KR101247457B1 - Method for Detecting Pseudomonas spp. - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시료 내에 존재하는 슈도모나스 속 균주를 검출하기 위한 capB 유전자의 용도에 관한 것으로서, capB 유전자를 이용한 슈도모나스 속 균주의 검출방법, 상기 유전자를 타겟으로 하는 슈도모나스 속 균주 검출용 프라이머 세트 및 프로브에 관한 것이다.
본 발명에 따른 시료 내 capB 유전자를 타겟으로 하는 슈도모나스 속 균주 검출방법은 육류 부패의 주 원인균인 슈도모나스 속 균주를 간편하고 신속하게 정량적으로 검출할 수 있어 육류의 부패 여부를 판단하는데 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to the use of the capB gene for detecting a strain of Pseudomonas genus present in a sample, to a method for detecting Pseudomonas strains using the capB gene, to a primer set and probe for detecting Pseudomonas strains targeting the gene will be.
CapB in a sample according to the invention Pseudomonas genus strain detection method targeting genes can be used to determine whether the meat spoilage can be easily and quickly quantitatively detect the strain Pseudomonas strain, the main cause of meat rot.
Description
본 발명은 시료 내에 존재하는 슈도모나스 속 균주를 검출하기 위한 capB 유전자의 용도에 관한 것으로서, capB 유전자를 이용한 슈도모나스 속 균주의 검출방법, 상기 유전자를 타겟으로 하는 슈도모나스 속 균주 검출용 프라이머 세트 및 프로브에 관한 것이다.The present invention relates to the use of the capB gene for detecting a strain of Pseudomonas genus present in a sample, to a method for detecting Pseudomonas strains using the capB gene, to a primer set and probe for detecting Pseudomonas strains targeting the gene will be.
육류에 존재하는 균주에는 Brochothrix thermosphacta , Lactic acid bacteria, Pseudomonas spp., Photobacterium phosphoreum , Shewanella putrefaciens 가 있다. 이중에서 육류의 형태에 관계없이 저온의 호기적 상태에서 지배적인 박테리아는 Pseudomonas spp.(슈도모나스 속 균주)인 것으로 알려져 있다. Strains present in meat include Brochothrix thermosphacta , Lactic acid bacteria , Pseudomonas spp ., Photobacterium phosphoreum , Shewanella There is putrefaciens . Among them, the dominant bacteria in aerobic conditions at low temperature, regardless of meat type, are known as Pseudomonas spp.
슈도모나스 속 균주는 동·식물, 인간 병원체, 육류·어류·유제품의 부패에 관여하는 저온성 균으로서, 대표적으로 Pseudomonas fragi , Pseudomonas putida , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas lundensis , Pseudomonas aeruginosa 등이 있다. 이 중 Pseudomonas fragi는 특히 쇠고기 부패 시 가장 많이 존재하는 균으로 부패취 생성 및 색 변화에 영향을 주는 것으로 알려졌다.Pseudomonas species strain is a psychrotrophic bacteria involved in animals and plants, a human pathogen, meat, fish, dairy products decay, typically Pseudomonas fragi , Pseudomonas putida , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas lundensis , Pseudomonas aeruginosa . Among them, Pseudomonas fragi is the most common bacterium in beef decay.
일반 PCR을 이용하여 녹농균인 Pseudomonas aeruginosa와 식물 병원체인 Pseudomonas syringae 를 검출하는 방법은 개발되었으나 육류 부패에 관여하는 슈도모나스 속 균주를 검출하는 방법은 아직 보고된 바 없다. Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa Using General PCR A method for detecting aeruginosa and Pseudomonas syringae , a plant pathogen, has been developed, but no method for detecting Pseudomonas spp. involved in meat rot has been reported.
본 발명은 육류 부패의 주 원인균인 슈도모나스 속 균주를 신속하게 정량적으로 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a method for rapidly and quantitatively detecting Pseudomonas genus strain which is a main cause of meat rot.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 시료 내 capB 유전자의 존재 유무를 확인하는 것을 포함하는 슈도모나스 속 균주의 검출방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method for detecting Pseudomonas genus strain comprising the presence or absence of the capB gene in the sample.
또한 본 발명은 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 3의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 슈도모나스 속 균주 검출용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention also provides a primer set for Pseudomonas genus strain detection comprising a primer having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a primer having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3.
또한 본 발명은 다음의 구조식으로 이루어진 슈도모나스 속 균주 검출용 프로브를 제공한다: In another aspect, the present invention provides a probe for detecting strain Pseudomonas consisting of the following structural formula:
5'-X-aggcttcggcttcatcactccacaat-Y-3'5'-X-aggcttcggcttcatcactccacaat-Y-3 '
이 때 X는 형광 표지인자이고, Y는 형광 억제물질(quencher)이다.X is a fluorescent marker, Y is a fluorescent inhibitor (quencher).
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 슈도모나스 속 균주 검출용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for Pseudomonas genus strain detection comprising the primer set and the probe.
본 발명에 따른 시료 내 capB 유전자를 타겟으로 하는 슈도모나스 속 균주 검출방법은 육류 부패의 주 원인균인 슈도모나스 속 균주를 간편하고 신속하게 정량적으로 검출할 수 있어 육류의 부패 여부를 판단하는데 유용하게 이용될 수 있다.Pseudomonas strain detection method that targets the capB gene in the sample according to the present invention can be useful for determining the rot of meat can be easily and quickly quantitatively detect the strain Pseudomonas strain, the main cause of meat rot have.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 슈도모나스 속 균주에 대한 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. (각 lane의 번호는 표 1에 개시된 균주 번호와 동일함, Lane 8: 음성 대조군, M: 사이즈 마커)
도 2는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 슈도모나스 속 이외의 균주에 대한 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. (각 lane의 번호는 표 1에 개시된 균주 번호와 동일함, Lane 29: 음성 대조군, M: 사이즈 마커)
도 3은 Pseudomonas fragi KCCM 34724의 생균수 측정 후 십진희석하여 검출한계를 검사한 결과이다. (검출한계: 1.2×105cfu/rxn ~ 1.2×100cfu/rxn )
도 4는 쇠고기를 슈도모나스 선택배지에 배양 후 추출한 DNA를 이용하여 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 (conventional PCR) 분석한 결과이다. (Lane 1: Pseudomonas fragi KCCM 34724, Lane 2~7: 쇠고기에서 추출한 DNA, Lane 8: 음성 대조군, M: 사이즈 마커)
도 5는 쇠고기를 슈도모나스 선택배지에 배양 후 추출한 DNA를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR) 분석한 결과이다.1 is a photograph showing the results of performing a PCR reaction on the Pseudomonas strain using the primer set according to the present invention. (Number of each lane is the same as the strain number disclosed in Table 1, Lane 8: negative control, M: size marker)
Figure 2 is a photograph showing the results of performing a PCR reaction for strains other than Pseudomonas using the primer set according to the present invention. (Number of each lane is the same as the strain number disclosed in Table 1, Lane 29: negative control, M: size marker)
Figure 3 is a graphical representation of Pseudomonas Fragi KCCM 34724 showed the limit of detection by virtue of decimal dilution after measuring viable cell count. (Detection limit: 1.2 × 10 5 cfu / rxn ~ 1.2 × 10 0 cfu / rxn)
Figure 4 shows the results of conventional PCR analysis using the DNA extracted after beef cultured in Pseudomonas selection medium. (Lane 1: Pseudomonas fragi KCCM 34724,
5 is a result of real-time PCR analysis using DNA extracted after culturing beef in Pseudomonas selective medium.
본 발명은 시료 내 슈도모나스 속 균주의 검출을 위한 capB 유전자의 용도를 제공하는 것으로서, 시료 내 capB 유전자의 존재 유무를 확인하는 것을 포함하는 슈도모나스 속 균주의 검출방법을 제공한다.The present invention provides a use of the capB gene for the detection of Pseudomonas genus strain in a sample, and provides a method for detecting the Pseudomonas genus strain comprising the presence or absence of the capB gene in the sample.
본 발명자들은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Genbank와 EBI(European Bioinformatics Institute)의 alignment program을 통해 슈도모나스 속 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 타겟 유전자를 탐색하였다. 그 결과 슈도모나스 속 균주를 저온의 환경에서 적응하고 성장하게 하는 capB 유전자를 선별하였으며, capB 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트를 제작한 후 PCR 반응을 수행하여 슈도모나스 속 균주만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.The present inventors searched for a target gene that can specifically detect Pseudomonas strains through an alignment program of the Genbank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the European Bioinformatics Institute (EBI). As a result, capB genes were selected for adaptation and growth of Pseudomonas spp. In low temperature environment. After preparing primer set for detecting capB gene, PCR reaction was performed to specifically detect Pseudomonas spp. Confirmed.
본 발명에 따른 capB 유전자는 특히 육류 시료 내에서 육류의 부패에 관여하는 슈도모나스 속 균주의 검출을 위해 사용하는 것이 바람직하다. 육류에 존재하면서 육류의 부패에 관여하는 균주들 중에서 육류의 종류에 관계없이 저온의 호기적 상태에서 지배적으로 존재하는 균주는 슈도모나스 속 균주인 것으로 알려져 있다. 그리고 capB 유전자는 이러한 육류의 부패에 관여하는 슈도모나스 속 균주들에 특이적으로 존재하는 유전자이다. 따라서 육류 시료 내에서 capB 유전자의 존재 유무를 확인함으로써 육류의 부패에 관여하는 슈도모나스 속 균주를 특이적으로 검출할 수 있으며, 이를 통하여 육류의 부패 여부를 판단할 수 있다.The capB gene according to the present invention is particularly preferably used for the detection of Pseudomonas strains involved in meat decay in meat samples. Among the strains that are present in meat and are involved in meat decay, it is known that Pseudomonas genus is the dominant strain in the aerobic state at low temperature regardless of the type of meat. And the capB gene is a gene specifically present in Pseudomonas strains involved in the decay of meat. Therefore, by confirming the presence of the capB gene in the meat sample, it is possible to specifically detect the Pseudomonas strain involved in the decay of meat, through which it is possible to determine whether the meat decay.
육류의 부패에 관여하는 슈도모나스 속 균주는 예를 들면 육류 내에서 부패취를 생성하거나 육류의 색 변화에 영향을 주는 균주들로서, 이에 한정되는 것은 아니지만 Pseudomonas fragi , Pseudomonas putida , Pseudomonas fluorescens , Pseudomonas lundensis, Pseudomonas aeruginosa 등이 있다.Pseudomonas species strain involved in the spoilage of meat, for example, as the strain generation spoilage take or to affect the color change of the meat in the meat, but not limited to Pseudomonas fragi , Pseudomonas putida , Pseudomonas fluorescens , Pseudomonas lundensis, Pseudomonas aeruginosa .
본 발명의 한 구체예에서, 시료 내 capB 유전자의 존재 유무의 확인은 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 수행할 수 있다. 통상적인 중합효소연쇄반응을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(conventional PCR) 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용할 수 있고, 리얼타임 중합효소연쇄반응을 이용하는 경우 실시간으로 정량적인 분석이 가능하다. In one embodiment of the present invention, the presence or absence of the capB gene in the sample can be carried out using a polymerase chain reaction (PCR). Conventional polymerase chain reaction can be used, and preferably, conventional PCR or real-time PCR can be used, and real-time polymerase chain reaction can be used. In this case, quantitative analysis is possible in real time.
컨벤셔널 중합효소연쇄반응은 특정 DNA를 증폭한 후에 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계를 추가로 수행하여야 하는 통상의 중합효소연쇄반응을 의미하며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 전기영동 등을 통하여 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 실시간 중합효소연쇄반응은 Taqman 방법을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응일 수 있다.Conventional polymerase chain reaction refers to a conventional polymerase chain reaction in which the step of amplifying a specific DNA after amplifying a specific DNA is additionally performed. The step of checking whether the specific DNA is amplified is It can be carried out by the method of confirming the size of the DNA product amplified through the electrophoresis. The real time polymerase chain reaction may be a real time polymerase chain reaction using Taqman method.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 중합효소연쇄반응은 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 3의 핵산서열을 갖는 프라이머를 이용하여 수행할 수 있다. 서열번호 2 및 서열번호 3의 핵산서열을 갖는 프라이머는 각각 capB 유전자의 18번~106번 핵산서열로 이뤄진 89bp의 단편을 증폭시키기 위한 정방향 및 역방향 프라이머이다.In another embodiment of the present invention, the polymerase chain reaction may be performed using a primer having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a primer having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3. The primers having the nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 are forward and reverse primers for amplifying a 89 bp fragment consisting of nucleic acid sequences 18-106 of the capB gene, respectively.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중합효소연쇄반응은 하기의 구조식으로 이루어진 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the polymerase chain reaction may be a real-time PCR using a probe consisting of the following structural formula.
5'-X-aggcttcggcttcatcactccacaat-Y-3'5'-X-aggcttcggcttcatcactccacaat-Y-3 '
이 때 X는 형광 표지인자이고, Y는 형광 억제물질(quencher)이다.X is a fluorescent marker, Y is a fluorescent inhibitor (quencher).
상기 형광표지인자 X는 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, RED610, TEXAS RED, RED670 또는 NED일 수 있으며, 상기 형광 억제물질은 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 6-TAMRA, ROX, BHQ-1,2,3, 시아닌, 안트로퀴논, 니트로티아졸, 니트로이미다졸, DABSYL 또는 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)일 수 있다.The fluorescent marker X may be, but is not limited to, for example, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, RED610, TEXAS RED, RED670 or NED, but the fluorescent inhibitor is not limited thereto. For example 6-TAMRA, ROX, BHQ-1,2,3, cyanine, antroquinone, nitrothiazole, nitroimidazole, DABSYL or MGBNFQ (molecular grove binding non-fluorescence quencher).
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 프로브는 Taqman 프로브로서 Taqman 방법을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the probe may be used for real-time polymerase chain reaction using the Taqman method as a Taqman probe.
또한 본 발명은 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 3의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 슈도모나스 속 균주 검출용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention also provides a primer set for Pseudomonas genus strain detection comprising a primer having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a primer having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3.
상기 프라이머 세트는 통상적인 중합효소연쇄반응에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(conventional PCR) 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응(real-time PCR)에 이용될 수 있고, 리얼타임 중합효소연쇄반응에 이용하는 경우 실시간으로 정량적인 분석이 가능하다.The primer set may be used in a conventional polymerase chain reaction, preferably in a conventional PCR or real-time PCR, real-time When used in the polymerase chain reaction, quantitative analysis in real time is possible.
또한 본 발명은 하기의 구조식으로 이루어진 슈도모나스 속 균주 검출용 프로브를 제공한다:In another aspect, the present invention provides a probe for detecting strain Pseudomonas consisting of the following structural formula:
5'-X-aggcttcggcttcatcactccacaat-Y-3'5'-X-aggcttcggcttcatcactccacaat-Y-3 '
이 때 X는 형광 표지인자이고, Y는 형광 억제물질(quencher)이다.X is a fluorescent marker, Y is a fluorescent inhibitor (quencher).
상기 형광표지인자 X는 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, RED610, TEXAS RED, RED670 또는 NED일 수 있으며, 상기 형광 억제물질은 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 6-TAMRA, ROX, BHQ-1,2,3, 시아닌, 안트로퀴논, 니트로티아졸, 니트로이미다졸, DABSYL 또는 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)일 수 있다.The fluorescent marker X may be, but is not limited to, for example, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, RED610, TEXAS RED, RED670 or NED, but the fluorescent inhibitor is not limited thereto. For example 6-TAMRA, ROX, BHQ-1,2,3, cyanine, antroquinone, nitrothiazole, nitroimidazole, DABSYL or MGBNFQ (molecular grove binding non-fluorescence quencher).
상기 프로브는 슈도모나스 속 균주에 특이적인 서열번호 4의 핵산서열의 5' 말단에 형광 표지인자로, 3' 말단에 형광 억제물질로 표지된 Taqman 프로브로서, Taqman 방법을 이용한 실시간 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.The probe is a Taqman probe labeled with a fluorescent marker at the 5 'end of the nucleic acid sequence of SEQ ID No. 4 specific to Pseudomonas strains, and a fluorescent inhibitor at the 3' end, and used for real-time polymerase chain reaction using the Taqman method Can be.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 슈도모나스 속 균주 검출용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for Pseudomonas genus strain detection comprising the primer set and the probe.
본 발명에 따른 검출용 키트는 상기 프라이머 세트 및 프로브 외에도 시료 내에서 슈도모나스 속 균주를 검출하기 위해 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP, 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.
The detection kit according to the present invention may include a reaction buffer solution, a polymerase, a dNTP, a stabilizer and all biological or chemical reagents, instructions for use, etc., in addition to the primer set and the probe, to detect Pseudomonas strains in a sample. have. Other configurations of such kits may be appropriately selected by those skilled in the art.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
실시예Example 1: One: 실험균주Experimental strain
본 발명에서 사용된 슈도모나스 속 균주를 포함한 기타 균주는 한국균주보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)와 생물자원센터(Biological Resource Center,BRC)에서 분양 받았으며, 그 목록은 표 1에 정리하였다. 균주의 배양은 DIFCO사의 LB(Luria-Bertani)배지와 균주 각각의 선택배지에서 배양하였고, 슈도모나스 속 균주는 MBCell의 Pseudomonas Agar Base와 CFC supplement(Cetrimide, Fucidin, Cephalordine)를 사용하여 배양하였다. 균주에서 DNA 추출은 PowerPrep™ DNA extraction kit(Kogene Biotech, Korea)를 사용하여 추출하였다. Other strains including Pseudomonas genus strains used in the present invention were distributed at the Korea Culture Center of Microorganisms (KCCM) and Biological Resource Center (BRC), the list is summarized in Table 1. Cultivation of the strain was carried out in DIFCO's LB (Luria-Bertani) medium and the selective medium of each strain, Pseudomonas Agar Base of MBCell and CFC supplements (Cetrimide, Fucidin, Cephalordine) were incubated. DNA extraction from the strain was performed using the PowerPrep ™ DNA extraction kit (Kogene Biotech, Korea).
실시예Example 2: 2: 프라이머primer 세트 제작 및 특이성 확인 Set Creation and Specificity Check
실시예Example 2-1: 2-1: 프라이머primer 세트 제작 Set production
슈도모나스 속 균주만을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제작하기 위하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Genbank와 EBI(European Bioinformatics Institute)의 alignment program을 통해 핵산서열을 비교 분석하였다. 그 결과 표 2에 나타난 바와 같이 슈도모나스 유전자 중 capB(cold acclimation protein) 유전자를 타겟 유전자로 선택하였으며(서열번호 1), capB 유전자의 18번~106번 핵산서열로 이뤄진 89bp의 단편을 증폭하기 위한 정방향 프라이머 capB-89F(서열번호 2)와 역방향 프라이머 capB-89R(서열번호 3)로 이루어진 프라이머 세트를 제작하였고, NCBI의 blast program과 EBI의 alignment program을 이용하여 특이성을 확인하였다.Nucleic acid sequences were compared and analyzed by Genbank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the alignment program of the European Bioinformatics Institute (EBI) in order to prepare a primer set capable of detecting only Pseudomonas strains. As a result, as shown in Table 2, capB (cold acclimation protein) gene of Pseudomonas gene was selected as a target gene (SEQ ID NO: 1), and capB A primer set consisting of a forward primer capB-89F (SEQ ID NO: 2) and a reverse primer capB-89R (SEQ ID NO: 3) for amplifying an 89 bp fragment consisting of nucleic acid sequences 18-106 of the gene was prepared, and a blast of NCBI Specificity was confirmed using the alignment program of the program and the EBI.
(Accession Number : U62986)capB gene
(Accession Number: U62986)
atcactccac aatccggtga cgacctgttt gttcacttca aagcaatcca atccgacggc ttcaagagcc tgaaagaagg ccaacaggtt tctttcatcg ctactcgcgg tcagaaaggc atgcaagctg aggaagttca agttatctaa-3'5'-atgtctaatc gccaaactgg taccgttaag tggttcaacg atgaaaaagg cttcggcttc
atcactccac aatccggtga cgacctgttt gttcacttca aagcaatcca atccgacggc ttcaagagcc tgaaagaagg ccaacaggtt tctttcatcg ctactcgcgg tcagaaaggc atgcaagctg aggaagttca agttatctaa-3 '
실시예Example 2-2: 2-2: 프라이머primer 세트의 특이성 확인 Confirm the specificity of the set
capB-89F/R 프라이머 세트를 사용하여 표 1에 기재된 균주를 대상으로 PCR Express thermocycler(Hybaid, USA)를 사용하여 일반 PCR을 수행하였다.Normal PCR was performed using PCR Express thermocycler (Hybaid, USA) against the strains listed in Table 1 using the capB-89F / R primer set.
0.2㎖ 튜브에 템플레이트 DNA (300ng/㎕) 2㎕, 10x Taq 버퍼 2.5㎕, 10mM dNTP 0.5㎕, Taq 폴리머라아제 0.7㎕, 서열번호 2와 서열번호 3의 프라이머를 각각 10pmol로 제작하여 1㎕씩 넣고 총 부피가 25㎕이 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 2 μl of template DNA (300 ng / μl), 2.5 μl of 10 × Taq buffer, 0.5 μl of 10 mM dNTP, 0.7 μl of Taq polymerase, and 10 μl of primers of SEQ ID NO. Sterile distilled water was added so that the total volume was 25 μl.
PCR 온도 조건은 95℃에서 2분간 실시 후 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 총 35 사이클을 진행한 다음 72℃에서 3분간 진행하였다. PCR temperature conditions were carried out for 2 minutes at 95 ℃ and then proceeded a total of 35 cycles of 30 seconds at 95 ℃, 30 seconds at 57 ℃, 1 minute at 72 ℃ 1 cycle and then proceeded for 3 minutes at 72 ℃.
증폭된 DNA는 2% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 확인하였다. 2% 아가로스 겔은 러닝버퍼인 TAE 버퍼(40mM Tris-acetate, 1mM EDTA, pH 8.0)에 2% 아가로스를 녹인 후 ethidium bromide(10mg/ml)를 60㎕첨가 한 뒤 상온에서 굳혔다. 6x 로딩버퍼(40% sucrose, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylencyanol)와 DNA를 혼합하여 겔에 주입하였다. 125V에서 25분간 전기영동 후 UV를 이용하여 증폭산물을 확인하였다. Amplified DNA was confirmed using 2% agarose gel electrophoresis. 2% agarose gel was dissolved in 2% agarose in running buffer TAE buffer (40mM Tris-acetate, 1mM EDTA, pH 8.0), and then 60 µl of ethidium bromide (10mg / ml) was added and dried at room temperature. 6x loading buffer (40% sucrose, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylencyanol) and DNA were mixed and injected into the gel. After electrophoresis at 125V for 25 minutes, the amplification product was confirmed using UV.
그 결과 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이 슈도모나스 속 균주인 1부터 7번 lane에서만 증폭산물이 생성됨을 확인하였으며, 이를 통해 슈도모나스 속 균주를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
As a result, as shown in Figures 1 and 2 it was confirmed that the amplification product is generated only in the strain 1 to 7 strain Pseudomonas genus, it was confirmed that the strain can be detected specifically Pseudomonas strain.
실시예Example 3: 3: RealReal -- timetime PCRPCR 을 통한 슈도모나스 속 균주의 검출Of Pseudomonas spp.
실시예Example 3-1: 3-1: 프로브Probe 제작 making
서열번호 1의 슈도모나스 속 균주에 특이적인 핵산서열(서열번호 4, 표 3)을 이용하여 프로브를 제작하였다. 프로브의 5' 말단은 형광 표지인자인 FAM(emission wavelength 520), 3' 말단은 형광 억제물질인 BHQ2(emission wavelength 610)로 표지하여 하기와 같은 구조식을 갖는 프로브를 제조하였다.Probes were prepared using nucleic acid sequences (SEQ ID NO: 4, Table 3) specific for Pseudomonas genus strain of SEQ ID NO: 1. The 5 'end of the probe was labeled with a fluorescent marker FAM (emission wavelength 520), and the 3' end with a fluorescent inhibitor BHQ2 (emission wavelength 610) to prepare a probe having the following structural formula.
FAM-aggcttcggcttcatcactccacaat-BHQ2FAM-aggcttcggcttcatcactccacaat-BHQ2
실시예Example 3-2: 3-2: RealReal -- timetime PCRPCR 분석 analysis
Stratagene?의 Mx3000P™를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하였다. 0.2㎖ PCR 스트립 튜브에 2 x master mix(ABI) 10㎕, 서열번호 2,3의 프라이머 각각 7.5pmol씩, 실시예 3-1에서 제조한 프로브 7.5pmol, 템플레이트 DNA 1㎕를 넣은 후 최종부피가 20㎕가 되도록 멸균증류수를 첨가하여 반응액을 제조하였다. Real-time PCR 조건은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 반응 후 95℃에서 15초, 60℃에서 30초를 1 사이클로 하여 총 40 사이클을 수행하였다.
Real-time PCR was performed using Stratagene® Mx3000P ™. 10 μl of 2 × master mix (ABI) and 7.5 pmol of each primer of SEQ ID NO: 2,3 were added to a 0.2 ml PCR strip tube, 7.5 pmol of the probe prepared in Example 3-1 and 1 μl of template DNA were added. Sterile distilled water was added to 20 μl to prepare a reaction solution. Real-time PCR conditions were performed for 2 minutes at 50 ° C, 10 minutes at 95 ° C, followed by 15 cycles at 95 ° C and 30 seconds at 60 ° C for a total of 40 cycles.
실시예Example 3-3: 검출 한계 조사 3-3: Detection limit probe
Real-time PCR 분석법에 의해 슈도모나스 속 균주가 감지되는 최저 농도를 확인하기 위하여 본 발명에서 제작한 프라이머 세트를 이용하여 검출한계를 조사하였다. In order to confirm the lowest concentration of Pseudomonas strains detected by real-time PCR analysis, the detection limit was investigated using the primer set prepared in the present invention.
Pseudomonas fragi KCCM 34724 균주를 배양 후, spectrophotometer를 이용하여 배양액을 적정 농도로 맞춘 다음 1㎖를 취해 십진희석하였다. 희석액을 LB 플레이트에 도말하여 30℃에서 배양 후 생균수 측정법으로 세포 수를 측정하였고 동시에 균액 1㎖을 취해 DNA를 추출하였다. 생균수 측정결과 1.2×107cfu/㎖이었고, 추출된 DNA를 십진 희석하여 <실시예 3-2>와 동일한 방법으로 real-time PCR을 수행하였다. Pseudomonas fragi After culturing the KCCM 34724 strain, the culture solution was adjusted to an appropriate concentration using a spectrophotometer, and then 1 ml was taken and diluted to dilute. The diluted solution was plated on an LB plate and cultured at 30 ° C., and the cell number was measured by viable cell count. At the same time, 1 ml of the bacterial solution was taken to extract DNA. The number of viable cells was 1.2 × 10 7 cfu / ml, and the extracted DNA was diluted in decimal to perform real-time PCR in the same manner as in <Example 3-2>.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이 1.2×100cfu/rxn까지 검출이 가능하였다.
As a result, as shown in Figure 3 it was possible to detect up to 1.2 × 10 0 cfu / rxn.
실시예Example 4: 4: PCRPCR 과 and realreal -- timetime PCRPCR 을 통한 쇠고기 시료에서의In beef samples through 슈도모나스 속 균주의 검출Detection of Pseudomonas spp.
시판되고 있는 쇠고기를 구입한 후 정량하여 멸균인산완충용액(bufferfield's phosphate buffer(IDF phosphate buffer 0.0425g/L of KH2PO4 adjusted to pH 7.2)) 45㎖와 혼합 후 균질화하였다. 혼합용액 1㎖를 취해 생리식염수를 이용하여 10배씩 희석하여 적당한 희석배수를 슈도모나스 선택배지에 도말 후 30℃에서 2일간 배양하였다. 총 6개의 morphology가 나타났으며 각각의 단일 콜로니를 LB broth에 계대배양 한 뒤 12,000rpm에서 10분간 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 남아있는 펠렛을 Power Prep™ DNA extraction kit를 사용하여 DNA를 추출하였고 이를 템플레이트 DNA로 사용하여 conventional PCR과 real-time PCR을 수행하였다. PCR 조성과 온도 조건은 실시예 2-2와 3-2에 제시된 내용과 동일하였다.Commercially available beef was quantified and mixed with 45 ml of sterile phosphate buffer (bufferfield's phosphate buffer (IDF phosphate buffer 0.0425 g / L of KH2PO4 adjusted to pH 7.2)) and homogenized. 1 ml of the mixed solution was diluted 10 times with physiological saline, and the appropriate dilution factor was smeared on Pseudomonas selective medium and incubated at 30 ° C. for 2 days. A total of six morphologies were shown, and each single colony was passaged to LB broth, followed by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes to remove supernatant. The remaining pellets were extracted with the Power Prep ™ DNA extraction kit and subjected to conventional and real-time PCR using template DNA. PCR composition and temperature conditions were the same as those shown in Examples 2-2 and 3-2.
분석 결과, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이 슈도모나스 선택배지에서 자란 콜로니 모두 슈도모나스 속 균주임을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 프라이머 세트와 Taqman 프로브를 이용한 real-time PCR방법은 쇠고기 내에 존재하는 슈도모나스 속 균주를 신속하게 정량적으로 검출하는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다.As a result, as shown in Figures 4 and 5, it was confirmed that all colonies grown in Pseudomonas selective medium were Pseudomonas strains. Therefore, the real-time PCR method using the primer set and Taqman probe according to the present invention may be usefully used to quickly and quantitatively detect Pseudomonas strains present in beef.
<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Method for Detecting Pseudomonas spp.
<130> P100659
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 210
<212> DNA
<213> capB gene
<400> 1
atgtctaatc gccaaactgg taccgttaag tggttcaacg atgaaaaagg cttcggcttc 60
atcactccac aatccggtga cgacctgttt gttcacttca aagcaatcca atccgacggc 120
ttcaagagcc tgaaagaagg ccaacaggtt tctttcatcg ctactcgcgg tcagaaaggc 180
atgcaagctg aggaagttca agttatctaa 210
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capB-89F
<400> 2
tggtaccgtt aagtggttca ac 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capB-89R
<400> 3
ttgctttgaa gtgaacaaac agg 23
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 4
aggcttcggc ttcatcactc cacaat 26
<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Method for Detecting Pseudomonas spp.
<130> P100659
<160> 4
<170> Kopatentin 1.71
<210> 1
<211> 210
<212> DNA
<213> capB gene
<400> 1
atgtctaatc gccaaactgg taccgttaag tggttcaacg atgaaaaagg cttcggcttc 60
atcactccac aatccggtga cgacctgttt gttcacttca aagcaatcca atccgacggc 120
ttcaagagcc tgaaagaagg ccaacaggtt tctttcatcg ctactcgcgg tcagaaaggc 180
atgcaagctg aggaagttca agttatctaa 210
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capB-89F
<400> 2
Claims (10)
5’-X-aggcttcggcttcatcactccacaat-Y-3’
이 때, X는 형광 표지인자이고, Y는 형광 억제물질(quencher)이다.The presence of capB (cold acclimation protein B) gene in the sample using real-time PCR using a primer having a nucleic acid sequence of SEQ ID NOs: 2 and 3 and a probe consisting of the following structural formula Pseudomonas genus strain detection method for detecting frozen meat rot comprising.
5'-X-aggcttcggcttcatcactccacaat-Y-3 '
In this case, X is a fluorescent marker, Y is a fluorescent inhibitor (quencher).
상기 X는 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, RED610, TEXAS RED, RED670 또는 NED 이고, Y는 6-TAMRA, ROX, BHQ-1,2,3, 시아닌, 안트로퀴논, 니트로티아졸, 니트로이미다졸, DABSYL 또는 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)인 슈도모나스 속 균주의 검출방법.The method of claim 1,
X is FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, RED610, TEXAS RED, RED670 or NED, Y is 6-TAMRA, ROX, BHQ-1,2,3, Cyanine, Anthroquinone, Nitro Method for detecting Pseudomonas genus strains that are thiazole, nitroimidazole, DABSYL or MGBNFQ (molecular grove binding non-fluorescence quencher).
하기의 구조식으로 이루어진 프로브를 포함하는, 시료 내 capB(cold acclimation protein B) 유전자의 존재 유무를 확인하여 냉동육 부패를 검출하기 위한 슈도모나스 속 균주 검출용 키트:
5'-X-aggcttcggcttcatcactccacaat-Y-3'
이 때 X는 형광 표지인자이고, Y는 형광 억제물질(quencher)이다.A primer set consisting of a primer having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a primer having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3; And
Pseudomonas genus strain detection kit for detecting frozen meat decay by checking the presence of the capB (cold acclimation protein B) gene in the sample, comprising a probe consisting of the following structural formula:
5'-X-aggcttcggcttcatcactccacaat-Y-3 '
X is a fluorescent marker, Y is a fluorescent inhibitor (quencher).
상기 X는 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, RED610, TEXAS RED, RED670 또는 NED 이고, Y는 6-TAMRA, ROX, BHQ-1,2,3, 시아닌, 안트로퀴논, 니트로티아졸, 니트로이미다졸, DABSYL 또는 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)인 슈도모나스 속 균주 검출용 키트.10. The method of claim 9,
X is FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, RED610, TEXAS RED, RED670 or NED, Y is 6-TAMRA, ROX, BHQ-1,2,3, Cyanine, Anthroquinone, Nitro Kit for detecting strain of Pseudomonas genus thiazole, nitroimidazole, DABSYL or MGBNFQ (molecular grove binding non-fluorescence quencher).
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