activity, in particular, antibacterial agents added to fish and general livestock feed As an active agent as well as food preservatives or cosmetics and other antimicrobial disinfectants can be applied as a microorganism-derived pesticides and domestic disinfectant of livestock is expected to be very useful in the art.

도 1은 본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7의 동정결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7의 다양한 배지에서의 성장을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7을 LB 액체 배지에 접종하여 30℃에서 배양한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7의 항균 범위를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7이 생산하는 박테리오신의 최소 저해 농도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 박테리오신에 대해 단백질 분해 효소 처리 후 잔존 활성을 나타낸 것이다.
도 8은 박테리오신의 열처리 후 잔존 활성을 나타낸 것이다.
도 9는 질소원에 따른 본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7의 성장을 나타낸 그래프이다.
도 10은 박테리오신의 pH 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 박테리오신의 정제시 pH에 따른 흡착율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 박테리오신의 정제시 pH에 따른 회수율을 나타낸 그래프이다.
도 13은 회수한 박테리오신의 SDS 전기영동을 통한 분자량을 측정결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the results of the identification of strains LK7 genus Aerococcus according to the present invention.
2 is a scanning electron micrograph of the genus Aerococcus strain LK7 according to the present invention.
Figure 3 shows the growth in a variety of medium of the genus Aerococcus strain LK7 according to the present invention.
Figure 4 is a graph showing the results of incubation at 30 ° C by inoculating aerobicus strain LK7 in LB liquid medium according to the present invention.
Figure 5 shows the antimicrobial range of aerobics strain LK7 in accordance with the present invention.
Figure 6 is a graph showing the minimum inhibitory concentration of bacteriocin produced by aerobicus strain LK7 according to the present invention.
Figure 7 shows the residual activity after proteolytic enzyme treatment for bacteriocin.
8 shows the residual activity after heat treatment of bacteriocin.
9 is a graph showing the growth of aerobic strain of the genus LK7 according to the present invention according to the nitrogen source.
10 is a graph showing pH stability of bacteriocins.
11 is a graph showing the adsorption rate according to pH at the time of purification of bacteriocin.
12 is a graph showing the recovery according to the pH of the bacteriocin purification.
Figure 13 shows the result of measuring the molecular weight through the SDS electrophoresis of the recovered bacteriocin.

본 발명에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 갖는 것으로 해석될 수 있다.The technical terms and scientific terms used in the present invention can be construed as meaning ordinary meanings understood by those of ordinary skill in the art without departing from the scope of the present invention.

본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7은 어류의 위장관내에서 분리되고, 박테리오신 생산능을 가지며, 항균활성을 갖는 것을 특징으로 한다. Aerococcus strain LK7 according to the present invention is isolated from the gastrointestinal tract of fish, is characterized by having bacteriocin production capacity and antibacterial activity.

이러한 본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7은 세포모양, 그람 염색, 에어로빅, 카탈라제 테스트, VP 테스트, 운동성, 블러드 아가상 녹화시험, NaCl에서의 성장 등과 16rDNA 서열화를 통한 결과를 살펴볼 때 에어로코커스 속 균주로 동정할 수 있다.Strain LK7 according to the present invention is aerobics strains when looking at the results through cell morphology, Gram staining, aerobics, catalase test, VP test, motility, blood imaginary greening test, growth in NaCl and 16rDNA sequencing I can identify with.

본 발명에서 동정된 에어로코커스 속 균주 LK7은 국립농업과학원 농업유전자원센타에 2010년 11월 22일자로 기탁번호 제 KACC 91604P 호로서 수탁하였다.Aerococcus strain LK7 identified in the present invention was deposited in the National Agricultural Science Institute Agricultural Genetic Resources Center as November 22, 2010 Accession No. KACC 91604P.

본 발명에서 사용한 실험어류, 사용균주 및 배지는 다음과 같다.
Experimental fish, strains and media used in the present invention are as follows.

실험어류 및 사용균주Experimental Fish and Strains Used

대한민국 경산, 대구광역시 수산시장 및 횟집에서 구입한 국내에서 가장 양식빈도가 높은 어종 중 광어와 우럭 등을 실험어류로 사용하였고, 항균력 측정에 사용된 균주는 어류질병을 야기하는 세균으로 한국수산과학원 어병방역센터에서 분양받아 15% 글리세롤(-70℃)에 보관하면서 사용하였다.
Among the most frequently farmed fish species purchased in Gyeongsan, Daegu fish market and sashimi, Korea was used as experimental fish. The strains used to measure antimicrobial activity were the bacteria causing fish disease. It was used at the control center and kept in 15% glycerol (-70 ℃).

사용배지Used badge

균주의 배양은 NSS 용액(NaCl 17.6g/ℓ, Na2SO4 1.47g/ℓ, NaHCO3 0.08g/ℓ, KCl 0.25g/ℓ, KBr 0.04g/ℓ, MgCl2ㆍ6H2O 1.87g/ℓ, CaCl2ㆍ2H2O 0.41g/ℓ, SrCl2ㆍ6H2O 0.008g/ℓ, H3BO3 0.008g/ℓ)에 MRS 브로스(프로테오스펩톤(proteosepeptone) 10g/ℓ, 비프 추출물(beef extract) 10g/ℓ, 이스트 추출물(yeast extract) 5g/ℓ, 덱스트로스(dextrose)20g/ℓ, 시트르산 암모늄(ammonium citrate) 2g/ℓ, 아세트산 나트륨(sodium acetate) 5g/ℓ, K2HPO4 2g/ℓ, MgSO4ㆍ7H2O 0.1g/ℓ, MnSO4ㆍ7H2O 0.05g/ℓ가 첨가된 배지)를 사용하였고, 분리는 비브리오 선별배지인 TCBS 한천배지를 사용하였다. 또한, 항균력 측정을 위하여 어류질병을 야기하는 세균의 배양은 LB 브로스를 사용하였다.Culture of the strain was NSS solution (NaCl 17.6g / L, Na 2 SO 4 1.47g / L, NaHCO 3 0.08g / L, KCl 0.25g / L, KBr 0.04g / L, MgCl 2 6H2O 1.87g / L, MRS broth (proteosepeptone 10 g / l, beep extract (beef) in CaCl 2 2H 2 O 0.41 g / l, SrCl 2 6H 2 O 0.008 g / l, H 3 BO 3 0.008 g / l extract 10g / ℓ, yeast extract 5g / ℓ, dextrose 20g / ℓ, ammonium citrate 2g / ℓ, sodium acetate 5g / ℓ, K 2 HPO 4 2 g / L, medium containing 0.1 g / L MgSO 4 · 7H 2 O, 0.05 g / L MnSO 4 · 7H 2 O)) were used, and TCBS agar medium, a Vibrio selection medium, was used for separation. In addition, LB broth was used for the culture of bacteria causing fish disease for the measurement of antimicrobial activity.

본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7을 LB 액체 배지에 접종하여 30℃에서 배양한 결과, 균체 증식은 배양 10시간이 지나면서부터 정지기에 들어가고, 박테리오신 생산은 접종 후 균체생육과 함께 생산되며, 배양 13시간 만에 최대 생산량을 나타내며 배양 24시간까지 유지되다가 차츰 감소하는 경향을 갖는다.As a result of inoculating aerobicus strain LK7 according to the present invention into LB liquid medium and incubating at 30 ° C., cell growth was stopped after 10 hours of cultivation, and bacteriocin production was produced together with cell growth after inoculation. It shows the maximum yield in time and tends to decrease until it is maintained up to 24 hours.

본 발명의 에어로코커스 속 균주 LK7의 배양액을 5×10- 2농도 이상으로 첨가시키면 리스토넬라 안길라리움의 생장은 저해되며, 이러한 MIC결과를 바탕으로 활성 단위(activity unit, AU)는 1ml 당 LD50(5×10-2)으로 나타낸 결과 100,000 AU/ml로 나타낼 수 있었다. The culture of the aero Rhodococcus sp LK7 of the present invention 5 × 10 - Growth of 2 if concentration or more is added to the restore Nella Anguilla Solarium is inhibiting, the activity units (activity unit, AU) Based on these MIC results per 1ml LD50 (5 × 10 −2 ) was used to indicate 100,000 AU / ml.

본 발명의 에어로코커스 속 균주 LK7이 생산하는 박테리오신은 단백질 분해효소에 의해 활성이 저해되며 열에 안정하다.Bacteriocin produced by the aerobicus strain LK7 of the present invention is inhibited in activity by protease and is stable to heat.

본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7은 위장관내에서 분리되고, 박테리오신 생산능을 가지며, 항균활성을 가지므로 이를 포함하는 제제는 항균활성을 갖는 항균물질 제제, 특히 어류 및 일반 가축 사료에 첨가되는 항균활성제로서 뿐만 아니라 식품 방부제 또는 화장품 및 기타 항균 소독제로서 미생물 유래의 농약 및 가축의 우리 소독제로서 적용될 수 있어 당분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.Aerococcus strain LK7 according to the present invention is isolated in the gastrointestinal tract, has a bacteriocin production capacity, and has an antimicrobial activity, so that the preparation comprising the antimicrobial agent having an antimicrobial activity, in particular, antibacterial agents added to fish and general livestock feed As an active agent as well as food preservatives or cosmetics and other antimicrobial disinfectants can be applied as a microorganism-derived pesticides and domestic disinfectant of livestock is expected to be very useful in the art.

이하 본 발명을 하기 실시 예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예 1: 균주 분리 및 항균물질 생산 균주의 탐색 Example 1 Screening of Strain Isolation and Antimicrobial Production Strains

위장관내에 서식하는 항균활성이 강한 균종의 분리를 위해 각 어종의 위와 내장을 적출해내어 최대한 세절하여 NSS 용액으로 진탕 배양하고 현탁액을 얻었다. 각 현탁액을 희석한 다음 0.1㎖씩을 미리 조성된 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하면서 물고기 내장에 서식하는 세균들의 콜로니를 얻었다. In order to isolate the strong antibacterial species living in the gastrointestinal tract, the stomach and intestines of each fish species were extracted and chopped as much as possible, followed by shaking culture with NSS solution to obtain a suspension. After diluting each suspension, 0.1 ml each was plated on a previously prepared LB agar medium to obtain colonies of bacteria inhabiting the fish intestine while incubating at 30 ° C. for at least 24 hours.

이어서, 선별된 균주의 어류질병을 야기하는 세균에 대한 항균력을 측정하기 위하여 먼저 한국 수산과학원 어류방역 센터에서 분양받은 병원미생물 리스토넬라 안길라룸 (Listonella anguillarum) 및 에드워드시엘라 타르타(Edward siella tarta)를 LB 한천배지에 100㎕씩 접종하여 위에서 얻어낸 균주의 투트피크(Toothpick)를 통해 클리어 존을 형성하는 균주를 최종 선별하였다. 선별한 균주들을 LB 액체 배지에 접종하여 하룻밤 진탕 배양한 후 원심 분리하여 균체를 제거하고 상등액만을 취하여 0.45㎛ 여과막(membrane filter)으로 잔존 균체를 완전히 제거한 후 미리 목표 균주가 도말되어 있는 LB 한천 배지 위에 페이퍼 디스크를 이용하여 항균활성을 실험한 결과 저해환이 가장 큰 균주 LK7을 최종 선발하였다.
Next, in order to measure the antimicrobial activity of the bacteria causing the fish disease of the selected strains, first, the hospital microbial Listonella Anguillalum ( Listonella), which was distributed at the Fisheries Protection Center of the Korean Fisheries Research and Development Institute Strains that form clear zones were finally selected through toothpick of strains obtained by inoculating 100 g of LB agar medium with anguillarum ) and Edward siella tarta. Selected strains were inoculated in LB liquid medium, shake-cultured overnight, centrifuged to remove the cells, and only the supernatant was removed to completely remove the remaining cells with a 0.45㎛ membrane filter. The antimicrobial activity was tested using a paper disk, and the strain LK7 with the largest inhibitory ring was finally selected.

실시예 2: 선발된 균주의 동정 Example 2 Identification of Selected Strains

선발된 균주인 LK7에 대해 형태적, 생리적 및 생화학적 실험을 통하여 동정을 실시하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 도 1은 선발된 균주의 동정결과를 나타낸 것이다. 이어서, 균주의 형태를 관찰하기 위해서 전자현미경을 이용하였고 그 결과를 도 2에 나타내었다. The selected strain LK7 was identified through morphological, physiological and biochemical experiments. The results are shown in Table 1 below. Figure 1 shows the results of the identification of the selected strains. Subsequently, an electron microscope was used to observe the morphology of the strain, and the results are shown in FIG. 2.

Test Test 본 발명의 에어로코커스 속
균주 LK7Aerobics genus of the present invention
Strain LK7 에어로코커스 속 균주Strains of the genus Aerococcus 세포 모양Cell shape cocci cocci cocci cocci 그람 염색Gram stain ++ ++ 에어로빅aerobic -- -- 카탈라제 테스트
(Catalase test)Catalase test
(Catalase test) -- -- VP 테스트VP test -- -- 운동성motility -- -- 블러드 아가상 녹화 Blood Sweetheart Recording -- ++ NaCl 6.5% 성장NaCl 6.5% growth ++ ++ 45℃에서 성장 Grow at 45 ℃ -- - -

상기 표 1 및 도 1의 결과로부터 선발된 본 균주는 그람 양성 구균으로 간주되었다. 이러한 동전된 균주는 에어로코커스 속 균주 LK7로서 국립농업과학원 농업유전자원센타에 2010년 11월 22일자로 기탁번호 제 KACC 91604P 호로서 수탁하였다.
The strain selected from the results in Table 1 and Figure 1 above was considered Gram-positive cocci. This coined strain was aerocaus strain LK7 and was deposited with the National Agricultural Science Institute Agricultural Genetic Resource Center as Accession No. KACC 91604P dated November 22, 2010.

실시예 3: 동정된 균주의 박테리오신의 생산 Example 3 Production of Bacteriocins of Identified Strains

동정된 균주인 LK7이 생산하는 박테리오신의 생산성을 알아보기 위한 최적 배양조건을 조사하였다. 여러 종의 배지 및 배양 시간을 달리하여 균주를 배양하였으며 균체량과 박테리오신 활성을 측정하였다. 배지로는 NSS MRS 배지에서 균체 증식과 박테리오신 활성이 가장 높게 나타났으나 LB 배지에서의 활성 또한 비슷한 수준으로 나왔기 때문에 LB 배지를 기본 배지로 하여 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 3에서 나타내었다. Optimal culture conditions were investigated to determine the productivity of the bacteriocin produced by the identified strain LK7. Strains were cultured at different media and incubation times, and cell mass and bacteriocin activity were measured. As the medium, cell growth and bacteriocin activity were highest in NSS MRS medium, but the activity in LB medium was similar. Therefore, LB medium was used as a basal medium. The results are shown in FIG.

또한, 동정된 균주 LK7을 LB 액체 배지에 접종하여 30℃에서 배양한 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보듯이, 균체 증식은 배양 10시간이 지나면서부터 정지기에 들어가는 것으로 나타났다. 박테리오신 생산은 접종 후 균체생육과 함께 생산되었으며, 배양 10시간 만에 최대 생산량을 나타내었으며 배양 24시간까지 유지되다가 차츰 감소하는 경향을 나타내었다.
In addition, the result of incubating the identified strain LK7 in LB liquid medium and incubating at 30 ° C. is shown in FIG. 4. As shown in Figure 4, the cell growth appeared to enter the stationary phase after 10 hours of culture. Bacteriocin production was produced along with cell growth after inoculation, and showed a maximum yield in 10 hours of culture, and gradually decreased until 24 hours of culture.

실시예 4: 항균범위 측정 Example 4 Antibacterial Range Measurement

본 균주인 LK7이 생산하는 박테리오신의 항균범위를 측정하기 위하여 몇몇 균주에 활성 실험을 시행하였다. 그 결과는 하기 표 3 및 도 5에 나타내었다.In order to measure the antimicrobial range of bacteriocin produced by this strain LK7, several strains were tested for activity. The results are shown in Table 3 and FIG. 5.

지시균Indicator 저해여부(1x)Inhibition (1x) 저해여부(10x)Inhibition (10x) 리스토넬라 안길라리움 ATCC19264
(Listonella anguillarum ATCC19264)Listonella Anguilarium ATCC19264
( Listonella anguillarum ATCC19264) ++ ++++++ 에드워드시엘라 타다
(Edwardsiella tarda)Edward Cielella
( Edwardsiella tarda ) -- -- 슈도모나스 푸티다
(Pseudomonas putida)Pseudomonas Putida
( Pseudomonas putida ) -- ++ `스파에로틸루스 나탄 ATCC15291
(Sphaerotilus natan ATCC15291)`` Spaerotileus Nathan ATCC15291
( Sphaerotilus natan ATCC15291) -- -- 아그로박테리움 튜모파시언스 GV3101
(Agrobacterium tumefaciens GV3101)Agrobacterium Tumopathians GV3101
( Agrobacterium tumefaciens GV3101) -- -- 대장균 JM109
(Escherichia coli JM109Escherichia coli JM109
( Escherichia coli JM109 ++ ++++ 바실러스 세레우스 KCTC1012
(Bacillus cereus KCTC1012)Bacillus cereus KCTC1012
( Bacillus cereus KCTC1012) -- ++ +: 억제 , - : 비억제 +: Suppression,-: non-inhibition

상기 표 3에서 보듯이 본 발명의 에어로코커스 속 균주 LK7의 경우 리스토넬라 안길라리움에는 큰 활성을 보였고 대장균에도 활성을 가짐을 확인 할 수 있었다. 또한 슈도모나스 푸디다와 바실러스 세레우스에는 10x로 농축하여야 활성을 가짐을 확인 할 수 있었다. As shown in Table 3, the aerobic strain of the present invention, LK7, showed great activity on Ristonella angilarium and was confirmed to have activity on Escherichia coli. In addition, Pseudomonas footida and Bacillus cereus must be concentrated to 10x to have activity.

또한, 어병 세균인 리스토넬라 안길라리움에 대한 항균 활성을 확인하였으며 박테리오신의 최소억제농도(MIC)를 측정하였다. 멸균된 배양액을 일정량의 증류수와 섞어 농도를 달리하여 실험을 진행하였으며 그 결과는 표 4 및 도 6에 나타내었다.
In addition, the antimicrobial activity of fishery bacteria, Ristonella angilarium, was confirmed, and the minimum inhibitory concentration (MIC) of bacteriocin was measured. The sterilized culture solution was mixed with a predetermined amount of distilled water and the experiment was performed at different concentrations, and the results are shown in Table 4 and FIG. 6.

박테리오신 농도Bacteriocin Concentration 00 0.10.1 0.20.2 0.30.3 0.40.4 0.50.5 0.60.6 0.70.7 0.80.8 0.90.9 1One 1.21.2 1.51.5 22 2.52.5 33 콜로니Colony 93049304 54165416 43524352 33243324 25922592 12351235 424424 644644 515515 169169 148148 156156 6969 2424 2222 1010

상기 표 4 및 도 6에서 보듯이, 리스토넬라 안길라리움의 생장은 본 발명의 에어로커커스 속 균주 LK7의 배양액을 90%농도 이상으로 첨가시켰을 때 저해되었다. 즉, 에어로코커스 속 균주 LK7이 생산하는 박테리오신이 어병 세균의 생장을 저해시키는 물질임을 확인할 수 있었다.
As shown in Table 4 and Figure 6, the growth of Listonella angilarium was inhibited when the culture solution of strain LK7 belonging to the aerokerus strain of the present invention was added above 90% concentration. That is, it could be confirmed that bacteriocin produced by the strain LK7 of the aerobic strain is a substance that inhibits the growth of fish disease bacteria.

실시예 5: 박테리오신의 분해효소 처리 및 열처리에 대한 영향 Example 5 Effect of Bacteriocin on Degrading Enzyme Treatment and Heat Treatment

박테리오신의 분해효소 처리 및 열처리에 대한 영향을 알아보기 위하여, 박테리오신 농축액에 단백질 가수분해 효소인 프로테아제 K, 트립신을 최종 농도 100㎍/ml이 되게 하고 50℃에서 5시간 반응시킨 후 잔존 활성을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 5 및 도 7에 나타내었다. In order to investigate the effects of bacteriocin on the enzyme treatment and heat treatment, protease K and trypsin, which are protease K and trypsin, were reacted in the bacteriocin concentrate at a final concentration of 100 µg / ml and reacted at 50 ° C. for 5 hours to measure residual activity. . The results are shown in Table 5 and FIG. 7.

열처리h) Heat treatment h) 클리어 존 크기(mm)Clear zone size (mm) 대조군Control group 2020 대조군+dH 2 O Control + dH 2 O 1515 트립신(10%)Trypsin (10%) 1515 트립신(20%)Trypsin (20%) 1010 프로테아제 k(10%)Protease k (10%) 00 프로테아제 k(20%)Protease k (20%) 00

상기 표 5 및 도 7에서 보듯이, 프로테아제 K에 의하여 활성이 모두 소실되었으며 트립신에 의하여 부분적으로 활성이 소실되었다. As shown in Table 5 and FIG. 7, all activity was lost by protease K and partially lost by trypsin.

이어서, 농축된 박테리오신 용액을 열처리하여 잔존 활성을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 6 및 도 8에 나타내었다. Subsequently, the concentrated bacteriocin solution was heat-treated to measure residual activity, and the results are shown in Table 6 and FIG. 8.

열처리h) Heat treatment h) 클리어 구역 크기(mm)Clear Zone Size (mm) ddH2OddH 2 O 00 무처리No treatment 2020 100℃, 1시간100 ° C, 1 hour 2020 100℃, 2시간100 ° C, 2 hours 2020 100℃, 3시간100 ℃, 3 hours 2020 100℃, 4시간100 ℃, 4 hours 20.520.5 100℃, 5시간100 ℃, 5 hours 2020

상기 표 6에서 보듯이, 박테리오신은 100℃에서 5시간 열처리하였을 때까지는 활성의 변화가 없음을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 박테리오신은 열에 대하여 안정한 것으로 판단되었다.
As shown in Table 6, the bacteriocin was found to have no change in activity until the heat treatment at 100 ℃ for 5 hours. From the above results, bacteriocin was determined to be stable against heat.

실시예 6: 박테리오신 생산에 따른 영양원의 효과 Example 6 Effect of Nutrients on Bacteriocin Production

본 발명의 균주인 에어로코커스 LK7이 생산하는 박테리오신의 최적 생산 배지 조성을 확립하기 위해 LB 액체배지(50%)에 다양한 탄소원(1%), 질소원(1%)을 첨가하여 본 균주를 30℃에서 24시간 배양한 후 균체량과 박테리오신 활성을 측정하였다. 하기 표 7 및 도 9에는 질소원 및 탄소원에 따른 에어로코커스 LK7의 성장을 나타내었으며, 하기 표 8에는 질소원 및 탄소원에 따른 에어로코커스 LK7의 활성을 나타내었다.In order to establish an optimal production medium composition of bacteriocin produced by the aerobicus LK7, the strain of the present invention, various strains of carbon (1%) and nitrogen (1%) were added to the LB liquid medium (50%) and the strain was grown at 30 ° C. Cell culture and bacteriocin activity were measured after time incubation. Table 7 and Figure 9 shows the growth of aerobics LK7 according to the nitrogen source and carbon source, Table 8 shows the activity of the aerobics LK7 according to the nitrogen source and carbon source.

탄소원
질소원 Carbon source
Nitrogen source 락토즈Laktos 글루코즈Glucose 시트르산
나트륨Citric acid
salt 아세트산
나트륨Acetic acid
salt 슈크로즈Sucrose 말토즈Malts (NH4)2SO4 (NH 4 ) 2 SO 4 0.2250.225 0.1440.144 0.0030.003 0.2190.219 0.1610.161 0.2720.272 우레아Urea 0.2070.207 0.6180.618 0.0030.003 0.2870.287 0.5570.557 0.5520.552 펩톤peptone 0.2320.232 0.1970.197 0.0040.004 0.3140.314 0.3340.334 0.2670.267 이스트
추출물East
extract 0.1240.124 0.0720.072 0.0440.044 0.6330.633 0.1030.103 0.1180.118 트립톤Tryptone 0.3540.354 0.3370.337 0.0030.003 0.2550.255 0.4540.454 0.5620.562 맥아 추출물Malt extract 0.1080.108 0.080.08 0.0140.014 0.7270.727 0.170.17 0.1040.104 비프 추출물Beef extract 0.10.1 0.050.05 0.0050.005 0.3130.313 0.020.02 0.0720.072

탄소원Carbon source 아세트산 나트튬 Natium Acetate 아세트산 나트튬Natium Acetate 아세트산 나트튬Natium Acetate 아세트산 나트튬Natium Acetate 아세트산 나트튬Natium Acetate 질소원　Nitrogen source 비프
추출물Beef
extract 맥아
추출물 malt
extract 이스트
추출물 East
extract 트립톤 Tryptone (NH4)2SO4 (NH 4 ) 2 SO 4 클리어
구역(mm) clear
Zone (mm) 13 13 14 14 1111 12 12 12 12

실시예 7: 박테리오신의 pH 안정성 Example 7 pH Stability of Bacteriocin

본 발명의 균주인 에어로코커스 LK7이 생산한 박테리오신의 pH 안정성을 보기 위해 박테리오신 100㎕에 pH 3.0에서 11까지의 완충액을 1:1로 첨가하여 4℃에서 12시간 처리한 다음 효소의 잔존활성을 측정하였다. 이때 pH 3.0~6.0은 100mM 시트르산 완충액으로, pH 6.0~8.0은 100mM 인산나트륨 완충액으로, 그리고 pH 9.0~1.0은 100mM 탄산나트륨 완충액을 이용하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다. 도 10에서 보듯이, LK7이 생산하는 박테리오신의 경우 pH가 높아질수록 활성이 점차 저해 되었으며, pH 7 이하에서는 활성을 유지 한다는 것을 알 수 있었다.In order to check the pH stability of the bacteriocin produced by the aerobicus LK7 strain of the present invention, 100 μl of bacteriocin was added 1: 1 at pH 3.0 to 11 and treated at 4 ° C. for 12 hours to measure the residual activity of the enzyme. It was. At this time, pH 3.0-6.0 was used as 100mM citric acid buffer, pH 6.0-8.0 was used as 100mM sodium phosphate buffer, and pH 9.0-1.0 was used in 100mM sodium carbonate buffer. The results are shown in Fig. As shown in FIG. 10, the bacteriocin produced by LK7 was gradually inhibited as the pH was increased, and the activity was maintained at pH 7 and below.

실시예 8: 박테리오신에 대한 금속이온의 영향 Example 8 Effect of Metal Ions on Bacteriocin

박테리오신의 금속이온에 대한 영향을 알아보기 위하여 각종 금속이온을 효소액에 첨가하여 금속이온의 최종농도를 1×10-3M으로 조정한 후 4℃에서 12시간 반응하여 금속이온이 효소활성에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타 내었다.
In order to examine the effects of bacteriocin on metal ions, various metal ions were added to the enzyme solution to adjust the final concentration of the metal ions to 1 × 10 -3 M, and then the reaction was carried out at 4 ° C. for 12 hours to affect the enzyme activity. Was reviewed. The results are shown in Table 9 below.

금속이온Metal ion 잔존 활성(%)Remaining active (%) FeSO4 FeSO 4 00 CaCl2 CaCl 2 00 AgNO3 AgNO 3 100100 MnSO4 MnSO 4 5050 MgSO4MgSO4 00 SnCl2SnCl2 00 BaCl2BaCl2 00 CoCl2CoCl2 100100 CuSO4CuSO4 00 ZnSO4ZnSO4 00

실시예 9: 박테리오신에 대한 효소 저해제의 영향 Example 9 Effect of Enzyme Inhibitors on Bacteriocin

박테리오신의 효소 저해제에 대한 영향을 알아보기 위하여 효소저해제를 효소액에 첨가하여 저해제의 최종농도를 1×10 - 3M으로 조정한 후 4℃에서 12시간 전처리 후 잔존 활성을 측정하여 효소저해제가 효소활성에 미치는 영향을 검토하였다. 하기 표 10에 그 결과를 나타내었다.
In order to examine the effect on the enzyme inhibitors of the bacteriocin was added to the enzyme inhibitor to the enzyme solution to a final concentration of inhibitor 1 × 10 - measuring a 3 after adjusting the M residual activity after 12 hours pre-treatment at 4 ℃ by inhibitors of the enzyme activity The impact on the system was reviewed. The results are shown in Table 10 below.

저해제Inhibitor 잔존 활성(%)Remaining active (%) SDSSDS 100100 EDTAEDTA 00 Sodium azideSodium azide 5050 UreaUrea 200200 Tween 80Tween 80 6060 Triton X-100Triton X-100 5050

실시예 10: 박테리오신의 정제 Example 10 : Purification of Bacteriocin

LK7 균주가 생산하는 박테리오신의 정제는 생산해낸 박테리오신을 LK7 균체에 흡착시킨 후 탈착하는 방법을 이용하여 진행하였다. 먼저 균체가 포함되어 있는 배양액의 pH를 적정하여 생산되어 있는 박테리오신을 균체에 흡착시켰다. 그 후 원심분리를 통해 균체만 회수 한 다음 1M NaCl(pH 2)에 현탁시켜 흡착되어 있는 박테리오신을 회수하였다. 회수한 박테리오신을 SDS 전기영동을 통해 분자량을 측정해 보았다. 그 결과를 도 11, 12 및 13에 나타 내었다. 박테리오신의 흡착의 경우 pH 6에서 100%의 효율을 보였으며, pH 2에서 회수율이 가장 크게 나타났다. 이렇게 정제한 박테리오신의 크기는 3.5-4kDa으로 정할 수 있었다.
Purification of the bacteriocin produced by the LK7 strain was carried out by adsorbing the produced bacteriocin to the LK7 cells and then desorption. First, the bacteriocin produced by titrating the pH of the culture solution containing the cells was adsorbed to the cells. Thereafter, only the cells were recovered by centrifugation and then suspended in 1M NaCl (pH 2) to recover the adsorbed bacteriocin. The recovered bacteriocin was measured for molecular weight by SDS electrophoresis. The results are shown in FIGS. 11, 12 and 13. The adsorption of bacteriocin showed 100% efficiency at pH 6 and the highest recovery at pH 2. The size of the purified bacteriocin was determined to be 3.5-4kDa.

본 발명에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7은 위장관내에서 분리되고, 박테리오신 생산능을 가지며, 항균활성을 가지므로 이를 포함하는 제제는 항균활성을 갖는 항균물질 제제, 특히 어류 및 일반 가축 사료에 첨가되는 항균활성제로서 뿐만 아니라 식품 방부제 또는 화장품 및 기타 항균 소독제로서 미생물 유래의 농약 및 가축의 우리 소독제로서 적용될 수 있어 당분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Aerococcus strain LK7 according to the present invention is isolated in the gastrointestinal tract, has a bacteriocin production capacity, and has an antimicrobial activity, so that the preparation comprising the antimicrobial agent having an antimicrobial activity, in particular, antibacterial agents added to fish and general livestock feed As an active agent as well as food preservatives or cosmetics and other antimicrobial disinfectants can be applied as a microorganism-derived pesticides and domestic disinfectant of livestock is expected to be very useful in the art.

국립농업과학원 농업유전자원센터National Institute of Agricultural Science KACC91604PKACC91604P 2010121320101213

Claims (3)

어류의 위장관내에서 분리되고, 박테리오신 생산능을 가지며, 리스토넬라 안길라리움, 대장균, 슈도모나스 푸디다 및 바실러스 세레우스에 대하여 항균활성을 갖는 에어로코커스 속(Aerococcus sp.) 균주 LK7(제 KACC 91604P 호). Aerococcus sp. Strain LK7 isolated from the gastrointestinal tract of the fish and having antibacterial activity against Bacteriocin production and against Ristonella angilarium , Escherichia coli, Pseudomonas footida and Bacillus cereus. number). 제 1 항에 따른 에어로코커스 속 균주 LK7 또는 이로부터 생산된 박테리오신을 포함하며, 리스토넬라 안길라리움, 대장균, 슈도모나스 푸디다 및 바실러스 세레우스에 대하여 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균활성을 갖는 항균물질 제제.It comprises aerobicus strain LK7 according to claim 1 or bacteriocin produced therefrom, and has an antimicrobial activity, characterized in that it has an antimicrobial activity against Listonella anguillarium, Escherichia coli, Pseudomonas footida and Bacillus cereus. Antimicrobial Agents. 제 2 항에 따른 리스토넬라 안길라리움, 대장균, 슈도모나스 푸디다 및 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 갖는 항균물질 제제를 어류 또는 가축 사료 중에 첨가하는 것을 특징으로 하는 항균활성제로서 사용하는 방법.

A method for use as an antimicrobial agent characterized in that an antimicrobial agent having antimicrobial activity against Listonella angilarium, Escherichia coli, Pseudomonas footida and Bacillus cereus according to claim 2 is added to a fish or animal feed.

KR1020100130352A 2010-12-18 2010-12-18 Aerococcus sp. lk7 having antibacterial activity and antimicrobial agent comprising same KR101249340B1 (en)

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