KR101238378B1 - Ｄｍｓｏ 용매를 이용한 ｆｒｅｔ 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법 - Google Patents

Ｄｍｓｏ 용매를 이용한 ｆｒｅｔ 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101238378B1
KR101238378B1 KR1020100041739A KR20100041739A KR101238378B1 KR 101238378 B1 KR101238378 B1 KR 101238378B1 KR 1020100041739 A KR1020100041739 A KR 1020100041739A KR 20100041739 A KR20100041739 A KR 20100041739A KR 101238378 B1 KR101238378 B1 KR 101238378B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fret
dmso
fluorescent
ssdna
polymer
Prior art date
Application number
KR1020100041739A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110122316A (ko
Inventor
우한영
강미정
Original Assignee
부산대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 부산대학교 산학협력단 filed Critical 부산대학교 산학협력단
Priority to KR1020100041739A priority Critical patent/KR101238378B1/ko
Publication of KR20110122316A publication Critical patent/KR20110122316A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101238378B1 publication Critical patent/KR101238378B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6445—Measuring fluorescence polarisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/521—Single-layer analytical elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/607—Detection means characterised by use of a special device being a sensor, e.g. electrode

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

본 발명은 용매를 이용한 수용성 공액 고분자 FRET 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 형광 공여체로서 양이온성 폴리플루오렌 코폴리머(FHQ 또는 FPQ), 형광 수용체로서 단일가닥 DNA가 결합된 플루오레세인(ssDNA-Fl) (Fl은 Fluorescein의 Fl) 또는 단일가닥 PNA가 결합된 플루오레세인(ssPNA-Fl)을 사용하며, 40~80 vol%의 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 포함하는 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 시스템 및 핵산 검출 방법에 관한 것이다.

Description

ＤＭＳＯ 용매를 이용한 ＦＲＥＴ 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법{A FRET system using DMSO solvent and a detection method of nucleic acid using the same}
본 발명은 용매를 이용한 수용성 공액 고분자 FRET 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 40~80 vol%의 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 포함하는 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
여러 가지 DNA 검출 방법 중에서 형광 고분자에서 검출 탐침(probe)으로의 형광공명에너지전달(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)을 이용한 검출방법은 고분자의 안테나 효과에 의해 probe 발색단의 형광 신호가 증폭되어 DNA 검출감도를 증대시킬 수 있는 장점을 갖고 있다(형광 고분자: FRET 공여체, probe PNA: FRET 수용체). 미국 UC, Santa Barbara (USCB)의 바잔(Bazan) 교수는 수용성 형광 공액고분자와 발색단을 레이블한 단일가닥 펩타이드 핵산(probe PNA, peptide nucleic acid, 전하없음)을 이용하여 특정 염기서열의 DNA를 검출하는 센싱 메커니즘을 고안하였다((a) Gaylord, B. S. et al. Proc. Natl . Acad . Sci . USA 2002, 99, 10954. (b) Gaylord, B. S. et al. J. Am . Chem . Soc . 2003, 125, 896. (c) US patent 7,144,950, 2006). 검출하고자 하는 target DNA에 상보적인 PNA에 발색단을 레이블하고(PNA-C*, probe PNA), 분석하고자 하는 DNA와 PNA-C*의 혼성화(hybridization)를 유도한 후 양전하 공액 고분자를 첨가한다. PNA-C*에 상보적인 염기서열을 갖는 target DNA가 존재할 경우 혼성화에 의해 DNA/PNA-C* 듀플렉스 (duplex, 음전하)가 형성되고 여기에 양이온 공액 고분자가 첨가되면 정전기적 인력에 의해 양전하 공액 고분자와 음전하의 DNA/PNA-C* 듀플렉스 사이에 정전기착물이 형성된다. 따라서 probe 발색단과 고분자가 FRET이 발생할 수 있을 정도로 가까워져서 고분자를 여기시 FRET에 의한 probe 발색단의 형광을 볼 수 있다. target DNA가 존재하지 않을 경우 PNA-C*와 DNA 사이의 hybridization은 발생하지 않고 음전하의 DNA만이 양전하 공액 고분자에 근접하게 되어 고분자/DNA 정전기 착체가 형성된다. 즉 probe 발색단과 고분자 간 거리가 좁혀지지 않아 고분자를 여기시킬 경우 FRET이 일어날 수 없고, 결과적으로 발색단의 형광이 발현되지 않고 형광 고분자로부터의 형광 신호가 검출된다. 따라서 FRET에 의해 유도된 형광의 유무로부터 특정 염기서열을 갖는 DNA의 존재여부를 실시간으로 빠르게 검출할 수 있다.
이와 같은 종래기술은 공액 구조 고분자 주쇄에서 기인하는 소수성으로 인해 물에서 제한된 용해도를 갖고 고분자 응집(aggregation, 수~수백 nm)현상이 발생한다. 이렇게 되면 고분자의 형광 등 광학 특성이 저하되고, 분석물(DNA, 단백질 등)과의 상호작용이 감소하여 형광에너지전달 효율이 줄어들게 된다.
또한, 공액고분자 전해질(FRET 공여체)을 사용한 바잔 교수의 FRET DNA 센서의 경우 DNA 검출감도를 높이기 위해서는 FRET에 의해 유도된 발색단(FRET 수용체) 형광을 최대화시켜야 한다. 대부분의 경우 양전하 고분자의 HOMO-LUMO 전자 구조와 발색단의 HOMO-LUMO 전자구조에 따라 FRET과 동시에 PCT (Photo-induced charge transfer)에 의한 형광 quenching이 일어나서 발색단의 형광이 억제되어 센서의 감도를 제한하게 된다. 즉 본 센서 시스템에서 FRET과 PCT는 경쟁관계에 있어 FRET 효율의 증대와 동시에 PCT에 의한 발색단의 형광 quenching을 최소화하여야만 고분자 FRET 센서의 성능을 한층 더 향상시킬 수 있다. FRET과 PCT는 공여체와 수용체의 거리에 매우 민감한데 FRET의 경우 r-6에 비례하고 PCT의 경우 지수함수적(e-r)으로 거리가 증가할수록 감소하는 특성이 있다. FRET과 PCT 모두 공여체-수용체 거리가 증가할수록 감소하지만 PCT는 지수 함수적으로 더 급격하게 감소하는 특성이 있다. 그러므로 FRET 공여체와 수용체의 거리를 sub-nanometer (혹은 옹스트롬) 단위에서 제어할 수 있으면 PCT 형광약화 (quenching)를 최소화시키고 FRET에 의한 발색단 형광을 증대시킬 수 있다. 하지만 나노미터 혹은 옹스트롬 단위에서 분자간 거리를 제어하는 것이 기술적으로 매우 어려워 매우 제한적인 접근만이 시도되고 있다. UCSB의 Bazan 교수는 PCT에 의한 발색단 형광 약화(quenching)를 억제하기 위해 공액 고분자 주쇄의 치환체를 변경하여 고분자의 HOMO-LUMO 전자 구조를 조절하거나(Liu, B.; Bazan, G. C. J. Am . Chem . Soc . 2006, 128, 1188.) 고분자와 발색단 간 거리를 조절하기 위하여 고분자 주쇄에 부피가 큰 분자를 달거나 (Woo, H. Y.; Vak, D.; Korystov, D.; Mikhailovsky, A.; Bazan, G. C.; Kim, D.-Y. Adv . Funct . Mater . 2007 , 17, 290.) 고분자 주쇄에 알킬그룹을 치환하고 알킬 체인의 길이를 변경하여 (Liu, B.; Gaylord, B. S.; Wang, S.; Bazan, G. C. J. Am . Chem . Soc . 2003, 125, 6705.) 정전기 착체 형성 후 양이온 고분자 공여체와 탐침 수용체 사이의 거리를 조절하여 결과적으로 FRET에 의한 발색단 형광을 증가시킨 연구결과를 발표하였다. 그러나 위에서 제안한 3가지 방법 모두 고분자 구조를 변경하기 위해 복잡한 합성을 필요로 하며 특수한 고분자 구조에 한정되어 모든 공액 고분자에 적용할 수 없다는 단점을 가지고 있다.
또한, 수용성 용매에 유기 용매를 첨가함으로써 고분자/DNA 정전기착체 내 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 영향을 주어 공여체와 수용체 거리를 조절한 연구는 추가적인 합성 과정을 수반하지 않고도 착체의 미세 구조를 변화시킬 수 있음을 보여주었으나, 유기 용매로서 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran, THF, (a) S. Wang and G. C. Bazan, Chem . Commun . 2004, 2508. (b) B. Liu and G. C. Bazan, Chem . Asian J. 2007, 2, 499.), N-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidone, NMP, Q.-H. Xu, B. S. Gaylord, S. Wang, G. C. Bazan, D. Moses, and A. J. Heeger, Proc . Natl . Acd . Sci . U.S.A., 2004, 101, 11634.) 내에서 고분자의 용해도가 떨어지고, 낮은 생체적합성, 독성으로 인해 실제 생체시료에 적용하기 힘들거나 연구자가 사용하기에 힘든 단점을 가지고 있다.
이에 본 발명자는 양이온 형광 고분자에서 probe 발색단이 레이블된 단일 가닥 DNA (혹은 PNA)로의 형광공명에너지전달을 이용한 수용성 DNA 센서 시스템에 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 첨가함으로써 고분자의 용해도를 증가시키고 흡수, 형광 등 광학특성을 향상시키며(고분자의 안테나 특성 극대화) 또한 고분자-DNA간 소수성 상호작용에 영향을 주어 FRET 공여체/수용체 정전기 착체의 미세구조를 제어하여 FRET과 PCT 형광억제 현상 사이의 경쟁을 제어하고자 본원 발명을 고안하였다.
본 발명의 목적은 수용성 공액 고분자 FRET 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법을 제공함을 목적으로 한다. 보다 구체적으로 본 발명은 40~80 vol%의 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 포함하는 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법을 제공함을 목적으로 한다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 형광 수용체로서 핵산에 결합된 형광분자 및 형광 공여체로서 양이온 공액 고분자를 포함하고, 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 포함하는 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 시스템을 제공한다.
상기 핵산은 단일가닥 DNA (ssDNA) 또는 단일가닥 PNA (ssPNA)일 수 있다.
상기 형광분자는 형광 염료, 반도체 나노크리스탈, 란탄화물 킬레이트 및 녹색 형광 단백질로부터 선택될 수 있다.
상기 형광 염료는 플루오레세인(fluoresein)일 수 있다.
상기 양이온 공액 고분자는 폴리플루오렌 코폴리머인 것이 바람직하다.
상기 폴리플루오렌 코폴리머는 폴리(9,9’-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌-알트-1,4-(2,5-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실옥시)페닐렌))테트라브로마이드(FHQ) 또는 폴리(9,9’-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌-알트-페닐렌)다이브로마이드(FPQ)인 것이 바람직하다.
상기 디메틸 설폭사이드는 상기 용매 중 40~80 vol%로 포함되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)를 이용한 핵산 검출 방법으로서, 디메틸 설폭사이드를 포함하는 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 FRET를 이용한 핵산 검출 방법을 제공한다.
상기 디메틸 설폭사이드는 상기 용매 중 40~80 vol%로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면 분석하고자 하는 시료 수용액에 DMSO를 첨가하여 고분자의 용해도와 광학특성을 향상시키고 고분자와 probe DNA (혹은 PNA)간 정전기착체의 미세구조(FRET 공여체-수용체 분자간 거리 등)를 옹스트롬 혹은 나노미터 수준에서 조절하여 고분자로부터 발색단으로의 FRET 특성을 향상시켜 고분자 FRET 바이오센서의 DNA 검출 감도를 증대시킬 수 있다. 고분자-DNA간 소수성 상호작용에 영향을 주어 FRET 공여체/수용체 정전기 착체의 미세구조를 제어하여 FRET과 PCT 형광억제 현상 사이의 경쟁을 제어할 수 있다. 또한 본 발명은 형광고분자 및 probe 발색단의 분자 구조의 변경 없이 손쉽게 FRET 고분자 센서의 검출 감도를 크게 향상시킬 수 있으며 이와 유사한 센서 시스템에 일반적으로 적용될 수 있다.
도 1은 DMSO에 의한 DNA 검출 센서의 최적화를 나타낸 개념도이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 양이온성 공액 고분자의 구조이다.
도 3은 PBS/DMSO 혼합용매안의 DMSO의 비율이 증가함에 따라 FHQ의 규격화된 흡수 및 PL 스펙트럼이다.
도 4는 PBS/DMSO 혼합용매안의 DMSO의 비율이 증가함에 따라 FHQ의 몰 흡광 계수(■) 와 PL 양자 수율(○)을 나타낸다.
도 5는 PBS/DMSO 혼합용매안의 DMSO의 비율이 증가함에 따라 플루오레세인의 규격화된 흡수 및 PL 스펙트럼이다.
도 6은 PBS/DMSO 혼합용매안의 DMSO의 비율이 증가함에 따라 플루오레세인의 몰 흡광 계수(■) 와 PL 양자 수율(○)을 나타낸다.
도 7은 형광공명에너지전달에 의해 유도된 발색단 형광에 대한 DMSO의 영향에 관한 것이다[(A)FHQ와 ssDNA-Fl, (B)FPQ와 ssDNA-Fl].
도 8은 다른 PBS/DMSO 혼합용매의 전하비 [+]/[-]=3.2에서 FHQ(■) 및 FPQ(○) 존재 하에서 FRET-유도된 Fl 신호 증폭에 관한 것이다.
도 9는 PBS/DMSO 혼합용매 안의 FHQ/ssDNA-Fl 및 FPQ/ssDNA-Fl에 있어 Stern-Volmer 감쇄 상수이다.
도 10은 다른 PBS/DMSO 혼합용매에서 FHQ의 첨가 전후 ssDNA-Fl의 λPL의 스펙트럼의 이동을 나타낸다. [ssDNA-Fl]=2.5 × 10-8M, [FHQ]=4.0×10-7M 이다.
도 11은 다른 PBS/DMSO 혼합용매에서 FHQ 첨가후 ssDNA-Fl의 Time-resolved PL 감퇴이다. [ssDNA-Fl]=2.5 × 10-8M, [FHQ]=4.0×10-7M (전하비 [-]:[+]=1:3.2) 이다.
도 12는 PBS/DMSO 혼합용매에서 FRET-유도된 PL 스펙트럼이다[(A)FHQ/ssPNA-Fl/ssDNAC, (B)FPQ/ssPNA-Fl/ssDNAC, (C)FHQ/ssPNA-Fl/ssDNANC].
본 발명의 제 1견지에 의하면, 형광 수용체로서 핵산에 결합된 형광분자 및 형광공여체로서 양이온 공액고분자를 포함하고, 버퍼(buffer)에 DMSO를 40~80 vol% 첨가하는 것을 특징으로 하는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 시스템을 제공한다. 상기 버퍼는 염기성 환경을 만들어 주는 것으로 예를 들어, 인산염 버퍼(Phosphate buffer, NaH2PO4 및 Na2HPO4) (pH 5.8-8.0), 인산염 - 시트르산 버퍼 (Phosphate-citrate buffer, Na2HPO4 및 C3H4OH(COOH)3) (pH 2.2-8.0), Barbital buffer (Sodium barbital 및 HCl) (pH 6.8-9.2), Glycine-NaOH buffer (pH 8.6-10.6), TAPS (3-{[tris(hydroxymethyl)methyl]amino}propanesulfonic acid) (pH 7.7-9.1), Bicine (N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine) (pH 7.6-9.0), Tris (tris(hydroxymethyl)methylamine) (pH 7.5-9.0), Tris-HCl buffer (pH 5.0-8.6), Tricine (N-tris(hydroxymethyl)methylglycine) (pH 7.4-8.8), HEPES (4-2-hydroxyethyl-1-piperazineethanesulfonic acid) (pH 6.8-8.2), TES (2-{[tris(hydroxymethyl)methyl]amino}ethanesulfonic acid) (pH 6.8-8.2) 등 이 있으며, 바람직하게는 인산완충용액 (phosphate buffer solution, PBS, pH = 8)이다.
또한, 본 발명의 FRET 시스템에 있어, 상기 핵산으로는 단일가닥 DNA (ssDNA) 또는 단일가닥 PNA (ssPNA)을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 FRET 시스템에는, 형광분자로서 형광 염료, 반도체 나노크리스탈, 란탄화물 킬레이트 및 녹색 형광 단백질을 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 형광염료로 플루오레세인(fluoresein, Fl)을 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 FRET시스템에 있어, 상기 양이온 공액 고분자는 양이온성 폴리플루오렌 코폴리머(cationic polyfluorene copolymer)인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 수용성 공액 고분자(water-soluble conjugated polymer), 양이온 공액 고분자(cationic conjugated polymer, CCP), 공액 고분자전해질(Conjugated polyelectrolytes)과 같은 용어는 FRET에 사용되는 공여체로서 양전하를 가진 수용성 고분자를 의미하는 것으로 상호교환가능하게 사용된다.
이러한 공액 고분자 전해질은 비편재화된 전자 구조를 특징으로 하며, 화학적 표적 및 생물학적 표적에 대한 높은 반응 광 리포터(highly responsive optical reporter)로서 사용될 수 있다. 또한 공액 고분자 전해질은 전자의 들뜬 상태를 전달하는데, 들뜬 상태에 존재하는 유사입자인 엑시톤(exciton)이 이런 고분자 내에서 이동이 가능하고, 공액 고분자의 발광 스펙트럼이 발색단의 흡수 스펙트럼과 겹치게 되면 FRET을 유발하고 에너지 전이에 의하여 장파장의 형광이 증폭되어 발현된다. 또한, 효율적인 공액 길이는 폴리머 사슬보다 실질적으로 짧기 때문에, 고분자 골격은 다량의 공액 세그먼트를 포함한다. 그러므로 공액화된 폴리머는 집광에 효율적이며, FRET 에너지 전달을 통해 광 신호를 증폭할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 양이온 공액 고분자는 상대적으로 높은 발광 양자 효율을 갖는 수용성 양이온성 폴리플루오렌 코폴리머 (cationic polyfluorene copolymer)로서, 폴리(9,9’-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌-알트-1,4-(2,5-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실옥시)페닐렌))테트라브로마이드(FHQ) 또는 폴리(9,9’-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌-알트-페닐렌)다이브로마이드(FPQ)를 사용하였다(도 2참조). 상기 고분자는 신호 발색을 위해 형광 분자에 근접하여야 하고 광 흡수 및 에너지 전달을 할 수 있어야 한다.
또한 본 발명의 FRET 시스템에 사용되는 형광분자는 신호 발색군(signaling chromophore)으로서, 적당한 용액에서 양이온 공액 고분자로부터 에너지를 흡수할 수 있고, 광을 방출할 수 있는 물질을 포함한다. 전형적인 형광분자로는 형광 염료, 반도체 나노크리스탈, 란탄화물 킬레이트 및 녹색 형광 단백질을 포함한다.
형광 염료의 예로는 플루오레세인, 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민 6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민 110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(상표명), Cy3(상표명), Cy3.5(상표명), Cy5(상표명), Cy5.5(상표명), Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6- 카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 알렉사 플로어(Alexa Fluor, 상표명) 350, 알렉사 플로어(상표명) 430, 알렉사 플로어(상표명) 488, 알렉사 플로어(상표명) 532, 알렉사 플로어(상표명) 546, 알렉사 플로어(상표명) 568, 알렉사 플로어(상표명) 594, 알렉사 플로어(상표명) 633, 알렉사 플로어(상표명) 647, 알렉사 플로어(상표명) 660, 알렉사 플로어(상표명) 680, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY, 상표명) FL, 보디피(상표명) FL-Br 2 , 보디피(상표명) 530/550, 보디피(상표명) 558/568, 보디피(상표명) 564/570, 보디피(상표명) 576/589, 보디피(상표명) 581/591, 보디피(상표명) 630/650, 보디피(상표명) 650/665, 보디피(상표명) R6G, 보디피(상표명) TMR, 보디피(상표명) TR, 이의 콘쥬게이트화물, 이들의 배합물을 포함한다. 란탄화물 킬레이트의 예로는 유로피윰(europium) 킬레이트, 테르비윰(terbium) 킬레이트 및 사마리윰(samarium) 킬레이트를 포함한다.
상기 용매에는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)가 포함되며, DMSO는 수용액과 완벽하게 혼합되는 친수성을 가지며 DNA, 단백질, 탄수화물 등 바이오 물질과 친화성을 갖고 인체에 독성이 없어 바이오센서 응용에 최적의 용매 성분이라 할 수 있다. 바람직한 DMSO의 사용량은 상기 용매에 40~80 vol%이다.
본 발명의 일실시예에서 40~80 vol%의 DMSO를 첨가한 인산완충용액의 경우 PCT 형광 억제 및 발색단 self quenching 현상이 감소하여 DMSO 첨가 전의 샘플보다 최대 37배 가량 FRET에 의한 탐침 발색단의 형광 신호가 증대하였다.
또한 본 발명의 제 2견지에 의하면, 상기에서 서술한 FRET 시스템을 이용한 핵산 검출 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법은 FRET 형광 수용체로서 타겟 DNA에 상보적인 서열을 갖는 단일가닥 DNA 또는 단일가닥 PNA에 결합된 형광분자 및 형광공여체로서 양이온 공액 고분자를 포함하고, 버퍼(buffer)에 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 40~80 vol% 첨가하는 것을 특징으로 하는, 타겟 DNA를 실시간으로 검출하는 수용성 공액 고분자 FRET 바이오센서를 이용하는 것이다. 상기 버퍼는 염기성 환경을 만들어 주는 것으로 예를 들어, 인산염 버퍼(Phosphate buffer, NaH2PO4 및 Na2HPO4) (pH 5.8-8.0), 인산염 - 시트르산 버퍼(Phosphate-citrate buffer, Na2HPO4 및 C3H4OH(COOH)3) (pH 2.2-8.0), 바르비탈 버퍼(Barbital buffer, Sodium barbital 및 HCl) (pH 6.8-9.2), Glycine-NaOH buffer (pH 8.6-10.6), TAPS (3-{[tris(hydroxymethyl)methyl]amino}propanesulfonic acid) (pH 7.7-9.1), Bicine (N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine) (pH 7.6-9.0), Tris (tris(hydroxymethyl)methylamine) (pH 7.5-9.0), Tris-HCl buffer (pH 5.0-8.6), Tricine (N-tris(hydroxymethyl)methylglycine) (pH 7.4-8.8), HEPES (4-2-hydroxyethyl-1-piperazineethanesulfonic acid) (pH 6.8-8.2), TES (2-{[tris(hydroxymethyl)methyl]amino}ethanesulfonic acid) (pH 6.8-8.2) 등 이 있으며, 바람직하게는 인산완충용액 (phosphate buffer solution, PBS, pH = 8)이다.
상기 본 발명의 FRET 센서의 일 양태로서, 양이온 공액 고분자를 여기할 수 있고, 검출되는 방출 파장(들) 보다 짧은 파장을 제공하는 임의의 기구를 여기용으로 사용할 수 있다. 여기 공급원은 신호표시 형광분자를 직접적으로 크게 여기하지 않는 것이 바람직하다. 공급원은 적당한 필터와 자외선(deuterium) 램프와 같은 광대역 UV 광원, 목적하는 파장을 추출 하는 모노크로마터를 통과시킨 후의 제논(xenon) 램프 또는 자외선 램프와 같은 백광원의 방출, 연속 파장(cw) 가스 레이저, 고형 상태 다이오드 레이저, 또는 임의의 펄스된 레이저일 수 있다. 신호표시 발색단에서 방출된 광은 임의의 적당한 장치 또는 기술(여러가지 적합한 접근법이 당업에 공지되어 있음)로 검출할 수 있다. 예를 들어, 형광측정기 또는 분광광도계를 고분자의 여기에 의해 신호표시 발색단의 파장 특성의 광을 시험 샘플이 방출하는 지의 여부를 검출하기 위해 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 실험
(1) 재료 및 방법
모든 화학물질은 Aldrich Chemical Co.에서 구입하였고 추가 정제 없이 사용하였다. 20개의 염기서열(5'-Fl-TTAA TCGA GTTA CCGC AATC, 서열번호 1)로 5'위치에 형광물질(fluorescein)로 라벨된 HPLC-정제 단일가닥 DNA (ssDNA-Fl)와 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PAN) (ssPNA-Fl)은 각각 Sigma-Genosys와 Panagene 로부터 입수하였다. 1H-NMR 스펙트럼은 JEOL (JNM-AL300) FT NMR system에 기록되었다. 고분자의 수평균 분자량(number-average molecular weight)은 Agilent Technologies 1200 Series의 겔투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)로 측정하였다. UV/vis 흡수 스펙트럼은 Jasco (V-630) spectrophotometer로 측정되었다. PL 스펙트럼(photoluminescence spectra)은 Xenon lamp 여기원(excitation source)을 갖는 Jasco (FP-6500) spectrofluorometer로 각 시료에 대해 90도 각도 검출을 사용하여 얻어졌다.
수용액 내 pH = 11일 때 플루오레세인을 기준하여 형광 양자 수득율을 측정하였다. PL (photoluminescence) 수명의 측정은 time-correlated single-photon counting technique (TCSPC)을 사용하여 수행되었다(D. V. O'Connor, D. Phillips, Time Correlated Single Photon Counting; Academic Press, London, U. K., 1984.). 광원으로 4 fs 의 펄스폭을 갖는 레이저 펄스를 사용하였다.
(2) 양이온성 공액 고분자의 합성
FRET의 공여체로서 두 개의 폴리플루오렌 코폴리머, 폴리(9,9’-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌-알트-1,4-(2,5-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실옥시)페닐렌))테트라브로마이드(FHQ),와 폴리(9,9’-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌-알트-페닐렌)다이브로마이드(FPQ)는 이전에 보고된( B. Liu and G. C. Bazan, J. Am . Chem . Soc. 2006, 128, 1188.) 절차를 변형하여 합성하였다. 중성의 전구체 고분자, FHN은 톨루엔/물 (2:1)에서 촉매로 Pd(PPh3)4 를 사용하여 80℃에서 24시간 동안 9,9-비스(6‘-브로모헥실)플루오렌 다이보로닉 에스터와 1,4-비스(6-브로모헥실옥시)-2,5-다이브로모벤젠의 스즈키 중합법에 의해 합성했다. FPN은 유사하게 2,7-다이브로모-9,9-비스(6’-브로모헥실)플루오렌 과 1,4-페닐렌비스보로닉 에스터 사이의 중합반응에 의해 얻었다. 중합 정도는 폴리스티렌 표준화합물을 기준으로 GPC (용매: THF)를 사용하여 FHN의 경우 Mn = 15,300 g/mol (PDI = 2.03)로 FPN의 경우 Mn = 16,700 g/mol (PDI = 2.32)로 측정되었다. 양이온성 수용성 고분자, FHQ와 FPQ는 상온에서 THF/메탄올 혼합물에서 48시간 동안 응축된 트리메틸아민과 함께 FHN과 FPN을 사용함으로써 얻었다. 1H-NMR (300 MHz, DMSO) δ (ppm), FHQ: 8.0-7.10 (br,8H) , 4.06 (br,4H) 3.30 (br,8H), 3.10 (br,18H), 3.02 (br,18H), 1.80-0.70 (br,36H). FPQ: 8.10-7.60 (br, 10H), 3.17 (br, 4H), 2.96 (s, 18H), 1.6-0.9 (br, 20H).
(3) DMSO /버퍼 혼합용매의 준비와 FRET -유도된 PL 측정
수용성 DMSO 용액은 5 mM 인산완충용액(phosphate buffer solution, PBS, pH = 8)에 DMSO의 비율을 20 vol%씩 변화시키면서 제조되었다. 혼합은 발열반응이고 발생된 열은 각각의 혼합물에 따라 다르기 때문에, 온도 효과를 제거하기 위하여 각각의 혼합액을 열적 평형 상태에 도달할 때가지 방치하였다. FRET-유도된 Fl 스펙트럼의 측정은 [ssDNA-Fl] = 2.5 × 10-8 M를 포함하는 PBS/DMSO (5 mM, pH = 8) 혼합용매에 [FHQ] = 1.0 × 10-7 M에서 4.0 × 10-7 M로 [FPQ] = 2.0 × 10-7 M에서 7.9 × 10-7 M로 농도를 증가시키면서 측정하였다. 각각의 고분자 첨가에 의해 [+]/[-]의 전하비는 0.8씩 증가하고, PBS에서 3.2 (CCP의 [+]/ssDNA-Fl의 [-])의 전하비에서 FRET 신호의 saturation을 측정하였기 때문에 최종 전하비는 [+]/[-]=3.2로 조절하였다.
(4) 광학 특성
FRET 스펙트럼에 있어서 DMSO의 효과를 알아보기 전에 다른 조성의 PBS/DMSO 혼합용매에서 FHQ와 FPQ의 광학적 특성을 조사했다(도 3, 4).
상기 실험에 대한 결과는 다음과 같다.
2. 결과
도 3에서 보듯이, 혼합 용매 내 DMSO의 양이 증가함(60 vol% 까지)에 따라 FHQ의 흡수 스펙트럼은 점차적으로 장파장으로 이동하고 형광 스펙트럼은 무시할 정도의 스펙트럼의 이동을 나타냈다. FHQ의 몰흡광계수(molar absorptivity, α)는 PBS에서 20,900 M-1cm-1, 80 vol% DMSO에서 29,600 M-1cm-1 및 순수한 DMSO에서 34,300 M-1cm-1로, DMSO 양이 증가함에 따라 대체로 증가했다. FHQ의 PL 양자효율 (quantum efficiency, FPL)은 다소 복잡한 경향은 나타냈다: DMSO 비율이 60vol% 까지 증가함에 따라 FPL는 감소했고 그 이후에는 증가했다(도 4). 순수한 DMSO 내에서 FPL 는 70% 였으며, 이는 순수 PBS에서 측정한 값(55%) 보다 높았다. FPQ의 광학적 특성의 변화는 FHQ의 경우와 유사하나 다소 차이가 있었다. DMSO의 양이 증가함에 따라 흡수 및 형광 스펙트럼은 처음에는 장파장으로 이동하였으나(40-60 vol% DMSO까지) 이후에는 단파장으로 이동했다. DMSO 혼합 비율 변화에 따른 FPQ의 α 변화량은 크지 않으며, FPL는 DMSO 양이 증가함에 따라 증가했다(PBS의 FPL = 23%, 80 vol% DMSO의 63%, DMDO의 83%). 혼합된 PBS/DMSO 용액 내 고분자의 광 특성 데이터는 표 1에 요약했다. 이런 스펙트럼의 변화는 용매의 극성/편극도, 고분자 용해도, 응집(또는 불응집)의 정도, 이와 같은 현상에 기인한 고분자 3차원 구조 변화의 관점에서 이해될 수 있다. CCP는 공액 주쇄에서 기인하는 소수성과 측쇄 말미의 이온성 전해질 그룹에서 기인하는 친수성을 모두 가지고 있기 때문에 CCP의 배좌와 구조는 용매의 구성에 의해 영향을 많이 받는다. 광학적 분광 데이터는 PBS가 충분한 영역(1~40 vol% DMSO)과 DMSO가 충분한 영역(60 ~ 100 vol% DMSO)으로 두 개의 도메인을 가지고 있는 것으로 분석된다. 혼합용매 내 DMSO의 비율이 33 mol% (또는 66 vol%) 보다 낮을 경우 DMSO는 1DMSO:2H2O 복합체를 형성하는 경향이 있고, 혼합 비율이 66 vol% 이상일 때 DMSO는 용질을 용해하는 작용을 한다. 이것이 60 vol% DMSO 전후의 급격한 스펙트럼 변화에 기인할 것으로 예상된다. 이처럼 간단히 용매의 구성 성분을 조절함으로써 CCP의 광학적 특성을 제어하고, 이를 통해 형광 에너지 전달을 조절할 수 있다.
Figure 112010028761986-pat00001
에너지 공여체인 CCP 뿐만 아니라 수용체인 탐침 플루오레세인 (fluorescein)의 광학적 특성 또한 혼합된 PBS/DMSO 용매로 변화될 수 있다. 이는 이전 연구(N. Klonis, A. H. A. Clayton, E. W. Voss Jr. and W. H. Sawyer, Photochem . Photobiol . 1998, 67, 500.)의 데이터와 일치한다: 혼합용매 내 DMSO 비율이 증가할수록 흡수와 방출 스펙트럼은 장파장으로 이동했고, 형광 양자 수율은 감소했고, 몰흡광계수는 증가했다(도 5, 표 2). 수소 결합 공여체 매체의 산도(hydrogen bond donor acidity of the medium)의 관점에 있어서, 플루오레세인의 바닥 상태가 용매 분자와의 수소 결합에 의해 안정화 되는 정도는 여기 상태가 안정화 되는 정도 보다 더 크기 때문에 혼합용매에서 물의 함량이 증가할수록 흡수와 방출 스펙트럼이 단파장으로 이동하는 결과를 보인다. 물의 수소 결합 공여체 산도(~1)는 DMSO의 산도(0)보다 훨씬 높기 때문에 DMSO 비율이 증가함에 따라 스펙트럼은 장파장으로 이동한다. DMSO 비율의 증가에 따른 형광 양자 효율의 감소는 internal conversion 의 관점으로 설명될 수 있다((a) M. M. Martin, Chem . Phys . Lett . 1975, 35, 105. (b) K. Takehira, K. Suzuki, H. Hiratsuka and S. Tobita, Chem . Phys . Lett . 2005, 413, 52. (c) K. Suzuki, H. Tanabe, S. Tobita and H. Shizuka J. Phys . Chem . A 1997, 101, 4496.)(도 6참조)
Figure 112010028761986-pat00002
(1) FRET -유도된 ssDNA - Fl 방출
PBS/DMSO 혼합 용매 내에서 CCP에서 플루오레세인이 레이블된 단일 가닥의 DNA (ssDNA-Fl)로의 FRET을 조사했다. 플루오레세인은 고분자와의 스펙트럼 중첩(λPL (CCP) = ~420 nm 및 λabs (Fl) = 494.5 nm)이 우수하여 FRET 수용체로서 선택되었다. 양이온의 고분자와 음이온의 올리고뉴클레오티드 사이의 정전기적 인력에 의해 CCP/ssDNA-Fl 복합체 형성이 가능하고, 이로 인해 CCP에서 ssDNA-Fl로 에너지 전달이 용이해진다. FRET에 의해 유도된 Fl 형광은 PBS/DMSO 혼합물에 CCP를 단계적으로 추가하면서 고분자를 여기시켜 측정했다. 0 vol%와 80 vol% (DMSO 혼합 비율) 혼합 용매 안에서 측정된 FRET에 의해 유도된 형광 스펙트럼은 도 7에 묘사했다. FHQ/ssDNA-Fl의 경우, 고분자 형광(λPL = ~420 nm)과 FRET에 의해 유도된 Fl 형광(λPL = ~530 nm) 모두 PBS 용액에서 심각하게 약화되었다. 순수 PBS에서의 신호와 비교하여 DMSO 혼합 비율이 80 vol%일 때 FRET Fl 형광 신호가 증폭되는 것을 관찰하였다. FHQ/ssDNA-Fl ([+]/[-]=3.2 전하비)의 경우, 80 vol% DMSO 혼합 용매 내에서 FRET 신호는 PBS내에서의 신호보다 36.8배 높았다. FPQ로부터의 FRET에 의한 Fl 형광 또한 순수 PBS에 비해 80 vol% DMSO 혼합 용매에서 3.8 배 증폭되었다. 용매 혼합 비율의 변화에 따른 FRET 신호의 증폭은 도 8에 나타내었다. 순수 DMSO에서는 낮은 용해도 때문에 ssDNA-Fl의 고유한 형광이 약하고, 불안정적이며, 여기광에 노출된 즉시 감소하기 때문에 순수한 DMSO는 FRET Fl 신호 측정에서 제외되었다. FRET Fl 신호는 DMSO의 혼합 비율을 증가함으로써 점차적으로 향상됨을 알 수 있다. 아래식에 표현된 FRET 과정에 관련된 파라미터를 분석함으로서 형광에너지 전달에 대한 DMSO의 영향을 조사했다. FRET 속도에 관한 식은 아래에서 묘사되었다.
Figure 112010028761986-pat00003
여기서 Q D 는 FRET 수용체가 없을 때의 공여체의 형광 양자 수율, k 2 는 공여체와 수용체의 전이 쌍극자 모멘트의 상대적 배향과 관련된 것이고, 적분 부분은 공여체의 방출 스펙트럼, F D (λ)와 수용체의 몰 흡광 스펙트럼, ε A (λ) 사이의 중첩 정도를 나타내며, τ D 는 수용체가 없을 때의 공여체의 형광 평균수명, r DA 는 공여체와 수용체 사이의 분자간 거리, n은 용매의 굴절률이다.
순수 PBS와 80 vol% PBS/DMSO 혼합물에서 FRET에 영향을 끼치는 요소들을 비교해 보면, DMSO의 존재 하에 스펙트럼의 중첩 정도는 감소하고(Fl 흡수 스펙트럼이 장파장으로 이동하므로), 용매의 n은 감소한다. 이것은 FRET을 감소시킬 것이다. CCP와 ssDNA-Fl가 일정한 배향성 없이 착체를 이루므로 k 2 는 어떤 용매 조건에서든지 유사할 것으로 예상되며, DMSO 비율이 60 vol%까지 증가함에 따라 Q D 는 감소하는데 이는 FRET을 감소시키는 작용을 한다. DMSO 비율의 증가로 인해 CCP-용매 간 소수성 상호작용이 증가함에 따라 CCP-DNA 간 소수성 상호작용이 감소하고, 그로 인해 CCP/ssDNA-Fl 복합체 형성이 약해져서 공여체와 수용체 사이의 분자간 거리, r DA 는 감소될 것이다. FRET에 영향을 주는 변수의 위와 같은 변화로 인해 FRET Fl 신호는 DMSO에 의해 감소할 것으로 예상된다. 따라서 DMSO 비율의 증가에 다른 FRET 신호 향상은 FRET과 에너지 소비적인 PCT 과정 사이 경쟁의 관점에서 이해될 수 있다.
(2) CCP 의 존재 시 ssDNA - Fl 의 PL 약화( quenching )
도 7(A)에서 보듯이, FHQ (λPL = ~420 nm)와 Fl (λPL = ~530 nm)의 형광은 대부분이 억제되는데, 이와 같은 현상은 이전의 연구 결과에서도 관찰되며 이는 고분자 HOMO로부터 여기된 Fl의 HOMO로의 PCT에 기인한다고 해석되고 있다((a) H. Y. Woo, D. Vak, D. Korystov, A. Mikhailovsky, G. C. Bazan and D.-Y. Kim, Adv . Funct . Mater . 2007, 17, 290. (b)M. Kang, O. K. Nag, R. R. Nayak, S. Hwang, H. Suh and H. Y. Woo, Macromolecules 2009, 42, 2708. (c) B. Liu, B. S. Gaylord, S. Wang and G. C. Bazan, J. Am . Chem . Soc . 2003, 125, 6705. (d) J. Catala´n, C. Dı´az and F. Garcı´a-Blanco, J. Org . Chem. 2001, 66, 5846.). 추가로, 정전기적 복합체 내 Fl의 국소적인 농도가 높아짐에 따라 형광이 자가억제(self-quenching)되는 현상 또한 Fl 형광 약화에 대한 원인으로 제안된다. PBS에서와 비교하여 PBS/DMSO 혼합용매 안에서의 CCP/ssDNA-Fl의 형광 약화 특성을 조사하기 위해서, CCP/ssDNA-Fl 복합체 내에서 직접적으로 여기되는 ssDNA-Fl의 형광을 측정했고 아래식에 의한 Stern-Volmer 계수를 계산함으로써 Fl 형광 약화를 정량했다.
Figure 112010028761986-pat00004
여기서, I와 I O 는 고분자 존재시, 부재시의 ssDNA-Fl 형광 세기 이고, [Q]는 고분자의 농도이다. Stern-Volmer 계수(K SV )는 Stern-Volmer plot (I 0/I 대 [CCP])의 선형 영역을 사용하여 계산되었다.
PBS/DMSO 혼합 용매에 ssDNA-Fl ([ssDNA-Fl] = 2.5 × 10-8 M)을 용해시킨 뒤 고분자를 [FHQ] = 2.5 × 10-8 M에서 1.0 × 10-7 M,로 [FPQ] = 5.0 × 10-8 M에서 2.0 × 10-7 M로 단계적으로 증가시키면서 형광 스펙트럼을 측정하였다. [+]/[-]의 전하비는 단계별로 고분자를 증가시킴에 따라 0.2 씩 증가 했다. PBS/DMSO 혼합물에서의 Fl의 λ abs에 해당하는 여기광을 이용하여 형광 스펙트럼을 얻었다.
도 9는 PBS/DMSO 혼합 용매 안에서 FHQ와 FPQ와 착체를 이룬 ssDNA-Fl의 Ksv의 값을 나타낸다. Ksv의 값은 DMSO 양이 증가할수록 감소하는 경향을 나타낸다: 0, 20, 40, 60 및 80 vol% DMSO 혼합용매에서 FHQ/ssDNA-Fl의 Ksv 값은 각각 4.2 × 106 M-1, 4.0 × 106 M-1 , 3.2 × 106 M-1, 2.3 × 106 M-1 및 1.1 × 106 M-1 로 측정되었다. 0, 20, 40, 60 및 80 vol% DMSO 혼합용매에서 FPQ/ssDNA-Fl의 Ksv 값은 각각 3.3 × 106 M-1, 2.9 × 106 M-1, 2.1 × 106 M-1, 1.2 × 106 M-1, 5.6 × 105 M- 1 이다. 이와 같은 형광 약화에 있어 고려되어야 할 중요한 요소는 PCT이다. Ksv 값으로부터 DMSO는 고분자에서 Fl로의 전자 전이를 감소시키는 것으로 기대된다. 전자 전이에 관한 정량적 이론인 유전체 연속체 모델에 따르면 PCT 과정에서 전하 재분배가 수반되다. 이런 전자 전이에 요구된 에너지, 즉 재조직 에너지(λ 0)는 공여체와 수용체 사이의 분자간 거리에 밀접하게 연관된다(k PCT ∝ 1/r DA ). CCP는 소수성 주쇄와 알킬그룹을, ssDNA-Fl은 소수성 염기 유닛을 가지고 있기 때문에 CCP와 ssDNA-Fl사이의 소수성 상호인력은 수용성 용액에서 CCP/ssDNA-Fl 복합체의 형성에 있어 중요하다. DMSO의 존재 하에서는 DMSO와 CCP(또는 DNA) 사이의 강한 인력 때문에 CCP와 ssDNA-Fl사이의 소수성 상호작용이 감소된다. 따라서 PBS에 DMSO가 혼합됨에 따라 CCP와 ssDNA-Fl의 복합체 형성이 느슨해지고, 분자 간 거리가 증가된다. 이렇게 증가된 공여체와 수용체 사이의 분자간 거리는 PCT 약화를 감소시킨다. 이에 더하여, DMSO 혼합 비율이 증가함에 따라 복합체 내에서 단위 부피당 Fl의 농도가 감소하여 자가형광억제가 줄어드는 것 또한 DMSO에 의해 감소되는 K SV 결과와 일치한다.
(3) ssDNA - Fl 에서 국소적 환경의 변화 ( Microenvironmental changes around ssDNA-Fl)
CCP와의 복합체 형성 전후, ssDNA-Fl의 형광 스펙트럼의 이동은 Fl 주변 환경의 변화를 나타내면서 r DA 와 연관된 중요한 정보를 제공한다(도 10). DMSO의 혼합 비율이 증가할수록 CCP와의 복합체를 형성함에 따른 스펙트럼 이동이 줄어들었고, 이는 DMSO에 의해 ssDNA-Fl 주위의 국소적인 환경 변화가 줄어듦을 의미한다. 이것은 혼합 용매 내 DMSO 비율이 증가함에 따라 CCP와 ssDNA-Fl 간 소수성 상호작용이 줄어들어 이들의 복합체 형성이 약해지기 때문이라고 해석될 수 있다.
(4) 시간에 따른 분해된 PL 소멸의 측정 ( Time - resolved PL decay measurement )
CCP/ssDNA-Fl 복합체에서의 Fl 형광 약화 과정을 조사하기 위해 시간에 따른 Fl 형광 감쇠를 측정하였다. 고분자가 과다하게 존재하는 조건에서 TCSPC (time-correlated single photon counting)를 사용함으로써 ssDNA-Fl의 형광 감쇠를 시간에 따라 분해하였다(표 3). pH 8의 물 내에서 ssDNA-Fl는 고분자가 존재하지 않을 때 τ = 4 ns 로 측정되었고, 이것은 이전의 보고된 데이터와 일치했다((a) M. Go¨tz, S. Hess, G. Beste, A. Skerra and M. E. Michel-Beyerle, Biochemistry 2002, 41, 4156. (b) R. R. Nayak, O. K. Nag, H. Y. Woo, S. Hwang, D. Vak, D. Korystov, Y. Jin and H. Suh, Curr . Appl . Phys . 2009, 9, 636.). 여기된 상태의 Fl은 고분자(FHQ 또는 FPQ)가 존재할 때 더 빠르게 소멸되는 것으로 보이고, 이것은 정류 상태 (steady-state)의 값과 일치한다. ssDNA-Fl의 형광 평균수명의 감소는 근처 고분자로부터 여기 상태의 Fl로의 전자 전이를 통한 빠른 비발광 소멸 경로(nonradiative decay pathways)의 존재의 관점에서 이해될 수 있다. Fl로의 전자 전이는 고분자와 Fl의 HOMO와 LUMO의 에너지 레벨의 배열 때문에 열역학적으로 유리하다. 측정은 여러 조성 비율의 PBS/DMSO 혼합 용매에 고분자가 과다하게 존재하는 조건([ssDNA-Fl] = 2.5 × 10-8 M, [FHQ] = 4.0 × 10-7 M 또는 [FPQ] = 8.0 × 10-7 M, 전하비 [+]/[-] = 3.2)을 형성하여 측정하였다. 이는 모든 ssDNA-Fl이 CCP와 복합체를 형성할 수 있도록 하기 위함이다. CCP와 복합체를 이룬 ssDNA-Fl의 형광 평균수명은 혼합 용매 내에서 DMSO의 vol% 증가에 따라 점차적으로 감소하는 것으로 측정되었다(도 11). 형광 감쇠는 약 2개의 지수적 감쇠 함수의 조합으로 나타내었다(표 3).
Figure 112010028761986-pat00005
표 3은 FHQ/ssDNA-Fl안에서 Fl의 time-resolved PL spectroscopy 요약을 나타내고, <τ>는(A 1 τ 1 2+A 2 τ 2 2)/(A 1 τ 1+A 2 τ 2)이다. A 1와 A 2는 진폭이고, τ 1과 τ 2는 각각 FHQ 존재 시 ssDNA-Fl의 첫 번째와 두 번째 형광 감쇠 모드의 평균수명이다.
CCP/ssDNA-Fl 내에서 ssDNA-Fl의 형광 평균수명은 DMSO 양이 증가함에 따라 증가하는 경향이 있다(도 11과 표3). 이것은 DMSO의 첨가에 따라 PCT와 같은 비복사성 감쇠 과정이 줄어듦을 의미한다. 이는 증가된 용매-용질의 소수성 상호작용 때문에 공여체와 수용체의 분자 사이가 더욱 분리된다는 관점에서 해석될 수 있다. 여러 조성의 PBS/DMSO 혼합용매 안에서 고분자 부재시의 ssDNA-Fl 형광 수명은 변화되지 않는다. 따라서 DMSO 혼합 비율 증가에 따른 CCP/ssDNA-Fl 복합체 내 Fl의 형광 평균수명 증가는 DMSO가 CCP와 ssDNA-Fl 사이의 결합을 약화시킴으로써 PCT에 의한 형광 억제 현상을 감소시킨다는 것을 지지할 수 있다.
(5) 탐침 PNA 을 사용하여 DNA 탐지
DNA 탐지는 플루오레세인이 레이블된 단일 가닥 탐침 펩타이드 핵산 (ssPNA-Fl, 탐침 PNA, N-TTAA TCGA GTTA CCGC AATC)에 상보적이거나(ssDNAc, 5'-GATT GCGG TAAC TCGA TTAA-3) 비상보적인(ssDNANC, 5'-GCAT GAAG TTAC TGAA TCCG) 단일 가닥 DNA를 사용하여 실행되었다. DNA 감지 원리는 CCP에서 ssPNA-Fl로의 FRET를 이용한다. 양이온의 CCP와 혼성된 이중 가닥 DNA (음이온의 전하를 띈 ssPNA-Fl/ssDNAc 이중 가닥)가 정전기적 복합체를 형성함에 따라 이들이 서로 근접해 지고, CCP에서 ssPNA-Fl로의 FRET이 일어남에 따라 특정 염기서열의 타겟 DNA를 감지할 수 있게 된다. 이러한 탐지 방법을 통해 DNA 염기 서열의 상보성에 대한 선택도를 조사하기에 앞서, ssPNA-Fl의 고유의 형광에 대한 용매의 효과를 조사하였다. DMSO 양이 증가함에 따라 ssPAN-Fl의 형광 세기는 증가하는데, 이것은 ssDNA-Fl의 경우와는 달리 PNA는 중성의 펩타이드 주쇄에 의해 DNA보다 훨씬 더 소수성을 띄므로 DMSO가 ssPNA-Fl의 용해도를 강화시키기 때문으로 예상된다. 이처럼 PBS/DMSO 혼합 용매 내에서 ssPAN-Fl의 고유한 형광이 강화되는 것은 DMSO에 의한 에너지 전달 강화에 더하여 FRET 신호를 향상시키는 역할을 할 수 있다.
FRET에 의해 유도된 형광 스펙트럼은 PBS/DMSO 혼합 용매에 ssPNA-Fl ([ssPNA-Fl] = 2.5 × 10-8 M)과 ssDNAC ([ssDNAC] = 2.5 × 10-8 M)를 넣고 이들을 열처리를 통해 혼성화한 뒤, 여기에 고분자([FHQ] = 3.0 × 10-7 M 또는 [FPQ] = 5.0 × 10-7 M)를 넣고 380 nm의 광으로 여기시킴으로서 측정되었다. 도 12를 보면, DMSO 첨가로 인해 CCP/ssPNA-Fl/ssDNAc에서의 FRET Fl 신호는 CCP/ssDNA-Fl의 경우와 유사하게 향상되는 것을 확인하였다. 이러한 감지 시스템의 염기 서열 상보성에 대한 선택도를 강조하기 위해 FRET에 의해 유도된 형광 스펙트럼은 고분자의 형광을 기준으로 규격화(normalization) 하였다. CCP/ssDNA-Fl의 경우와 비교해 보면, CCP/ssPNA-Fl/ssDNAc로부터 FRET 신호는 더 낮은 DMSO 혼합 비율(40 vol%)로 된 혼합 용매 안에서 최대화 된다. CCP/ssDNA-Fl의 경우에는 80 vol% DMSO 용액에서 최대의 FRET 신호 증폭을 얻었다. 음이온의 DNA와 DMSO에 비해 중성의 PNA와 DMSO 간 소수성 용질-용매 상호 작용은 더 민감하기 때문에 CCP와 ssDNA-Fl과 비교했을 때 CCP와 ssPNA-Fl/ssDNAC의 소수성 상호 작용은 DMSO에 의해 더욱 감소할 것이다. 이 같은 용질-용매 간 상호 작용의 차이는 정전기적 복합체의 미세 구조에 영향을 주어 에너지 전달 현상에 영향을 끼칠 것이다. 비상보적 DNA (ssDNANC)의 경우 FRET Fl 신호는 DMSO 혼합 비율이 60 vol%로 증가할 때 까지는 관찰되지 않았다. 이는 탐침 PNA와 ssDNANC 사이의 혼성화가 이루어지지 않아서 에너지 전달에 필요한 CCP, ssPNA-Fl 간 정전기적 복합체 형성이 가능하지 않기 때문이다. 80 vol% DMSO 혼합 용매 안에서 FHQ/ssPNA-Fl/ssDNANC 의 경우 FRET 신호는 관찰되어 이 혼합 용매에서는 염기서열에 대한 선택성이 부재함을 관찰하였다(도 12C). FPQ/ssPNA-Fl/ssDNANC에서도 유사한 경향이 관찰되었다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

  1. 형광 수용체로서 핵산에 결합된 형광분자 및 형광 공여체로서 양이온 공액 고분자를 포함하고, 60~80vol%의 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 포함하는 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산은 단일가닥 DNA 또는 단일가닥 PNA인 것을 특징으로 하는 FRET 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 형광분자는 형광 염료, 반도체 나노크리스탈, 란탄화물 킬레이트 및 녹색 형광 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 FRET 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 형광 염료는 플루오레세인(fluoresein)인 것을 특징으로 하는 FRET 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 양이온 공액 고분자는 폴리플루오렌 코폴리머인 것을 특징으로 하는 FRET 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 폴리플루오렌 코폴리머는 폴리(9,9’-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌-알트-1,4-(2,5-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실옥시)페닐렌))테트라브로마이드 또는 폴리(9,9’-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌-알트-페닐렌)다이브로마이드인 것을 특징으로 하는 FRET 방법.
  7. 삭제
  8. 형광 수용체로서 핵산에 결합된 형광분자 및 형광 공여체로서 양이온 공액 고분자를 포함하고, 60~80vol%의 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 포함하는 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 FRET(fluorescence resonance energy transfer)방법을 이용한 핵산 검출 방법.
  9. 삭제
KR1020100041739A 2010-05-04 2010-05-04 Ｄｍｓｏ 용매를 이용한 ｆｒｅｔ 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법 KR101238378B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100041739A KR101238378B1 (ko) 2010-05-04 2010-05-04 Ｄｍｓｏ 용매를 이용한 ｆｒｅｔ 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100041739A KR101238378B1 (ko) 2010-05-04 2010-05-04 Ｄｍｓｏ 용매를 이용한 ｆｒｅｔ 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110122316A KR20110122316A (ko) 2011-11-10
KR101238378B1 true KR101238378B1 (ko) 2013-02-28

Family

ID=45392866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100041739A KR101238378B1 (ko) 2010-05-04 2010-05-04 Ｄｍｓｏ 용매를 이용한 ｆｒｅｔ 시스템 및 이를 이용한 핵산 검출 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101238378B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102866139B (zh) * 2012-09-21 2014-08-06 南开大学 基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法
KR20180136436A (ko) 2016-03-28 2018-12-24 에이에이티 바이오퀘스트, 인코포레이티드 폴리플루오레노[4,5-cde]옥세핀 접합체 및 피분석물 검출 방법에서의 이의 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chem Asian J, Vol. 2, No. 4, pp. 499-504 (2007.04.02.) *
J Phys Chem B, Vol. 113, No. 17, pp. 5788-5793 (2009.04.30.) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110122316A (ko) 2011-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shamsipur et al. Facile preparation and characterization of new green emitting carbon dots for sensitive and selective off/on detection of Fe3+ ion and ascorbic acid in water and urine samples and intracellular imaging in living cells
Tuncel et al. Conjugated polymer nanoparticles
Wu et al. Energy transfer in a nanoscale multichromophoric system: fluorescent dye-doped conjugated polymer nanoparticles
Pu et al. Conjugated Polyelectrolytes as Light‐Up Macromolecular Probes for Heparin Sensing
Huang et al. Synthesis and properties of a novel water-soluble anionic polyfluorenes for highly sensitive biosensors
Uchiyama et al. Environment‐sensitive fluorophores with benzothiadiazole and benzoselenadiazole structures as candidate components of a fluorescent polymeric thermometer
Gao et al. Copper (II)-mediated fluorescence of lanthanide coordination polymers doped with carbon dots for ratiometric detection of hydrogen sulfide
KR101572901B1 (ko) 2-단계 fret를 이용한 공액고분자 전해질 및 압타머 프로브 기반 표적 물질의 검출 방법 및 형광 센서
Yang et al. Hydrophobic-sheath segregated macromolecular fluorophores: colloidal nanoparticles of polycaprolactone-grafted conjugated polymers with bright far-red/near-infrared emission for biological imaging
KR101041446B1 (ko) 공액고분자 2단계 ｆｒｅｔ 시스템 및 바이오센서
Barik et al. A fluorescent all-fluorene polyazomethine—towards soluble conjugated polymers exhibiting high fluorescence and electrochromic properties
Bao et al. Conjugated polymers containing a 2, 2′-biimidazole moiety—a novel fluorescent sensing platform
US20130164531A1 (en) High-Density Fluorescent Dye Clusters
Liu et al. 2, 6-Substituted pyridine derivative-containing conjugated polymers: synthesis, photoluminescence and ion-sensing properties
Staneva et al. Studying pH dependence of the photophysical properties of a blue emitting fluorescent PAMAM dendrimer and evaluation of its sensor potential
Qian et al. Simultaneous detection of multiple DNA targets by integrating dual‐color graphene quantum dot nanoprobes and carbon nanotubes
KR101312354B1 (ko) 양이온성 공액 고분자 전해질 기반 표적 물질 검출 방법
Sun et al. Fluorescence turn-on detection of DNA based on the aggregation-induced emission of conjugated poly (pyridinium salt) s
Wang et al. Synthesis of an amphiphilic copolymer bearing rhodamine moieties and its self-assembly into micelles as chemosensors for Fe3+ in aqueous solution
Xu et al. Fluorescent detection of heparin by a cationic conjugated polyfluorene probe containing aggregation-induced emission units
NamáChan Highly emissive and biocompatible dopamine-derived oligomers as fluorescent probes for chemical detection and targeted bioimaging
An et al. A new FRET-based ratiometric probe for fluorescence and colorimetric analyses of adenosine 5′-triphosphate
Ding et al. Off–on phosphorescence assay of heparin via gold nanoclusters modulated with protamine
Li et al. Tetraphenylethene decorated hyperbranched poly (amido amine) s as metal/organic-solvent-free turn-on AIE probe for specific pyrophosphate detection
Geng et al. Graphene oxide enhanced fluorescence of conjugated polyelectrolytes with intramolecular charge transfer characteristics

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160203

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee