KR101215740B1 - 가변적 접선류 여과 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 접선류 여과에 의해 면역글로불린 용액을 농축시키는 방법에 관한 것으로, 이때 막투과압 및 직교류는 가변적이다.
Description
본 발명은 단백질 농축 분야에 관한 것으로, 보다 정확하게는 면역글로불린 농축을 위한 접선류 여과(TFF)의 용도에 관한 것이다.
단백질 및 특히 면역글로불린은 오늘날 의학 포르토폴리오에서 중요한 역할을 한다. 재조합 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 문헌[Marino, M.H., Biopharm. 2 (1989) 18-33], [Goeddel, D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7] 및 [Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159]에 기재되어 있다. 약학적 용도로 사용하기 위한 폴리펩티드는 주로 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, BHK 세포, PER.C6® 세포 등에서 생산된다.
인간에 적용하기 위한, 모든 약학 물질은 특정 기준을 충족시켜야 한다. 인간에 대한 생약학(biopharmaceutical) 제제의 안전성을 보증하기 위해, 예컨대 심각한 위해를 일으키는 핵산, 바이러스 및 숙주 세포 단백질은 제거되어야 한다. 규제 조건을 충족시키기 위해, 하나 이상의 정제 단계가 제조 공정에 수반되어야 한다. 특히, 순도, 처리량 및 수율은 적절한 정제 공정을 결정하는데 중요한 역할을 한다.
화학적 및 물리적 성질, 예컨대 분자량 및 2차 개질을 포함하는 도메인 구조 때문에, 면역글로불린의 다운스트림 처리는 매우 복잡하다. 예컨대, 다운스트림 처리(DSP)에서 배합된 약물뿐만 아니라 중간체에서도 농축 용액은 경제적 관리 및 제품 저장(application storage)을 위해 적은 부피를 성취하는 것이 필요하다. 또한, 짧은 농축 시간은 원활한 공정 및 짧은 작업 시간을 구현하는데 바람직하다. 본원에서 특히 최종 정제 단계 후의 불완전한 TFF 공정은 약물 제품에도 영향을 미치는 지속적 손상을 일으킬 수 있다. 모노클로날 항체(mAb) 중간체 용액에서의 접선류 농축 공정에서의 전단 응력과 응집 사이의 상호관계는 문헌[Ahere, K., et al. (J Membr. Sci. 274 (2006) 108-115)]에서 조사되었다. 공정 성능 및 응집 상태에 대한 농축 시간, 선택된 유동 및 압력의 영향은 모니터링되었다(예컨대 문헌[Dosmar, M., et al., Bioprocess Int. 3 (2005) 40-50] 및 [Luo, R., et al., Bioprocess Int. 4 (2006) 44-46] 참조).
문헌[Mahler, H.-C., et al. (Eur. J. Pahrmaceut. Biopharmaceut. 59 (2005) 407-417)]은 상이한 교반 응력 방법에 의해 형성된 액체 IgG1-항체 배합물에서의 응집체의 도입 및 분석을 기재하고 있다. US 6,252,055에 농축된 모노클로날 항체 제제가 보고되어 있다. 농축된 항체 제제의 제조 방법이 US 2006/0182740에 기재되어 있다. 한외여과, 투석여과 및 제 2 한외여과 순서를 포함하는 조합 공정은 US 2006/0051347에 기재되어 있다. EP 0 907 378에는 250 ml/분의 고정된 재순환 속도를 사용하는 직교류 한외여과를 이용하여 항체 제제를 농축시키는 방법이 기재되어 있다. 접선류 여과 방법 및 이를 위한 장치는 US 2004/0167320에 기재되어 있다. WO 97/45140에는 농축된 항체 용액이 기재되어 있다.
본 발명은 재조합식으로 생산된 면역글로불린을 함유하는 용액의 농축 방법을 제공한다.
보다 상세하게, 본 발명의 한 양태는 접선류 여과에 의해 면역글로불린 용액을 농축하는 방법으로서, 이때, 적용되는 막투과압(transmembrane pressure) 및 직교류(cross-flow)가,
a) 농축되는 용액 1 ml 당 30 mg 이하의 면역글로불린 농도 범위에서 1.4 bar 내지 1.6 bar의 막투과압 및 75 ml/분 내지 90 ml/분의 직교류,
b) 15 mg/ml 내지 55 mg/ml의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 140 ml/분 내지 160 ml/분의 직교류, 및
c) 45 mg/ml 초과의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 120 ml/분 내지 140 ml/분의 직교류
로 가변적이다.
하나의 실시양태에서, 상기 단계 c)에서의 농도 범위는 50 mg/ml 내지 275 mg/ml이다. 바람직한 실시양태에서, 단계 c)에서의 농도 범위는 50 mg/ml 내지 180 mg/ml이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 단계 c)에서의 농도 범위는 50 mg/ml 내지 130 mg/ml이다. 다른 실시양태에서, 상기 막투과압 및 직교류는, 단계 a)에서 1.5 bar 및 80 ml/분, 단계 b)에서 0.85 bar 및 150 ml/분, 및/또는 단계 c)에서 0.85 bar 및 130 ml/분이다. 다른 실시양태에서, 상기 면역글로불린 용액은 완충된 면역글로불린 수용액이다.
본 발명의 다른 양태는,
a) 이종(heterologous) 면역글로불린을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 포유류 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 이종 면역글로불린의 발현에 적합한 조건 하에 상기 단계 a)의 세포를 배양시키는 단계;
c) 상기 재조합 포유류 세포 또는 배양 배지로부터 상기 이종 면역글로불린을 회수하는 단계; 및
d) 상기 이종 면역글로불린을 포함하는 수득된 완충된 수용액을 가변적인 막투과압 및 직교류에 의한 접선류 여과를 이용하여 농축시키는 단계
를 상기의 순서로 포함하는, 이종 면역글로불린을 생산하는 방법이다.
하나의 실시양태에서, 상기 방법의 단계 d)는,
i) 농축되는 용액 1 ml 당 30 mg 이하의 면역글로불린 농도 범위에서 1.4 bar 내지 1.6 bar의 막투과압 및 75 ml/분 내지 90 ml/분의 직교류,
ii) 15 mg/ml 내지 55 mg/ml의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 140 ml/분 내지 160 ml/분의 직교류, 및
iii) 45 mg/ml 초과의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 120 ml/분 내지 140 ml/분의 직교류
로 가변적인 막투과압 및 직교류에 의한 접선류 여과를 이용하여 상기 수득된 완충된 수용액을 농축시키는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 상기 방법은, 단계 d) 이전 또는 이후에
e) 상기 이종 면역글로불린을 함유하는 완충된 수용액을 정제하는 단계
를 포함한다.
다른 실시양태에서, 상기 이종 면역글로불린은 온전한(complete) 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 접합체(conjugate)이다. 하나의 실시양태에서, 상기 포유류 세포는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포 또는 PER.C6® 세포이다.
도 1은 90 ml/분의 불변적(constant) CF 하에 여러 가지의 불변적 Δp 모드 및 농축법에서의 막의 플러싱 이전의 항-IL-IR 항체 용액의 플럭스 대 단백질 농도를 도시한다. 1: 불변적 방법 Δp = 1.2 bar, 2: 불변적 방법 Δp = 1.8 bar, 3: 불변적 방법 Δp = 3.0 bar, 4: 불변적 방법 CF 90 ml/분.
도 2는 불변적 방법을 이용한 항-IL-IR 항체 용액의 농축 전 및 후의 입자의 수를 도시한다. 1: 농축 전, 2: τw=216, 3: τw=324, 4: τw=541.
도 3은 여러 가지 방법에 의한 농축 전 및 후의 항-IL-IR 항체 용액의 입자의 수를 도시한다. 1: 농축 전, 2: 본 발명에 따른 가변적 방법, 3: 불변적 방법 CF 90 ml/분.
도 4는 항-IL-IR 항체 용액의 플럭스 대 단백질 농도를 도시한다. 1: 불변적 방법 CF 90 ml/분, 2: τw=541, 3: 본 발명에 따른 가변적 방법.
도 5는 50 ml/분(●), 80 ml/분(▲), 및 130 ml/분(■)의 직교류에 대한 5.3 mg/ml의 단백질 농도에서의 항-IL-IR 항체 용액의 막투과 플럭스 대 막투과압을 도시한다.
도 6은 80 ml/분(●), 130 ml/분(▲), 및 150 ml/분(■)의 직교류에 대한 45 mg/ml의 단백질 농도에서의 항-IL-IR 항체 용액의 막투과 플럭스 대 막투과압을 도시한다.
도 7은 50 ml/분(●), 80 ml/분(▲), 및 130 ml/분(■)의 직교류에 대한 90 mg/ml의 단백질 농도에서의 항-IL-IR 항체 용액의 막투과 플럭스 대 막투과압을 도시한다.
도 8은 50 ml/분(●), 80 ml/분(▲), 및 130 ml/분(■)의 직교류에 대한 180 mg/ml의 단백질 농도에서의 항-IL-IR 항체 용액의 막투과 플럭스 대 막투과압을 도시한다.
도 9는 여러 가지 방법에 의해 수득된 시트레이트 완충액 중 항-IL-IR 항체 용액의 농축물의 입자 분석도이다. 1. 농축 전, 2: 본 발명에 따른 가변적 방법, 3: 불변적 방법 CF 90 ml/분, 4: 불변적 방법 Δp = 1.8 bar, 5: 불변적 방법 Δp = 3.0 bar.
도 10은 여러 가지 방법에 의해 수득된 시트레이트 완충액 중 항-IL-IR 항체 용액의 농축물의 동적 광산란 분석도이다. ◆: 농축 전, ■: 본 발명에 따른 가변적 방법, ▲: 불변적 방법 CF 90 ml/분, ●: 불변적 방법 Δp = 1.8 bar.
도 11은 여러 가지 방법에 의해 수득된 시트레이트 완충액 중 항-IL-IR 항체 용액의 농축물의 탁도 측정값을 도시한다. 1. 농축 전, 2: 본 발명에 따른 가변적 방법, 3: 불변적 방법 CF 90 ml/분, 4: 불변적 방법 Δp = 1.8 bar, 5: 불변적 방법 Δp = 3.0 bar.
도 12는 본 발명에 따른 방법 및 여러 가지 완충액을 사용한 불변적 방법에 의해 수득된 시트레이트 완충액 중 항-IL-IR 항체 용액의 농축물의 탁도 측정값을 도시한다. 1. 시트레이트 완충액에서의 농축 전, 2: 시트레이트 완충액을 사용한 본 발명에 따른 가변적 방법, 3: 시트레이트 완충액을 사용한 불변적 방법 Δp = 3.0 bar, 4: 히스티딘 완충액에서의 농축 전, 5: 히스티딘 완충액을 사용한 본 발명에 따른 가변적 방법, 6: 히스티딘 완충액을 사용한 불변적 방법 Δp = 3.0 bar.
도 13은 여러 가지 방법에 의해 및 여러 가지 완충액에서 수득된 농축물의 동적 광산란 분석도이다. a) 시트레이트 완충액 중 항-IL-IR 항체(◆: 농축 전, ■: 본 발명에 따른 가변적 방법에 의한 농축 이후, ▲: 불변적 방법 Δp = 1.8 bar), b) 히스티딘 완충액 중 항-IL-IR 항체(◆: 농축 전, ■: 본 발명에 따른 가변적 방법에 의한 농축 이후, ▲: 불변적 방법 Δp = 3.0 bar).
도 14는 히스티딘 완충액 중 항-P-셀렉틴 항체의 농축의 탁도 측정(a) 및 동적 광산란 분석(b) 결과를 나타낸다. 1: 농축 전(◆), 2: 본 발명에 따른 가변적 방법(■), 3: 불변적 방법 Δp = 3.0 bar(▲).
도 15는 농축된 면역글로불린 용액의 여과능에 대한 농축 모드의 효과를 도시한다.
도 2는 불변적 방법을 이용한 항-IL-IR 항체 용액의 농축 전 및 후의 입자의 수를 도시한다. 1: 농축 전, 2: τw=216, 3: τw=324, 4: τw=541.
도 3은 여러 가지 방법에 의한 농축 전 및 후의 항-IL-IR 항체 용액의 입자의 수를 도시한다. 1: 농축 전, 2: 본 발명에 따른 가변적 방법, 3: 불변적 방법 CF 90 ml/분.
도 4는 항-IL-IR 항체 용액의 플럭스 대 단백질 농도를 도시한다. 1: 불변적 방법 CF 90 ml/분, 2: τw=541, 3: 본 발명에 따른 가변적 방법.
도 5는 50 ml/분(●), 80 ml/분(▲), 및 130 ml/분(■)의 직교류에 대한 5.3 mg/ml의 단백질 농도에서의 항-IL-IR 항체 용액의 막투과 플럭스 대 막투과압을 도시한다.
도 6은 80 ml/분(●), 130 ml/분(▲), 및 150 ml/분(■)의 직교류에 대한 45 mg/ml의 단백질 농도에서의 항-IL-IR 항체 용액의 막투과 플럭스 대 막투과압을 도시한다.
도 7은 50 ml/분(●), 80 ml/분(▲), 및 130 ml/분(■)의 직교류에 대한 90 mg/ml의 단백질 농도에서의 항-IL-IR 항체 용액의 막투과 플럭스 대 막투과압을 도시한다.
도 8은 50 ml/분(●), 80 ml/분(▲), 및 130 ml/분(■)의 직교류에 대한 180 mg/ml의 단백질 농도에서의 항-IL-IR 항체 용액의 막투과 플럭스 대 막투과압을 도시한다.
도 9는 여러 가지 방법에 의해 수득된 시트레이트 완충액 중 항-IL-IR 항체 용액의 농축물의 입자 분석도이다. 1. 농축 전, 2: 본 발명에 따른 가변적 방법, 3: 불변적 방법 CF 90 ml/분, 4: 불변적 방법 Δp = 1.8 bar, 5: 불변적 방법 Δp = 3.0 bar.
도 10은 여러 가지 방법에 의해 수득된 시트레이트 완충액 중 항-IL-IR 항체 용액의 농축물의 동적 광산란 분석도이다. ◆: 농축 전, ■: 본 발명에 따른 가변적 방법, ▲: 불변적 방법 CF 90 ml/분, ●: 불변적 방법 Δp = 1.8 bar.
도 11은 여러 가지 방법에 의해 수득된 시트레이트 완충액 중 항-IL-IR 항체 용액의 농축물의 탁도 측정값을 도시한다. 1. 농축 전, 2: 본 발명에 따른 가변적 방법, 3: 불변적 방법 CF 90 ml/분, 4: 불변적 방법 Δp = 1.8 bar, 5: 불변적 방법 Δp = 3.0 bar.
도 12는 본 발명에 따른 방법 및 여러 가지 완충액을 사용한 불변적 방법에 의해 수득된 시트레이트 완충액 중 항-IL-IR 항체 용액의 농축물의 탁도 측정값을 도시한다. 1. 시트레이트 완충액에서의 농축 전, 2: 시트레이트 완충액을 사용한 본 발명에 따른 가변적 방법, 3: 시트레이트 완충액을 사용한 불변적 방법 Δp = 3.0 bar, 4: 히스티딘 완충액에서의 농축 전, 5: 히스티딘 완충액을 사용한 본 발명에 따른 가변적 방법, 6: 히스티딘 완충액을 사용한 불변적 방법 Δp = 3.0 bar.
도 13은 여러 가지 방법에 의해 및 여러 가지 완충액에서 수득된 농축물의 동적 광산란 분석도이다. a) 시트레이트 완충액 중 항-IL-IR 항체(◆: 농축 전, ■: 본 발명에 따른 가변적 방법에 의한 농축 이후, ▲: 불변적 방법 Δp = 1.8 bar), b) 히스티딘 완충액 중 항-IL-IR 항체(◆: 농축 전, ■: 본 발명에 따른 가변적 방법에 의한 농축 이후, ▲: 불변적 방법 Δp = 3.0 bar).
도 14는 히스티딘 완충액 중 항-P-셀렉틴 항체의 농축의 탁도 측정(a) 및 동적 광산란 분석(b) 결과를 나타낸다. 1: 농축 전(◆), 2: 본 발명에 따른 가변적 방법(■), 3: 불변적 방법 Δp = 3.0 bar(▲).
도 15는 농축된 면역글로불린 용액의 여과능에 대한 농축 모드의 효과를 도시한다.
본 발명은 100 mg/ml 초과의 농도로 면역글로불린 용액을 농축시키는 방법을 보고한다. 놀랍게도 이는 본 발명에 따른 방법에 의해 낮은 응집체 형성으로 짧은 시간 내에 성취될 수 있음이 밝혀졌다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "접선류 여과" 또는 "TFF"는, 농축되는 폴리펩티드 함유 용액이 여과 막의 표면을 따라(즉, 접선 방향으로) 유동하는 여과 방법을 의미한다. 상기 여과 막은 특정의 컷 오프(cut off) 값을 갖는 공극 크기를 갖는다. 하나의 실시양태에서, 상기 컷 오프 값은 20 kDa 내지 50 kDa의 범위, 바람직하게는 30 kDa이다. 이런 여과 방법은 한외여과 방법의 한 종류이다. 용어 "직교류(cross-flow)"는, 막에 대해 접선 방향인 농축되는 상기 용액의 유동(잔류물 유동)을 의미한다. 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있는 용어 "플럭스" 또는 "투과물 유동(flow)"은 막을 횡단하는, 즉 막의 공극을 통한 유체의 유동을 의미한다. 즉, 이는 막을 통한 여과물의 유동의 부피 속도를 의미한다. 상기 유동은 보통 리터/m2/h(LMH)로서 단위 시간 당 단위 막 면적 당 부피로 주어진다. 하나의 실시양태에서, 상기 직교류는 0.02 m2의 막 면적에 대한 ml/분 단위의 직교류인 것을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 상기 직교류는 개별 단계에서 240 l/m2/h, 450 l/m2/h, 및 390 l/m2/h이다. 투과물은 농축되는 용액의 용매 및 사용된 막의 컷 오프 값 미만의 분자량을 갖는 분자를 포함하지만, 이종 면역글로불린은 포함하지 않는다. 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있는 용어 "막투과압(transmembrane pressure)" 또는 "TMP"는 여과 막의 공극을 통해 용매 및 여과 막의 컷 오프 값보다 작은 성분을 이동시키기 위해 적용되는 압력을 의미한다. 막투과압은 주입구, 배출구 및 투과물의 평균 압력이며, 하기 식으로 계산될 수 있다.
용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 암호화된 1종 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 의미한다. 알려진 면역글로불린 유전자는 상이한 불변 영역 유전자뿐만 아니라 수 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 면역글로불린은 예컨대 Fv, Fab, 및 F(ab)2 뿐만 아니라 단일 쇄(scFv) 또는 다이아바디(diabody)를 비롯한 다양한 포맷으로 존재할 수 있다(예컨대 문헌[Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883], [Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426], 일반적으로는 [Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984)], 및 [Hunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16)]).
용어 "온전한(complete) 면역글로불린"은 2개의 소위 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드(경쇄) 및 2개의 소위 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드(중쇄)를 포함하는 면역글로불린을 의미한다. 온전한 면역글로불린의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 각각은 항원과 상호작용할 수 있는 결합 영역을 포함하는 가변 도메인(가변 영역)(일반적으로 폴리펩티드 쇄의 아미노 말단부)을 함유한다. 온전한 면역글로불린의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 각각은 또한 불변 영역(일반적으로 카복실 말단부)을 함유한다. 중쇄의 불변 영역은 항체가 i) Fc 감마 수용체(FcγR)를 함유하는 세포, 예컨대 포식 세포, 또는 ii) 신생(neonatal) Fc 수용체(FcRn)(또한 브람벨 수용체로서 알려짐)를 함유하는 세포와의 결합을 매개한다. 또한, 이는 전통적 보체계(complement system) 예컨대 성분(C1q)의 인자를 비롯한 일부 인자들과의 결합을 매개한다. 다음 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 상이한 절편(segment), 즉 4개의 골격부(FR) 및 3개의 고변이 영역(CDR)을 포함한다.
용어 "면역글로불린 단편(fragment)"은 중쇄의 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지(hinge)-영역, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인, 경쇄의 가변 도메인 또는 CL 도메인 중 하나 이상의 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 또한 이들의 유도체 및 변이체도 포함된다. 예컨대, 1종 이상의 아미노 산 또는 아미노산 영역이 소실된 가변 도메인도 존재할 수 있다.
용어 "면역글로불린 접합체(conjugate)"는 추가 폴리펩티드에 펩티드 결합을 통해 접합된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 추가 폴리펩티드는 비-면역글로불린 펩티드 예컨대 호르몬, 성장 수용제, 안티퓨조제닉(antifusogenic) 펩티드, 보체 인자 등이 있다.
일반적 크로마토그래피 방법 및 이들의 사용은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대 문헌[Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed.), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)], [Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)], [Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991)], [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)], [Sambrook, J., et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989], 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York]를 참조한다.
재조합식으로 생산된 이종 면역글로불린의 정제를 위해, 종종 상이한 컬럼 크로마토그래피 단계들의 조합이 이용된다. 일반적으로 단백질 A 친화 크로마토그래피 후에 1 또는 2개의 추가 분리 단계를 수행한다. 최종 정제 단계는 예컨대 응집된 면역글로불린, 잔류 HCP(숙주 세포 단백질), DNA(숙주 세포 핵산), 바이러스 또는 내독소와 같은 미량의 불순물 및 오염원의 제거를 위한 소위 "폴리싱(polishing) 단계"이다. 이런 폴리싱 단계에서 종종 플로-쓰루(flow-through) 방식에서 음이온 교환 물질이 사용된다.
단백질 회수 및 정제를 위한 여러가지 방법들, 예컨대 미생물 단백질을 사용한 친화도 크로마토그래피(예: 단백질 A 또는 단백질 G 친화도 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예: 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합식 교환), 티오필릭(thiophilic) 흡착(예: 베타-머캅토에탄올 및 기타 SH 리간드), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예: 페닐-세팔로즈, 아자-아레노필릭 수지 또는 m-아미노페닐보론산), 금속 킬레이트 친화도 크로마토그래피(예: Ni(II)- 및 Cu(II)-친화도 물질), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동법(예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동)은 잘 정립되어 있고, 널리 사용되고 있다(문헌[Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1988) 93-102]).
용어 "이종(heterologous) 면역글로불린"은 포유류 세포에 의해 천연적으로 생산되지 않은 면역글로불린을 가리킨다. 본 발명의 방법에 따라 생산된 면역글로불린은 재조합 기법에 의해 생산된다. 이런 방법은 당업계에 널리 알려져 있고, 진핵 세포에서의 단백질 발현, 이어서 이종 면역글로불린의 회수 및 단리, 및 통상적으로 약학적으로 허용가능한 순도로의 정제를 포함한다. 면역글로불린의 생산, 즉 발현에서, 경쇄를 암호화하는 핵산 및 중쇄를 암호화하는 핵산은 표준 방법에 의해 발현 카세트로 각각 삽입된다. 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산은 통상의 절차를 이용하여 용이하게 단리 및 시퀀싱된다. 하이브리도마(hybridoma) 세포는 이런 핵산의 공급원으로서 역할을 할 수 있다. 상기 발현 카세트는 발현 플라스미드로 삽입될 수 있고, 그 후, 트랜스펙션 되지 않으면 면역글로불린을 생산하지 않는 숙주 세포로 트랜스펙션될 수 있다. 발현은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 수행되고, 면역글로불린은 용해(lysis) 후에 세포로부터 또는 배양물 상청액으로부터 회수된다.
본원 내에서 사용된 용어 "면역글로불린 용액"은 온전한 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 접합체를 함유하는 완충된 수용액을 의미한다. 이 용액은 예컨대 배양물 상청액, 컬럼 크로마토그래피 용리액 또는 폴리싱된 면역글로불린 용액일 수 있다.
"이종 DNA" 또는 "이종 폴리펩티드"는 소정의 숙주 세포 내에 천연적으로 존재하지 않는 DNA 분자 또는 폴리펩티드, 또는 DNA 분자의 집단 또는 폴리펩티드의 집단을 의미한다. 특정 숙주 세포에 대해 이종인 DNA 분자는, 숙주 DNA가 비-숙주 DNA(즉, 외인성 DNA)와 조합되는 한, 숙주 세포 종으로부터 유도된 DNA(즉, 내인성 DNA)를 함유할 수 있다. 예컨대, 프로모터를 포함하는 숙주 DNA 절편에 구동적으로(operably) 링크된 폴리펩티드를 암호화하는 비-숙주 DNA 절편을 함유하는 DNA 분자는 이종 DNA 분자인 것으로 고려된다. 역으로, 외인성 DNA 분자는 외인성 프로모터와 구동적으로 링크된 내인성 구조 유전자를 포함할 수 있다. 비-숙주 DNA 분자에 의해 암호화된 펩티드 또는 폴리펩티드는 "이종" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
"이종 면역글로불린의 발현에 적합한 조건 하에"라는 표현은 면역글로불린을 발현하는 포유류 세포의 배양에 사용되며 당업자에게 공지되어 있거나 이들이 용이하게 결정할 수 있는 조건을 의미한다. 또한, 이런 조건은 배양되는 포유류 세포의 유형 및 발현되는 면역글로불린의 유형에 좌우되어 변할 수 있음이 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 포유류 세포는 20℃ 내지 40℃의 온도에서 면역글로불린의 효과적 단백질 생산을 가능케 하는데 충분한 시간, 예컨대 4 내지 28일 동안 배양된다.
용어 "재조합 포유류 세포"는 핵산, 예컨대 이종 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 도입/트랜스펙션될 수 있거나, 도입/트랜스펙션되는 세포를 의미한다. 용어 "세포"는 핵산의 발현을 위해 사용되는 세포를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 포유류 세포는 CHO 세포(예: CHO K1, CHO DG44), BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK 293 세포, HEK 293 EBNA 세포 또는 PER.C6® 세포 또는 COS 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 포유류 세포는 CHO 세포, BHK 세포, HEK 세포, Sp2/0 세포 또는 PER.C6® 세포이다. 본원에 사용된 "세포"라는 표현은 대상(subject) 세포 및 그의 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "재조합 세포"는 전달 횟수(number of transfer)와 관계없이 이들로부터 유도된 자손을 비롯한 1차 트랜스펙션된 세포 및 배양물을 포함한다. 또한 계획적 또는 우연적 돌연변이 때문에, DNA 내용물에서 정확하게 일치하지 않을 수도 있음이 이해된다. 최초로 형질전환된 세포와 동일한 기능 또는 생물학적 활성를 갖는 변이 자손도 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "완충된"은 산성 또는 염기성 물질의 첨가 또는 방출에 의해 pH의 변화가 완충 물질에 의해 수평화된 용액을 의미한다. 이런 효과를 발휘하는 임의의 완충 물질이 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 완충 물질, 예컨대 인산 또는 그의 염, 아세트산 또는 그의 염, 시트르산 또는 그의 염, 모폴린 또는 그의 염, 2-(N-모폴리노) 에탄설폰산 또는 그의 염, 히스티딘 또는 그의 염, 글라이신 또는 그의 염, 또는 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄(TRIS) 또는 그의 염이 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 완충 물질은 인산 또는 그의 염, 아세트산 또는 그의 염, 시트르산 또는 그의 염, 또는 히스티딘 또는 그의 염이다. 임의로, 완충 물질은 추가의 염, 예컨대 염화나트륨 및/또는 황산나트륨 및/또는 염화칼륨 및/또는 황산칼륨 및/또는 나트륨 시트레이트 및/또는 칼륨 시트레이트를 포함할 수도 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 완충된 수용액의 pH 값은 pH 3.0 내지 pH 10.0, 바람직하게는 pH 3.0 내지 pH 7.0, 보다 바람직하게는 pH 4.0 내지 pH 6.0, 가장 바람직하게는 pH 4.5 내지 pH 5.5이다.
이제, 여과 공정 동안 막투과압 및 직교류가 가변적이고 농축되는 용액 중의 면역글로불린의 실제 농도에 따라 적합화된 본 발명에 따른 접선류 여과(TFF) 방법에 의해, 응집체가 적게 형성되는 농축된 면역글로불린 용액이 단 시간 내에 수득될 수 있음이 놀랍게도 밝혀졌다. 다시 말하면, 본 발명에 따른 TFF 방법(즉, 여과 공정 동안 막투과압이 변하고, 항체 용액의 실제 농도에 따라 적합화되는 방법)이 적용되는 경우 접선류 여과 동안 응집체 형성이 적게 된다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 본 발명에 따른 방법은 당업계에 공지된 불변적 방법(즉, 여과 공정 이전에 막투과압이 채택되고, 전체 접선류 여과 공정 동안 일정하게 유지되는 방법)과 비교되는 가변적 방법이다.
본 발명은 접선류 여과에 의해 면역글로불린 용액을 농축하는 방법을 포함하며, 이때, 적용되는 막투과압 및 직교류가 여과 공정 동안 농축되는 면역글로불린 용액 중의 면역글로불린의 농도에 따라 가변적이고 변화됨으로써, 이에 따라
a) 농축되는 용액 1 ml 당 30 mg 이하의 면역글로불린 농도 범위에서 1.4 bar 내지 1.6 bar의 막투과압 및 75 ml/분 내지 90 ml/분의 직교류가 적용되고,
b) 15 mg/ml 내지 55 mg/ml의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 140 ml/분 내지 160 ml/분의 직교류가 적용되고,
c) 45 mg/ml 초과의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 120 ml/분 내지 140 ml/분의 직교류가 적용된다.
TFF에서의 전단 응력과 응집 형성 사이에 상관관계가 존재한다. 그 효과를 평가하기 위해, 사용된 막의 표면에서의 유동-유발된 전단 응력(τw)은 문헌[Gerhart, et al. (Fundamentals of Fluid Mechanics, Addison-Wesley Publishing Company (1993))] 및 [Cheryan, et al. (Ultrafiltration and Microfiltration Handbook, second edition CRC Press LLC (1998))]에 기초한 하기 식을 사용하여 계산된다.
상기 식에서, dH는 수력학적(hydraulic) 직경이고, a는 폭이고, b는 높이이고, L은 유동 채널의 길이이다. 또한, Δp=pi-po(이때 pi는 적용된 주입구 압력이고, p0은 배출구 압력이다). 하나의 예로서, 30 kDa의 공칭 분자량 컷 오프 및 0.02 m2의 막 면적을 갖는, 재생 셀룰로스로 이루어진 하이드로사르트(Hydrosart)TM 막(독일 괴팅겐 소재의 사르토리우스 아게의 사르토콘 슬라이스 200 하이드로사르트TM)이 사용된다. 사용된 막 카세트에서, 1.08 mm의 수력학적 직경이 계산되었다. 상기 막은 먼저 표준 TFF 법으로, 즉 농축 공정 동안 막투과압 및 직교류의 변화 없이 구동되었다. 사전 설정된 불변적 Δp 및 0.6 bar의 사전 설정된 불변적 막투과압(TMP)을 갖는 3종의 상이한 불변적 방법을 분석하였다.
표 1: 적용된 압력 차 및 상응하는 전단 응력의 개관
플럭스 대 상승하는 단백질 농도의 관찰에 의하면, 여러 가지 Δp에서의 방법들에 대한 곡선에서의 유의적인 차이가 없다. 그러나, 3 bar 모드에서, 높은 주입구 압력에 기인한 보다 낮은 종말 농도가 관찰되었다. 보다 낮은 불변적 직교류(CF: 90 ml/분) 및 보다 낮은 평균 Δp(약 0.9 bar) 하에서 수행된 농축 모드와 비교 시에, 1.2 내지 1.8 bar의 보다 높은 Δp는 시간에 대해 개선된 플럭스 성능 및 보다 높은 종말 농도에 기여한다(TMP는 항상 0.6 bar이다).
농축 공정 전 및 후의 탁도, 광 엄폐도(light obscuration)(LO) 및 동적 광산란(DLS) 데이터를 비교하면, 증가된 응집체 형성이 증가된 전단 응력과 함께 관찰되었다(도 2).
TFT 방법은 TMP/CF-스카우팅(scouting) 실험에 기반한 스트레싱 고(high) 주입구 압력 모드(Δp = 3 bar)와 비교 시 대등한 전체 공정 시간으로 개발되어졌다(문헌[Luo, R., et al., Bioprocess Int. 4 (2006) 44-54] 참조). 본 발명에 따른 방법은 감소된 면역글로불린 형성과 함께 시간에 대한 플럭스 성능을 개선하기 위해, 즉 적은 응집체 형성 및 짧은 전체 농축 시간을 조합하기 위해 개발되었다. 본 발명에 따른 방법의 개발 동안 TMP 및 CF 스카우팅은 농축되는 면역글로불린 용액 중의 유효(prevailing) 면역글로불린 농도에 의존하여 수행되었다. 주어진 농도에서의 가장 우수한 플럭스 프로파일에 따라 적합화된 TMP 및 CF를 이용한 방법이 밝혀졌다. 농축의 최종 단계에서의 고 주입구 압력의 불이익(문헌[Dosmar, M., et al., Bioprocess Int. 3 (2005) 40-50] 참조) 없이 본 발명에 따른 방법은 생성된 농축물에 대한 탁도, LO 및 DLS 데이터에서 낮은 응집체 부담(burden)을 보였다(도 3 및 4 참조). 또한, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 보다 높은 종말 농도를 성취하였다.
본 발명에 따른 방법에서, 막투과압 및 직교류는 농축되는 면역글로불린 용액의 실제 농도에 대하여 변한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 가변적 접선류 여과법으로서, 이때 농축되는 용액 중의 면역글로불린의 실제 농도에 의해 적용되는 막투과압 및 직교류가 결정된다. 따라서, 막투과압 및 직교류는, 적용되는 응력을 감소시키고 이에 따라 응집된 면역글로불린 분자의 형성을 감소시키고 짧은 전체 농축 시간을 제공하기 위해 면역글로불린의 실제 농도에 따라 조정된다.
본 발명에 따른 방법에서, 3가지의 농도 범위가 정의된다. 농축되는 용액의 제 1 실제 농도 범위는 0 mg/ml 내지 30 mg/ml이고, 제 2 실제 농도 범위는 15 mg/ml 내지 55 mg/ml이고, 제 3 실제 농도 범위는 45 mg/ml 내지 180 mg/ml이다. 전술된 바와 같이, 이들 농도 범위는 중복되는 범위가 있다. 15 mg/ml 내지 30 mg/ml 및 45 mg/ml 내지 55 mg/ml의 중복 농도 범위에서는 막투과압 및 직교류에 대한 여러 가지 값이 본 발명에 따른 방법에서 이용될 수 있다. 이들 중복 농도 범위에서, 두 가지 TMP 및 CF 설정들 중 임의의 것을 응집체 형성 또는 공정 시간에 감지가능한 효과를 미치지 않으면서 적용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법의 하나의 실시양태에서, a) 내지 b)의 조건 및 b) 내지 c) 조건은 중복 농도 범위에서 임의의 농도 값으로 변할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 단계 c)의 농도 범위는 50 mg/ml 내지 275 mg/ml이다. 다른 실시양태에서, 막투과압 및 직교류는 단계 a)에서 1.5 bar 및 80 ml/분, 단계 b)에서 0.85 bar 및 150 ml/분, 및/또는 단계 c)에서 0.85 bar 및 130 ml/분이다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 용액은 완충된 면역글로불린 수용액이다. 하나의 실시양태에서, 농도 범위는 a) 단계에서 5 내지 25 mg/ml, b) 단계에서 25 내지 50 mg/ml, 및 c) 단계에서 50 내지 140 mg/ml이다.
본 발명의 다른 양태는 하기 단계들을 하기 순서로 포함하는 이종 면역글로불린을 생산하는 방법이다:
a) 이종 면역글로불린을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 포유류 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 이종 면역글로불린의 발현에 적합한 조건 하에 상기 세포를 배양시키는 단계;
c) 상기 재조합 포유류 세포 또는 배양 배지로부터 상기 이종 면역글로불린을 회수하는 단계; 및
d) 상기 이종 면역글로불린을 포함하는 수득된 완충된 수용액을 가변적이고 면역글로불린 농도 의존성 막투과압 및 직교류에 의한 접선류 여과를 이용하여 농축시키는 단계.
본 발명에 따른 생산 방법의 하나의 실시양태에서, 상기 단계 d)가 상기 수득된 완충된 수용액을,
i) 농축되는 용액 1 ml 당 30 mg 이하의 면역글로불린 농도 범위에서 1.4 bar 내지 1.6 bar의 막투과압 및 75 ml/분 내지 90 ml/분의 직교류,
ii) 15 mg/ml 내지 55 mg/ml의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 140 ml/분 내지 160 ml/분의 직교류, 및
iii) 45 mg/ml 초과의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 120 ml/분 내지 140 ml/분의 직교류
로 가변적이고 면역글로불린 농도 의존성 막투과압 및 직교류에 의한 접선류 여과를 이용하여 농축시키는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 상기 방법은 단계 d) 이전 또는 이후에, e) 상기 이종 면역글로불린을 함유하는 완충된 수용액을 정제하는 단계를 포함한다.
단계 e)의 정제는 여러 가지 방법 및 기법, 예컨대 크로마토그래피 단계, 상이한 또는 유사한 크로마토그래피 단계들의 조합, 탈염, 한외여과, 투석여과, 동결건조, 완충액 변화, 또는 이들의 조합 등에 의해 수행된다.
다른 실시양태에서, 상기 이종 면역글로불린은 온전한 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 접합체이다. 하나의 실시양태에서, 상기 포유류 세포는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, 또는 PER.C6® 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 포유류 세포는 CHO 세포, BHK 세포, HEK 세포, Sp2/0 세포 또는 PER.C6® 세포이다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 개시된다. 본 발명의 정신으로부터 벗어남이 없이 개시된 절차에서 변형이 가해질 수 있음을 이해할 것이다.
항-IL-IR 항체(예컨대 WO 2005/023872 참조) 및 항-P-셀렉틴 항체(예컨대 WO 2005/100402 참조)는 본 발명의 시점에서 당사 연구실에서 충분한 양으로 입수가능하였으며, 그러므로 본 발명은 이들 2종의 면역글로불린으로 예시된다. 이런 예시된 기재는 예로서만 사용도고, 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
[실시예]
실시예 1
분석 방법
a) 탁도 측정
광도측정에 의한 흡광도를, 항체 용액 중에서 흡수되는 내인성 발색단이 없는 350 nm 및 550 nm에서 결정하였다(UV-VIS 분광계 에볼루션(Evolution) 500, 미국 월텀 소재의 써모 피셔 사이언티픽). 샘플은 비희석 상태로 측정되었다. 기준 배지로서 적절한 완충 용액이 사용되었다. 매 측정은 3회 수행되었다.
b) 크기-배제-HPLC
크로마토그래피를 ASI-100 HPLC 시스템(독일 이드스타인 소재의 디오넥스)에서 토소 하스(Tosoh Haas) TSK 3000 SWXL 컬럼을 사용하여 수행하였다. 용리 피크를 280 nm에서 UV 다이오드 어레이 검출기(디오넥스)로써 모니터링하였다. 농축된 샘플을 1 mg/ml로 용해한 후, 200 mM 칼륨 다이하이드로겐 포스페이트 및 250 mM 칼륨 클로라이드로 이루어진 pH 7.0 완충액으로 안정한 바셀린이 성취될 때까지 컬럼을 세척하였다. 분석 수행은, 실온에서 30분에 걸쳐 0.5 ml/분의 유속을 이용하여 아이소크래틱(isocratic) 조건 하에 실행되었다. 크로마토그램은 크로멜레온(독일 이드스타인 소재의 디오넥스)으로 수동으로 적분되었다. 응집율(%)은 단량체 피크의 AUC와 고분자량 형태의 곡선 하부 면적(AUC)을 비교함으로써 결정되었다.
c) 광 엄폐도(light obscuration)
1 내지 200 ㎛ 범위의 입자 부담(burden)을 모니터링하기 위해 SVSS-C 입자 분석지가 사용되었다(독일 루테스하임 소재의 PAMAS 파르티켈메스- 운트 아날리세시스테메). 상기 시스템은 근-모노사이즈 폴리스티렌 구를 사용하여 미국 약전 Vol. 24, <788>의 요건에 따라 보정하였다. 0.5 ml의 예비-플러싱(pre-flushing) 부피를 가진 0.5 ml의 부피를 3회 측정하였다. 결과를 평균값으로 계산하고, 1.0 ml의 샘플 부피를 기준으로 하였다. 계수된 입자들의 수는 센서의 농도 한계치 내에 있었다.
d) 동적 광산란법(DLS)
DLS는 전형적으로 서브-미크론 크기 범위의 입자 크기를 측정하는 비-침입성 기법이다. 본 발명에서, 1 nm 내지 6 ㎛ 크기 범위를 모니터링하기 위해 온도 제어 수정 큐빗(25℃)이 구비된 제타사이저 나노 S 기기(맬버른 인스트루먼츠, 영국 워세스터셔)가 사용되었다. 산란된 레이저 백(back) 라이트의 강도는 173°의 각에서 검출되었다. 강도는 입자 확산 속도에 좌우되는 속도로 변동하며, 그 후 입자 크기에 의해 영향을 받는다. 그러므로, 입자 크기 데이터는 산란광 강도의 변동의 분석으로부터 생성될 수 있다(문헌[Dahneke, B.E. (ed), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983)], 및 [Pecora, R., Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press (1985)]). 강도에 의한 크기 분포는 DTS 소프트웨어(맬버른)의 다중 협소(multiple narrow) 모드를 이용하여 계산하였다. 실험은 비희석된 샘플을 사용하여 수행되었다.
e) 퓨리에-변환 적외선 분광법
열전쌍에 연결된 플로-쓰루(flow-through) 전달 셀(아쿠아스펙)이 구비된 텐서 27 분광계(독일 에트링겐 소재의 브루커 옵틱)를 사용하여 비희석된 단백질 용액의 FT-IR 스펙트럼을 기록하였다. 각 스펙트럼에서, 단일-빔 모드에서 4 cm-1 해상도로 120-스캔 인터페로그램(interferogram)을 수집하였다. 기준 배지로서, 적절한 투과물(permeate)이 사용되었다. 수집된 단백질 및 완충액 계의 인터페로그램을 퓨리에 변환시켰다. 또한, 단백질은 스펙트럼을 상응하는 완충액 계의 스펙트럼에 대해서 보정하였다.
실시예
2
TMP 및 CF 조건의 결정
컨디셔닝 및 여과된 시트레이트-완충된 항-IL-IR 항체의 수용액을, 30 kDa의 공칭 분자량 컷-오프 및 0.02 m2의 막 면적을 갖는 재생 셀룰로스로 된 하이드로사르트TM 막을 갖는 스케일링 가능한(scaleable) 평판 카세트(독일 괴팅겐 소재의 사르토리우스)를 사용하는, 자동화된 TFF 시스템 AKTA크로스플로우TM(스웨덴 웁살라 아머샴 바이오사이언스 AB 소재의 GE 헬스케어)를 사용함으로써 100 mg/ml까지 20배로 농축시켰다. AKTA크로스플로우TM을 제어하는 유니콘 소프트웨어에 의해 생성되는 여러 가지 농도 프로그램을 수행하였다. 총 막 부하는 약 400 g/m2였다.
4개의 사전 설정된 막투과압에서의 플럭스 및 압력 프로파일은 여러 가지 직교류에 대해 농축되는 면역글로불린 용액 중 여러 가지 면역글로불린 농도에서 결정된다. TMP는 0.3 bar, 0.5 bar, 0.9 bar 또는 2.0 bar로 설정되었다. 각 TMP 및 단백질 농도에 대한 직교류는 50 ml/분, 80 ml/분, 130 ml/분(45 mg/ml 단백질 농도에서는 제외) 및 150 ml/분(45 mg/ml 단백질 농도에서만)이었다. 여러 가지 단백질 농도는 5.3 mg/ml, 45 mg/ml, 90 mg/ml 및 180 mg/ml이었다. 그 결과는 도 5 내지 8에 도시되어 있다.
높은 공급물 플럭스 및 높은 공급물 압력이 우수한 막투과 플럭스를 제공함이 농축 공정 동안 확인되었다. 그러나 농축 공정 동안, 특히 후기에, 분극(polarization) 층이 만들어져서 막 과압(overpressure) 및 감소된 (투과물) 플럭스를 생성한다. 증가된 공급물 압력은 보다 높은 플럭스 및 그에 따른 신속한 농축 공정을 제공하지만, 이런 가속화는 증가된 응집체 형성을 수반함이 또한 확인되었다(도 9 내지 11).
이를 고려할 때, 개선된 면역글로불린 농축 방법을 위한 범위 및 조건은 하기와 같이 밝혀졌다:
농축되는 용액 1 ml 당 30 mg 이하의 면역글로불린 농도 범위에서 1.4 bar 내지 1.6 bar의 막투과압 및 75 ml/분 내지 90 ml/분의 직교류,
15 mg/ml 내지 55 mg/ml의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 140 ml/분 내지 160 ml/분의 직교류, 및
45 mg/ml 초과의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 120 ml/분 내지 140 ml/분의 직교류.
이들 파라미터는 감소된 응집체 형성 및 짧은 농축 시간을 성취하는 방법을 제공한다.
실시예 3
본 발명에 따른 가변적 방법과 불변적 방법의 비교
본 발명에 따른 방법을 농축된 면역글로불린 용액의 제조를 위한 여러 가지 불변적 파라미터의 방법과 비교하였다. 목표 농도를 90 mg/ml로 설정하였다. 실시예 2에 따른 장치를 사용하여 접선류 여과를 수행하였다. 비교되는 방법들(방법 1 내지 4는 불변적 방법이고, 방법 5는 본 발명에 따른 가변적 방법이다)의 여러 가지 파라미터는 다음과 같다:
방법 1:
막투과압 = 0.6 bar
직교류 = 90 ml/분
Δp = 0.7 bar
방법 2:
막투과압 = 0.6 bar
Δp = 1.2 bar
방법 3:
막투과압 = 0.6 bar
Δp = 1.8 bar
방법 4:
막투과압 = 0.6 bar
Δp = 3.0 bar
방법 5:
a) 막투과압 = 1.5 bar, Δp = 0.5 bar,
b) 막투과압 = 0.85 bar, Δp = 1.2 bar,
a) 막투과압 = 0.85 bar.
여러 가지 파라미터 및 90 mg/ml의 면역글로불린 농도로 면역글로불린 용액을 농축시키는데 필요한 시간이 표 2에 기재되어 있다.
표 2: 여러 가지 농축 방법에 대한 파라미터의 비교
여러 가지 방법의 결과로부터, 방법 2 내지 4와 비교 시에 방법 5(즉, 가변적 방법)의 경우 상당히 감소된 응집체 형성이 성취될 수 있고, 따라서 개선된 성질을 갖는 면역글로불린 농축물이 수득될 수 있다. 방법 1과 비교 시에 보다 신속한 농축 방법을 성취할 수 있다.
실시예 4
여러 가지 완충액 계 중의 항-IL-IR 항체의 농도
시트레이트 완충액 또는 히스티딘 완충액을 사용한 항-IL-IR 항체 수용액 완충액의 비교용 농축을 실시예 2의 장치 및 본 발명의 방법(실시예 3의 방법 5)을 이용하여 수행하였다. 결과는 도 12 및 13에 도시되어 있다. 도 12 및 13 각각으로부터, 사용되는 완충액은 본 발명의 농축 방법에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
실시예 5
항-P-셀렉틴 항체의 농축
실시예 2의 방법에 따라 항-P-셀렉틴 항체의 농축을 수행하고, 결과를 도 14에 도시한다.
실시예 6
농축된 용액의 여과
실시예 2의 방법에 따라 수득된 농축 용액을, 접선류 여과 후에 듀라포어(Durapore)(PVDF, 독일 쉬발바흐 소재의 밀리포어 게엠베하) 막(4.52 cm2 필터 면적)을 통해 0.75 bar의 압력으로써 여과하였다.
고도로 농축된 면역글로불린 용액의 여과능은 사용된 농축 방법에 의존하는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 가변적 방법에 의해 수득된 농축 면역글로불린 용액은 다른 고정식 방법과 비교 시에 여과 유동에서의 감소된 저하(decline)를 보이는 것이 밝혀졌다.
Claims (20)
- 접선류 여과에 의해 면역글로불린 용액을 농축하는 방법으로서,
이때, 막투과압(transmembrane pressure) 및 직교류(cross-flow)가,
i) 농축되는 용액 1 ml 당 30 mg 이하의 면역글로불린 농도 범위에서 1.4 bar 내지 1.6 bar의 막투과압 및 75 ml/분 내지 90 ml/분의 직교류,
ii) 15 mg/ml 내지 55 mg/ml의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 140 ml/분 내지 160 ml/분의 직교류, 및
iii) 45 mg/ml 초과의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 120 ml/분 내지 140 ml/분의 직교류
로 가변적이며, 중복되는 농도 범위의 임의의 농도 값에서 변할 수 있는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 iii)에서의 농도 범위가 45 mg/ml 내지 130 mg/ml인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 막투과압 및 직교류가
i)에서 1.5 bar 및 80 ml/분,
ii)에서 0.85 bar 및 150 ml/분, 및
iii)에서 0.85 bar 및 130 ml/분
중 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법. - a) 이종(heterologous) 면역글로불린을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 포유류 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 이종 면역글로불린의 발현에 적합한 조건 하에 상기 세포를 배양시키는 단계;
c) 상기 재조합 포유류 세포 또는 배양 배지로부터 상기 이종 면역글로불린을 회수하는 단계; 및
d) 상기 이종 면역글로불린을 포함하는 수득된 완충된 수용액을 가변적인 막투과압 및 직교류에 의한 접선류 여과를 이용하여 농축시키는 단계
를 포함하고,
상기 단계 d)가, 상기 수득된 완충된 수용액을
i) 농축되는 용액 1 ml 당 30 mg 이하의 면역글로불린 농도 범위에서 1.4 bar 내지 1.6 bar의 막투과압 및 75 ml/분 내지 90 ml/분의 직교류,
ii) 15 mg/ml 내지 55 mg/ml의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 140 ml/분 내지 160 ml/분의 직교류, 및
iii) 45 mg/ml 초과의 농도 범위에서 0.8 bar 내지 0.9 bar의 막투과압 및 120 ml/분 내지 140 ml/분의 직교류
로 가변적이며, 중복되는 농도 범위의 임의의 농도 값에서 변할 수 있는 막투과압 및 직교류에 의한 접선류 여과를 이용하여 농축시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는,
이종 면역글로불린을 생산하는 방법. - 삭제
- 제 4 항에 있어서,
상기 방법이 단계 d) 이전 또는 이후에,
e) 상기 이종 면역글로불린을 함유하는 완충된 수용액을 정제하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 면역글로불린이 온전한(complete) 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 접합체(conjugate)인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 포유류 세포가 CHO 세포, BHK 세포, HEK 세포, Sp2/0 세포 또는 PER.C6® 세포인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 접선류 여과가 20 내지 50 kDa 분자량의 범위의 컷오프(cut off) 값을 갖는 막을 사용하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 면역글로불린 용액이 pH 3.0 내지 pH 10.0의 pH 값을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 10 항에 있어서,
상기 pH 값이 pH 3.0 내지 pH 7.0의 범위인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 방법이, 농축되는 용액 중의 면역글로불린의 실제 농도가 적용되는 막투과압 및 직교류를 결정하는 가변적 접선류 여과법인 것을 특징으로 하는, 방법. - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 농도 범위가, i)에서 5 내지 25 mg/ml, ii)에서 25 내지 50 mg/ml, 및 iii)에서 50 내지 140 mg/ml인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 이종 면역글로불린이 온전한 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 접합체인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 접선류 여과가 20 내지 50 kDa 분자량의 범위의 컷오프 값을 갖는 막을 사용하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 면역글로불린 용액이 pH 3.0 내지 pH 10.0의 pH 값을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 방법이, 농축되는 용액 중의 면역글로불린의 실제 농도가 적용되는 막투과압 및 직교류를 결정하는 가변적 접선류 여과법인 것을 특징으로 하는, 방법. - 삭제
- 제 4 항에 있어서,
상기 농도 범위가, i)에서 5 내지 25 mg/ml, ii)에서 25 내지 50 mg/ml, 및 iii)에서 50 내지 140 mg/ml인 것을 특징으로 하는, 방법.
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