KR101242113B1 - Cationic Sendai F/HN viroplex for Gene Delivery - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 목적 뉴클레오타이드 서열; (b) 양이온성 지질(cationic lipids); 및 (c) 바이러스 제제(viral agent)로 이루어진 목적 뉴클레오타이드의 세포로의 트랜스펙션용 바이로좀 복합체(viroplex) 및 이를 이용한 유전자 전달 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이로좀 복합체는 양성 전하를 가지는 양이온성 지질인 DMKE(O,O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate)로 인하여 목적 뉴클레오타이드 서열(예컨대, pDNA 또는 siRNA)과 효과적으로 결합할 수 있으며, 센다이 바이러스의 세포막 부착 단백질인 F/HN 단백질을 포함하여 세포, 보다 바람직하게는 부유세포(suspension cells)와의 효과적인 부착을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바이로좀 복합체는 보다 효율적이고 안정적으로 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반 또는 도입할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이로좀 복합체를 포함하는 조성물은 연구 또는 치료 목적으로 이용될 수 있다.The present invention provides an antibody comprising (a) a target nucleotide sequence; (b) cationic lipids; And (c) a viroplex for transfection into cells of a target nucleotide consisting of a viral agent and a gene delivery method using the same. The virosome complex of the present invention can effectively bind to a target nucleotide sequence (eg, pDNA or siRNA) due to DMKE (O, O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate), a cationic lipid having a positive charge, and Sendai F / HN protein, which is a cell membrane adhesion protein of a virus, can be used to induce effective attachment to cells, more preferably suspension cells. Thus, the virosome complexes of the present invention can carry or introduce the desired nucleotide sequence into cells more efficiently and stably. In addition, the composition comprising the virosome complex of the present invention can be used for research or therapeutic purposes.

Description

유전자 전달용 양이온성 센다이 Ｆ／ＨＮ 바이로좀 복합체{Cationic Sendai F/HN viroplex for Gene Delivery}Cationic Sendai F / HN virosome complex for gene delivery {Cationic Sendai F / HN viroplex for Gene Delivery}

본 발명은 양이온성 센다이 F/HN 바이로좀 복합체 및 이의 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to cationic Sendai F / HN virosome complexes and their use.

최근 다양한 유전자 전달체들이 개발되어 있다. 특히, 양이온성 리포좀을 기반으로 많은 제품이 출시되어 있으며, 다른 여러 부착세포(HeLa 세포-자궁 경부암 세포, 293 세포-신장암 세포, A549 세포-폐암 세포, B16BL6 세포-흑색종 세포, HepG2 세포-간암 세포 등)에서 양이온성 리포좀 유전자 전달체(lipofectamine2000 외)들은 뛰어난 유전자 전달 효율을 보이고 있다. 반면, 부유세포(T-백혈병 세포 등)에서의 유전자 전달 효율은 낮은 유전자 전달 효율을 보이고 있다. 이렇듯 현재 개발된 양이온성 리포좀 유전자 전달체들은 부착세포(adherent cell)에서는 효율적인 유전자 전달과 발현 효율을 보이고 있으나, 부유세포(suspension cell), 특히 백혈병 세포 등에서는 유전자 전달이 잘 이루어지지 않는 것으로 알려져 있다. 이러한 양이온성 리포좀을 기반으로 한 유전자 전달체의 부유세포 내 유전자 전달 효율을 높이기 위하여 센다이 바이러스(Sendai virus 또는 HJV, hemagglutinating virus of Japan)의 외피부착단백질인 F/HN 단백질을 추출하여 양이온성 리포좀 복합체에 삽입하여 양이온성 센다이 F/HN 바이로좀 복합체(cationic sendai F/HN viroplex)를 제작하게 되었다. 센다이 F/HN 단백질은 두 가지 센다이 바이러스 외피의 당단백질로 구성되어 있다. 헤마글루티닌-뉴라미니다제(hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질과 융합(F) 단백질로 이루어져 있으며, F 단백질은 F1과 F2 두 단백질 분자의 복합체의 형태로 센다이 바이러스가 숙주의 세포 내로 침입하는데 있어, 세포막 부착능이 뛰어난 것으로 알려져 있다. HN 단백질은 세포막 외부에서 발현되는 당단백질이나 당지질의 시알산 수용체와 용이하게 부착이 되어 세포 내로 바이러스가 침입하는데 용이한 것으로 알려져 있다. 즉, 센다이 바이러스의 F/HN 단백질은 대부분의 세포막 표면에서 발현되는 시알산 수용체에 특이적으로 부착하고, 세포막 부착능이 뛰어나 숙주의 세포 내로 쉽게 침입할 수 있도록 하는 역할을 한다. 이러한 세포막 부착능을 지닌 센다이 F/HN 단백질은 인플루엔자 바이러스의 외피단백질인 HA 단백질처럼 중성 또는 양이온성 리포좀 유전자 전달체에 삽입하여 유전자 전달 효율을 더욱 개선할 수 있다는 장점을 지니고 있다.Recently, various gene carriers have been developed. In particular, many products have been released based on cationic liposomes, and many other adherent cells (HeLa cell-uterine cervical cancer cell, 293 cell-renal cancer cell, A549 cell-lung cancer cell, B16BL6 cell-melanoma cell, HepG2 cell- Cationic liposome gene carriers (such as lipofectamine2000) in liver cancer cells have shown excellent gene transfer efficiency. On the other hand, gene delivery efficiency in floating cells (T-leukemia cells, etc.) shows low gene delivery efficiency. The cationic liposome gene carriers thus developed show efficient gene transfer and expression efficiency in adherent cells, but gene delivery is not well performed in suspension cells, especially leukemia cells. In order to improve the gene transfer efficiency of the cationic liposome-based gene carriers in the floating cells, F / HN protein, which is an enveloped protein of Sendai virus (Sendai virus or HJV, hemagglutinating virus of Japan), was extracted and added to the cationic liposome complex. The cationic sendai F / HN viroplex was prepared by inserting the cationic sendai F / HN viroplex. Sendai F / HN protein consists of two proteins of the Sendai virus envelope. It consists of a hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein and a fusion (F) protein, which is a complex of the two protein molecules F1 and F2 that the Sendai virus invades into the host cell. It is known to be excellent in cell membrane adhesion. HN protein is known to be easily attached to the glycoprotein or glycolipid sialic acid receptor expressed outside the cell membrane to facilitate virus invasion into the cell. That is, F / HN protein of Sendai virus specifically attaches to sialic acid receptors expressed on the surface of most cell membranes, and is excellent in cell membrane adhesion, and serves to easily invade into cells of the host. The Sendai F / HN protein having the cell membrane adhesion ability has the advantage of being able to be inserted into a neutral or cationic liposome gene transporter like HA protein, which is an envelope protein of influenza virus, to further improve gene transfer efficiency.

현재 유전자 전달은 플라스미드 DNA와 siRNA(small interfering RNA)를 주로 다양한 세포주에 전달을 하고 있다. 특히, siRNA는 최근 각광 받고 있는 유전자로 많은 표적 유전자를 대상으로 제작되고 다양한 세포에 적용을 하고 있다. 이러한 siRNA의 작용 기전은 RNAi(RNA interference)라고 하며, 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA(dsRNA)를 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적유전자의 mRNA의 분해를 유도하고 표적유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상이다. 특히, siRNA는 19 내지 21 bp 크기의 이중 나선 구조를 가지는 짧은 RNA분자로서, 세포 내로 도입되어 상보적인 염기 서열을 가지는 세포 내 메신저 RNA(mRNA)를 절단하고 그 유전자의 발현을 억제하는 기능을 수행한다(G.J. Hannon, RNA interference, Nature, 418, 244-51, 2002). 이러한 RNAi의 기작은 종래의 방법들과 비교하여 선택적으로 표적유전자의 발현을 억제가 효율적이고 성공적이기 때문에 종래의 pDNA의 재조합에 의한 유전자 파괴방법을 대신하는 간단한 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로써 유전자전달 및 치료의 방법으로서 상당한 관심을 모으고 있다. RNAi는 선충(nematode)에서 최초 발견되었으나(Nature 391, 806-811, 1998), 현재는 여러 식물, 선형동물, 초파리 및 원생동물 등의 동물에서도 관찰된다고 알려져 있다(Genes Dev. 15, 485-490 2001). 따라서, 이것은 기능 유전체학의 연구 도구로서 또한 각종 암들 및 바이러스성 질환에 대한 항암제 또는 항바이러스제등의 후보 치료 물질로서 각광 받고 있다(Y. Dorsett, and T. Tuschl, siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov, 3, 318-29, 2004).Currently, gene transfer delivers plasmid DNA and siRNA (small interfering RNA) mainly to various cell lines. In particular, siRNA is a gene that has been in the spotlight recently and is produced for many target genes and applied to various cells. The mechanism of action of these siRNAs is called RNA interference (RNAi), by introducing double-stranded RNA (dsRNA) consisting of a sense RNA having a sequence homologous to the mRNA of a target gene and an antisense RNA having a sequence complementary thereto. It is a phenomenon that can selectively induce the degradation of mRNA of the target gene and inhibit the expression of the target gene. In particular, siRNA is a short RNA molecule having a double helix structure of 19 to 21 bp size, and is introduced into a cell to cut a messenger RNA (mRNA) in a cell having a complementary nucleotide sequence and to suppress expression of the gene. (GJ Hannon, RNA interference, Nature, 418, 244-51, 2002). This mechanism of RNAi is a simple gene knock-down method that replaces conventional pDNA recombination method because it selectively and efficiently inhibits expression of target genes compared to conventional methods. Significant attention is drawn to methods of delivery and treatment. RNAi was first discovered in nematodes (Nature 391, 806-811, 1998), but is now known to be found in many plants, linear animals, fruit flies and protozoa (Genes Dev. 15, 485-490). 2001). Thus, it has been in the spotlight as a research tool of functional genomics and as a candidate therapeutic substance such as anticancer agent or antiviral agent for various cancers and viral diseases (Y. Dorsett, and T. Tuschl, siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics.Nat Rev Drug Discov, 3, 318-29, 2004).

그러나 현재까지 부유세포 내(T-백별형 세포 등)에 위와 같은 유전자(pDNA와 siRNA)를 효율적으로 이용하기에는 해결해야 할 문제들이 있다. 특히, 유전자 전달이 어렵기로 알려진 부유세포 내에 효율적인 유전자 전달을 할 수 있는 유전자 전달체의 개발이 필요한 실정이다.However, to date, there are problems to be solved in order to efficiently use such genes (pDNA and siRNA) in floating cells (T-white cell). In particular, there is a need for the development of gene carriers capable of efficient gene delivery in suspended cells known to be difficult to gene transfer.

따라서, 유전자를 부유세포에 효율적으로 전달할 수 있는 센다이 F/HN 바이로좀과 같은 우수한 유전자 전달체의 개발이 필요한 실정이다.
Therefore, there is a need for development of excellent gene carriers such as Sendai F / HN virosomes that can efficiently transfer genes to floating cells.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시된다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입됨으로써 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명이 보다 명확하게 설명된다.
Throughout this specification, numerous patent documents and articles are referred to and the citations are indicated in parentheses. The disclosures of cited patent documents and articles are incorporated herein by reference in their entirety, so that the level of the technical field to which the present invention belongs and the present invention are more clearly explained.

본 발명자들은 목적 뉴클레오타이드(예를 들어, pDNA, siRNA, miRNA, 등)를 효율적으로 세포 내로 전달할 수 있는 복합체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 양이온성 지질과 F/HN(fusion/hemagglutinin-neuraminidase) 단백질, 바람직하게는 DMKE(O,O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate)와 센다이 바이러스(sendai virus)-유래된 F/HN 단백질을 재조합함으로써 제조된 센다이 F/HN 바이로좀 복합체(sendai F/HN viroplex)가 진핵세포, 보다 바람직하게는 부유세포에 상기 목적 뉴클레오타이드를 매우 효율적으로 전달할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made diligent research efforts to develop complexes capable of efficiently delivering target nucleotides (eg, pDNA, siRNA, miRNA, etc.) into cells. As a result, we found cationic lipids and fusion / hemagglutinin-neuraminidase (F / HN) proteins, preferably DMKE (O, O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate) and sendai virus-derived F By confirming that the Sendai F / HN viroplex prepared by recombining / HN protein can deliver the target nucleotides very efficiently to eukaryotic cells, more preferably floating cells, To complete.

따라서, 본 발명의 목적은 트랜스펙션용 바이로좀 복합체(viroplex)를 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a viroplex for transfection.

본 발명의 다른 목적은 유전자 전달 방법을 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide a gene delivery method.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 목적 뉴클레오타이드 서열; (b) 양이온성 지질(cationic lipids); 및 (c) 바이러스 제제(viral agent)로 이루어진 목적 뉴클레오타이드의 세포로의 트랜스펙션용 바이로좀 복합체를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a kit comprising: (a) a target nucleotide sequence; (b) cationic lipids; And (c) provides a virosome complex for transfection of the target nucleotides into cells consisting of a viral agent (viral agent).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 복합체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 유전자 전달 방법을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a gene delivery method comprising the step of contacting the complex described above with a cell.

본 발명자들은 목적 뉴클레오타이드(예를 들어, 재조합 DNA, 플라스미드 DNA, siRNA, miRNA, 등)를 효율적으로 세포 내로 전달할 수 있는 복합체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 양이온성 지질과 F/HN 단백질, 바람직하게는 DMKE와 센다이 바이러스-유래된 F/HN 단백질을 재조합함으로써 제조된 센다이 F/HN 바이로좀 복합체가 진핵세포, 보다 바람직하게는 부유세포에 상기 목적 뉴클레오타이드를 매우 효율적으로 전달할 수 있다는 것을 확인하였다.The present inventors have made diligent research efforts to develop complexes capable of efficiently delivering target nucleotides (eg, recombinant DNA, plasmid DNA, siRNA, miRNA, etc.) into cells. As a result, the inventors have found that Sendai F / HN virosome complexes prepared by recombining cationic lipids with F / HN proteins, preferably DMKE, and Sendai virus-derived F / HN proteins, are eukaryotic cells, more preferably. It was confirmed that the target nucleotides can be delivered to the floating cells very efficiently.

대부분의 세포막은 음성 전하(negative charge)를 가지기 때문에, 음전하를 가지는 분자들은 세포내로 용이하게 전달될 수 없다. 최근에 양이온성 리포좀을 기반으로 하는 다양한 유전자 전달체들이 개발되어 왔다. 이러한 양이온성 리포좀은 세포막의 음성 전하에 의한 분자들을 세포내로 효율적으로 전달하는 매개체 역할을 한다. 리포좀(liposomes) 같은 지질 응집물(lipid aggregates)은 거대분자(예컨대, DNA, RNA 또는 단백질)의 살아있는 세포로의 도입에 기능할 수 있는 것으로 알려져 있다. 리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 리포펙타민(Lipofectamine; Gibco BRL)이 있다. Since most cell membranes have a negative charge, negatively charged molecules cannot be easily transferred into the cell. Recently, various gene carriers based on cationic liposomes have been developed. These cationic liposomes act as mediators to efficiently deliver molecules by negative charge of the cell membrane into the cell. Lipid aggregates, such as liposomes, are known to be able to function in the introduction of macromolecules (eg, DNA, RNA or proteins) into living cells. Liposomes are automatically formed by phospholipids dispersed in the aqueous phase. Examples of successfully delivering foreign DNA molecules into liposomes into cells include Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta , 721: 185-190 (1982) and Nicolau et al. , Methods Enzymol. 149: 157-176 (1987). Meanwhile, the most commonly used reagent for transforming animal cells using liposomes is lipofectamine (Lipofectamine; Gibco BRL).

다양한 형태의 지질 응집물은 리포좀, 단일막 운반체(unilamellar vesicles), 다중막 운반체(multilamellar vesicles), 마이셀 및 이의 유사체를 포함하며, 그 크기가 나노미터에서 마이크로미터 범위의 입자 크기를 가진다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 지질 응집물의 구조는 지질 조성 및 응집물을 형성시키는 방법에 따라 결정된다. 예를 들어, 핵산과 결합할 수 있는 양성 전하(positive charge)를 띤 운반체 및 다른 지질 응집물을 형성하기 위해, 양이온성 지질은 단독으로 이용될 수도 있으며, 비-양이온성 지질(예를 들어, 포스포티딜에타놀라민 같은 중성 인지질)과 조합하여 이용될 수도 있다. 양성 전하를 가진 지질 응집물은 핵산과 결합하고, 이후 타겟 세포에 의해 흡수된다. 그 결과, 상기 지질 응집물은 타겟 세포로의 핵산 트랜스펙션을 촉진할 수 있다(Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417(1987); Epstein, D. et al., U.S. Pat. No. 4,897,355). 하지만, 양이온성 지질이 모든 세포 형태에 대한 트랜스펙션에 보편적으로 효과적인 것은 아니다. 세포 형태에 따라 트랜스펙션 효율성(effectiveness)은 양이온성 지질 조성물 및 형성된 지질 응집물(lipid aggregate)의 형태에 따라 결정된다. 또한, 특정 양이온성 지질은 세포주에 약간의 독성을 가짐으로써, 트랜스펙션에 이용되는 양이온성 지질의 농도가 제한될 수 있다. 고등진핵세포의 특정 형태들의 트랜스펙션에 있어서, 현재 상업적으로 유용한 양이온성 지질이 이용될 수 없다. 일반적으로, 상술한 트랜스펙션이 어려운 세포들은 부유세포주(suspension cell lines) 및 인간의 일차 세포주(primary human cell lines)이며, 보다 상세하게는 섬유아세포주 및 대식세포주를 포함한다. 따라서, 양이온성 지질-매개된 트랜스펙션의 효율을 증대시키고 양이온성 지질-DNA 복합체가 효율적으로 트랜스펙션될 수 있는 세포의 범위를 넓히는 조성물 및 방법이 당업계에서 시급히 요구되는 실정이다.Various forms of lipid aggregates include liposomes, unilamellar vesicles, multilamellar vesicles, micelles, and analogs thereof, with sizes ranging from nanometers to micrometers. As is well known in the art, the structure of a lipid aggregate depends on the lipid composition and the method of forming the aggregate. For example, cationic lipids may be used alone to form positively charged carriers and other lipid aggregates capable of binding to nucleic acids, and non-cationic lipids (eg, Neutral phospholipids such as potidylethanolamine). Lipid aggregates with a positive charge bind with the nucleic acid and are then taken up by the target cell. As a result, the lipid aggregates can promote nucleic acid transfection into target cells (Felgner, PL et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 84: 7413-7417 (1987); Epstein, D et al. , US Pat. No. 4,897,355). However, cationic lipids are not universally effective for transfection of all cell types. Depending on the cell morphology, the transfection efficiency depends on the type of cationic lipid composition and the lipid aggregate formed. In addition, certain cationic lipids have some toxicity to cell lines, thereby limiting the concentration of cationic lipids used for transfection. In transfection of certain forms of higher eukaryotic cells, currently commercially available cationic lipids are not available. Generally, the above-mentioned transfected cells are suspension cell lines and primary human cell lines, more specifically fibroblast lines and macrophage lines. Thus, there is an urgent need in the art for compositions and methods that increase the efficiency of cationic lipid-mediated transfection and broaden the range of cells in which cationic lipid-DNA complexes can be efficiently transfected.

본 발명에 따르면, 본 발명의 복합체(viroplex)는 양이온성 지질(cationic lipids) 및 바이러스 제제(viral agent)를 이용하여 목적 뉴클레오타이드를 세포내로 안정적이고 효율적으로 트랜스펙션시킬 수 있다.According to the present invention, the viroplex of the present invention can stably and efficiently transfect target nucleotides into cells using cationic lipids and viral agents.

본 발명에서 이용될 수 있는 양이온성 지질은 특별하게 제한되지 않으며, DMKE(O,O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate), DOTMA(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium chloride), DOTAP(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methyl sulfate), DOSPA(2,3-dioleyloxy-N-[2-(sperminecarboxyamide)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propaniminium trifluoroacetate), DC-Chol3)β-[N-(N'N'dimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol 또는 이의 유도체들을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 양이온성 지질은 DMKE 또는 이의 유도체이다. Cationic lipids that can be used in the present invention are not particularly limited, DMKE (O, O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate), DOTMA (N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N , N, N-triethylammonium chloride), DOTAP (N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium methyl sulfate), DOSPA (2,3-dioleyloxy-N- [2- (sperminecarboxyamide) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaniminium trifluoroacetate), DC-Chol3) β- [N- (N'N'dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol or derivatives thereof. According to a preferred embodiment of the present invention, the cationic lipids that can be used in the present invention are DMKE or derivatives thereof.

바람직하게는, 본 발명에서 이용될 수 있는 양이온성 지질은 단가(monovalent) 또는 다가(polyvalent) 양이온성 지질이며, 보다 바람직하게는 다가 양이온성 지질이다. 선택적으로, 양이온성 지질은 비-양이온성 지질, 특히 중성 지질[예컨대, DOPE (dioleoylphosphatidyl-ethanolamine)]과 조합될 수 있다. 또한, 양이온성 지질 응집물은 3β-OH 스테롤, 특히 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 3β-OH 스테롤을 포함하는 양이온성 지질 응집물은 상기 바이러스 제제와의 조합에에서 매우 유용하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 양이온성 지질은 콜레스테롤과 조합되어 적용된다.Preferably, the cationic lipids that can be used in the present invention are monovalent or polyvalent cationic lipids, more preferably polyvalent cationic lipids. Optionally, the cationic lipids can be combined with non-cationic lipids, especially neutral lipids (eg, DOPE (dioleoylphosphatidyl-ethanolamine)). In addition, cationic lipid aggregates may comprise 3β-OH sterols, especially cholesterol. Cationic lipid aggregates comprising 3β-OH sterols are very useful in combination with the viral agents. According to a preferred embodiment of the invention, the cationic lipids of the invention are applied in combination with cholesterol.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 양이온성 지질인 DMKE(O,O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate)는 연세대학교 박용석 교수가 개발한 신규한 양이온성 지질(참조: 국내특허등록, 제10-0389292호; 유럽(영국)특허등록, 제1485346호)로서, 탄소 길이가 16개로 글루탄산염을 기능기로 포함하고 있어 효율적으로 목적 뉴클레오타이드를 포획하고 전달할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the cationic lipid of the present invention DMKE (O, O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate) is a new cationic lipid developed by Professor Yong-Seok Park of Yonsei University (Refer to domestic patent registration, No. 10-0389292; European (UK) Patent Registration No. 1485346), which has 16 carbons in length and contains glutamate as a functional group to efficiently capture and deliver the desired nucleotides.

본 명세서의 용어 “지질 응집물(lipid aggregates)”은 운반체(vesicles), 마이셀 및 무정형 응집물 뿐 아니라, 단일막 및 다중막 리포좀을 포함하며, 바람직하게는 양이온성 리포좀이다. 상기 양이온성 리포좀은 충분한 양이온성 지질을 포함하는 지질 응집물로서, 선택적으로 비-양이온성 지질과 조합되어 네트 양성 전하를 가지는 지질 응집물을 의미한다. 본 발명의 양이온성 지질 및 지질 응집물은 핵산과 복합체를 이룰 수 있다.The term “lipid aggregates” herein includes single membrane and multi-membrane liposomes, as well as vesicles, micelles and amorphous aggregates, preferably cationic liposomes. The cationic liposomes are lipid aggregates comprising sufficient cationic lipids, meaning lipid aggregates that have a net positive charge, optionally in combination with non-cationic lipids. Cationic lipids and lipid aggregates of the present invention may be complexed with nucleic acids.

본 명세서의 용어 “트랜스펙션(transfection)”은 생물학적으로 활성을 지니는 핵산의 세포내 운반 및 도입하는 것을 의미하며, 보다 상세하게는 발현가능한 핵산의 세포내 운반 및 도입됨으로써, 상기 핵산이 세포내에서 발현되는 것을 의미한다. 상기 세포는 바람직하게는 동물세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물세포이며, 보다 더 바람직하게는 부유세포 또는 부착세포이고, 가장 바람직하게는 부유세포(예컨대, T-백혈병 세포)이다. 본 명세서의 용어 “발현(expression)”은 일과성 발현 및 안정적 발현을 모두 포함하여 기능성 핵산의 세포 내 존재를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(예를 들어, gDNA, cDNA, pDNA 또는 재조합 DNA) 그리고 RNA 분자(예를 들어, 안티센스 RNA, siRNA 또는 miRNA)를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term “transfection” refers to the intracellular delivery and introduction of biologically active nucleic acids, and more particularly the intracellular delivery and introduction of expressible nucleic acids, such that the nucleic acid is intracellular. It means to be expressed in. The cells are preferably animal cells, more preferably mammalian cells, even more preferably floating cells or adherent cells, and most preferably floating cells (eg T-leukemia cells). The term "expression" as used herein refers to the presence of functional nucleic acid in cells, including both transient and stable expression. As used herein, the term “nucleic acid molecule” is meant to encompass DNA (eg, gDNA, cDNA, pDNA or recombinant DNA) and RNA molecules (eg, antisense RNA, siRNA or miRNA) inclusively The nucleotides, which are the basic structural units in the molecule, include not only natural nucleotides but also analogs with modified sugar or base sites (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90: 543-584 (1990).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 복합체에서 이용되는 바이러스 제제는 외피 바이러스(enveloped viruses)의 외피 구성물이며, 보다 바람직하게는 센다이 바이러스의 외피구성물이고, 보다 더 바람직하게는 센다이 바이러스(sendai virus, SeV)의 F/HN(fusion/hemagglutinin-neuraminidase) 단백질이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the viral agent used in the complex of the present invention is an envelope composition of enveloped viruses, more preferably an envelope composition of Sendai virus, and even more preferably, Sendai virus. virus, SeV), F / HN (fusion / hemagglutinin-neuraminidase) protein.

마우스 파라인플루엔자 바이러스 제I형 또는 HVJ(hemagglutinating virus of Japan)으로도 알려져 있는 센다이 바이러스는 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) 패밀리에 속하는 단일-가닥 RNA 바이러스이다. 센다이 바이러스는 마우스, 햄스터, 돼지, 래트에서 높은 전달성 호흡기 감염을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스 제제는 센다이 바이러스의 외피부착단백질인 F/HN 단백질을 포함한다. 센다이 F/HN 단백질은 두 종류의 센다이 바이러스 외피 당단백질인, 헤마글루티닌-뉴라미니다제(hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질과 융합(F) 단백질로 이루어져 있다. 상기 F 단백질은 F1과 F2 단백질 분자의 복합체로, 세포막 부착능이 뛰어나 숙주의 세포 내로 침입에 관여하며, HN 단백질은 세포막 외부에서 발현되는 당단백질이나 당지질의 시알산 수용체와 용이하게 부착이 되어 세포 내로 바이러스가 침입에 직접적으로 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 센다이 바이러스의 F/HN 단백질은 대부분의 세포막 표면에서 발현되는 시알산 수용체에 특이적으로 부착하고, 세포막 부착능이 뛰어나 숙주의 세포 내로 쉽게 침입할 수 있도록 하는 기능을 한다. Sendai virus, also known as mouse parainfluenza virus type I or hemagglutinating virus of Japan (HVJ), is a single-stranded RNA virus belonging to the Paramyxoviridae family. Sendai virus is known to cause high transmission respiratory infections in mice, hamsters, pigs and rats. According to a preferred embodiment of the present invention, the viral preparation of the present invention comprises F / HN protein, which is an enveloped protein of Sendai virus. Sendai F / HN protein consists of two types of Sendai virus envelope glycoproteins, hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein and fusion (F) protein. The F protein is a complex of F1 and F2 protein molecules, has excellent cell membrane adhesion ability and is involved in invasion into the cell of the host, and HN protein is easily attached to the glycoprotein or glycolipid sialic acid receptor expressed outside the cell membrane and into the cell. It is known that viruses are directly involved in intrusions. Therefore, the F / HN protein of Sendai virus specifically attaches to sialic acid receptors expressed on most cell membrane surfaces, and has excellent function of cell membrane adhesion so that it can easily invade into cells of the host.

본 발명에 따르면, 본 발명의 바이러스 제제로 이용되는 센다이 F/HN 단백질은 세포막 부착능이 높은 센다이 바이러스 외피 단백질로써 계면활성제인 트라이톤 X-100 및 균질기(homogenizer)를 이용하여 바이러스를 파쇄한 뒤에 초원심분리를 하여 바이러스의 외피단백질을 획득하였다. 이때, 불순물(예컨대, 계면활성제, 바이러스-유래된 물질들)은 SM2-bead를 이용하여 제거하고, 남은 상층액을 수득하여 센다이 F/HN 단백질을 추출하였다.According to the present invention, the Sendai F / HN protein used as the virus preparation of the present invention is a Sendai virus envelope protein having high cell membrane adhesion ability, and then, after breaking down the virus using a surfactant Triton X-100 and a homogenizer, Centrifugation to obtain the envelope protein of the virus. At this time, impurities (eg, surfactants, virus-derived materials) were removed using SM2-bead, and the remaining supernatant was obtained to extract Sendai F / HN protein.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 트랜스펙션용 복합체(viroplex)는 핵산과 결합하는 양이온성 지질인 DMKE와 세포막 표면에 발현되는 시알산 수용체와의 우수한 결합력 및 뛰어난 세포막 부착능을 가지는 센다이 F/HN 단백질을 재조합하여 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 트랜스펙션시킬 수 있는 유전자 전달 시스템이다. 본 발명의 복합체는 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다. 따라서, 본 발명의 복합체는 매우 용이하고 효율적으로 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반 또는 도입할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the transfection complex (viroplex) of the present invention has Sendai having excellent binding ability and excellent cell membrane adhesion ability between DMKE, a cationic lipid that binds nucleic acid, and sialic acid receptor expressed on the cell membrane surface. A gene delivery system capable of recombining F / HN proteins to transfect a target nucleotide sequence into cells. The complex of the present invention carries a target nucleotide sequence intended for interaction with the cell and transported into the cell through mechanisms such as endocytosis, adsorption to the cell surface or fusion with plasma cell membranes. Therefore, the complex of the present invention can carry or introduce the desired nucleotide sequence into the cell very easily and efficiently.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 목적 뉴클레오타이드 서열은 바이러스에서 유래되지 않은 뉴클레오타이드 서열로, 재조합 DNA, pDNA(plasmid DNA), siRNA(small interfering RNA) 또는 miRNA(microRNA)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 목적 뉴클레오타이드 서열은 pDNA 또는 siRNA이다. 본 명세서에서, 목적 뉴클레오타이드 서열은 유전자 서열 또는 핵산 서열을 의미하며 상호교환되어 사용될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the nucleotide sequence of interest of the present invention is a nucleotide sequence not derived from a virus, including, but not limited to, recombinant DNA, plasmid DNA (pDNA), small interfering RNA (siRNA) or miRNA (microRNA). It is not limited. Most preferably, the target nucleotide sequence of the present invention is pDNA or siRNA. As used herein, a nucleotide sequence of interest means a gene sequence or nucleic acid sequence and can be used interchangeably.

본 발명에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).As used herein, the term “siRNA” refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (see WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99 / 07409 and WO 00/44914) siRNAs are provided as an efficient gene knockdown method or as a gene therapy method because they can inhibit the expression of target genes siRNA was first discovered in plants, worms, fruit flies and parasites. siRNA was developed / used and applied to mammalian cell research (Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).

보다 상세하게는, 본 발명의 복합체는 목적 뉴클레오타이드 서열(pDNA 또는 siRNA)을 양이온성 지질인 DMKE와 복합체를 형성시킨 후 완전한 복합체를 형성하기 전에 센다이 F/HN 단백질을 첨가하여 유전자 전달용 복합체를 제조한다. 바람직하게는, 플라스미드 DNA의 크기는 3.5-7 kb 정도이며, siRNA의 길이는 19-24 mer가 효율적으로 포획되지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.More specifically, the complex of the present invention forms a complex for gene delivery by adding the Sendai F / HN protein to the target nucleotide sequence (pDNA or siRNA) with a cationic lipid DMKE before forming a complete complex. do. Preferably, the size of the plasmid DNA is about 3.5-7 kb and the length of the siRNA is efficiently captured by 19-24 mer, but is not necessarily limited thereto.

본 발명의 바이로좀 복합체는 세포막 표면에서 발현하는 시알산 수용체 용이하게 결합되는 HN 단백질과 세포막과 쉽게 부착이 되는 F 단백질을 포함하고 있기 때문에, 부착세포 및 부유세포 모두에서 유전자 전달이 매우 효율적이다. 또한, 본 발명의 바이로좀 복합체는 양이온성 리포좀인 DMKE에 의한 표면의 양전기성을 가짐으로써, 세포 표면과의 결합 및 유전자 전달이 우수하다. 따라서, 양이온성 지질에 의한 양전기성 전하와 세포막 결합이 뛰어난 센다이 F/HN 단백질을 포함하는 본 발명의 바이로좀 복합체는 종래의 양이온성 리포좀들보다 부유세포에 대한 결합과 유전자 전달이 효율성과 안정성이 뛰어난 장점을 가지며, 다양한 암세포와 여러 세포주들에 연구용과 치료용 유전자 전달 시스템으로서 적용될 수 있다.Since the virosome complex of the present invention contains an HN protein that is easily bound to the sialic acid receptor expressed on the cell membrane surface and an F protein that is easily attached to the cell membrane, gene transfer is highly efficient in both adherent and suspended cells. . In addition, the virosome complex of the present invention has a surface positive charge by DMKE, which is a cationic liposome, and is excellent in binding to a cell surface and gene transfer. Accordingly, the virosome complex of the present invention comprising Sendai F / HN protein having excellent positive charge and cell membrane binding by cationic lipids has more efficient and stable binding and gene transfer to suspended cells than conventional cationic liposomes. It has this outstanding advantage and can be applied as a gene delivery system for research and treatment to various cancer cells and various cell lines.

본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체가 세포내로 pDNA와 siRNA를 트랜스펙션시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체와 유전자(pDNA 또는 siRNA)를 결합시키고 이를 부유세포인 인간 T-세포 유래의 Jurkat과 CEM, H9 세포에 투입한 결과, 4시간 이후 다른 유전자 전달체보다 세포 내로 유전자의 전달이 효과적으로 이루어 질 수 있음을 알 수 있다(참조: 도 5).In order to determine whether the Sendai F / HN virosome complex of the present invention can transfect pDNA and siRNA into a cell, the Sendai F / HN virosome complex of the present invention is combined with a gene (pDNA or siRNA). As a result, the cells were injected into Jurkat, CEM, and H9 cells derived from human T-cells, which are suspended cells, and thus, gene transfer into cells was more efficient than other gene carriers after 4 hours (see FIG. 5). .

상술한 바와 같이, 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체는 여러 세포주의 세포막에서 발현되는 공통적인 수용체(예컨대, 시알산 수용체)와 세포막 부착 능력이 뛰어나기 때문에, 범용 세포주에 적용할 수 있다. 또한, 플라스미드 DNA와 더불어 siRNA도 전달할 수 있는 범용 유전자 전달체로 적용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체는 다양한 적용범위를 가지는 매우 유용하고 효율적인 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다.As described above, the Sendai F / HN virosome complex of the present invention can be applied to a general-purpose cell line because it has a common receptor (eg, sialic acid receptor) and cell membrane adhesion ability expressed in cell membranes of various cell lines. . In addition, it can be applied as a universal gene carrier capable of delivering siRNA in addition to plasmid DNA. Therefore, the Sendai F / HN virosome complex of the present invention can be used as a very useful and efficient gene delivery system having various applications.

한편, 본 발명의 바이로좀 복합체를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물로 제공될 수 있다.On the other hand, it can be provided as a pharmaceutical composition comprising the virosome complex of the present invention as an active ingredient.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 바이로좀 복합체를 유효성분으로 포함하기 때문에, 본 명세서의 불필요한 반복 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 공통 사항은 그 기재를 생략한다. Since the pharmaceutical composition of the present invention includes the aforementioned virosome complex of the present invention as an active ingredient, common descriptions are omitted in order to avoid excessive complexity due to unnecessary repetitive description of the present specification.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여, 국부 투여 또는 전신투여를 이용하여 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is preferably parenteral, and may be administered, for example, by intravenous administration, subcutaneous administration, topical administration or systemic administration.

본 발명의 유전자 전달체인 센다이 F/HN 바이로좀 복합체의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 일반적으로 N/P 비율은 DNA의 경우는 1:3, siRNA인 경우는 1:6으로 제조하여 사용할 수 있고, 100 내지 300 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다The dose of the Sendai F / HN virosome complex, which is the gene carrier of the present invention, may be determined by the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, degree of disease symptom, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response sensitivity. It is varied by such factors as, in general, the N / P ratio is 1: 3 for DNA, 1: 6 for siRNA can be prepared and used, the amount of 100 to 300 mg / kg once a day Can be administered in three to three divided

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
The pharmaceutical compositions of the present invention are prepared in unit dosage form by being formulated with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients, according to methods which may be readily practiced by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 목적 뉴클레오타이드의 세포로의 트랜스펙션용 바이로좀 복합체(viroplex) 및 이를 이용한 유전자 전달방법에 관한 것이다.(a) The present invention relates to a virosome complex for transfection of a target nucleotide into a cell and a gene delivery method using the same.

(b) 본 발명의 바이로좀 복합체는 양성 전하를 가지는 양이온성 지질인 DMKE(O,O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate)로 인하여 목적 뉴클레오타이드 서열(예컨대, pDNA 또는 siRNA)과 효과적으로 결합할 수 있다.(b) The virosome complex of the present invention can effectively bind a target nucleotide sequence (eg, pDNA or siRNA) due to DMKE (O, O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate), a cationic lipid having a positive charge. have.

(c) 또한, 본 발명의 바이로좀 복합체는 센다이 바이러스의 세포막 부착 단백질인 F/HN 단백질을 포함하여 세포, 보다 바람직하게는 부유세포(suspension cells)와의 효과적인 부착을 유도할 수 있다.(c) In addition, the virosome complex of the present invention may include an F / HN protein, which is a cell membrane adhesion protein of Sendai virus, to induce effective attachment to cells, more preferably suspension cells.

(d) 따라서, 본 발명의 바이로좀 복합체는 보다 효율적이고 안정적으로 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반 또는 도입할 수 있다.(d) Thus, the virosome complexes of the present invention can transport or introduce the desired nucleotide sequence into cells more efficiently and stably.

(e) 본 발명의 바이로좀 복합체를 포함하는 조성물은 연구 또는 치료 목적으로 이용될 수 있다.
(e) The composition comprising the virosome complex of the present invention may be used for research or therapeutic purposes.

도 1은 유전자와 유전자 전달용 센다이 F/HN 바이로좀 복합체를 제작하는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2은 유전자(pDNA 또는 siRNA)와 유전자 전달용 센다이 바이로좀 복합체를 반응시켜 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체가 형성되는지 여부를 전기영동을 통하여 확인한 결과이다. 도 2a는 pDNA와 센다이 F/HN 바이로좀 복합체를 다양한 N/P 비율로 반응시켰을 때의 결과이다(레인 M, 1 kb 마커; 레인 2, pLuc; 레인 3, 4, 5 및 6, 본 발명의 바이로좀 복합체와의 N/P 비율이 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 1:6). 도 2b는 siRNA와 센다이 F/HN 바이로좀 복합체를 다양한 N/P 비율로 반응시켰을 때의 결과이다(레인 M, 100 bp 마커; 레인 2, FITC-siRNA; 레인 3, 4, 5 및 6, 본 발명의 바이로좀 복합체와의 N/P 비율이 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 1:6).
도 3은 본 발명의 유전자 전달용 센다이 F/HN 바이로좀 복합체의 부유세포인 Jurkat 세포(A)와 CEM 세포(B)에 형질감염 효과를 확인하기 위하여 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-pLuc를 처리한 후 24시간 또는 48시간 째에 루시퍼라제 형광을 검출한 결과이다.
도 4는 본 발명의 유전자 전달용 센다이 F/HN 바이로좀 복합체의 부유세포인 Jurkat 세포(A)와 CEM 세포(B)에 형질감염 효과를 확인하기 위하여 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-pEGFP를 처리한 후 24시간 또는 48시간 째에 GFP 형광을 검출한 결과이다.
도 5는 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체에 의한 부유세포인 Jurkat 세포(A)와 CEM 세포(B)에서 트랜스펙션 효율을 측정한 결과로서, 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-FITC-siRNA를 처리한 후 4시간 또는 24시간 째에 효과를 측정한 결과이다
도 6은 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체와 비멘틴-억제 siRNA를 부유세포인 Jurkat 세포에 트랜스펙션시켜 비멘틴 억제를 확인한 결과로서, 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-vim1 처리한 24시간 째에 비멘틴의 억제를 보여준다.
도 7은 본 발명의 유전자 전달용 센다이 F/HN 바이로좀 복합체의 세포 독성을 나타낸 결과로, 부유세포인 Jurkat 세포에 농도별(0, 1, 2, 4, 6, 10 ㎍/㎖)로 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체를 처리한 후 24시간의 결과를 보여준다.Figure 1 shows a schematic diagram of a process for producing a gene and Sendai F / HN virosome complex for gene delivery.
Figure 2 is a result of confirming by electrophoresis whether the Sendai F / HN virosome complex of the present invention is formed by reacting a gene (pDNA or siRNA) and the Sendai virosome complex for gene delivery. Figure 2a is a result of reacting the pDNA and Sendai F / HN virosome complex at various N / P ratio (lane M, 1 kb marker; lane 2, pLuc; lanes 3, 4, 5 and 6, the present invention N / P ratios with the virosome complexes of 1: 1, 1: 2, 1: 3 and 1: 6). Figure 2b is the result of the reaction of siRNA and Sendai F / HN virosome complex at various N / P ratio (lane M, 100 bp marker; lane 2, FITC-siRNA; lanes 3, 4, 5 and 6, N / P ratios with the virosome complexes of the present invention are 1: 1, 1: 2, 1: 3 and 1: 6, respectively.
Figure 3 is the Sendai F / HN virosome of the present invention to confirm the transfection effect on the Jurkat cells (A) and CEM cells (B) that are floating cells of the Sendai F / HN virosome complex for gene delivery of the present invention. Luciferase fluorescence was detected 24 hours or 48 hours after treatment with complex-pLuc.
Figure 4 is the Sendai F / HN virosome of the present invention to confirm the transfection effect on the Jurkat cells (A) and CEM cells (B) that are floating cells of the Sendai F / HN virosome complex for gene delivery of the present invention. GFP fluorescence was detected 24 hours or 48 hours after treatment with complex-pEGFP.
5 is a result of measuring the transfection efficiency in the Jurkat cells (A) and CEM cells (B), which are floating cells by the Sendai F / HN virosome complex of the present invention, the Sendai F / HN viro of the present invention The effect was measured 4 hours or 24 hours after treatment with some complex-FITC-siRNA.
6 is a result of transfecting the Sendai F / HN virosome complex and the non-mentin-suppressive siRNA of the present invention into Jurkat cells, which are suspended cells, to confirm the inhibition of non-mentin, the Sendai F / HN virosome complex of the present invention. Inhibition of non-mentin at 24 hours after -vim1 treatment.
Figure 7 shows the cytotoxicity of the Sendai F / HN virosome complex for gene delivery of the present invention, by concentration (0, 1, 2, 4, 6, 10 ㎍ / ㎖) to the floating cells Jurkat cells The result of 24 hours after the Sendai F / HN virosome complex of the present invention is shown.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

참고예 1: 양이온성 지질인 DMKE(O,O'-디미리스틸-N-리실 글루타메이트)Reference Example 1: DMKE (O, O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate), a cationic lipid

대한민국 특허등록번호 제10-0389292호와 유럽(영국) 특허등록번호 제PCT/KR2002/01377에 기재된 내용은 본 발명의 참조로써 포함한다. 상기 대한민국 특허등록번호 제10-0389292호에 기재된 것과 동일한 방법으로 양이온성 지질을 합성하였고, 유전자와의 효율적인 결합 및 세포 내 전달이 가능한 유전자 포획용 양이온성 지질을 제조하였다.
The contents described in Korean Patent Registration No. 10-0389292 and European Patent Registration No. PCT / KR2002 / 01377 are incorporated by reference of the present invention. Cationic lipids were synthesized in the same manner as described in Korean Patent Registration No. 10-0389292, and cationic lipids for gene capture capable of efficient binding to cells and intracellular delivery were prepared.

실시예 1: 본 발명의 부유세포 유전자 전달용 센다이 F/HN 바이로좀 복합체의 제조Example 1 Preparation of Sendai F / HN Virosome Complex for Suspension Cell Gene Delivery of the Present Invention

<1-1> 양이온성 지질인 DMKE 합성<1-1> DMKE Synthesis as Cationic Lipid

상기 참고예 1에서 말단의 C가 16개와 기능기에 글루탐산염(Sigma Aldrich)을 포함하고 있는 양이온성 지질을 대한민국 특허등록번호 제10-0389292호와 유럽(영국) 특허등록번호 제PCT/KR2002/01377에 기재된 내용을 바탕으로 합성을 하였고, HPLC(Pharmacia Biothech) 분석을 한 결과 순도가 99% 이상, 질량은 3 g으로 나타났다. 상기 양이온성 지질은 클로로폼과 에탄올(Sigma Aldrich) 구매처의 혼합물(부피비 2:1)에 넣고 -20℃에 사용 전까지 보관하였다.In the reference example 1, a cationic lipid containing 16 terminal C and glutamate (Sigma Aldrich) in a functional group is disclosed in Korean Patent Registration No. 10-0389292 and European (UK) Patent Registration No. PCT / KR2002 / 01377 Synthesis was performed based on the contents described in the above. As a result of HPLC (Pharmacia Biothech) analysis, the purity was 99% or more and the mass was 3 g. The cationic lipid was placed in a mixture of chloroform and ethanol (Sigma Aldrich) (volume ratio 2: 1) and stored at -20 ° C until use.

상기와 같이 제조된 글루탐산염을 포함하고 있는 양이온성 지질을 ‘DMKE(O,O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate)’라고 명명하였다.Cationic lipid containing glutamate prepared as described above was named 'DMKE (O, O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate)'.

<1-2> 세포막 결합력이 높은 센다이 바이러스 F/HN 단백질 추출<1-2> Sendai virus F / HN protein extraction with high cell membrane binding ability

10-11일 된 계태아에 센다이 바이러스(ATCC; #1698936, VR 907)를 4 HAU/100㎕ 접종한다. 접종 계태아를 3일 동안 37℃ 인공배양기(Grumbach)에서 배양하고 4℃에서 24시간 냉장보관 후 알란토익액을 채취하여 초원심분리를 통해 바이러스를 분리한다. 이렇게 순수 분리된 바이러스를 계면활성제인 트라이톤 X-100(Ducsan pure chemical)을 처리하여 바이러스를 용해시키고 초원심분리한 후, SM2-Bio Bead(Bio-rad Lab.)의 단계적 첨가를 통해 계면활성제를 제거하면서 센다이 바이러스의 표면단백질을 분리한다. 마지막으로 분리된 단백질은 전기영동을 통해 66 kDa의 HN 단백질과 45 kDa의 F 단백질을 분석하였고, 단백질을 정량한 결과 F/HN 단백질의 수율은 약 10 mg 정도로 나타났다.
10-11 day old embryos are inoculated with 4 HAU / 100 μl of Sendai virus (ATCC; # 1698936, VR 907). Inoculated chicks are incubated in a 37 ° C. artificial incubator (Grumbach) for 3 days, and refrigerated at 4 ° C. for 24 hours to collect allantoic fluids to separate viruses through ultracentrifugation. The pure virus was treated with surfactant Triton X-100 (Ducsan pure chemical) to dissolve the virus and ultracentrifuged, and then surfactant was added through the stepwise addition of SM2-Bio Bead (Bio-rad Lab.). While removing, isolate the surface protein of Sendai virus. Finally, the isolated protein was analyzed by electrophoresis of 66 kDa HN protein and 45 kDa F protein, and the yield of F / HN protein was about 10 mg.

<1-3> 양이온성 리포좀인 DMKE/콜레스테롤 제조<1-3> Preparation of DMKE / Cholesterol, a Cationic Liposome

상기 <실시예 1-1>에서 합성한 양이온성 지질인 DMKE를 보조지질인 콜레스테롤(Sigma chemical Co.)과 몰비(1:1)로 혼합하고, 질소 가스를 이용하여 혼합한 지질들로 필름을 형성시킨다. 이렇게 필름을 형성한 지질 혼합을 진공상태로 하여 유기용매를 완전히 제거하고, 3차 증류수를 넣어 수화하여 DMKE/콜레스테롤 리포좀(liposome)을 형성한다. 실온에서 초음파분해를 통해 형성된 리포좀의 크기를 균일하게 만든 뒤 사용 전까지 4℃에 보관하였다.DMKE, a cationic lipid synthesized in <Example 1-1>, was mixed with cholesterol (Sigma chemical Co.), a secondary lipid, in a molar ratio (1: 1), and a film was mixed with lipids mixed using nitrogen gas. Form. The film-forming lipid mixture is then vacuumed to completely remove the organic solvent, followed by hydration with tertiary distilled water to form DMKE / cholesterol liposomes. The liposomes formed by sonication at room temperature were uniformly sized and stored at 4 ° C. until use.

상술한 바와 같이, 제조된 양이온성 리포좀을 ‘DMKE/콜레스테롤’이라고 명명하였다.As described above, the prepared cationic liposomes were named 'DMKE / cholesterol'.

<1-4> 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체와 유전자(pDNA 또는 siRNA)의 결합<1-4> Binding of Sendai F / HN Virosome Complex and Gene (pDNA or siRNA) of the Present Invention

루시퍼라제를 발현하는 표지 유전자(pLuc) 1 ㎍ 또는 형광(FITC)으로 표지된 FITC-siRNA[센스(플루오레세인), 5’-CCUACGCCACCAAUUUCGU(dTdT)-3’; 안티센스, 5’-ACGAAAUUGGUGGCGUAGG(dTdT)-3’; 21 mer; Bioneer 사, Lot No. R90212-HNF] 70 pmole을 증류수 50 ㎕에 희석한 후, 상기 <실시예 1-3>에서 제조된 양이온성 리포좀인 DMKE/콜레스테롤과 다양한 N/P 비율(0, 1, 2, 3, 6)로 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 20분 후 센다이 F/HN 단백질을 넣어준 유전자와 질량대비 동량으로 첨가하여 주고 30분간 실온에서 반응시켰다. 위 반응 과정은 도 1에 기재되어 있다.FITC-siRNA [sense (fluorescein), 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU (dTdT) -3 ′ labeled with 1 μg of a marker gene (pLuc) expressing luciferase or fluorescence (FITC); Antisense, 5'-ACGAAAUUGGUGGCGUAGG (dTdT) -3 '; 21 mer; Bioneer, Lot No. R90212-HNF] After dilution of 70 pmole in 50 μl of distilled water, various cationic liposomes DMKE / cholesterol prepared in <Example 1-3> and various N / P ratios (0, 1, 2, 3, 6) The reaction was carried out at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, the gene was added in the same amount to the gene to which Sendai F / HN protein was added and reacted at room temperature for 30 minutes. The above reaction process is described in FIG.

상기와 같이 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체와 유전자들(pLuc 또는 FITC-siRNA)의 복합체 형성 여부를 확인하기 위해, 1% 아가로오스(Bio-rad Lab.) 겔 상에서 100V, 20분 동안 전기영동을 실시하였다. 상기 전기영동 후, 아가로오스 겔을 EtBr(ethidium bromide; Sigma chemical Co.)에 20분 동안 염색하고 5분 세척한 다음 자외선을 조사하여 본 발명의 센다이 바이로좀 F/HN 복합체-유전자 형성 여부를 확인하고 그 결과를 도 2에 기재하였다.In order to confirm whether the Sendai F / HN virosome complex and genes (pLuc or FITC-siRNA) of the present invention are formed as described above, 100V, 20 on a 1% agarose (Bio-rad Lab.) Gel Electrophoresis was performed for minutes. After the electrophoresis, the agarose gel was stained with EtBr (ethidium bromide; Sigma chemical Co.) for 20 minutes, washed for 5 minutes, and then irradiated with UV light to determine whether the Sendai virosome F / HN complex-gene was formed. It was confirmed and the results are shown in FIG.

도 2에서 확인한 바와 같이, 높은 N/P 비율로 갈수록 본 발명의 유전자 전달용 센다이 바이로좀 F/HN 복합체-유전자가 잘 형성됨을 알 수 있었으며, 보다 구체적으로 pDNA는 N/P 비율이 3 이상부터, siRNA는 N/P 비율이 6 이상부터 모든 유전자들이 본 발명의 센다이 바이로좀 F/HN 복합체와 결합함을 알 수 있었다.As confirmed in FIG. 2, it was found that the higher the N / P ratio, the better the Sendai virosome F / HN complex-gene for gene delivery of the present invention was formed. More specifically, the pDNA has an N / P ratio of 3 or more. From the siRNA, it was found that all genes bind to the Sendai virosome F / HN complex of the present invention since the N / P ratio is 6 or more.

<실험예 1> 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체의 세포 트랜스펙션 효과Experimental Example 1 Cell Transfection Effect of Sendai F / HN Virosome Complex of the Present Invention

부유세포인 인간 T-세포 유래 Jurkat 세포와 CEM 세포(서울대학교 의과대학 병리학 연구실 정경천 교수 제공)를 10% 비동화시킨 FBS(Fetal bovine serum; Gibco), 100U/㎖ 페니실린(Gibco), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin; Gibco)이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco)에 37℃, 5% CO2배양기에서 배양하였다. 위 세포를 6-웰 플레이트(NuncTM)에 1 X 106개씩 넣어주고 혈청이 배제된 배지를 넣어 1.5 ㎖로 맞추었다.FBS (Fetal bovine serum; Gibco), 100 U / ml penicillin (Gibco), 100 μg / a Incubated in 37%, 5% CO 2 incubator in RPMI-1640 medium (Gibco) containing ml streptomycin (Gibco). Stomach cells were placed in 6-well plates (Nunc TM ) in 1 × 10 6 cells and serum-free medium was adjusted to 1.5 ml.

<1-1> 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체의 pDNA 세포 전달 효과<1-1> pDNA Cell Delivery Effect of Sendai F / HN Virosome Complex of the Present Invention

상기 제시한 방법으로 세포를 준비하고 여기에 상기 <실시예 1-4>에서 제조된 유전자 전달용 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-pDNA(본 발명의 유전자 전달용 복합체:pDNA = 3:1)를 첨가하고 실온에서 15분 동안 반응 시킨 후, 4시간 동안 37℃, 5% CO2 세포배양기 ---- (Thermo Scientific) 구매처 ---- 에서 배양하였다. 상기 배양 후 10% 혈청이 첨가될 수 있도록 혈청과 배지를 넣어 2 ㎖로 맞추고, 다시 24시간 ~ 48시간 동안 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다. 상기 배양 후 각각의 샘플 세포주를 인산염 완충액[phosphate buffer saline(PBS), pH 7.4]으로 세척하였으며, pLuc 유전자의 전달은 용해 완충액(lysis buffer)으로 세포를 파쇄하여 루시퍼라제 어세이(Promega)를 통하여 분석하였다. 또한, pEGFP 유전자의 전달과 발현 정도는 2% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 세포를 5분 동안 고정시키고 인산염 완충액(pH 7.4)으로 세척한 후 FACS(BD biosciences) 분석을 실시하였다.The cells were prepared by the above-described method, and the Sendai F / HN virosome complex-pDNA for gene delivery (pDNA = 3: 1) of the present invention prepared in <Example 1-4> was used herein. After the reaction was added at room temperature for 15 minutes, the cells were incubated at 37 ° C. for 5 hours in a 5% CO 2 cell culture medium (Thermo Scientific). After the incubation, the serum and the medium was added to 2 ml so that 10% serum could be added thereto, and then cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 cell incubator for 24 to 48 hours. After incubation, each sample cell line was washed with phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4), and the transfer of pLuc gene was disrupted by lysis buffer to the cells through a luciferase assay (Promega). Analyzed. In addition, the degree of delivery and expression of pEGFP gene was fixed for 5 minutes with 2% paraformaldehyde (paraformaldehyde), washed with phosphate buffer (pH 7.4) and then subjected to FACS (BD biosciences) analysis.

도 3에서 확인할 수 있듯이, 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-pLuc를 처리한 경우 Jurkat 세포에서는 24시간째 1 X 106 RLU/mg 이상, 48시간째 1 X 107 RLU/mg 이상의 루시퍼라제가 발현되는 전달 효율을 나타냈다. 또한, 도 4에서 기재된 바와 같이 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-pEGFP를 처리한 경우 24시간에서 8% 이상, 48시간에서 약 20%의 GFP가 발현되는 효율을 보였다. CEM 세포에서는 루시퍼라제 발현이 24시간과 48시간 모두 1 X 106 RLU/mg 이상으로 나타났다. 또한, GFP 발현은 24시간에서 4% 이상, 48시간에서 8% 이상을 보였다. 이에 반해, 종래의 유전자 전달 효율이 우수하다고 알려진 양이온성 리포좀 전달체(lipofectamine 2000; Invitogen)은 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-pDNA와 비교하여 Jurkat 세포와 CEM 세포 모두에서 낮은 유전자 발현 효율을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체가 부유세포에 효율적으로 유전자를 전달하고 있음을 확인할 수 있었다.As can be seen in Figure 3, Sendai F / HN, if treated with a little complex by -pLuc in Jurkat cells 24 hours after the 1 X 10 6 RLU / mg or more, 48 hours after 1 X 10 7 RLU / mg or more luciferase I Expressed delivery efficiency was shown. In addition, when the Sendai F / HN virosome complex-pEGFP treatment as described in Figure 4 showed an efficiency of expressing at least 8% at 24 hours, GFP of about 20% at 48 hours. Luciferase expression in CEM cells was greater than 1 × 10 6 RLU / mg for both 24 and 48 hours. In addition, GFP expression was at least 4% at 24 hours and at least 8% at 48 hours. In contrast, the cationic liposome transporter (lipofectamine 2000; Invitogen), which is known to have excellent gene transfer efficiency, has low gene expression efficiency in both Jurkat cells and CEM cells compared to the Sendai F / HN virosome complex-pDNA of the present invention. Indicated. Therefore, it was confirmed that the Sendai F / HN virosome complex of the present invention efficiently transfers genes to floating cells.

<1-2> 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체의 siRNA 세포 전달 효과<1-2> siRNA Cell Delivery Effect of Sendai F / HN Virosome Complex of the Present Invention

상기 <실험예 1-1>과 같은 방법으로 세포를 준비하고 여기에 상기 <실시예 1-4>에서 제조된 유전자 전달용 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-siRNA(본 발명의 유전자 전달용 복합체:siRNA = 6:1)를 첨가하고 실온에서 15분 동안 반응 시킨 후, 4시간 동안 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다. 상기 배양 후 10% 혈청이 첨가될 수 있도록 혈청과 배지를 넣어 2 ㎖로 맞추고, 다시 4시간과 24시간 동안 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다. 상기 배양 후 각각의 샘플 세포주를 인산염 완충액(pH 7.4)으로 세척 후, FITC-siRNA 전달을 2% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 세포를 5분 동안 고정시키고 인산염 완충액(pH 7.4)으로 세척한 후 FACS 분석을 실시하였다.The cells were prepared in the same manner as in <Experimental Example 1-1>, and the Sendai F / HN virosome complex-siRNA for gene delivery prepared in <Example 1-4> -siRNA (complex for gene delivery of the present invention) : siRNA = 6: 1) was added and reacted for 15 minutes at room temperature, and then cultured in a 37%, 5% CO 2 cell incubator for 4 hours. After the incubation, the serum and the medium were added to 2 ml so that 10% serum could be added, and then cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 cell incubator for 4 hours and 24 hours. After incubation, each sample cell line was washed with phosphate buffer (pH 7.4), and then FITC-siRNA delivery was fixed with 2% paraformaldehyde for 5 minutes, washed with phosphate buffer (pH 7.4), and then FACS. Analysis was performed.

상기 도 5에서 기재된 바와 같이 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-FITC-siRNA를 처리한 경우 Jurkat 세포에서 4시간째 76% 이상, 24시간째 49% 이상의 FITC-siRNA가 전달되는 효율을 보였다. 또한, CEM 세포에서는 4시간째 69% 이상, 24시간째 33% 이상의 FITC-siRNA가 전달되는 효율을 나타냈다. 반면에, 종래의 유전자 전달효율이 우수하다고 알려진 양이온성 리포좀 전달체(lipofectamine 2000)에 두 세포주에서 4시간 및 24시간 모두 본 발명인 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-siRNA보다 FITC-siRNA 전달 효율이 낮은 것을 확인하였다. 또한, 상기 도 6에서 제시된 바와 같이 세포 내 비멘틴의 발현을 억제할 수 있는 siRNA인 vim 1[센스, 5’-UGAAGCUGCUAACUACCAA-3’; 안티센스, 5’-UUGGUAGUUAGCAGCUUCA-3’; 제놀루션, 19 mer, pre-validation, Lot No. GP-RNA-1015)을 Jurkat 세포에 처리하여 발현억제를 분석한 결과, 센다이 F/HN 바이로좀 복합체-vim 1이 약 15% 이상이 억제되었다. 반면, 종래의 유전자 전달체인 양이온성 리포좀 전달체(lipofectamine 2000)는 거의 억제가 없는 것을 확인할 수 있었다.As described in FIG. 5, when the Sendai F / HN virosome complex-FITC-siRNA was treated, at least 76% at 4 hours and at least 49% at 24 hours were delivered to Jurkat cells. In CEM cells, more than 69% at 4 hours and 33% at 24 hours of FITC-siRNA were delivered. On the other hand, the cationic liposome transporter (lipofectamine 2000), which is known to have superior gene transfer efficiency, has a lower FITC-siRNA delivery efficiency than the present Sendai F / HN virosome complex-siRNA in both cell lines for 4 hours and 24 hours in both cell lines. It was confirmed. In addition, as shown in FIG. 6, vim 1 [sense, 5′-UGAAGCUGCUAACUACCAA-3 ′, which is an siRNA capable of inhibiting the expression of non-mentin in cells; Antisense, 5'-UUGGUAGUUAGCAGCUUCA-3 '; Xenoltion, 19 mer, pre-validation, Lot No. GP-RNA-1015) was treated with Jurkat cells to inhibit expression. As a result, more than about 15% of Sendai F / HN virosome complex-vim 1 was inhibited. On the other hand, the cationic liposome transporter (lipofectamine 2000), which is a conventional gene transporter, was found to have almost no inhibition.

<실험예 2> 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체의 부유세포 내에서의 세포독성Experimental Example 2 Cytotoxicity in Suspension Cells of the Sendai F / HN Virosome Complex of the Present Invention

상기 <실험예 1-1>과 같은 방법으로 세포를 준비하고 여기에 제조된 유전자 전달용 센다이 F/HN 바이로좀 복합체를 다양한 질량비율(0, 1, 2, 4, 6, 10 ㎍/㎖)로 첨가하고 실온에서 15분 동안 반응 시킨 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다. 상기 배양 후 각각의 샘플 세포주를 인산염 완충액(pH 7.4)으로 세척한 후, PI(BD Pharmigenin) 염색을 5분간 시행한 뒤 FACS 분석을 실시하였다. 도 7에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 센다이 F/HN 바이로좀 복합체가 종래의 양이온성 리포좀 유전자 전달체(lipofectamine 2000)보다 독성이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 종래의 양이온성 리포좀 유전자 전달체는 작은 함유량에서도 높은 독성을 나타냈다.Prepare cells in the same manner as in <Experimental Example 1-1> and various mass ratios (0, 1, 2, 4, 6, 10 μg / ml) of the Sendai F / HN virosome complex for gene delivery prepared therein ), And reacted for 15 minutes at room temperature, followed by incubation for 24 hours at 37 ℃, 5% CO 2 cell culture. After the culture, each sample cell line was washed with phosphate buffer (pH 7.4), and then subjected to PI (BD Pharmigenin) staining for 5 minutes, followed by FACS analysis. As can be seen in Figure 7, the Sendai F / HN virosome complex of the present invention was confirmed to be less toxic than the conventional cationic liposome gene carrier (lipofectamine 2000). In contrast, conventional cationic liposome gene carriers exhibit high toxicity even at small contents.

상기와 같이 본 발명의 유전자 전달용 센다이 F/HN 바이로좀 복합체는 다른 유전자 전달 제제보다 효과적으로 세포 안으로 유입되어 핵 내에 pDNA를 전달하여 발현하고, 세포질(cytoplasm)로 siRNA를 유출시키는 것을 알 수 있었다. 또한, 세포 독성이 낮아 안정적으로 세포 내로 유전자를 전달할 수 있음을 알 수 있었다.
As described above, the Sendai F / HN virosome complex for gene delivery of the present invention was introduced into the cell more effectively than other gene delivery agents, delivering and expressing pDNA in the nucleus, and was found to leak siRNA into the cytoplasm. . In addition, it was found that the cytotoxicity can be reliably delivered to the cell with low cytotoxicity.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (12)

(a) 목적 뉴클레오타이드 서열; (b) DMKE(O,O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate); 및 (c) 센다이 바이러스(sendai virus)-유래된 F/HN(fusion/hemagglutinin-neuraminidase) 단백질로 이루어진 목적 뉴클레오타이드의 부유세포(suspension cells)로의 트랜스펙션용 바이로좀 복합체(viroplex).
(a) the target nucleotide sequence; (b) DMKE (O, O'-dimyristyl-N-lysyl glutamate); And (c) a viroplex for transfection of the target nucleotides consisting of sendai virus-derived F / HN (fusion / hemagglutinin-neuraminidase) proteins into suspension cells.
제 1 항에 있어서, 상기 목적 뉴클레오타이드 서열은 바이러스에서 유래되지 않은 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 복합체.
The complex of claim 1, wherein the target nucleotide sequence is a nucleotide sequence not derived from a virus.
제 1 항에 있어서, 상기 목적 뉴클레오타이드 서열은 재조합 DNA, pDNA(plasmid DNA), siRNA(small interfering RNA) 또는 miRNA(microRNA)인 것을 특징으로 하는 복합체.
The complex of claim 1, wherein the target nucleotide sequence is recombinant DNA, plasmid DNA (pDNA), small interfering RNA (siRNA), or miRNA (microRNA).
삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 복합체는 세포독성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 복합체.
The complex of claim 1, wherein the complex does not have cytotoxicity.
제 1 항 내지 제 3 항, 그리고 제 11 항 중 어느 한 항의 복합체를 분리된 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 유전자 전달 방법.12. A gene delivery method comprising the step of contacting a complex of any one of claims 1-3 and 11 with an isolated cell.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6210708B1 (en) * 1996-05-08 2001-04-03 Nika Health Products Limited Cationic virosomes as transfer system for genetic material
KR100389292B1 (en) * 2001-01-22 2003-06-27 박용석 Positively Charged Lipid and Liposome Containing the Same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6210708B1 (en) * 1996-05-08 2001-04-03 Nika Health Products Limited Cationic virosomes as transfer system for genetic material
KR100389292B1 (en) * 2001-01-22 2003-06-27 박용석 Positively Charged Lipid and Liposome Containing the Same

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Biochem. Mol. Biol. Vol. 35, No. 5, p. 459-464 (2002. 9. 30.) *
J. Biochem. Mol. Biol. Vol. 35, No. 5, p. 459-464 (2002. 9. 30.)*
J. Exp. Biomed. Sci. Vol. 15, No. 4, p. 265-272 (2009. 12. 31.) *
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