KR101215284B1 - PKC activation as a means for enhancing sAPPα secretion and improving cognition using bryostatin type compounds - Google Patents

Abstract

본 발명은 α-세크레타제를 조절하고/하거나 인지능력을 개선시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 질환에 걸린 개체, 특히 알쯔하이머병 환자에서 개선된/증진된 인지능력, 및 증가된 sAPP 생산을 통한 질환의 치료에 관한 것이다. 거대환 락톤(즉, 브리오스타틴류 및 네리스타틴류)는 본 발명의 조성물과 함께 사용하기에 바람직한 화합물이다. 본 발명은 유효량의 단백질 키나제 C(PKC) 활성화제(들)을 투여함으로써 PKC를 활성화시킴을 포함하여, 비-아밀로이드형성성 가용성 APP의 생성을 증가시키는 방법을 또한 제공한다.The present invention relates to compositions and methods for modulating α-secretase and / or improving cognition. The invention further relates to the treatment of diseases through improved / enhanced cognitive abilities, and increased sAPP production in individuals with disease, in particular Alzheimer's disease patients. Macrocyclic lactones (ie bryostatins and neristatins) are preferred compounds for use with the compositions of the present invention. The present invention also provides a method of increasing the production of non-amyloidogenic soluble APP, including activating PKC by administering an effective amount of protein kinase C (PKC) activator (s).

Description

브리오스타틴형 화합물을 사용한 ｓＡＰＰα 분비의 증진 및 인지 개선을 위한 수단으로서의 ＰＫＣ 활성화{PKC activation as a means for enhancing sAPPα secretion and improving cognition using bryostatin type compounds}PKC activation as a means for enhancing sAPPα secretion and improving cognition using bryostatin type compounds}

본 발명은 α-세크레타제의 조절 및 인지 증진에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 알쯔하이머병과 같은 아밀로이드 프로세싱과 관련된 상태의 치료를 위한 화합물 및 이러한 상태의 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to the regulation and cognitive enhancement of α-secretase. The invention further relates to compounds for the treatment of conditions associated with amyloid processing such as Alzheimer's disease and compositions for the treatment of such conditions.

인지에 영향을 미치는 각종 장애 및 질환이 존재한다. 인지는 일반적으로 다음과 같은 적어도 3가지의 상이한 요소를 포함하는 것으로 기술될 수 있다: 주의력, 학습력 및 기억력. 이러한 각각의 요소 및 이의 개별적 수준은 피험자의 전반적 인지능력 수준에 영향을 미친다. 예를 들어, 알쯔하이머병 환자는 전반적 인지 상실 및 이로 인한 각각의 상기 특징의 악화로 고통을 받으며, 이 질환과 흔히 동반되는 것은 기억 상실이다. 다른 질환에서, 환자는 인지의 다른 특징들과 보다 주로 관련되는 인지 손상으로 고통받는다. 예를 들어, 주의력 결핍성 과잉행동 장애(ADHD)는 주의력이 있는 상태를 유지하는 개체의 능력에 촛점을 맞춘 것이다. 기타 상태에는 기타 신경계 질환, 노화 및 암 치료와 같이 정신 능력에 유해한 효과를 유발할 수 있는 상태의 치료와 관련되는 일반적 치매, 졸중/허혈 및 정신 지체가 포함된다.There are a variety of disorders and diseases that affect cognition. Cognition can generally be described as including at least three different elements: attention, learning and memory. Each of these factors and their individual levels affect the subject's overall level of cognition. For example, Alzheimer's disease patients suffer from general cognitive loss and the resulting aggravation of each of these features, which is often associated with memory loss. In other diseases, patients suffer from cognitive impairment, which is more often associated with other features of cognition. Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), for example, focuses on an individual's ability to remain alert. Other conditions include general dementia, stroke / ischemia, and mental retardation associated with the treatment of conditions that may cause deleterious effects on mental abilities, such as other neurological diseases, aging, and cancer treatment.

인지 장애는 오늘날의 사화에서 다양한 문제를 유발한다. 따라서, 과학자들은 인지 증진제 또는 인지 활성화제를 개발하고자 노력하여 왔다. 개발된 인지 증진제 또는 활성화제는 일반적으로 누트로픽(nootropic), 혈관확장제, 대사 증진제, 정신자극제, 콜린작용성 제제, 생체 아민 약물 및 신경펩타이드를 포함하도록 분류된다. 혈관확장제 및 대사 증진제(예: 디하이드로에르고톡신)은 대뇌 혈관 결찰-허혈에 의해 유도된 인지 장애에서 주로 효과적이지만, 이들은 임상적 용도와 다른 유형의 인지 장애에서는 효능이 없다. 개발된 인지 증진제 중에서, 전형적으로 대사성 약물만이 임상적 용도로 사용되며, 나머지는 여전히 조사 단계에 있다. 누트로픽 중에서, 예를 들어, 피라세탐은 말초 내분비계를 활성화시키는데, 이는 환자에서 생산된 고농도의 스테로이드로 인해 알쯔하이머병에 적절하지 않은 것이며, 콜린작동성 제제인 타크린은 구토, 설사 및 간독성을 포함하는 다양한 부작용을 갖고 있다.Cognitive impairment causes a variety of problems in today's culture. Therefore, scientists have been trying to develop cognitive enhancers or cognitive activators. The developed cognitive enhancers or activators are generally classified to include nootropics, vasodilators, metabolic enhancers, psychostimulants, cholinergic agents, bio amine drugs and neuropeptides. Vasodilators and metabolic enhancers (eg, dihydroergotoxins) are primarily effective in cognitive disorders induced by cerebral vascular ligation-ischemia, but they are ineffective in clinical uses and other types of cognitive disorders. Of the cognitive enhancers developed, typically only metabolic drugs are used for clinical use, with the remainder still under investigation. Among nootropics, for example, piracetam activates the peripheral endocrine system, which is unsuitable for Alzheimer's disease due to the high concentrations of steroids produced in patients, and the cholinergic agent tacrine prevents vomiting, diarrhea and hepatotoxicity. It has a variety of side effects, including.

질병이 걸린 개체의 인지능력을 개선시키는 방법은 다양한 연구의 대상이 되어 왔다. 최근에는 알쯔하이머병과 관련된 인지 상태 및 환자의 기억력을 개선시키는 상이한 방법이 각종 접근법 및 전략의 대상이 되고 있다. 불행히도, 이러한 접근법 및 전략은 질병에 걸린 개체에서 증상과 일시적 인지만을 개선시킬 뿐 질병의 진행에는 효과가 없다. 알쯔하이머병의 경우, 전형적으로 콜린작용성 경로 또는 기타 뇌 전달물질 경로를 통해 인지를 개선시키고자 하는 노력이 조사되어 왔다. 1차적 접근법은 약물 치료요법을 통한 아세틸 콜린에스테라제 효소의 억제에 의존한다. 아세틸 콜린에스테라제는 주요 뇌 효소이며 이의 수준을 조작하면 다른 신경계 기능의 다양한 변화가 초래될 수 있으며 부작용이 유발될 수 있다.Methods for improving the cognitive abilities of diseased individuals have been the subject of various studies. Recently, different approaches to improving the cognitive state and memory of patients associated with Alzheimer's disease have been the subject of various approaches and strategies. Unfortunately, this approach and strategy only improves symptoms and transient cognition in diseased individuals but has no effect on disease progression. In Alzheimer's disease, efforts have been investigated to improve cognition, typically through cholinergic pathways or other brain transporter pathways. The primary approach relies on the inhibition of acetylcholinesterase enzyme through drug therapy. Acetylcholinesterase is a major brain enzyme and its manipulation can lead to various changes in other nervous system functions and can cause side effects.

이러한 방법과 기타 방법은 적어도 일시적으로만 인지를 개선시킬 수 있으며 질환 진행을 수정하거나 질환의 원인을 해결하지 못하였다. 예를 들어, 알쯔하이머병은 전형적으로 아밀로이드 전구체 단백질의 축적을 통한 플라크의 형성과 관련된다. 아밀로이드와 플라크 형성에 대한 치료를 통해 면역학적 반응을 유도하고자 하는 시도는 동물 모델에서 수행되었지만 사람에게까지 성공적으로 확대되지 못했다.These and other methods can improve cognition at least temporarily and do not modify disease progression or resolve the cause of the disease. For example, Alzheimer's disease is typically associated with the formation of plaques through the accumulation of amyloid precursor proteins. Attempts to induce immunological responses through the treatment of amyloid and plaque formation have been performed in animal models but have not been successfully extended to humans.

게다가, 콜린에스테라제 억제제는 단기간 동안에 경미한 정도 내지 중간 정도의 증상을 갖는 일부 알쯔하이머병 환자에서만 증상을 개선시키므로 전체 환자 집단 중 소수에게만 유용한 치료법이다. 인지를 개선시키는데 있어 현재의 노력은 질환 상태를 치료하지 못하고 단지 증상을 완화시키기만 한다는 것이 보다 더욱 비관적이다. 현행 치료법은 질환 진행을 수정하지 못한다. 이러한 치료는 또한 알쯔하이머병 환자의 증상을 치료하기 위해 백신의 사용을 포함하며, 이는 마우스 시험에서는 그럴듯하고 효과적이지만 사람에서는 중증 부작용을 유발하는 것으로 나타났다.In addition, cholinesterase inhibitors are useful treatments for only a minority of the entire patient population as they improve symptoms only in some Alzheimer's patients with mild to moderate symptoms in a short period of time. It is even more pessimistic that current efforts to improve cognition do not cure disease states but merely relieve symptoms. Current therapies do not modify disease progression. These treatments also include the use of vaccines to treat symptoms in Alzheimer's disease patients, which have been shown to be plausible and effective in mouse testing but cause severe side effects in humans.

그 결과, 인지 손상, 특히 알쯔하이머병 질환에서 인지 손상의 치료를 위한 콜린작용성 경로의 사용은 부적절한 것으로 입증되었다. 게다가, 인지 개선을 위한 현행 치료법은 특정 신경퇴행성 질환으로 제한되며 기타 인지 상태의 치료에서는 효과가 입증되지 않았다. As a result, the use of cholinergic pathways for the treatment of cognitive impairment, particularly cognitive impairment in Alzheimer's disease, has proved inadequate. In addition, current therapies for cognitive improvement are limited to certain neurodegenerative diseases and have not proven effective in the treatment of other cognitive conditions.

알쯔하이머병은 뇌내의 특정 뉴론 아집단의 광범위한 손실과 연관되고 가장 일반적인 증상인 기억 상실을 동반한다[참조: Katzman, R. (1986) New England Journal of Medicine 314: 964]. 알쯔하이머병은 신경병리학적 변화와 관련하여 잘 특성화되어 있다. 그러나, 비정상성이 말초 조직에서 보고되었는데, 이는 알쯔하이머병이 중추신경계의 병리상태가 가장 두드러진 전신 장애라는 가능성을 뒷받침한다[참조: Connolly, G. , Fibroblast models of neurological disorders: fluorescence measurement studies, Review, TiPS Vol. 19, 171-77 (1998)]. 유전학적 기원 및 1번, 14번 및 21번 염색체와 알쯔하이머병의 연관성에 대한 논의는 다음 문헌을 참조한다[참조: St. George-Hyslop, P. H., et al., Science 235: 885 (1987); Tanzi, Rudolph et al., The Gene Defects Responsible for Familial Alzheimer's Disease, Review, Neurobiology of Disease 3, 159-168 (1996); Hardy, J., Molecular genetics of Alzheimer's disease, Acta Neurol Scand: Supplement 165: 13-17 (1996)]. Alzheimer's disease is associated with extensive loss of certain neuronal subpopulations in the brain and is accompanied by memory loss, the most common symptom (Katzman, R. (1986) New England Journal of Medicine 314: 964). Alzheimer's disease is well characterized with regard to neuropathological changes. However, abnormalities have been reported in peripheral tissues, supporting the possibility that Alzheimer's disease is the most prominent systemic disorder of the central nervous system. Connolly, G., Fibroblast models of neurological disorders: fluorescence measurement studies, Review, TiPS Vol. 19, 171-77 (1998). For a discussion of genetic origins and the association of chromosomes 1, 14 and 21 with Alzheimer's disease, see the following references. George-Hyslop, P. H., et al., Science 235: 885 (1987); Tanzi, Rudolph et al., The Gene Defects Responsible for Familial Alzheimer's Disease, Review, Neurobiology of Disease 3, 159-168 (1996); Hardy, J., Molecular genetics of Alzheimer's disease, Acta Neurol Scand: Supplement 165: 13-17 (1996)].

뉴론 손실 및 질환의 근본적 병인을 유도하는 세포상 변화는 조사중에 있는 반면, APP 대사의 중요성은 익히 확립되어 있다. 알쯔하이머병 환자의 뇌에서의 생리학 또는 병태생리학에서 역활을 하는 것으로 일관적으로 동정되는 두 단백질은 β-아밀로이드 및 tau[참조: Selkoe, D. , Alzheimer's Disease: Genes, Proteins, and Therapy, Physiological Reviews, Vol. 81, No. 2,2001]이다. β-아밀로이드 단백질 대사의 결함 및 비정상적 칼슘 항상성 및/또는 칼슘 활성화된 키나제에 관한 논의는 다음 문헌을 참조한다[참조: Etcheberrigaray et al., Calcium responses are altered in fibroblasts from Alzheimer's patients and pre-symptomatic PS1 carriers: a potential tool for early diagnosis, Alzheimer's Reports, Vol. 3, Nos. 5 & 6, pp. 305-312 (2000); Webb et al., Protein kinase C isozymes: a review of their structure, regulation and role in regulating airways smooth muscle tone and mitogenesis, British Journal of Pharmacology, 130, pp 1433-52 (2000)]. The cellular changes leading to neuronal loss and the underlying pathogenesis of the disease are under investigation, while the importance of APP metabolism is well established. Two proteins consistently identified as playing a role in physiology or pathophysiology in the brain of Alzheimer's disease patients are β-amyloid and tau [Selkoe, D., Alzheimer's Disease: Genes, Proteins, and Therapy, Physiological Reviews, Vol. 81, No. 2,2001. For a discussion of defects in β-amyloid protein metabolism and abnormal calcium homeostasis and / or calcium activated kinases, see Etcheberrigaray et al., Calcium responses are altered in fibroblasts from Alzheimer's patients and pre-symptomatic PS1 carriers : a potential tool for early diagnosis, Alzheimer's Reports, Vol. 3, Nos. 5 & 6, pp. 305-312 (2000); Webb et al., Protein kinase C isozymes: a review of their structure, regulation and role in regulating airways smooth muscle tone and mitogenesis, British Journal of Pharmacology, 130, pp 1433-52 (2000)].

추가로, 정상적 및 비정상적 기억력과 관련하여 K⁺ 및 Ca^{2 +} 채널 둘다가 기억 저장 및 회상에 역할을 하는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 칼륨 채널이 기억 저장동안에 변화되는 것으로 밝혀졌다[참조: Etcheberrigaray, R. , et al. (1992) Proceeding of the National Academy of Science 89: 7184; Sanchez-Andres, J. V. and Alkon, D. L. (1991) Journal of Neurobiology 65:796; Collin, C., et al. (1988) Biophysics Journal 55:955; Alkon, D.L., et al. (1985) Behavioral and Neural Biology 44:278; Alkon, D. L. (1984) Science 226:1037]. 이러한 관찰은 알쯔하이머병 환자에서 거의 보편적인 기억 상실 증상과 연관하여 알쯔하이머병 병리상태의 가능한 부위로서의 칼륨 채널의 기능과 인지에 미치는 PKC 조절의 효과에 관한 조사를 유도하였다.In addition, both K ⁺ and Ca ^{2 +} channels have been shown to play a role in memory storage and recall in relation to normal and abnormal memory. For example, potassium channels have been found to change during memory storage. Etcheberrigaray, R., et al. (1992) Proceeding of the National Academy of Science 89: 7184; Sanchez-Andres, JV and Alkon, DL (1991) Journal of Neurobiology 65: 796; Collin, C., et al. (1988) Biophysics Journal 55: 955; Alkon, DL, et al. (1985) Behavioral and Neural Biology 44: 278; Alkon, DL (1984) Science 226: 1037. This observation led to an investigation of the effect of PKC regulation on the function and cognition of potassium channels as possible sites of Alzheimer's disease pathology in association with nearly universal memory loss symptoms in Alzheimer's disease patients.

PKC는 비-수용체 세린-트레오닌 단백질 키나제의 가장 큰 유전자 계열 중 하나로서 동정되었다. 80년대 초반에 니시즈카(Nishizuka) 및 동료들[참조: Kikkawa et al., J. Biol. Chem., 257, 1334 (1982)]에 의해 PKC가 발견되고 PKC가 포르볼 에스테르에 대한 주요 수용체[참조: Ashendel et al., Cancer Res., 43, 4333 (1983)]로서 확인된 이래로, 다수의 생리학적 시그날전달 기작이 상기 효소에 기인하는 것으로 사료되어 왔다. PKC에 대한 집중적 관심은, 그 형성이 성장 및 분화 인자의 작용에 의한 인지질 턴오버와 결부되는 작동인자(effector)인 칼슘 및 디아실글리세롤(및 이의 포르볼 에스테르 모사체)에 의해 시험관내에서 활성화되는 PKC의 독특한 능력때문이다.PKC has been identified as one of the largest gene families of non-receptor serine-threonine protein kinases. Nishizuka and colleagues in the early eighties [Kikkawa et al., J. Biol. Chem., 257, 1334 (1982)], since PKC has been found and PKC has been identified as the major receptor for phorbol esters (Ashendel et al., Cancer Res., 43, 4333 (1983)). The physiological signal transduction mechanism of is believed to be due to the enzyme. The intensive interest in PKC is activated in vitro by calcium and diacylglycerols (and their phorbol ester mimetics), which are effectors whose formation is associated with phospholipid turnover by the action of growth and differentiation factors. PKC's unique ability.

PKC 유전자 계열은 현재 다음의 4가지 하위그룹으로 분류되는 11개의 유전자로 이루어진다: (1) 전형적 PKCα, β₁, β₂(β₁ 및 β₂는 동일한 유전자의 다르게 스플라이싱된 형태이다) 및 γ, (2) 신규 PKCδ, ε, η 및 θ, (3) 비전형적 PKCζ, λ, η및 ι및 (4) PKCμ. PKCμ는 신규 PKC 이소형과 유사하지만 추정 트랜스막 도메인을 갖다는 점에서 상이하다[참조: Blohe et al., Cancer Metast. Rev., 13, 411 (1994); Ilug et al., Biochem j., 291, 329 (1993); Kikkawa et al., Ann. Rev. Biochem. 58, 31 (1989)]. α, β₁, β₂ 및 γ 이소형은 Ca^{2 +}, 인지질 및 디아실글리세롤-의존적이며 PKC의 전형적 이소형인 반면, 다른 이소형은 인지질 및 디아실글리세롤에 의해 활성화되지만 Ca^{2 +}에 의존적이지 않다. 모든 이소형은 5개의 가변성(V1 내지 V5) 영역을 포함하며, α, β및 γ 이소형은 고도로 보존된 4개(C1 내지 C4)의 구조적 도메인을 함유한다. PKCα, β및 γ 를 제외한 모든 이소형은 C2 도메인이 결여되어 있으며 λ, η및 이소형은 디아실글리세롤이 결합하는 C1 내의 9개의 시스테인-풍부 아연 핑거(zinc finger) 도메인 중 2개가 또한 결여되어 있다. C1 도메인은 또한 모든 이소형간에 고도로 보존되어 있으며 당해 효소의 불활성 형태를 생성하는 기질-결합 부위를 차단함으로써 자동조절성 기능을 제공하는 가성기질(pseudosubstrate) 서열을 함유한다[참조; House et al., Science, 238, 1726 (1987)].The PKC gene family currently consists of eleven genes classified into four subgroups: (1) typical PKCα, β ₁ , β ₂ (β ₁ and β ₂ are different spliced forms of the same gene) and γ, (2) novel PKCδ, ε, η and θ, (3) atypical PKCζ, λ, η and ι and (4) PKCμ. PKCμ is similar to the new PKC isotype but different in that it has a putative transmembrane domain. See Blohe et al., Cancer Metast. Rev., 13, 411 (1994); Ilug et al., Biochem j., 291, 329 (1993); Kikkawa et al., Ann. Rev. Biochem. 58, 31 (1989). α, β _1, β ₂ and γ isoform is Ca ^{2 +,} phospholipid and diacylglycerol-dependent and while type typically isobutane of PKC, other isoforms are activated by phospholipid and diacylglycerol but not dependent on Ca ^{2 +} not. All isotypes contain five variable (V1 to V5) regions, and the α, β and γ isoforms contain four highly conserved structural domains (C1 to C4). All isoforms except PKCα, β and γ lack C2 domains and λ, η and isoforms also lack two of the nine cysteine-zinc finger domains in C1 to which diacylglycerol binds. have. The C1 domain also contains a pseudosubstrate sequence that is highly conserved between all isotypes and provides autoregulatory function by blocking substrate-binding sites that produce an inactive form of the enzyme [see; House et al., Science, 238, 1726 (1987)].

이러한 구조적 특징으로 인해, 다양한 PKC 이소형은 생리학적 자극에 반응하여 시그날 전달(signal transduction)[참조: Nishizuka, Cancer, 10,1892 (1989)], 및 신생물성 형질전환 및 분화[참조: Glazer, Protein Kinase C, J. F. Kuo, ed., Oxford U. Press (1994) at pages 171-198]에 있어 고도로 특수화된 역활을 하는 것으로 사료된다. 공지된 PKC 조절인자의 논의에 대해서는 다음 문헌을 참조한다[참조: PCT/US97/08141, 미국 특허 제5,652,232호; 제6,043,270호; 제6,080,784호; 제5,891,906호; 제5,962,498호; 제5,955,501호; 제5,891,870호 및 제5,962,504호].Due to these structural features, various PKC isotypes are able to signal transduction in response to physiological stimuli (Nishizuka, Cancer, 10,1892 (1989)), and neoplastic transformation and differentiation (Glaser, Protein Kinase C, JF Kuo, ed., Oxford U. Press (1994) at pages 171-198]. For a discussion of known PKC modulators, see the following references: PCT / US97 / 08141, US Pat. No. 5,652,232; No. 6,043,270; 6,080,784; 6,080,784; 5,891,906; 5,891,906; 5,962,498; 5,955,501; 5,891,870 and 5,962,504].

PKC가 시그날 전달에서 하는 중심적 역활의 관점에서, PKC는 APP 프로세싱의 조절에 대한 흥미로운 표적인 것으로 증명되었다. PKC가 APP 프로세싱의 조절에 역할 수행한다는 것은 널리 확립되어 있다. 예를 들어, 포르볼 에스테르는 PKC 활성화를 통해 분비된 비-아밀로이드형성성 가용성 APP(sAPP)의 상대량을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 포르볼 에스테르에 의한 PKC의 활성화는 APP 분자의 직접적 인산화를 초래하는 것으로 보이지 않는다. 정확한 작용 부위에 상관없이, 포르볼-유도된 PKC 활성화는 비-아밀로이드형성성 경로인 α-세크레타제를 증진시키거나 우선적이 되도록 한다. 따라서, PKC 활성화는 유해하지 않은 sAPP의 생산에 영향을 주고 유익한 sAPP를 생산하기 위한 흥미로운 접근법이며 동시에 Aβ 펩타이드의 상대량을 감소시킨다. 그러나, 포르볼 에스테르는 이의 종양 촉진 활성으로 인해 궁극적인 약물 개발에 적합한 화합물이 아니다[참조: Ibarreta, et al., Benzolactam (BL) enhances sAPP secretion in fibroblasts and in PC12 cells, NeuroReport, Vol. 10, No. 5 & 6, pp 1035-40 (1999)].In view of the central role that PKC plays in signal delivery, PKC has proved to be an interesting target for the regulation of APP processing. It is widely established that PKC plays a role in regulating APP processing. For example, phorbol esters have been shown to significantly increase the relative amounts of secreted non-amyloidogenic soluble APP (sAPP) via PKC activation. However, activation of PKC by phorbol esters does not appear to result in direct phosphorylation of APP molecules. Regardless of the exact site of action, phorbol-induced PKC activation enhances or makes it a preferential, α-secretase, non-amyloidogenic pathway. Thus, PKC activation affects the production of non-hazardous sAPPs and is an interesting approach to producing beneficial sAPPs while at the same time reducing the relative amount of Αβ peptide. However, phorbol esters are not suitable compounds for ultimate drug development because of their tumor promoting activity [Ibarreta, et al., Benzolactam (BL) enhances sAPP secretion in fibroblasts and in PC12 cells, NeuroReport, Vol. 10, No. 5 & 6, pp 1035-40 (1999)].

개별적 PKC 이소자임(isozyme)이 생물학적 과정에서 상이하며 때로는 상반되는 역활을 한다는 증거가 증가하고 있으며, 이는 약리학적 개발에 대한 2가지 방향을 제공한다. 하나는 PKC의 특이적(바람직하게는 이소자임 특이적) 억제제의 디자인이다. 이러한 접근법은 촉매적 도메인이 PKC의 이소자임 특이성에 대한 주된 원인이 되는 도메인이 아니라는 사실에 의해 복잡하게 된다. 다른 접근법은 이소자임-선택적, 조절 부위-지시된 PKC 활성화제를 개발하는 것이다. 이러한 접근법은 반대되는 생물학적 효과를 갖는 다른 시그날 전달의 효과를 억제하는 방법을 제공할 수 있다. 대안으로, 급성 활성 후에 PKC의 하향조절을 유도함으로써 PKC 활성화제가 장기간 길항작용을 유발할 수 있다. 브리오스타틴은 항암제로서 현재 임상 시험중에 있다. 브리오스타틴은 PKC의 조절 도메인에 결합하여 이 효소를 활성화시키는 것으로 공지되어 있다. 브리오스타틴은 PKC의 이소자임-선택적 활성화제의 한 예이다. 브리오스타틴 이외에도, PKC를 조절하는 화합물은 밝혀져있다[참조: 제WO 97/43268호].There is increasing evidence that individual PKC isozymes play different and sometimes opposite roles in biological processes, providing two directions for pharmacological development. One is the design of specific (preferably isozyme specific) inhibitors of PKC. This approach is complicated by the fact that the catalytic domain is not the domain responsible for the isozyme specificity of PKC. Another approach is to develop isozyme-selective, regulatory site-directed PKC activators. Such an approach may provide a way to suppress the effects of other signal transfers with opposite biological effects. Alternatively, PKC activators can induce long-term antagonism by inducing downregulation of PKC after acute activity. Briostatin is currently in clinical trials as an anticancer agent. Briostatin is known to bind to the regulatory domain of PKC to activate this enzyme. Briostatin is an example of an isozyme-selective activator of PKC. In addition to bryostatin, compounds regulating PKC have been identified (WO 97/43268).

인지능력 또는 일반 인지의 특정한 특징을 통해 개선된 전반적 인지를 위한 치료방법의 개발이 여전히 요구된다. 또한, 특정 질환 상태 또는 인지 장애와 관련이 있는지의 여부에 상관 없이 인지 증진을 개선시키기 위한 방법의 개발이 여전히 요구된다. 본 발명의 방법 및 조성물은 이러한 요구를 충족시키며 알쯔하이머병 및 기타 신경퇴행성 질환에 대한 임상 치료를 크게 개선시킬 뿐만 아니라 개선된 인지 증진을 제공한다. 당해 방법 및 조성물은 또한 α-세크레타제의 조절을 통해 인지 상태의 치료 및/또는 증진을 제공한다.
There is still a need to develop treatments for improved overall cognition through specific features of cognitive abilities or general cognition. In addition, there is still a need for development of methods to improve cognitive enhancement, whether or not they are associated with specific disease states or cognitive disorders. The methods and compositions of the present invention meet these needs and provide not only significantly improved clinical treatment for Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases, but also improved cognitive enhancement. The methods and compositions also provide for the treatment and / or enhancement of cognitive status through the modulation of α-secretase.

본 발명은 인지능력의 증진/개선과 관련된 상태의 치료를 위한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 추가로 치료된 피험자에서 개선된/증진된 인지능력을 제공하는, 아밀로이드 프로세싱과 관련된 상태, 예를 들어, 알쯔하이머병의 치료를 위한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 화합물 및 조성물은 브리오스타틴류 및 네리스타틴류의 거대환 락톤으로부터 선택된다.The present invention relates to compounds, compositions and methods for the treatment of conditions associated with enhancement / improvement of cognition. In a preferred embodiment, the present invention further relates to compounds, compositions and methods for the treatment of conditions associated with amyloid processing, such as Alzheimer's disease, which provide improved / enhanced cognitive abilities in the treated subject. In particular, the compounds and compositions of the present invention are selected from macrocyclic lactones of bryostatins and neristatins.

다른 측면에서, 본 발명은 α-세크레타제 활성을 조절하는 거대환 락톤 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 브리오트타틴류 및 네리스타틴류 화합물이 관심대상이며 브리오스타틴-1이 더욱 관심대상이다.In another aspect, the present invention relates to macrocyclic lactone compounds, compositions, and methods for modulating α-secretase activity. In particular, bryostatin and nelistatin compounds are of interest, and bryostatin-1 is of further interest.

본 발명의 또 다른 측면은 가용성 α-아밀로이드 전구체 단백질(αAPP)를 생성하는 α-세크레타제 경로를 증진시켜 β-아밀로이드 응집을 예방하고 인지능력을 개선/증진시키기 위해, 아밀로이드 프로세싱과 관련된 상태를 변경하는 PKC 활성화제로서의 브리오스타틴류 및 네리스타틴류 화합물에 관한 것이다. 이러한 활성화제, 특히 브리오스타틴-1을, 예를 들어, 알쯔하이머병의 치료시에 사용할 수 있다. Another aspect of the present invention is directed to a state associated with amyloid processing to enhance the α-secretase pathway that produces soluble α-amyloid precursor protein (αAPP) to prevent β-amyloid aggregation and improve / promote cognitive ability. It relates to bryostatins and nelistatins compounds as altered PKC activators. Such activators, in particular bryostatin-1, can be used, for example, in the treatment of Alzheimer's disease.

또 다른 측면에서, 본 발명은 피험자에게 유효량의 브리오스타틴 또는 네리스타틴류 화합물을 투여함을 포함하여, 알쯔하이머병과 동반되는 바와 같은 플라크 형성을 치료하고, 피험자의 인지 상태를 개선/증진시키는 방법에 관한 것이다. 보다 바람직한 양태에서, 당해 화합물은 브리오스타틴-1이다.In another aspect, the present invention relates to a method of treating plaque formation as accompanied by Alzheimer's disease and improving / promoting a subject's cognitive state, comprising administering to the subject an effective amount of a bryostatin or nelistatin compound will be. In a more preferred embodiment, the compound is bryostatin-1.

본 발명의 또 다른 측면은 (i) 가용성 β-아밀로이드를 상승시키고 가용성 αAPP를 생성시키고 β-아밀로이드 응집을 예방하기에 유효한 양의 거대환 락톤; 및 (ii) 약제학적으로 효과적인 담체를 포함하는, 플라크 형성을 치료하고 인지능력을 개선/증진시키기 위한 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 당해 조성물은 알쯔하이머병과 결부된 인지 능력을 개선/증진시키는데 사용된다. 거대환 락톤은 바람직하게는 브리오스타틴류 또는 네리스타틴류 화합물로부터 선택되고, 특히 브리오스타틴-1이다.Another aspect of the present invention provides a composition comprising: (i) an amount of macrocyclic lactone effective to elevate soluble β-amyloid, produce soluble αAPP and prevent β-amyloid aggregation; And (ii) a pharmaceutically effective carrier, for treating plaque formation and improving / promoting cognition. In a preferred embodiment, the composition is used to improve / enhance cognitive abilities associated with Alzheimer's disease. Macrocyclic lactones are preferably selected from bryostatins or neristatins, in particular bryostatin-1.

본 발명의 하나의 양태에서, PKC 이소엔자임(isoenzyme)의 활성화는 개선된 인지능력을 초래한다. 하나의 양태에서, 개선된 인지능력은 기억력이다. 다른 양태에서, 개선된 인지능력은 학습력이다. 또 다른 양태에서, 개선된 인지능력은 주의력이다. 또 다른 양태에서, PKC의 이소엔자임은 거대환 락톤(즉, 브리오스타틴류 및 네리스타틴류)에 의해 활성화된다. 특히, 브리오스타틴-1 내지 브리오스타틴-18과 네리스타틴이 PKC 이소엔자임을 활성화시키는데 사용된다. 바람직한 양태에서, 브리오스타틴-1이 사용된다.In one embodiment of the present invention, activation of PKC isoenzyme results in improved cognitive ability. In one embodiment, the improved cognitive ability is memory. In another embodiment, the improved cognitive ability is learning ability. In another embodiment, the improved cognitive ability is attention. In another embodiment, the isoenzyme of PKC is activated by macrocyclic lactones (ie bryostatins and nelistatins). In particular, bryostatin-1 to bryostatin-18 and nelistatin are used to activate PKC isoenzyme. In a preferred embodiment, bryostatin-1 is used.

다른 측면에서, 본 발명은 인지능력을 개선시키기에 유효한 양으로 투여되는 PKC 이소엔자임 활성화제의 조성물을 포함한다. 바람직한 양태에서, PKC 이소엔자임 활성화제는 거대환 락톤(즉, 브리오스타틴류 및 네리스타틴류)로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 투여되는 PKC 활성화제의 양은 sAPP의 생산을 증가시키기에 유효한 양이다. 보다 바람직한 양태에서, 투여되는 조성물의 양은 근육통을 유발하지 않는다.In another aspect, the invention includes a composition of a PKC isoenzyme activator administered in an amount effective to improve cognition. In a preferred embodiment, the PKC isoenzyme activator is selected from macrocyclic lactones (ie bryostatins and neristatins). In a preferred embodiment, the amount of PKC activator administered is an amount effective to increase the production of sAPP. In a more preferred embodiment, the amount of the composition administered does not cause myalgia.

바람직한 양태에서, PKC 이소엔자임은 신경계 질환, 졸중 (stroke) 또는 저산소증을 앓고 있거나 앓은적이 있는 피험자에서 활성화된다. 보다 바람직한 양태에서, PKC 이소엔자임은 알쯔하이머병 환자 또는 모델에서 활성화된다.In a preferred embodiment, PKC isoenzyme is activated in a subject suffering from or having a neurological disease, stroke or hypoxia. In a more preferred embodiment, PKC isoenzyme is activated in Alzheimer's disease patients or models.

본 발명의 다른 양태에서, PKC 활성화는 아밀로이드 전구체 단백질 대사의 조절을 초래한다. 추가로, 이러한 PKC 활성화에 의한 조절은 알파 세크레타제 경로의 증가를 초래한다. 알파 세크레타제 경로는 인지 손상과 관련되는 비독성이며 비-아밀로이드형성성인 단편을 초래한다. 그 결과, 피험자의 인지 상태가 개선된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, PKC 활성화는 아밀로이드형성성이며 독성인 단편 Aβ40 및 Aβ42를 감소시킨다.In another embodiment of the invention, PKC activation results in the regulation of amyloid precursor protein metabolism. In addition, regulation by this PKC activation results in an increase in the alpha secretase pathway. Alpha secretase pathways lead to nontoxic and non-amyloidogenic fragments associated with cognitive impairment. As a result, the cognitive state of the subject is improved. In another embodiment of the invention, PKC activation reduces amyloidogenic and toxic fragments Aβ40 and Aβ42.

본 발명의 다른 양태는 PKC 이소엔자임의 활성화를 통해 인지능력을 개선시키는 방법이다. 본 발명의 다른 양태에서, PKC 활성화는 "정상" 피험자에서 일어난다. 본 발명의 다른 양태에서, PKC 활성화는 질환을 앓고 있거나 인지능력이 악화되었거나 인지의 기능장애를 앓고 있는 피험자에서 일어난다. 바람직한 양태에서 당해 방법은 알쯔하이머병의 치료방법이다.Another aspect of the invention is a method of improving cognitive abilities through activation of PKC isoenzyme. In another embodiment of the invention, PKC activation occurs in a "normal" subject. In another embodiment of the invention, PKC activation occurs in a subject suffering from a disease, deteriorating cognitive ability, or suffering from cognitive dysfunction. In a preferred embodiment the method is a method for treating Alzheimer's disease.

본 발명의 다른 양태에서, PKC의 조절은 인지능력을 개선시키면서 종양을 촉진하지 않는 제제의 사용을 통해 이루어진다. 바람직한 양태에서, PKC 활성화제는 브리오스타틴-1 내지 브리오스타틴-18 및 네리스타틴으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 브리오스타틴-1이 사용된다. 다른 양태에서, 인지능력을 개선시키고 부작용을 감소시키기 위해 브리오스타틴-1이 비-브리오스타틴류 화합물과 병용하여 사용된다.In another embodiment of the present invention, modulation of PKC is achieved through the use of agents that improve cognition but do not promote tumors. In a preferred embodiment, the PKC activator is selected from bryostatin-1 to bryostatin-18 and nelistatin. In a more preferred embodiment, bryostatin-1 is used. In another embodiment, bryostatin-1 is used in combination with non-Briostatin compounds to improve cognition and reduce side effects.

본 발명의 다른 양태에서, 거대환 락톤(즉, 브리오스타틴류 및 네리스타틴류)를 통한 PKC의 조절은 알쯔하이머병과 관련된 상태의 시험을 위해 시험관내에서 사용된다. 시험관내 사용은 예를 들어, 섬유모세포, 혈액 세포 시험 또는 세포 모델에서의 이온 채널 전도도의 모니터링을 포함한다.In another embodiment of the invention, the regulation of PKC via macrocyclic lactones (ie bryostatins and nelistatins) is used in vitro for testing of conditions associated with Alzheimer's disease. In vitro use includes monitoring of ion channel conductivity in, for example, fibroblasts, blood cell tests or cell models.

본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 화합물 및 조성물은 정맥내 및 뇌실내 투여를 포함하여 경구 및/또는 주사가능한 형태를 통해 투여된다.In a preferred embodiment of the invention, the compounds and compositions are administered via oral and / or injectable forms, including intravenous and intraventricular administration.

따라서, 본 발명은 피험자에게 본 발명의 화합물 중 하나의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 당해 피험자에서 손상된 기억력 또는 학습력 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 기억력 결손 또는 손상된 학습력이 발생한 임상 상태의 치료학적 처리시에 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 기억력 및 합습력이 개선될 수 있다. 이로써 피험자의 상태가 개선될 수 있다.Accordingly, the present invention provides a method of treating impaired memory or learning disorders in a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of one of the compounds of the invention. Thus, the compounds of the present invention can be used in the therapeutic treatment of clinical conditions in which memory deficits or impaired learning have occurred. In this way, memory and training can be improved. This may improve the subject's condition.

당해 조성물 및 방법은 중요한 특징으로서 또는 관련 증상으로서 기억력 손상 또는 학습 장애가 발생한 임상 상태 및 장애의 치료에서의 용도를 갖는다. 본 발명의 화합물을 사용하여 치료할 수 있는 이러한 상태의 예에는 알쯔하이머병, 다발경색 치매 및 파킨슨병을 동반하거나 동반하지 않은 알쯔하이머병의 루이소체(Lewy-body) 변이; 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jakob disease) 및 코르사코프병(Korsakow's disorder)이 포함된다.The compositions and methods have use in the treatment of disorders and clinical conditions in which memory impairment or learning disorders have occurred as important features or as related symptoms. Examples of such conditions that can be treated using the compounds of the present invention include Lewy-body variations of Alzheimer's disease, multiple infarct dementia and Alzheimer's disease with or without Parkinson's disease; Creutzfeld-Jakob disease and Korsakow's disorder.

당해 조성물 및 방법은 또한 연령 (age)과 관련되며 전기경련요법의 결과로서 일어나거나, 예를 들어, 졸중, 마취 사고, 두부 손상, 저혈당증, 일산화탄소 중독, 리튬 중독 또는 비타민 결핍증에 의해 유발되는 뇌 손상의 결과인 손상된 기억력 또는 학습력을 치료하기 위해 사용될 수 있다.The compositions and methods are also age related and brain damage that occurs as a result of electrospasm or is caused by, for example, strokes, anesthesia accidents, head injury, hypoglycemia, carbon monoxide poisoning, lithium poisoning or vitamin deficiency. It can be used to treat impaired memory or learning ability as a result.

당해 화합물은 종양을 촉진하지 않으며 이미 II기 임상 시험중이라는 추가의 잇점을 갖는다.The compound does not promote tumors and has the additional advantage that it is already in Phase II clinical trials.

본 발명은 인지 증진, 인지 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 인지 증진, 인지 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 활성 성분으로서 거대환 락톤(즉, 브리오스타틴류 및 네리스타틴류) 및 이들의 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to compositions for cognitive enhancement, prevention and / or treatment of cognitive disorders. More particularly, the invention relates to pharmaceutical compositions comprising macrocyclic lactones (ie bryostatins and nelistatins) and derivatives thereof as active ingredients for cognitive enhancement, prevention and / or treatment of cognitive disorders.

따라서, 본 발명의 1차적 목적은 인지 강화, 인지 장애의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 당해 약제학적 조성물은 거대환 락톤, 특히 브리오스타틴류 및 네리스타틴류, 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체와 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다.Accordingly, it is a primary object of the present invention to provide pharmaceutical compositions for cognitive enhancement, prevention and / or treatment of cognitive disorders. The pharmaceutical composition comprises macrocyclic lactones, in particular bryostatins and neristatins, or pharmaceutically acceptable salts or derivatives thereof and pharmaceutically acceptable carriers or excipients.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인지의 증진, 인지 장애의 예방 및/또는 치료시에 유용할 수 있으며, 여기서 인지 장애는 본원에서 기술하는 바와 같은 학습력 획득, 기억 강화 및 재생의 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는다. Pharmaceutical compositions according to the present invention may be useful in enhancing cognition, preventing and / or treating cognitive disorders, wherein cognitive disorders include, but are not limited to, impairment of learning ability, memory enhancement and regeneration as described herein. It is not limited.

본 발명은 포유동물 세포에서 단백질의 인산화를 조절하거나 이에 영향을 미치는 하나 이상의 제제의 유효량을 환자에게 투여함으로써 알쯔하이머병을 포함하는 신경계 장애와 관련된 아밀로이드증을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for treating amyloidosis associated with neurological disorders including Alzheimer's disease by administering to a patient an effective amount of one or more agents that regulate or affect the phosphorylation of proteins in mammalian cells.

본 발명은 또한 환자에게 유효량의 거대환 락톤(즉, 브리오스타틴류 및 네리스타틴류)을 투여함을 포함하는, 알쯔하이머병의 치료방법을 제공한다.The present invention also provides a method of treating Alzheimer's disease, comprising administering to a patient an effective amount of macrocyclic lactones (ie, bryostatins and neristatins).

다른 양태에서, 브리오스타틴 또는 네리스타틴류 화합물은 피험자에서의 종양형성 반응을 예방하거나 감소시키기 위해 상이한 프로볼 에스테르와 함께 상기한 방법에서 사용될 수 있다.
In other embodiments, the bryostatin or nelistatin compounds may be used in the methods described above with different probol esters to prevent or reduce oncogenic responses in the subject.

도 1A는 sAPPα 분비에 미치는 상이한 PKC 억제제 및 농도의 효과를 예시한 것으로서, 여기서 브리오스타틴-1은 대조군 및 벤조락탐보다 낮은 농도에서 보다 큰 효능을 나타낸다 - 브리오스타틴(0.1nM, 검은색 막대)은 익히 특성화된, 부검으로 확인된 AD 세포주에서 3시간 동안 항온처리한 후에 배지 중의 sAPP- α의 양을 급격하게 증가시켰다(p < 0.0001, ANOVA). 그래프 단위는 비히클인 단독의 DMSO에 대해 상대적인 것이다. 브리오스타틴은 동일한(0.1nM) 농도에서 다른 PKC 활성화제인 BL에 비해 유의적으로(p<0.01, 터키 사후 검정(Tukey's post Test)) 효능적이다. 스타우로스포린(100nM)에 의한 전처리(가장 우측의 막대)는 브리오스타틴(0.1nM)의 효과를 완전히 소멸시켰다. 브리오스타틴은 또한 2개의 대조군 세포주에서는 분비를 증진시키는데 효과적이었으나, AD 세포주(빗금친 막대)에서는 보다 적은 정도로 효과적이었다.
도 1B는 sAPPα 분비에 미치는 브리오스타틴-1의 상이한 농도의 효과를 시간 경과에 따라 예시한 것이다 - 분비는 15분간의 항온처리 시간(브리오스타틴 0.1nM)까지는 명백히 약간씩 증가하며 160시간 항온처리 시간에서 거의 최대이며 최대 3시간까지 지속적으로 상승한다. 보다 낮은 농도, 즉 0.01M에서의 브리오스타틴은 120분 항온처리 후에 분비에 대한 훨씬 느리지만 거의 동일한 효과를 갖는다.
도 1C는 다양한 실험 조건 및 세포주하에서의 sAPPα 분비를 사람 섬유모세포에서의 sAPPα의 웨스턴 블롯 분석법을 통해 예시한 것이다.
도 2는 PKCα이소자임에 미치는 상이한 농도의 브리오스타틴-1의 효과를 예시한 것이다.
도 3은 수중 미로를 학습하는데 요구되는 시간의 양을 처리된 랫트 대 대조군으로서 예시한 것이다 - 모리스 수중 미로(Morris Water Maze)에서의 학습 곡선은 브리오스타틴(뇌실내)이 초기 시행으로부터의 탈출 잠복기의 감소로 증명되는 바와 같이 동물의 수행능을 개선시켰음을 보여준다.
도 4A는 대조군 랫트가 상이한 사분역에서 수영하는데 소요된 시간의 양을 예시한 것이다 - 대조군 및 처리된 동물은 둘다 표적 사분역에 대한 수행능의 유지를 나타낸다(도 4B 참조).
도 4B는 처리된 랫트가 상이한 사분역에서 수영하는데 소요된 시간의 양을 예시한 것이다.
도 4C는 대조군 랫트와 비교하여 처리된 랫트가 표적 사분역에서 소요한 시간의 양 사이의 차이를 예시한 것이다 - 처리된 동물은 대조군에 비해 개선된 체류시간을 나타냈다.
도 5A는 사람 섬유모세포에서의 PKC 전위를, 막 결합형 PKC(P=미립자)의 면역반응성(전체 단백질 함량에 의해 정규화됨)과 세포질 분획(S= 가용성)에서 검출된 면역반응성 사이의 비를 나타내는 막대 그래프로 예시한 것이다. PKC-α전위는 0.1nM 브리오스타틴과 30분 동안 항온처리한 후(검정색 막대) 현저하게 나타났다. 전위는 180분 항온처리(가장 우측의 막대)에서도 여전히 존재한다(P>S).
도 5B는 다른 PKC 이소엔자임이 검출되었으며 이의 전위 수준이 PKC-α의 경우에 관찰된 수준과 유사하였음을 예시한 것이다.
도 6A는 이유 직후(3주)부터 BL 1mg/kg(매일 복강내 투여)로 처리하기 시작하여 17주 동안 처리한 유전자 전이 마우스(어린 동물)를 사용한 생체내 시험을 예시한 것이다. 비히클 단독과 비교하여 처리된 그룹의 뇌내의 sAPPα는 유의적으로 증가되었다.
도 6B는 동일한 동물에서 Aβ40이 비례적으로 감소되었음을 예시한 것이다.
도 7A는 BL 및 LQ12 처리를 7주 동안 막대 그래프에서 명시한 투여량 및 스케쥴로 받은 약 6개월령의 유전자 전이 마우스(성체 동물)을 사용한 생체내 시험을 예시한 것이다. 검정색 막대로 표시한 처리로 sAPP-α에 있어 약간 증가하였다.
도 7B는 10mg/kg에서 매주 BL 및 LQ12로 처리한 동물(검정색 막대)에서 관찰된 소폭의 Aβ40 감소(유의적이지 않음)를 예시한 것이다. Aβ40의 예상치못한(빗금친 막대) 증가가 BL 10mg/kg로 매일 처리한 동물에서 관찰되었다.
도 8은 대조군 및 AD 세포 둘다에 대한 0.1nM의 브리오스타틴을 투여한 후 사람 섬유모세포에서의 sAPPα 분비를 예시한 것이다.
도 9는 AD 세포에서 브리오스타틴을 투여한 후의 sAPP에 대한 면역블롯을 예시한 것이다.
도 10은 처리된 마우스에 미치는 브리오스타틴의 양성 효과 및 대조군과 비교하여 증가된 수명을 예시한 것이다.
도 11은 처리된 동물 대 미처리된 동물에 대한 수중 시험에서 소요된 시간을 예시한 것이다.
도 12는 대조군에 비해서 감소된, 처리된 동물에서의 가용성 Aβ-40의 농도를 예시한 것이다.
도 13은 대조군에 비해서 감소된, 처리된 동물에서의 가용성 Aβ-42의 농도를 예시한 것이다.
도 14는 티오플라빈 S 염색 후에 대조군에 비해서 감소된, 처리된 동물에서 확인된 플라크의 %를 예시한 것이다.1A illustrates the effect of different PKC inhibitors and concentrations on sAPPα secretion, where bryostatin-1 shows greater efficacy at lower concentrations than the control and benzolactam-bryostatin (0.1 nM, black bars) After an incubation for 3 hours in well-characterized autopsy identified AD cell lines, the amount of sAPP-α in the medium increased dramatically (p <0.0001, ANOVA). The graph units are relative to DMSO alone, which is the vehicle. Briostatin is significantly more potent (p <0.01, Turkey's post Test) than BL, the other PKC activator, at the same (0.1 nM) concentration. Pretreatment with the staurosporin (100 nM) (the rightmost bar) completely abolished the effect of bryostatin (0.1 nM). Briostatin was also effective in enhancing secretion in two control cell lines, but to a lesser extent in AD cell lines (hatched bars).
FIG. 1B illustrates the effect of different concentrations of bryostatin-1 on sAPPα secretion over time—secretion is clearly slightly increased up to 15 minutes of incubation time (Briostatin 0.1 nM) and 160 hours incubation time. Almost maximum at and continues to rise up to 3 hours. Briostatin at lower concentrations, i.e. 0.01 M, has a much slower but nearly identical effect on secretion after 120 min incubation.
1C illustrates sAPPα secretion under various experimental conditions and cell lines via Western blot analysis of sAPPα in human fibroblasts.
2 illustrates the effect of bryostatin-1 at different concentrations on PKCα isozyme.
Figure 3 illustrates the amount of time required to learn an underwater maze as a treated rat versus control-learning curve in Morris Water Maze shows the incubation period for bryostatin (intraventricular) to escape from initial trials. Improved animal performance as evidenced by the reduction of.
4A illustrates the amount of time control rats spent swimming in different quadrants—both control and treated animals showed retention of performance for the target quadrant (see FIG. 4B).
4B illustrates the amount of time spent treated rats swim in different quadrants.
4C illustrates the difference between the amount of time spent rats in the target quadrant compared to control rats-treated animals showed improved retention time compared to control.
5A shows the ratio of PKC translocation in human fibroblasts between the immunoreactivity of membrane-bound PKC (P = particulates) (normalized by total protein content) and the immunoreactivity detected in cytoplasmic fraction (S = soluble). The bar graph is shown. PKC-α potential was remarkable after incubation with 0.1 nM bryostatin for 30 minutes (black bars). The potential is still present at 180 min incubation (rightmost bar) (P> S).
5B illustrates that other PKC isoenzymes were detected and their potential levels were similar to those observed for PKC-α.
FIG. 6A illustrates in vivo testing with transgenic mice (young animals) treated for 17 weeks starting immediately after weaning (week 3) with BL 1 mg / kg (daily intraperitoneal administration). SAPPα in the brain of the treated group was significantly increased compared to vehicle alone.
6B illustrates that Aβ40 was proportionally reduced in the same animal.
FIG. 7A illustrates in vivo testing using about 6 months old transgenic mice (adult animals) receiving BL and LQ12 treatment at 7 weeks for the dosage and schedule indicated in the bar graph. Treatment with black bars slightly increased the sAPP-α.
FIG. 7B illustrates the small Aβ40 reduction (not significant) observed in animals treated with BL and LQ12 (black bars) weekly at 10 mg / kg. Unexpected increases in Aβ40 (hatched bars) were observed in animals treated daily with BL 10 mg / kg.
FIG. 8 illustrates sAPPα secretion in human fibroblasts following administration of 0.1 nM bryostatin to both control and AD cells.
9 illustrates an immunoblot for sAPP after administration of bryostatin in AD cells.
FIG. 10 illustrates the positive effect of bryostatin on treated mice and increased longevity compared to the control.
FIG. 11 illustrates the time spent in underwater testing for treated and untreated animals.
Figure 12 illustrates the concentration of soluble Aβ-40 in treated animals compared to the control.
FIG. 13 illustrates the concentration of soluble Aβ-42 in treated animals compared to the control.
FIG. 14 illustrates the percentage of plaques identified in treated animals, reduced as compared to controls after thioflavin S staining.

기억 상실 및 손상된 학습능력은 광범위한 임상 상태의 특징이다. 예를 들어, 기억 상실은 알쯔하이머병을 포함한 치매 상태의 가장 공통된 증상이다. 기억력 결손은 또한 다발경색 치매(MID), 뇌혈관 결핍에 의해 유발되는 노인성 치매 및 파킨슨병을 동반하거나 동반하지 않은 알쯔하이머병의 루이소체 변이형, 또는 크레이츠펠트-야콥병과 같은 다른 종류의 치매에서도 일어난다. 기억 상실은 뇌가 손상된 환자의 공통된 특징이다. 뇌 손상은 예를 들어, 통상적 졸중 후에 또는 마취 사고, 두부 손상, 저혈당증, 일산화탄소 중독, 리튬 중독, 비타민(B1, 티아민 및 B12) 결핍증 또는 과량의 알콜 사용 또는 코르사코프병의 결과로서 발생할 수 있다. 기억력 손상은 추가로 연령과 관련되며, 성명, 장소 및 단어와 같은 정보를 회상하는 능력은 연령이 증가함에 따라 감소되는 것으로 보인다. 일시적 기억 상실이 전기경련요법(ECT) 후에 주요 우울 장애를 앓는 환자에서 일어날 수도 있다. 알쯔하이머병이 사실상 노년 집단에서 진행성 치매를 초래하는 가장 중요한 임상적 실재인 반면에, 저산소증/졸중은 신경계 장애와 관련되지 않은 현저한 기억력 결손을 초래한다.Memory loss and impaired learning are hallmarks of a wide range of clinical conditions. Memory loss, for example, is the most common symptom of dementia, including Alzheimer's disease. Memory deficits are also present in other types of dementia, such as multiple infarct dementia (MID), senile dementia caused by cerebrovascular deficiency and Alzheimer's variants with or without Parkinson's disease, or Creutzfeldt-Jakob disease. Happens. Memory loss is a common feature of patients with brain damage. Brain damage can occur, for example, after a general stroke or as a result of anesthesia accidents, head injury, hypoglycemia, carbon monoxide poisoning, lithium poisoning, vitamin (B1, thiamine and B12) deficiencies or excessive alcohol use or Korsakoff disease. Memory impairment is further age-related, and the ability to recall information such as names, places, and words seems to decrease with age. Temporary memory loss may occur in patients with major depressive disorder after electroconvulsion therapy (ECT). While Alzheimer's disease is the most important clinical reality that actually causes progressive dementia in the elderly population, hypoxia / stroke results in significant memory deficits not associated with neurological disorders.

알쯔하이머병을 앓는 개체는 진행성 기억력 손상, 언어와 시공간적 기술 및 행동 결함을 특징으로 한다[참조: McKhann et al., 1986, Neurology, 34: 939-944]. 알쯔하이머병을 앓는 개체의 인지 손상은 대뇌 피질, 해마, 전뇌 기저부 및 기타 뇌 영역에 위치하는 신경 세포의 퇴행의 결과이다. 부검시에 수득된 알쯔하이머병 뇌의 조직학적 분석은 퇴행성 뉴론의 핵주위부세포체 및 축색돌기내의 신경섬유농축체(NFT), 세포외 신경(노인성) 플라크 및 병에 걸린 뇌 영액의 일부 혈관 내부 및 주위의 아밀로이드 플라크의 존재를 입증하였다. 신경섬유농축체는 쌍을 이룬 나선형 필라멘트로도 지칭되는, 나선형 방식으로 쌍을 이룬 섬유(직경 약 10nm)를 함유하는 비정상적 섬유상 구조물이다. 신경 플라크는 퇴행성 신경 말단(축색돌기 및 수지상 둘다)에 위치하며 아밀로이드 단백질 섬유의 코어 화합물을 함유한다. 요약하면, 알쯔하이머병은 주로 세포골격 단백질로 이루어진 세포내 신경섬유농축체, 및 세포외 실질 및 뇌혈관 아밀로이드를 포함하는 특정한 신경병리학적 특징에 의해 특성화된다. 추가로, 당해 분야에는 알쯔하이머병 환자, 정상적인 노년층 및 기타 신경퇴행성 질환, 예를 들어, 파킨슨병, 헌팅턴 무도병, 베르니케-코르사코프 또는 정신분열증을 앓는 사람들을 구별하기 위한 신규한 방법이 있으며, 이는 예를 들어, 미국 특허 제5,580,748호 및 제6,080,582호에 추가로 기재되어 있다. Individuals with Alzheimer's disease are characterized by progressive memory impairment, language and spatiotemporal skills and behavioral deficits (McKhann et al., 1986, Neurology, 34: 939-944). Cognitive impairment in individuals with Alzheimer's disease is the result of degeneration of nerve cells located in the cerebral cortex, hippocampus, forebrain base and other brain regions. Histological analysis of Alzheimer's disease brain obtained at necropsy revealed neurofibrillary tangles (NFT), extracellular nerve (senile) plaques in degenerative neurons and some vessels of diseased brain fluid and The presence of surrounding amyloid plaques was demonstrated. Neurofibrous concentrates are abnormal fibrous structures containing fibers (about 10 nm in diameter) that are paired in a helical fashion, also referred to as paired helical filaments. Neural plaques are located at the degenerative nerve ends (both axons and dendritic) and contain core compounds of amyloid protein fibers. In summary, Alzheimer's disease is characterized by intracellular neurofibrillary tangles consisting predominantly of cytoskeletal proteins, and certain neuropathological features, including extracellular parenchyma and cerebrovascular amyloid. In addition, there are novel methods in the art to distinguish people with Alzheimer's disease, normal older people and other neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Huntington's chorea, Wernicke-Korsakoff or schizophrenia, for example For example, US Pat. Nos. 5,580,748 and 6,080,582 are further described.

알쯔하이머병은 단백질 이화작용의 변경을 특징으로 하며 특징적으로 초기 기억 상실과 함께 나타난다. AD의 대부분의 특징적 임상 징후는 기억 상실이다. 기억 상실은 전형적으로 질환의 과정에서 초기에 발생하며 주로 최근 정보의 학습에 영향을 미친다. 정상적 연상 기억 저장과 관련되며 AD 환자로부터의 세포에서 영향을 받거나 잘못 조절되는 분자상 과정 및 세포상 과정은 AD를 치료 또는 경감시키고/시키거나 기억을 개선시키기 위한 수단이다. AD에서 기억 획득과 기억 상실 간에 집중되어 있는 중심적이고 잠재적으로 중요한 위치는 단백질 키나제 C이다. 동물 모델에서 연상 기억에 중요한 다수의 분자 및 분자상 사건은 AD에서 변경되었거나 결함이 있는 것으로 나타났다. 이는 K⁺ 채널, 칼슘 조절 및 단백질 키나제 C(PKC)를 포함한다. PKC는 또한 AD 병태생리학에서 중요한 요소인 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 프로세싱에 관여한다. 변경된 단백질 인산화는 알쯔하이머병에서 발견되는 세포내 신경섬유농축체의 형성에 연루되었다. AD에서 발견되는 아밀로이드 플라크의 주요 성분이 유래되는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 이화작용에서의 단백질 인산화에 대한 역활이 또한 조사되어 왔다. 알쯔하이머병의 병리상태의 중요한 특징은 플라크 내부의 아밀로이드 단백질의 침착이다.Alzheimer's disease is characterized by alterations in protein catabolism and characteristically manifests with early memory loss. Most characteristic clinical signs of AD are memory loss. Memory loss typically occurs early in the course of the disease and primarily affects the learning of recent information. Molecular and cellular processes that are associated with normal associative memory storage and are affected or misregulated in cells from AD patients are means for treating or alleviating AD and / or improving memory. The central and potentially important location concentrated between memory acquisition and memory loss in AD is protein kinase C. Many molecular and molecular events that are important for associative memory in animal models have been shown to be altered or defective in AD. This includes K ⁺ channels, calcium regulation and protein kinase C (PKC). PKC is also involved in the processing of amyloid precursor protein (APP), an important factor in AD pathophysiology. Altered protein phosphorylation has been implicated in the formation of intracellular neurofibrillary tangles found in Alzheimer's disease. The role of protein phosphorylation in the catabolism of amyloid precursor protein (APP) from which the major component of amyloid plaques found in AD has been investigated has also been investigated. An important feature of the pathology of Alzheimer's disease is the deposition of amyloid proteins inside plaques.

아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 프로세싱은 이후에 응집하여, 노인성 또는 알쯔하이머(AD) 플라크로서 알려진 AD의 특징적인 아밀로이드 침착물을 형성하는 단편의 생산을 결정한다. 따라서, APP 프로세싱은 AD에서 초기의 주요 병태생리학적 사건이다.Processing of the amyloid precursor protein (APP) subsequently aggregates to determine the production of fragments that form characteristic amyloid deposits of AD known as senile or Alzheimer's (AD) plaques. Thus, APP processing is an early major pathophysiological event in AD.

3가지의 선택적 APP 프로세싱 경로가 동정되었다. 이리 명명된 "정상적" 프로세싱은 잔기 Lys16(또는 Lys16과 Leu17 사이; APP770 명명법)에서 Aβ 서열 내의 APP를 절단하여, 거대 N-말단 외부도메인(ectodomain) 및 소형 9kDa 막 결합형 단편의 비-아밀로이드형성성 단편들을 초래하는 효소의 참여를 포함한다. 아직 완전히 확인되지 않은 상기 효소는 α-세크레타제로서 공지되어 있다. 2개의 추가 세크레타제가 APP 프로세싱에 참여한다. 하나의 선택적 경로는 Met671과 Asp672 사이에서 Aβ 도메인 외부의 (β-세크레타제에 의한) APP의 분해 및 엔도솜-리소좀 시스템의 참여를 포함한다. 추가의 분해 부위는 Aβ 펩타이드의 39번째 아미노산 이후에 원형질막내의 Aβ 부분의 카복실-말단에서 발생한다. 세크레타제(γ) 작용은 전체 Aβ 서열과 약 6kDa의 세포 부착형 단편을 함유하는 세포외 아미노산 말단을 생성시킨다. 따라서, β및 γ 세크레타제에 의한 프로세싱은 잠재적 아밀로이드형성성 단편을 생성시키는데, 이는 이들 단편이 완전한 Aβ 서열을 함유하기 때문이다. 몇가지 유형의 증거는 모든 선택적 경로가 정해진 시스템내에서 발생하며 가용성 Aβ가 "정상 생성물"일 수 있음을 나타냈다. 그러나, CSF와 혈장내의 순환성 Aβ의 양이 "스웨덴식(Swedish)" 돌연변이를 보유한 환자에서 상승된다는 증거도 있다. 게다가, 이러한 돌연변이 또는 APP₇₁₇ 돌연변이로 형질감염된, 배양된 세포는 다량의 Aβ를 분비한다. 보다 최근에는, 기타 APP 돌연변이 및 PS1과 PS2 돌연변이의 보유자는 상승된 양의 특정 형태, 즉 긴(42개 또는 43개 아미노산) Aβ를 분비하는 것으로 나타났다.Three optional APP processing paths have been identified. This named “normal” processing cleaves APP in the Aβ sequence at residues Lys16 (or between Lys16 and Leu17; APP770 nomenclature) to form non-amyloid formation of large N-terminal external domains and small 9kDa membrane bound fragments. Involvement of enzymes resulting in sex fragments. The enzyme, not yet fully identified, is known as α-secretase. Two additional secretases participate in APP processing. One optional pathway involves the degradation of APP (by β-secretase) and participation of the endosome-lysosomal system outside the Aβ domain between Met671 and Asp672. Additional cleavage sites occur at the carboxyl-terminus of the Aβ portion in the plasma membrane after the 39th amino acid of the Aβ peptide. Secretase (γ) action produces an extracellular amino acid terminus that contains the entire Αβ sequence and about 6 kDa cell-attached fragments. Thus, processing with β and γ secretases creates potential amyloidogenic fragments because these fragments contain complete Aβ sequences. Some type of evidence indicated that all selective pathways occur within a given system and that the soluble Αβ may be a "normal product". However, there is also evidence that the amount of circulating Αβ in CSF and plasma is elevated in patients with "Swedish" mutations. In addition, cultured cells transfected with this or APP ₇₁₇ mutations secrete large amounts of Aβ. More recently, other APP mutations and carriers of PS1 and PS2 mutations have been shown to secrete elevated amounts of certain forms, long (42 or 43 amino acids) Aβ.

따라서, 모든 선택적 경로가 정상적으로 일어날 수 있다해도, 우선되는 불균형한 아밀로이드형성성 프로세싱이 가족성 AD 및 아마도 산발성 AD에서 일어난다. 이러한 증진된 아밀로이드형성성 경로는 결국에는 AD 환자에서 뇌내의 원섬유 및 플라크 형성을 유도한다. 따라서, 비-아밀로이드형성성 α-세크레타제 경로가 우선되도록 하는 중재는 APP 프로세싱의 균형을 잠재적 독성 Aβ 펩타이드와 비교해 sAPP의 상대량을 증가시키는 추측상 비-병원성 경로 방향으로 효과적으로 이동시킨다.Thus, although all selective pathways can occur normally, preferential imbalanced amyloidogenic processing occurs in familial AD and possibly sporadic AD. This enhanced amyloidogenic pathway eventually leads to fibril and plaque formation in the brain in AD patients. Thus, interventions that make non-amyloidogenic α-secretase pathways preferentially shift the balance of APP processing in the direction of speculative non-pathogenic pathways that increase the relative amount of sAPP compared to potential toxic Aβ peptides.

PKC 이소엔자임은 생화학적, 생물리학적 및 행동학적 효능의 독특한 상관관계가 입증될 수 있게 하고 피험자에게 적용되어 인지능력을 개선시킬 수 있도록 하는 중요하고 특이적인 율속 분자 표적을 제공한다.PKC isoenzymes provide important and specific rate-of-molecular targets that enable unique correlations of biochemical, biophysical and behavioral efficacy to be demonstrated and applied to subjects to improve cognitive abilities.

본 발명의 발명자들은 단백질 키나제 C(PKC)의 활성화제로서 브리오스타틴을 연구하였다. 알쯔하이머머병(AD) 환자의 섬유모세포의 변경 중에서 PKC의 변경 뿐만 아니라 칼슘 조절과 칼륨(K⁺) 채널의 변경이 포함된다. PKC 활성화는 TEA-유도된 [Ca^{2 +}] 상승으로 측정된 바에 의하면 정상 K⁺ 채널 기능을 복구시키는 것으로 나타났다. 추가의 패치-클램프 데이터는 113pS K⁺ 채널 활성의 복구에 미치는 PKC 활성화제의 효과를 증명한다. 따라서, PKC 활성화제에 기초한 K⁺ 채널의 복구는 AD 병태생리학의 조사에 관한 접근법으로서 확립되었으며 AD 치료제에 대한 유용한 모델을 제공한다[참조: 전문이 본원에서 참조로 인용되는 계류중인 출원 제09/652,656].The inventors of the present invention studied bryostatin as an activator of protein kinase C (PKC). Alterations of fibroblasts in patients with Alzheimer's disease (AD) include alterations in PKC as well as alteration of calcium regulation and potassium (K ⁺ ) channels. PKC activation has been shown to reportedly measured as TEA- induced [Ca ^{2 +]} it rises restore normal K ⁺ channel function. Additional patch-clamp data demonstrate the effect of the PKC activator on the recovery of 113 pS K ⁺ channel activity. Thus, repair of K ⁺ channels based on PKC activators has been established as an approach to the investigation of AD pathophysiology and provides a useful model for AD therapies. See pending application No. 09 /, which is incorporated herein by reference in its entirety. 652,656].

알쯔하이머병(AD) 환자의 말초 조직과 동물 신경세포의 사용은 AD 뇌에서의 유사한 과정을 반영하는 다수의 세포상/분자상 변경을 동정할 수 있게 함으로써 병태생리학적 관련성을 동정할 수 있게 한다[참조: Baker et al., 1988; Scott, 1993; Huang, 1994; Scheuner et al., 1996; Etcheberrigaray & Alkon, 1997; Gasparini et al., 1997]. 칼륨 채널 기능의 변경은 AD 환자로부터 수득된 섬유모세포[참조: Etcheberrigaray et al., 1993] 및 혈액 세포[참조: Bondy et al., 1996]에서 동정되었다. 또한, AD 병태생리학에서 주요 역활자로서 널리 인정된 β-아밀로이드[참조: Gandy & Greengard, 1994; Selkoe, 1994; Yankner, 1996]는 대조군 섬유모세포에서 AD-유사 K⁺ 채널의 변경을 유도할 수 있는 것으로 나타났다[참조: Etcheberrigaray et al., 1994]. K⁺ 채널에 미치는 β-아밀로이드의 유사하거나 필적하는 효과는 실험실 동물의 뉴론에서 보고된 바 있다[참조: Good et al., 1996; 또한 개관에 대해서는 Fraser et al., 1997를 참조]. AD 뇌내의 해마에서 아파민-민감성 K⁺ 채널 변경(아파민 결합으로 측정됨)의 초기 관찰은 K⁺ 채널이 AD에서 병태생리학적으로 관련될 수 있다는 제시를 뒷받침한다[참조: Ikeda et al., 1991]. 게다가, 단백질 키나제 C(PKC)는 AD 환자의 말초 조직과 뇌 조직에서 필적하는 효과를 나타낸다. 이러한 효소(들)의 수준 및/또는 활성은 AD 환자의 뇌와 섬유모세포에서 유도되었다[참조: Cole et al., 1988; Van Huynh et al., 1989; Govoni et al., 1993; Wang et al., 1994]. 면역블롯팅 분석을 이용한 연구로 각종 PKC 이소자임, 주로 α 이소자임은 AD 환자의 섬유모세포에서 현저하게 감소된 한편[참조: Govoni et al., 1996], α이소자임과 β이소자임은 둘다 AD 환자의 뇌에서 감소된 것으로 드러났다[참조: Shimohama et al., 1993; Masliah et al., 1990]. 이러한 뇌 PKC 변경은 질환 과정에서 초기 사건일 수 있다[참조: Masliah et al., 1991]. 또한, 흥미롭게도, PKC 활성화가 아밀로이드 전구체 단백질의 비-아밀로이드형성성 프로세싱을 선호하는 것으로 보인다는 것이 주지된다[참조: Buxbaum et al., 1990; Gillespie et al., 1992; Selkoe, 1994; Gandy & Greengard, 1994; Bergamashi et al., 1995; Desdouits et al., 1996; Efhimiopoulus et al., 1996]. 따라서, PKC 및 K⁺ 채널 변경은 둘다 AD에 공존하며 AD에서 말초 및 뇌에서 발현된다. The use of peripheral tissues and animal neurons in patients with Alzheimer's disease (AD) enables the identification of pathophysiological relevance by enabling the identification of a number of cellular / molecular changes that reflect similar processes in the AD brain [ See Baker et al., 1988; Scott, 1993; Huang, 1994; Scheuner et al., 1996; Etcheberrigaray & Alkon, 1997; Gasparini et al., 1997]. Alterations in potassium channel function have been identified in fibroblasts (Etcheberrigaray et al., 1993) and blood cells (Bondy et al., 1996) obtained from AD patients. In addition, β-amyloid widely recognized as a major role in AD pathophysiology [Gandy & Greengard, 1994; Selkoe, 1994; Yankner, 1996] has been shown to be able to induce alteration of AD-like K ⁺ channels in control fibroblasts (Etcheberrigaray et al., 1994). Similar or comparable effects of β-amyloid on K ⁺ channels have been reported in neurons in laboratory animals. Good et al., 1996; See also Fraser et al., 1997 for an overview. Early observations of apamin-sensitive K ⁺ channel alterations (measured by apamin binding) in the hippocampus in the AD brain support the suggestion that K ⁺ channels may be pathophysiologically related to AD [Ikeda et al. , 1991]. In addition, protein kinase C (PKC) has comparable effects in peripheral and brain tissues of AD patients. The level and / or activity of these enzyme (s) was induced in the brain and fibroblasts of AD patients. See Cole et al., 1988; Van Huynh et al., 1989; Govoni et al., 1993; Wang et al., 1994]. Studies using immunoblotting analysis have shown that various PKC isozymes, mainly α isozymes, are significantly reduced in fibroblasts of AD patients (Govoni et al., 1996), while both α and β isozymes are AD It has been shown to be reduced in the brain of the patient. Shimohama et al., 1993; Masliah et al., 1990. Such brain PKC alterations may be early events in the disease process (Masalih et al., 1991). It is also interesting to note that PKC activation appears to favor non-amyloidogenic processing of amyloid precursor proteins. Buxbaum et al., 1990; Gillespie et al., 1992; Selkoe, 1994; Gandy & Greengard, 1994; Bergamashi et al., 1995; Desdouits et al., 1996; Efhimiopoulus et al., 1996]. Thus, both PKC and K ⁺ channel alterations coexist in AD and are expressed in peripheral and brain in AD.

PKC가 K⁺ 채널을 포함하는 이온 채널을 조절하고 결손 PKC가 결손 K⁺ 채널을 유도하는 것으로 공지되어 있기 때문에 PKC와 K⁺ 채널 변경 사이의 연관성이 조사되어 왔다. 이는 APP의 조절뿐만 아니라 기억 확립과 회상에서 하는 PKC 및 K⁺ 채널의 역활을 위해 중요한 것이다[참조: Alkon et al., 1988; Covarrubias et al., 1994; Hu et al., 1996]. AD 섬유모세포는 K⁺ 채널과 PKC가 결손 둘다를 입증하기 위해 사용되었다[참조: Etcheberrigaray et al., 1993; Govoni et al., 1993, 1996]. 또한, 연구에 의해, PKC 활성화제로 처리된, 공지된 기능장애 K⁺ 채널을 갖는 섬유모세포가 TEA-유도된 칼슘 상승의 존재/부재로 모니터링한 바와 같이 채널 활성을 복구시키는 것으로 나타났다. 또한, 테트라에틸암모늄 클로라이드(TEA)-유도된 [Ca^{2 +}] 상승에 기초한 검정은 기능성 113pS K⁺ 채널이 TEA 차단에 감수성임을 나타내기 위해 사용되었다. 따라서, 대조군 개체의 섬유모세포에서 관찰된 TEA-유도된 [Ca^{2 +}] 상승 및 K⁺ 채널 활성은 AD 환자의 섬유모세포에는 실질적으로 존재하지 않는다[참조: Etcheberrigaray et al., 1993; Hirashima et al., 1996]. 이러한 연구는 PKC 활성화제의 사용이 TEA 시험처리(challenge)에 대한 AD 섬유모세포주의 반응성을 복구시킬 수 있음을 입증한다. 또한, 이러한 연구로부터의 면역블롯 증거는 이러한 복구가 α-이소형의 우선적인 참여와 관련됨을 입증한다.The association between PKC and K ⁺ channel alterations has been investigated because PKC regulates ion channels comprising K ⁺ channels and the missing PKC induces missing K ⁺ channels. This is important not only for the regulation of APP, but also for the role of PKC and K ⁺ channels in memory establishment and recall [Alkon et al., 1988; Covarrubias et al., 1994; Hu et al., 1996. AD fibroblasts have been used to demonstrate both K ⁺ channels and PKC deficiencies. Etcheberrigaray et al., 1993; Govoni et al., 1993, 1996]. In addition, studies have shown that fibroblasts with known dysfunctional K ⁺ channels treated with PKC activators restore channel activity as monitored by the presence / absence of TEA-induced calcium elevations. Further, tetraethylammonium chloride (TEA) - black, based on the induced [Ca ^{2 +]} increase was used to indicate that the functional channel 113pS K ⁺ sensitive to TEA blocked. Accordingly, the fiber TEA- the [Ca ^{2 +]} increases, and K ⁺ channel activity observed in induced cells in the control object is not present substantially, the fibroblasts of patients with AD [see: Etcheberrigaray et al, 1993; Hirashima et al., 1996]. This study demonstrates that the use of PKC activators can restore the responsiveness of AD fibroblast lines to TEA challenge. In addition, immunoblot evidence from this study demonstrates that this repair is associated with the preferential participation of the α-isotype.

본 발명의 발명자들은 또한 단백질 키나제 C의 활성화가 알쯔하이머병(AD) 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 α-세크레타제 프로세싱을 선호하여 비-아밀로이드형성성 가용성 APP(sAPP)의 생성을 초래함을 관찰하였다. 따라서, 아밀로이드형성성 A_1-40 및 A_1-42(3)의 상대적 분비량이 감소된다. 이는 APP 및 프레세닐린 AD 돌연변이를 발현하는 섬유모세포 및 기타 세포가 증가된 양의 전체 Aβ 및/또는 증가된 비의 A_1-42(3)/A_1-40를 분비하기 때문에 특히 중요한 것이다. 흥미롭게도, PKC 결손은 AD 뇌(α 및 β이소형) 및 AD 환자의 섬유모세포(α 이소형)에서 발견되었다.The inventors also observed that activation of protein kinase C favors α-secretase processing of Alzheimer's disease (AD) amyloid precursor protein (APP) resulting in the production of non-amyloidogenic soluble APP (sAPP). It was. Thus, the relative amounts of amyloidogenic A _1-40 and A _{1-42 (3)} are reduced. This is particularly important because fibroblasts and other cells expressing APP and presenilin AD mutations secrete increased amounts of total Aβ and / or increased ratios of A _{1-42 (3)} / A _1-40 . Interestingly, PKC deficiencies have been found in AD brains (α and β isotypes) and fibroblasts (α isotypes) in AD patients.

연구로 α, β 및 γ 이소형에 대한 선택성이 개선된 기타 PKC 활성화제(즉, 벤조락탐)가 sAPP 분비를 기저 수준 이상으로 증진시키는 것으로 나타났다. 벤조락탐-처리된 AD 세포에서의 sAPP 분비는 또한 10μM BL 처리 후에 약간의 sAPP 분비 증가만을 나타낸 대조군 벤조락탐-처리된 섬유모세포에 비해 다소 높았다. 스타우로스포린(PKC 억제제)이 대조군 및 AD 섬유모세포 둘다에서 벤조락탐의 효과를 제거한 한편 관련 화합물이 PC12 세포에서 약 3배의 sAPP 분비를 유발함이 추가로 보고되었다. 본 발명의 발명자들은 브리오스타틴이 종양을 촉진하지 않으며 이미 II기 임상 시험중에 있기 때문에 비-아밀로이드형성성 APP 프로세싱을 선호하는 PKC 활성화제로서의 브리오스타틴의 사용이 특히 치료학적 가치가 있다는 것을 밝혀냈다.Studies have shown that other PKC activators (ie benzolactams) with improved selectivity to the α, β and γ isotypes enhance sAPP secretion above baseline levels. SAPP secretion in benzolactam-treated AD cells was also somewhat higher than control benzolactam-treated fibroblasts, which showed only a slight increase in sAPP secretion after 10 μM BL treatment. It was further reported that staurosporin (PKC inhibitor) eliminated the effects of benzolactam in both control and AD fibroblasts, while the related compounds caused about three-fold sAPP secretion in PC12 cells. The inventors of the present invention have found that the use of bryostatin as a PKC activator favoring non-amyloidogenic APP processing is of particular therapeutic value because bryostatin does not promote tumors and is already in Phase II clinical trials.

기억은 정보 처리와 관련된 뇌 구조내의 지속적 시냅스 변형의 결과인 것으로 사료되고 있다. 시냅스는, 기억 관련 사건에 변화된 유전자 발현 및 단백질 전사, 변경된 키나제 활성 또는 변형된 시그날전달 다단계가 관여하는지에 관계없이, 기억 관련 사건이 이의 기능적 발현을 현실화하도록 하는 최종 표적으로서 중요한 부위인 것으로 고려된다. Ca^{2 +}/칼모둘린 II 키나제, 단백질 키나제 C, 칼렉시틴, 22-kDa 학습-관련 Ca^{2 +} 결합 단백질 및 II형 리아노딘 수용체를 포함하는 소수의 단백질이 연상 기억에 연루되어 왔다. 거대환 락톤의 투여를 통한 PKC의 조절은 시냅스 변형을 개시하는 기작을 제공한다.Memory is believed to be the result of persistent synaptic modifications in the brain structures involved in information processing. Synapses are considered to be important sites as final targets to enable memory-related events to realize their functional expression, regardless of whether memory-related events involve altered gene expression and protein transcription, altered kinase activity, or modified signal transduction multistage. . Ca ^{2 +} / calmodulin kinase II, protein kinase C, knife Lexi tin, 22-kDa learning-related Ca ^{2 +} binding proteins a small number of containing the protein and the Type II RIA nodin receptors have been implicated in the associative memory. Regulation of PKC through the administration of macrocyclic lactones provides a mechanism for initiating synaptic modification.

기억과 학습이 손상된 부위는 기억 및 학습 과정의 상이한 특징을 입증할 수 있는 동물 모델에 풍부하다[참조: Hollister, L. E., 1990, Pharmacopsychiat., 23, (Suppl 11) 33-36]. 이용가능한 기억 상실 및 손상된 학습력 동물 모델은 별개의 사건을 상기해내는 동물의 능력을 측정함을 포함한다. 이들 시험은 모리스 수중 미로 및 수동 회피 시험을 포함한다. 모리스 수중 미로에서, 동물은 4개의 사분역(이중 하나만이 물 아래에 안전한 플랫폼을 갖고 있다)으로 나누어진 탱크에서 수영하도록 한다. 상기 플랫폼을 제거하고 동물을 부정확한 사분역에 대해 정확한 사분역을 찾는데 소요된 시간에 대해 시험한다. 수동 회피 시험에서, 동물은 경미한 전기 충격이 전달되는 상이한 환경을 상기해내고 제2 경우에 이를 회피한다. 수동 회피 시험의 변이형은 밝은 개방된 환경보다 어두운 폐쇄된 환경을 선호하는 설치류의 선호도를 사용한다. 추가의 논의는 다음 문헌에서 찾아볼 수 있다[참조: Crawley, J. N., 1981, Pharmacol. Biochem. Behav., 15,695-699 ; Costall, B. et al, 1987, Neuropharmacol., 26,195-200 ; Costall, B. et al, 1989, Pharmacol. Biochem. Behav., 32,777-785 ; Barnes, J. M. et al, 1989, Br. J. Pharmacol., 98 (Suppl) 693P; Barnes, J. M. et al., 1990, Pharmacol. Biochem. Behav., 35,955-962].Sites with impaired memory and learning are abundant in animal models that can demonstrate different characteristics of memory and learning processes (Hollister, L. E., 1990, Pharmacopsychiat., 23, (Suppl 11) 33-36). Available memory loss and impaired learning ability animal models include measuring the animal's ability to recall discrete events. These tests include the Morris Water Maze and Passive Evasion Tests. In the Morris underwater maze, animals are allowed to swim in tanks divided into four quadrants, only one of which has a safe platform under water. The platform is removed and the animal is tested for the time taken to find the correct quadrant for the incorrect quadrant. In a passive avoidance test, the animal is reminded of the different circumstances in which a slight electric shock is transmitted and avoids it in the second case. A variant of the passive avoidance test uses rodent preference, which favors a dark closed environment over a bright open environment. Further discussion can be found in the following publications: Crawley, J. N., 1981, Pharmacol. Biochem. Behav., 15,695-699; Costall, B. et al, 1987, Neuropharmacol., 26, 195-200; Costall, B. et al, 1989, Pharmacol. Biochem. Behav., 32,777-785; Barnes, J. M. et al, 1989, Br. J. Pharmacol., 98 (Suppl) 693P; Barnes, J. M. et al., 1990, Pharmacol. Biochem. Behav., 35,955-962.

"정상적"이란 용어의 사용은 감소된 또는 손상된 인지기능을 갖거나 이를 나타내는 것으로 진단되지 않은 개체를 포함하여 의미된다. 상이한 인지능력은 운동-공간 기술의 시험 내지 보다 복잡한 기억 회상 시험을 포함하나 이에 제한되지 않는 당해 분야에 익히 확립된 공지된 기술을 통해 시험하고 평가할 수 있다. 비영장류의 인지능력용으로 사용되는 시험의 비제한적 예에는 모리스 수중 미로, 방사상 미로, T자 미로, 눈 깜빡거림 조건화(Eye Blink Conditioning), 지연회상 및 단서회상이 포함되며, 영장류 피험자 시험용에는 눈 깜빡거림, 지연회상, 단서회상, 얼굴인식, 간이 정신상태 검사 및 알쯔하이머병 평가 인지 세부평가(ADAS-Cog)가 포함된다. 이들 시험 중 다수는 전형적으로 AD를 앓는 환자를 위한 정신 상태 평가에서 사용된다. 마찬가지로, 유사한 목적을 위한 동물 모델에 대한 평가는 문헌에 익히 기재되어 있다.The use of the term "normal" is meant to include individuals who have not been diagnosed with or exhibit reduced or impaired cognitive function. Different cognitive abilities can be tested and assessed through known techniques well established in the art, including but not limited to tests of motor-spatial techniques or more complex memory recall tests. Non-limiting examples of tests used for cognitive abilities of non-primates include the Morris Water Maze, Radial Maze, T-Shaped Maze, Eye Blink Conditioning, Delayed Recall, and Clue Recall. Flickering, delayed recall, clue recall, facial recognition, simplified mental state testing, and Alzheimer's disease assessment cognitive sub-assessment (ADAS-Cog). Many of these tests are typically used in mental state assessment for patients with AD. Likewise, evaluation of animal models for similar purposes is well described in the literature.

PKC를 자극하도록 작용하는 거대환 락톤(즉, 브리오스타틴류 및 네리스타틴류)이 특히 관심대상이다. 브리오스타틴류 화합물 중에서 브리오스타틴-1이 PKC를 활성화시키는 것으로 나타났고 종양 촉진 활성이 없는 것으로 증명되었다. PKC 활성화제로서의 브리오스타틴-1은 브리오스타틴-1의 용량 반응 곡선이 이상성(biphasic)이기 때문에 특히 유용하다. 또한, 브리오스타틴-1은 PKCα, PKCδ 및 PKCε을 포함하는 PKC 이소자임의 차별적 조절을 나타낸다. 브리오스타틴-1은 동물 및 사람에서 독성과 안정성 시험중에 있으며 항암제로서 활발히 조사되고 있다. 연구시 브리오스타틴-1의 사용은 사람에서의 주된 부작용이 근육통인 것으로 결정되었으며 최대 용량이 40mg/m²로 제한되었다. 본 발명의 sAPP 분비의 급격한 증가를 유발하기 위해 0.1nM의 브리오스타틴-1의 농도를 사용하였다. 브리오스타틴-1은 단독의 비히클 및 10,000배 높은 농도에서 사용된 다른 PKC 활성화제인 벤조락탐(BL)과 비교하였다. 또한, 0.01nM에서 사용된 브리오스타틴도 sAPP 분비를 개선시키는데 효과적인 것으로 증명되었다(도 1A 참조). PKC 전위는 활성화의 정도가 30분째에 최대이고 이후에 부분적으로 감소하여 최대 6시간까지 기저 전위 수준보다 높게 유지되는 것으로 나타난다(도 1B, 2, 8 및 9 참조). PKC 억제제 스타우로스포린의 사용은 sAPP 분비에 미치는 브리오스타틴의 효과를 완전히 방지한다. 데이타는 PKC 활성화가 sAPP 분비에 미치는 브리오스타틴의 효과를 매개함을 입증한다(도 1 및 2 참조).Of particular interest are macrocyclic lactones (ie bryostatins and neristatins) that act to stimulate PKC. Among the bryostatins compounds, bryostatin-1 has been shown to activate PKC and has been shown to have no tumor promoting activity. Briostatin-1 as a PKC activator is particularly useful because the dose response curve of bryostatin-1 is biphasic. In addition, bryostatin-1 exhibits differential regulation of PKC isozymes, including PKCα, PKCδ and PKCε. Briostatin-1 is being tested for toxicity and stability in animals and humans and is being actively investigated as an anticancer agent. The use of bryostatin-1 in the study was determined to be the major side effect of muscle pain in humans, with a maximum dose limited to 40 mg / m ² . A concentration of bryostatin-1 of 0.1 nM was used to cause a sharp increase in sAPP secretion of the present invention. Briostatin-1 was compared to benzolactam (BL), a vehicle alone and other PKC activators used at concentrations 10,000 times higher. In addition, bryostatin used at 0.01 nM also proved effective in improving sAPP secretion (see FIG. 1A). The PKC translocation appears to be at a maximum degree of activation at 30 minutes and then partially decreases to remain above the base potential level for up to 6 hours (see FIGS. 1B, 2, 8 and 9). The use of the PKC inhibitor staurosporin completely prevents the effect of bryostatin on sAPP secretion. The data demonstrate that PKC activation mediates the effect of bryostatin on sAPP secretion (see FIGS. 1 and 2).

거대환 락톤, 특히 브리오스타틴-1은 미국 특허 제4,560,774호에 기재되어 있다. 거대환 락톤 및 이의 유도체는 당해 분야의 다른 곳, 예를 들어, 미국 특허 제6,187,568호, 미국 특허 제6,043, 270호, 미국 특허 제5,393,897호, 미국 특허 제5,072,004호, 미국 특허 제5,196,447호, 미국 특허 제4,833,257호 및 제4,611,066호에 기재되어 있다. 상기 특허들에는 각종 화합물과, 소염제 또는 항종양제로서의 용도를 포함한 거대환 락톤에 대한 각종 용도가 기재되어 있다. 브리오스타틴류 화합물에 대한 다른 논의는 문헌[참조: Differential Regulation of Protein Kinase C Isozymes by Bryostatin 1 and Phorbol 12-Myristate 13-Acetate in NIH 3T3 Fibroblasts, Szallasi et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 269, No. 3, pp. 2118-24 (1994); Preclinical Pharmacology of the Natural Product Anticancer Agent Bryostatin 1, an Activator of Protein Kinase C, Zhang et al., Caner Research 56, 802-808 (1996); Bryostatin 1, an activator of protein kinase C, inhibits tumor promotion by phorbol esters in SENCAR mouse skin, Hennings et al., Carcinogenesis vol. 8, no. 9, pp 1343-46 (1987); Phase II Trial of Bryostatin 1 in Patients with Relapse Low-Grade Non-Hodgkin's Lymphoma and Chronic Lymphocytic Leukemia, Varterasian et al., Clinical Cancer Research, Vol. 6, pp. 825-28 (2000); and Review Article: Chemistry and Clinical Biology of the Bryostatins, Mutter et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 8, pp. 1841-1860 (2000)]에서 찾아볼 수 있다. Macrocyclic lactones, particularly bryostatin-1, are described in US Pat. No. 4,560,774. Macrocyclic lactones and derivatives thereof are described elsewhere in the art, for example, US Pat. No. 6,187,568, US Pat. No. 6,043,270, US Pat. No. 5,393,897, US Pat. No. 5,072,004, US Pat. No. 5,196,447, USA Patents 4,833,257 and 4,611,066. These patents describe various compounds and their uses for macrocyclic lactones, including as anti-inflammatory or anti-tumor agents. Other discussions of bryostatin compounds can be found in Differential Regulation of Protein Kinase C Isozymes by Bryostatin 1 and Phorbol 12-Myristate 13-Acetate in NIH 3T3 Fibroblasts, Szallasi et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 269, no. 3, pp. 2118-24 (1994); Preclinical Pharmacology of the Natural Product Anticancer Agent Bryostatin 1, an Activator of Protein Kinase C, Zhang et al., Caner Research 56, 802-808 (1996); Bryostatin 1, an activator of protein kinase C, inhibits tumor promotion by phorbol esters in SENCAR mouse skin, Hennings et al., Carcinogenesis vol. 8, no. 9, pp 1343-46 (1987); Phase II Trial of Bryostatin 1 in Patients with Relapse Low-Grade Non-Hodgkin's Lymphoma and Chronic Lymphocytic Leukemia, Varterasian et al., Clinical Cancer Research, Vol. 6, pp. 825-28 (2000); and Review Article: Chemistry and Clinical Biology of the Bryostatins, Mutter et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 8, pp. 1841-1860 (2000).

브리오스타틴류를 포함하는 거대환 락톤은 본래 뷰굴라 네리티나 엘.(Bugula neritina L.)로부터 유도된 공지된 화합물을 대표한다. 거대환 락톤, 특히 브리오스타틴류에 대한 다수의 용도가 공지되어 있으나 거대환 락톤과 인지 증진 사이의 관련성은 아직 공지되어 있지 않다.Macrocyclic lactones, including bryostatins, represent known compounds originally derived from Bugula neritina L .. Numerous uses are known for macrocyclic lactones, particularly bryostatins, but the relationship between macrocyclic lactones and cognitive enhancement is not yet known.

본 발명에서 사용되 수 있는 화합물의 예에는 거대환 락톤(즉, 브리오스타틴류 및 네리스타틴류 화합물)이 포함된다. 이들 화합물의 특정 양태는 실시예 및 상세한 설명에 기재되어 있으며, 참조문헌에 기재된 화합물들 및 이들의 유도체도 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.Examples of compounds that can be used in the present invention include macrocyclic lactones (ie, bryostatins and nelistatins compounds). Certain embodiments of these compounds are described in the Examples and the Detailed Description, and it should be understood that the compounds and derivatives thereof described in the references can also be used in the compositions and methods of the present invention.

당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 거대환 락톤 화합물 및 이의 유도체, 특히 브리오스타틴류는 조합적 합성 기술로 다루기가 쉬우므로 당해 화합물의 라이브러리를 생성시켜, 조성물의 효능 및 안정성을 포함하나 이에 제한되지 않는 약리학적 파라메터를 최적화시킬 수 있다. 추가로, 이러한 라이브러리를 검정하여, α-세크레타제 및/또는 PKC를 선호적으로 조절하는 구성원을 결정할 수 있다.As will be appreciated by those skilled in the art, macrocyclic lactone compounds and derivatives thereof, especially bryostatins, are easy to handle with combinatorial synthetic techniques, resulting in libraries of the compounds, including the efficacy and stability of the composition. One can optimize the pharmacological parameters, which are not limited thereto. In addition, such libraries can be assayed to determine members that preferentially modulate α-secretase and / or PKC.

천연 생성물 및 발효 브로쓰의 조합적 라이브리리 고처리량 스크리닝으로 몇가지 신규 약물이 발견되었다. 현재, 화학적 다양성의 생성 및 스크리닝은 선도 화합물의 발견을 위한 주요 기술로서 널리 사용되고 있으며, 이는 확실히 약물 발견 분야에서 중요한 근본적 진보이다. 게다가, "선도" 화합물이 동정된 후, 조합적 기술은 목적하는 생물학적 활성의 최적화를 위한 유익한 도구를 제공한다. 이해될 수 있는 바와 같이, 대상 반응은 약제 또는 기타 생물학적으로 또는 의학적으로 관련되는 활성 또는 물질 관련 품질의 스크리닝을 위한 화합물의 조합적 라이브러를 생성시키기에 매우 적합하다. 본 발명의 목적을 위한 조합적 라이브러리는 목적하는 특성에 대해 함께 스크리닝될 수 있는 화학적으로 관련되는 화합물들의 혼합물로서, 상기 라이브러리는 용액 중에 존재할 수 있거나 고체 지지체에 공유적으로 연결될 수 있다. 다수의 관련 화합물을 단일 반응으로서 제조하는 것은 수행되어야할 필요가 있는 다수의 스크리닝 과정을 크게 감소시키고 단순화시킨다. 적절한 생물학적 특성에 대한 스크리닝은 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 α-세크레타제 및/또는 PKC에 효과적으로 결합하는 하나 이상의 본 발명의 화합물의 능력을 측정하는 방법을 또한 제공한다.Combination library high throughput screening of natural products and fermentation broth has found several new drugs. At present, the generation and screening of chemical diversity is widely used as the main technique for the discovery of the leading compounds, which is certainly an important fundamental advance in the field of drug discovery. In addition, after "leading" compounds have been identified, combinatorial techniques provide a valuable tool for the optimization of the desired biological activity. As can be appreciated, the subject response is well suited to generate combinatorial libraries of compounds for screening of pharmaceutical or other biologically or medically relevant activity or substance related qualities. Combinatorial libraries for the purposes of the present invention are mixtures of chemically related compounds that can be screened together for desired properties, which may be present in solution or covalently linked to a solid support. The preparation of multiple related compounds as a single reaction greatly reduces and simplifies the multiple screening procedures that need to be performed. Screening for appropriate biological properties can be performed by conventional methods. Accordingly, the present invention also provides a method of measuring the ability of one or more compounds of the invention to bind α-secretase and / or PKC effectively.

하기하는 조합적 라이브리러를 제조하기 위한 다양한 기술이 당해 분야에서 이용가능하지만, 본 발명이 상기한 예와 설명에 의해 제한되지 않음이 이해될 것이다[참조: Bondelle et al. (1995) TrendsAnal. Chem. 14: 83; the Affymax 미국 특허 제5,359,115호 및 제5,362,899호: the Ellman 미국 특허 제5,288,514호: the Still et al. PCT 공개공보 제WO 94/08051호; Chen et al. (1994) JACS1 1 6: 2661 : Kerr et al.(I 993) JACS11 5: 252; PCT 공개공보 제W092/10092호, 제W093/09668호 및 제W091/07087호; 및 the Lemer et al. PCT 공개공보 제W093/20242호]. 따라서, 약 16개 내지 1,000,000개 이상의 다양성(diversomer)에 속하는 다양한 라이브러리를 합성하고 특정 활성 또는 특성에 대해 스크리닝할 수 있다.While various techniques for making the combinatorial libraries described below are available in the art, it will be understood that the invention is not limited by the examples and descriptions set forth above. See, eg, Bondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14: 83; the Affymax US Pat. Nos. 5,359,115 and 5,362,899: the Ellman US Pat. No. 5,288,514: the Still et al. PCT Publication No. WO 94/08051; Chen et al. (1994) JACS1 1 6: 2661: Kerr et al. (I 993) JACS11 5: 252; PCT Publications W092 / 10092, W093 / 09668 and W091 / 07087; And the Lemer et al. PCT Publication No. W093 / 20242]. Thus, various libraries belonging to about 16 to 1,000,000 or more diversomers can be synthesized and screened for specific activities or properties.

본 발명의 화합물은 다양한 경로에 의해 경구, 직장, 비경구(예; 피하, 근육내 및 정맥내), 경막외, 경막내, 관절내, 국소 및 구강 투여를 포함하는 다양한 투여 형태로 투여할 수 있다. 사람 성인에 대한 용량 범위는 환자의 연령, 체중 및 상태 및 투여 경로를 포함하는 다수의 요인에 따라 좌우될 수 있다.The compounds of the invention can be administered in a variety of dosage forms including oral, rectal, parenteral (eg, subcutaneous, intramuscular and intravenous), epidural, intradural, intraarticular, topical and oral administration by a variety of routes. have. Dosage ranges for human adults may depend on a number of factors, including the age, weight and condition of the patient and the route of administration.

경구 투여의 경우, 희석제, 분산제 및/또는 표면활성제를 함유하는 미세 분말 또는 과립을 음료(draft), 물 또는 시럽제 중에서, 건조한 상태로 캡슐 또는 샤세제 중에서, 현탁화제가 포함될 수 있는 비-수성 현탁제중에서 또는 수중 현탁제 또는 시럽제 중에서 제조할 수 있다. 경우에 따라 또는 필요에 따라 풍미제, 방부제, 현탁화제, 증점제 또는 유화제가 포함될 수 있다.For oral administration, fine powders or granules containing diluents, dispersants and / or surfactants may be used in non-aqueous suspensions, which may include suspending agents in beverages, water or syrups, in dry capsules or cachets. It may be prepared in air or in suspension or syrup in water. Flavors, preservatives, suspending agents, thickeners or emulsifiers may be included as desired or as desired.

혼합에 의해 포함될 수 있는 기타 화합물에는 예를 들어, 의학적 불활성 성분, 예를 들어, 정제 또는 캡슐제용의 락토스, 덱스트로스, 사카로스, 셀룰로스, 전분 또는 탄산칼슘, 연질 캡슐제용 올리브유 또는 에틸 올레이트 및 현탁제 또는 유제용의 물 또는 식물성 오일과 같은 고체 및 액체 희석제; 실리카, 활석, 스테아르산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트 및/또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제; 콜로이드성 점토와 같은 겔화제; 트라가칸트 고무 또는 나트륨 알기네이트와 같은 증점제; 전분, 아라비아 고무, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀루로스 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 결합제; 전분, 알긴산, 알기네이트 또는 나트륨 전분 글리콜레이트와 같은 붕해제; 발포성 혼합물; 염료; 감미제; 레시틴, 폴리소르베이트 또는 라우릴설페이트와 같은 습윤제; 및 이러한 제형용으로 공지된 첨가제인 기타 치료학적으로 허용되는 보조 성분, 예를 들어, 보습제, 방부제, 완충제 및 항산화제가 있다.Other compounds that may be included by mixing include, for example, medically inert ingredients such as lactose, dextrose, saccharose, cellulose, starch or calcium carbonate for tablets or capsules, olive oil or ethyl oleate for soft capsules and Solid and liquid diluents, such as water or vegetable oils for suspending or emulsions; Lubricants such as silica, talc, stearic acid, magnesium or calcium stearate and / or polyethylene glycol; Gelling agents such as colloidal clays; Thickeners such as tragacanth rubber or sodium alginate; Binders such as starch, gum arabic, gelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose or polyvinylpyrrolidone; Disintegrants such as starch, alginic acid, alginate or sodium starch glycolate; Effervescent mixtures; dyes; Sweeteners; Wetting agents, such as lecithin, polysorbate or laurylsulfate; And other therapeutically acceptable auxiliary ingredients which are known additives for such formulations, for example moisturizers, preservatives, buffers and antioxidants.

경구 투여용 액체 분산제는 시럽제, 유제 또는 현탁제일 수 있다. 시럽제는 담체로서, 예를 들어, 사카로스 또는 글리세롤 및/또는 만니톨 및/또는 소르비톨과의 사카로스를 함유할 수 있다. 특히, 당뇨병 환자용 시럽제는 담체로서, 글루코스로 대사되지 않거나 단지 매우 소량만이 글루코스로 대사되는 유일한 생성물, 예를 들어, 소르비톨만을 함유할 수 있다. 현탁제 및 유제는 담체로서, 예를 들어, 천연 고무, 아가, 나트륨 알기네이트, 펙틴, 메틸셀루로스, 카복시메틸셀룰로스 또는 폴리비닐 알콜을 함유할 수 있다.Liquid dispersants for oral administration may be syrups, emulsions or suspensions. Syrups may contain, for example, saccharose or saccharose with glycerol and / or mannitol and / or sorbitol as carriers. In particular, syrups for diabetic patients may contain, as a carrier, only products that are not metabolized into glucose or only very small amounts, such as sorbitol. Suspending agents and emulsions may contain, for example, natural rubber, agar, sodium alginate, pectin, methylcellulose, carboxymethylcellulose or polyvinyl alcohol as carriers.

근육내 주사용 현탁제 또는 액제는 활성 화합물과 함께, 멸균수, 올리브유, 에틸 올레이트, 글리콜(예: 폴리프로필렌 글리콜)과 같은 약제학적으로 허용되는 담체 및 경우에 따라, 적당량의 리도카인 하이드로클로라이드를 함유할 수 있다. 정맥내 주사 또는 주입용 액제는 담체로서, 예를 들어, 일반적으로 주사용수인 멸균수를 함유할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 상기 액제는 멸균, 수성, 등장성 식염 용액의 형태를 취할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 화합물은 리포좀내에 봉입시킬 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 기타 공지된 활성제 전달 시스템을 사용할 수 있다.Injectable suspensions or solutions for intramuscular injection, together with the active compound, contain a pharmaceutically acceptable carrier such as sterile water, olive oil, ethyl oleate, glycols (e.g. polypropylene glycol) and, if appropriate, an appropriate amount of lidocaine hydrochloride. It may contain. Intravenous injection or infusion solutions can contain, for example, sterile water, which is generally water for injection, as a carrier. Preferably, however, the liquid preparation may take the form of a sterile, aqueous, isotonic saline solution. Alternatively, the compounds of the present invention can be enclosed in liposomes. The compounds of the present invention can also use other known active agent delivery systems.

본 발명의 화합물은 기타 첨가제와 결합되지 않은 순수한 형태로 투여될 수도 있으며, 이 경우에 캡슐제, 샤세제 또는 정제가 바람직한 투여 형태이다.The compounds of the invention may also be administered in pure form, in combination with other additives, in which case capsules, cachets or tablets are the preferred dosage forms.

분리된 단위로서 제공되는 정제 및 기타 제시 형태는 통상적으로 본 발명의 화합물 중 하나의 1일 용량 또는 이의 적절한 분획을 함유한다. 예를 들어, 단위는 본 발명의 화합물 중 하나 5mg 내지 500mg을 함유할 수 있지만, 보다 일반적으로는 10mg 내지 250mg을 함유할 수 있다.Tablets and other presentation forms provided as separate units typically contain a daily dose of one of the compounds of the present invention or an appropriate fraction thereof. For example, a unit may contain 5 mg to 500 mg of one of the compounds of the present invention, but more generally 10 mg to 250 mg.

본 발명의 조성물의 약리학적 활성은 당해 분야에 공지된 표준 약리학적 모델을 사용하여 입증할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 적합한 중합체 매트릭스 또는 부위-특이적 전달용 막내에 혼입 또는 봉입시킬 수 있거나, 부위 특이적 전달을 개시할 수 있는 특이적 표적화제와 함께 작용화시킬 수 있다. 이러한 기술뿐만 아니라 기타 약물 전달 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.The pharmacological activity of the compositions of the present invention can be demonstrated using standard pharmacological models known in the art. In addition, the compositions of the present invention may be incorporated or encapsulated in a suitable polymer matrix or membrane for site-specific delivery, or may be functionalized with specific targeting agents that may initiate site specific delivery. These and other drug delivery techniques are well known in the art.

요약하면, PKC의 활성화는 기억 획득을 개시할 뿐만 아니라 APP의 비-아밀로이드형성성 α-세크레타제 프로세싱을 촉진한다. 종양 비촉진인자 PKC 활성화제인 브리오스타틴-1은 AD 환자의 섬유모세포에서 α-세크레타제 생성물인 sAPPα의 분비를 급격하게 증진시킨다. 그 효과는 나노몰농도 이하 농도의 브리오스타틴에서 지배적이었다. 뇌실내로 주사된 브리오스타틴도 또한 모리스 수중 미로 패러다임에 도입된 랫트의 수행능력을 증진시켰다. 최근의 생체내 연구는, 이미 AD 세포내에서 K⁺ 채널 결손을 복구시키고 sAPPα를 증진시키는 것으로 나타난 PKC 활성화제인 벤조락탐이 런던 V717I APP 돌연변이를 보유한 유전자 전이 마우스의 뇌에서 sAPPα의 양을 현저히 증가시키고 Aβ40의 양을 감소시켰음을 나타냈다. 이러한 결과는 PKC(및 이의 활성화)가 AD와 관련된 증상 및 기억 상실의 치료 또는 경감을 위한 도구일 수 있음을 입증한다. 브리오스타틴-1은 보다 효능적일 뿐만 아니라 종양 촉진 활성이 없고 이미 사람의 암 치료에 대한 임상 연구중에 있기 때문에 특히 관심대상이다. 하기 실험은 브리오스타틴-1이 APP의 α-프로세싱(증가된 양의 sAPPα를 생성시킴)을 급격하고 강력하게 증진시키고 모리스 수중 미로 시험에서 랫트의 수행능력을 개선시킨다는 증거를 제공한다. 하기 실험은 또한 또 다른 PKC 활성화제인 벤조락탐이 생체내에서 현저한 sAPPα 증가 및 Aβ40 감소를 유발한다는 증거를 제공한다.In summary, activation of PKC not only initiates memory acquisition but also promotes non-amyloidogenic α-secretase processing of APP. Briostatin-1, a tumor non-promoting factor PKC activator, dramatically enhances the secretion of the α-secretase product sAPPα in fibroblasts of AD patients. The effect was dominant in bryostatin at sub-nanomolar concentrations. Briostatin injected into the ventricle also enhanced the performance of rats introduced into the Morris Water Maze paradigm. Recent in vivo studies have shown that benzolactam, a PKC activator that has already been shown to repair K ⁺ channel defects and enhance sAPPα in AD cells, significantly increases the amount of sAPPα in the brains of transgenic mice carrying the London V717I APP mutation. It was shown that the amount of Aβ40 was reduced. These results demonstrate that PKC (and its activation) may be a tool for the treatment or alleviation of symptoms and memory loss associated with AD. Briostatin-1 is of particular interest because it is not only more potent but also has no tumor promoting activity and is already in clinical research on human cancer treatment. The following experiments provide evidence that bryostatin-1 rapidly and strongly enhances the α-processing of APP (which produces increased amounts of sAPPα) and improves the rat's performance in the Morris water maze test. The following experiment also provides evidence that another PKC activator, benzolactam, causes significant sAPPα increase and Aβ40 decrease in vivo.

본원의 모든 문헌, 논문 또는 특허 참조는 본원의 내용과 부합되지 않는 정도로 본원에서 참조로 인용된다. 이제 본 발명은 본 발명을 설명하기 위함이지 본 발명의 범주를 제한하기 위함이 아닌 실시예로 설명할 것이다.
All publications, articles or patent references herein are incorporated herein by reference to the extent that they do not conform to the teachings herein. The present invention will now be described by way of example only, to illustrate the invention, not to limit the scope of the invention.

실시예Example I: I:

세포 배양Cell culture

배양된 피부 섬유모세포는 코리엘 세포 저장소(Coriell Cell Repository)로부터 입수하고, 이의 배양용으로 확립된 일반적 지침을 약간 변형시켜 사용하여 성장시켰다[참조: Cristofalo & Carptentier, 1988; Hirashima et al., 1996]. 세포를 성장시킨 배양 배지는 10% 태아 송아지 혈청(제조원: Biofluids, Inc.)가 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; GIBCO)였다. 대조군 세포주(AC) AG07141와 AG06241 및 가족성 AD(FAD) 사례(AG06848)로부터의 섬유모세포를 사용하였다.Cultured dermal fibroblasts were obtained from the Coriell Cell Repository and grown using slight modifications to the general guidelines established for their culture. Cristofalo & Carptentier, 1988; Hirashima et al., 1996]. The culture medium in which the cells were grown was Dulbecco's modified Eagle's medium (GIBCO) supplemented with 10% fetal calf serum (Biofluids, Inc.). Fibroblasts from control cell lines (AC) AG07141 and AG06241 and familial AD (FAD) cases (AG06848) were used.

PKCPKC 활성화제 Activator

상이한 조직 분포, 상이한 이소자임의 명백히 구별되는 역활 및 병리상태에의 상이한 관여는 특이적 이소자임을 선택적으로 표적화할 수 있는 약제학적 도구의 사용을 중요하게 만든다[참조: Kozikowski et al., 1997; Hofmann, 1997]. 약품화학 분야에서의 최근의 조사로 몇가지 PKC 활성화제, 예를 들어, 상이하 벤조락탐 및 피롤리디논이 개발되었다. 그러나, 현재 연구된 브리오스타틴 PKC 활성화제는 이소특이적(isospecific) 활성을 제공한다는 잇점을 가질뿐만 아니라, 종양을 촉진하는 바와 같은 이미 사용된 PKC 활성화제의 단점이 없다. 브리오스타틴은 PKC의 조절 도메인에 대해 경쟁하며 상기 부위내에서 매우 특이적인 수소결합 상호작용으로 결합된다. 상기 화합물의 유기화학 및 분자 모델링에 관한 추가 정보는 문헌 전반에 걸쳐 찾아볼 수 있다.Different tissue distributions, distinctly distinct roles of different isozymes, and different involvement in pathology make use of pharmaceutical tools capable of selectively targeting specific isozymes [Kozikowski et al., 1997; Hofmann, 1997]. Recent investigations in the field of pharmaceutical chemistry have led to the development of several PKC activators, for example, different benzolactams and pyrrolidinones. However, the currently studied bryostatin PKC activators not only have the advantage of providing isospecific activity, but also lack the disadvantages of already used PKC activators such as to promote tumors. Briostatin competes for the regulatory domain of PKC and is bound by a very specific hydrogen bond interaction within this site. Additional information regarding organic chemistry and molecular modeling of these compounds can be found throughout the literature.

처리process

세포를 5 내지 7일 동안 6cm 페트리 접시에서 합류성(confluence)에 도달할 때까지 성장시켰다. 실험 당일에 배지를 혈청을 함유하지 않는 DMEM으로 교체하고 2시간 동안 정치시켰다. 2시간의 혈청 고갈을 완료한 후, 브리오스타틴, BL 및 DMSO를 적절한 농도(브리오스타틴의 경우 0.1 및 0.01nM; 0.1nM, 0.1μM 및 1μM BL)에서 상기 배지에 직접 적용하여 처리하였다. DMSO는 모든 경우에 1% 미만이었다. 대부분의 경우, 배지는 sAPP 분비를 위해 처리한지 3시간 후에 수집하여 처리하였다. 분비의 시간 경과를 확립하기 위해 다른 시점을 또한 사용하였다. Cells were grown until confluence reached in a 6 cm Petri dish for 5-7 days. On the day of the experiment the medium was replaced with DMEM containing no serum and left for 2 hours. After completion of 2 hours of serum depletion, bryostatin, BL and DMSO were treated by direct application to the medium at appropriate concentrations (0.1 and 0.01 nM for bryostatin; 0.1 nM, 0.1 μM and 1 μM BL). DMSO was less than 1% in all cases. In most cases, media was collected and treated 3 hours after treatment for sAPP secretion. Other time points were also used to establish the time course of secretion.

PKCPKC 전위에 대한  For potential 면역블롯Immunoblot 검정 black

면역블롯 실험을 익히 확립된 과정[참조: Dunbar, 1994]를 사용하여 수행하였다. 세포를 6cm 페트리 접시에서 합류성(약 90%)에 도달할 때까지 성장시켰다. 5분, 30분, 60분 및 120분 동안의 0.1nM 브리오스타틴-1 처리에 반응하는 이소자임의 수준을 문헌[참조: Racchi et al., (1994)]에 의해 확립된 과정을 약간 변형시킨 과정을 사용하여 정량화하였다. 섬유모세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고 PBS에서 스크랩하고 저속 원심분리로 수집하였다. 펠렛을 다음의 균질화 완충액 속에 재현탁시켰다: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 2mM EDTA, 2mM EGTA, 5mM DTT, 0.32 M 슈크로스 및 프로테아제 억제제 칵테일(제조원: Sigma). 초음파 처리하고 약 12,000g에서 20분 동안 원심분리하여 균질물을 수득하고, 세포질 분획으로서 상청액을 사용하였다. 펠렛을 1.0% 트리톤 X-100를 함유하는 동일한 완충액 속에서 균질화시키고, 얼음 속에서 45분 동안 항온처리하고 약 12,000g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상기 뱃치로부터의 상청액을 막 분획으로서 사용하였다. 단백질 측정 후, 단백질 20㎍을 2×전기영동 샘플 완충액(제조원: Novex) 속에 희석시키고, 5분 동안 비등시키고 10% 아크릴아미드 겔상에서 전개시키고 전기영동에 의해 PVDF 막으로 전이시켰다. 상기 막을 5% 밀크 차단제와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리함으로써 이로 포화시켰다. PKC 이소형에 대한 1차 항체(제조원: Transduction Laboratories)를 차단 용액 속에 희석(1:1000)시키고 막과 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 2차 항체인 알칼리성 포스파타제 항마우스 IgG(제조원: Vector Laboratories)와 항온처리한 후, 막을 제조업자의 지침에 따라서 화학발광성 기질(제조원: Vector Laboratories)을 사용하여 현상하였다. 밴드 강도를 BioRad GS-800 보정된 스캐닝 농도계 및 다중분석 소프트웨어(제조원: BioRad)를 사용하여 농도계로 정량하였다.Immunoblot experiments were performed using well established procedures (Dunbar, 1994). Cells were grown until they reached confluence (about 90%) in 6 cm Petri dishes. The level of isozyme in response to 0.1 nM bryostatin-1 treatment for 5, 30, 60 and 120 minutes slightly modified the process established by Racchi et al. (1994). Quantification using the procedure. Fibroblasts were washed twice with ice cold PBS, scraped in PBS and collected by low speed centrifugation. The pellet was resuspended in the following homogenization buffer: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 5 mM DTT, 0.32 M sucrose and protease inhibitor cocktail from Sigma. Sonication and centrifugation at about 12,000 g for 20 minutes yielded a homogenate and the supernatant was used as the cytosolic fraction. The pellet was homogenized in the same buffer containing 1.0% Triton X-100, incubated for 45 minutes in ice and centrifuged for 20 minutes at about 12,000 g. Supernatant from the batch was used as the membrane fraction. After protein measurement, 20 μg of protein was diluted in 2 × electrophoresis sample buffer (Novex), boiled for 5 minutes, run on 10% acrylamide gel and transferred to PVDF membrane by electrophoresis. The membrane was saturated with this by incubating with 5% milk blocker for 1 hour at room temperature. Primary antibodies to the PKC isoform (Transduction Laboratories) were diluted (1: 1000) in blocking solution and incubated with membranes overnight at 4 ° C. After incubation with the secondary antibody, alkaline phosphatase anti mouse IgG (Vector Laboratories), the membrane was developed using a chemiluminescent substrate (Vector Laboratories) according to the manufacturer's instructions. Band intensities were quantified with a densitometer using a BioRad GS-800 calibrated scanning densitometer and multiple analysis software (BioRad).

sAPPsAPP - 결정/- decision/ sAPPsAPP α의 측정measurement of α

분비된 APP의 농도를 프로토콜을 약간 변형시켜 통상의 면역블롯팅기술을 사용하여 측정하였다. 각 접시/처리로부터의 침전된 단백질 추출물을 갓 제조된 10% 아크릴아미드 Tris-HCl 미니겔에 부하하고 SDPAGE로 분리시켰다. 부하된 샘플의 용량을 접시당 총 세포 단백질에 대해 교정하였다. 이어서, 단백질을 전기영동에 의해 PVDF 막으로 전이시켰다. 막을 5% 탈지분유로 포화시켜 비-특이적 결합을 차단시켰다. 차단된 막을, 조건화된 배지(SENETEK) 중의 sAPP-알파를 인식하는 시판되는 항체 6E10(1:500)과 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 세척 후, 상기 막을 실온에서 양고추냉이 퍼옥시다제 공액된 항-마우스 IgG 2차 항체(제조원: Jackson's Laboratories)와 함께 항온처리하였다. 이어서, 강화된 화학발광으로 시그날을 검출한 다음, Hyperfilm ECL(제조원: Amersham)에 노출시켰다. 밴드 강도를 BioRad GS-800 보정된 스캐닝 농도계 및 다중분석 소프트웨어(제조원: BioRad)를 사용하여 농도계로 정량하였다.The concentration of secreted APP was measured using conventional immunoblotting techniques with a slight modification of the protocol. Precipitated protein extracts from each dish / treatment were loaded onto freshly prepared 10% acrylamide Tris-HCl minigel and separated by SDPAGE. The dose of loaded sample was corrected for total cell protein per dish. The protein was then transferred to the PVDF membrane by electrophoresis. The membrane was saturated with 5% skim milk powder to block non-specific binding. Blocked membranes were incubated overnight at 4 ° C. with commercially available antibody 6E10 (1: 500) recognizing sAPP-alpha in conditioned medium (SENETEK). After washing, the membranes were incubated with horseradish peroxidase conjugated anti-mouse IgG secondary antibody (Jackson's Laboratories). The signal was then detected by enhanced chemiluminescence and then exposed to Hyperfilm ECL (Amersham). Band intensities were quantified with a densitometer using a BioRad GS-800 calibrated scanning densitometer and multiple analysis software (BioRad).

도 8 및 9에 도시한 바와 같이, 브리오스타틴-1은 PKC의 활성화를 입증하는강력한 반응을 유도한다. PKC의 활성화는 0.1nM의 브리오스타틴-1만을 투여한 다음에 전달한 후 30분째에 용이하게 검출될 수 있음이 주지되어야 한다. As shown in FIGS. 8 and 9, bryostatin-1 induces a strong response demonstrating activation of PKC. It should be noted that activation of PKC can easily be detected 30 minutes after delivery following administration of only 0.1 nM bryostatin-1.

또한, 흥미롭게도 APP 대사 및 이의 부산물의 효과에 관한 데이타가 고려된다. 연구로, PKC 활성화가 비-아밀로이드형성(가용성 APP, 세크레타제의 추정 생성물) 분비된 단편 대 아밀로이드형성(Aβ1-40 및/또는 Aβ1-42) 분비된 단편의 비의 양을 증가시킨다는 것이 입증되었다[참조: Buxbaum et al., 1990; Gillespie et al., 1992; Selkoe, 1994]. 이러한 이론으로 국한됨이 없이, PKC가 낮은 AD 세포가 sAPP의 분비가 손상되었고/었거나 아밀로이드형성성 단편의 비율이 증가될 수 있음이 추측될 수 있다. 게다가, 일부 AD 세포주가 결손 PKC 및 손상된 sAPP 분비 둘다를 나타낸다는 증거가 있다[참조: Bergamaschi et al., 1995; Govoni et al., 1996]. 또한, β-아밀로이드는 섬유모세포에서 AD-유사 K⁺ 채널 결함을 유도하고[참조: Etcheberrigaray et al., 1994] 배양된 뉴론에서 K+ 채널을 차단하는 것[참조: Good et al., 1996]으로 나타났다. 따라서, 본 발명자들은 이소자임-특이적 PKC 결함이 비정상적 APP 프로세싱을 유도할 수 있고 이러한 프로세싱은 다른 가능한 유해한 효과 중에서도 K⁺ 채널 기능을 변경시킬 수 있다는 기계론적 연관성을 제시한다. 최근의 예비 데이타는 또한, 아마도 잘못된 주기적 방식으로 β-아밀로이드가 PKC의 감소를 유발함을 제시한다[참조: Favit et al., 1997].Interestingly, data on the effects of APP metabolism and its byproducts are also considered. Studies have demonstrated that PKC activation increases the ratio of non-amyloidogenic (soluble APP, putative product of secretase) secreted fragments to amyloidogenic (Aβ1-40 and / or Aβ1-42) secreted fragments. Buxbaum et al., 1990; Gillespie et al., 1992; Selkoe, 1994]. Without being limited to this theory, it can be surmised that AD cells with low PKC may impair the secretion of sAPP and / or increase the proportion of amyloidogenic fragments. In addition, there is evidence that some AD cell lines exhibit both defective PKC and impaired sAPP secretion. Bergamaschi et al., 1995; Govoni et al., 1996]. In addition, β-amyloid induces AD-like K ⁺ channel defects in fibroblasts (Etcheberrigaray et al., 1994) and blocks K + channels in cultured neurons [Good et al., 1996]. appear. Thus, we present a mechanistic association that isozyme-specific PKC defects can induce abnormal APP processing and that such processing can alter K ⁺ channel function, among other possible deleterious effects. Recent preliminary data also suggest that β-amyloid causes a decrease in PKC, perhaps in an erroneous periodic manner (Favit et al., 1997).

요약하면, 상기 데이타는 특이적 이소자임을 표적화하는 PKC 기능을 상향조절하는 전략이 sAPP 생산을 증가시킴을 제시한다. 이들 연구 및 이러한 섬유모세포 모델은 잠재적인 근본적 병리학적 과정을 변경시키는 화합물(예: 브리오스타틴)의 효과를 모니터링하는 도구로서 설명되고 사용될 수 있다. 추가로, 당해 분야의 숙련가라면 Ca^{2 +} 영상화 및 전기생리학을 통해 이러한 샘플들을 추가로 시험하는 방법을 알고 있을 것이다. 이어서, 이러한 화합물은 상기 장애용 약리학적 제제의 이론적 디자인(ratinal design)을 위한 토대로서 사용할 수 있다.
In summary, the data suggest that a strategy of upregulating PKC function targeting specific isotopes increases sAPP production. These studies and such fibroblast models can be described and used as tools to monitor the effects of compounds (eg, bryostatin) that alter potential underlying pathological processes. In addition, you will know how to test additionally these samples through the skilled garamyeon Ca ^{2 +} imaging and electrophysiological in the art. Such compounds can then be used as the basis for the theoretical design of the pharmacological agent for the disorder.

실시예Example IIII : 행동학적 연구Behavioral research

학습 및 기억에서 브리오스타틴-1의 효과를 연구하고 위해 모리스 수중 미로 패러다임(48)을 사용하였다. 체중이 220 내지 250g인 위스타 알비노 랫트(n=20)를 사료와 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하면서 1주 동안 사육하였다. 스테인레스 강 도관을 이미 기술된 과정(49)에 따라서 각 랫트에 좌우로 위치시킨다. 모든 동물은 모든 추가 실험 전에 1주간의 회복기를 가졌다. 이어서, 동물을 무작위적으로 실험군과 대조군으로 분류하였다. 처리 및 훈련하기 적어도 24시간 전에 모든 동물을 수중에 위치시켜 120초 동안 수영하도록 함으로써 MWM 실험 상황에 예비노출시켰다. 훈련은 표준 과정(49)에 따라 수행하고 4일 연속 1일당 2회의 시행으로 이루어졌다. 처리된 동물에게는 1번째 및 5번째 훈련 시행하기 약 30분 전에 브리오스타틴의 2μM을 1㎕/부위로 (뇌실내) 투여하였다. 대조군에게는 동이한 스케쥴에 따라서 동일 용적의 비히클만을 투여하였다. 15일째에, 플랫폼을 제거하고 체류 시험을 수행하였다. 동물의 운동 및 탈출 잠복기를 자동화 추적 시스템으로 기록하였다. 학습력은 훈련 시행마다의 탈출 잠복기의 감소로서 측정하였는데, 탈출 잠복기는 처리된 동물에서 현저하게 저하되었다. 기억의 획득은 관련 사분역(5일째)에서 소요한 시간으로서 측정하였다. 기억 또는 체류는 모의(sham) 주사 동물과 비교하여 처리된 동물에서 현저하게 증가되었다(도 3 및 4A 내지 4C 참조). 브리오스타틴-1로 처리된 랫트는 처리한지 2일 이내에 대조군 랫트에 비해서 개선된 인지를 나타냈다(도 3 참조). 브리오스타틴-1은 종양을 치료하기 위해 사용되는 농도보다 300배 내지 300,000배 낮은 농도에서 사용하여 인지를 개선시킬 수 있다. 상기 실시예는 인지능력이 브리오스타틴-1의 투여를 통해서, 질환에 걸리지 않은 다른 피험자에 비해서 질환에 걸린 피험자에서 개선될 수 있음을 추가로 나타낸다.The Morris Water Maze Paradigm (48) was used to study the effects of bryostatin-1 on learning and memory. Wistar albino rats (n = 20), weighing 220-250 g, were bred for 1 week with free access to feed and water. Stainless steel conduits are placed left and right on each rat in accordance with the process 49 previously described. All animals had a week of recovery before all further experiments. The animals were then randomly divided into experimental and control groups. At least 24 hours prior to treatment and training all animals were pre-exposed to the MWM experimental situation by placing them in water and swimming for 120 seconds. The training was conducted according to the standard course (49) and consisted of two trials per day for four consecutive days. Treated animals received 2 μM of bryostatin at 1 μl / site (intraventricular) about 30 minutes before the first and fifth training sessions. The control group received only the same volume of vehicle according to the same schedule. On day 15, the platform was removed and the retention test performed. The movement and escape latency of the animals was recorded with an automated tracking system. Learning ability was measured as a decrease in the escape latency at each training run, with the escape latency significantly reduced in the treated animals. Acquisition of memory was measured as time spent in the relevant quadrant (day 5). Memory or retention was significantly increased in treated animals compared to sham injected animals (see FIGS. 3 and 4A-4C). Rats treated with bryostatin-1 showed improved cognition as compared to control rats within 2 days of treatment (see FIG. 3). Briostatin-1 may be used at concentrations 300 to 300,000 times lower than the concentration used to treat tumors to improve cognition. This example further shows that cognitive ability can be improved in diseased subjects compared to other subjects not affected by the administration of bryostatin-1.

암에 대하여 이미 수행된 안전성, 독성 및 II기 임상 연구 때문에, PKC 활성화제, 특히 브리오스타틴-1이 안전한 것으로 검증될 수 있고 AD 치료/인지 증진에 대한 II기 연구가 진척될 수 있다고 결론지을 수 있다. 게다가, 브리오스타틴-1의 친유성 성질은 증가된 혈뇌 장벽 운반을 제공한다. 본 발명은 정맥내, 경구, 심실내 및 기타 공지된 투여 방법을 가능하게 한다.Because of the safety, toxicity and stage II clinical studies already performed on cancer, it can be concluded that PKC activators, particularly bryostatin-1, may be proven safe and that stage II studies on AD treatment / cognition enhancement may be advanced. have. In addition, the lipophilic nature of bryostatin-1 provides increased blood brain barrier transport. The present invention enables intravenous, oral, intraventricular and other known methods of administration.

sAPP 분비 실험, PKC 활성화 실험 및 동물 행동 실험의 시험은 sAPP 분비의 증가가 증가된 PKC 활성화 후에 일어나고 동물 행동 연구에서 인지를 개선시킴을 나타냈다.
Testing of sAPP secretion experiments, PKC activation experiments, and animal behavioral experiments have shown that an increase in sAPP secretion occurs after increased PKC activation and improves cognition in animal behavioral studies.

실시예Example IIIIII : 유전자 전이 동물 및 : Gene transfer animals and 생체내In vivo 연구 Research

V717I 돌연변이를 보유한 유전자 전이 마우스를 약 3주령(이유 후)에서 17주(n=4) 동안 BL(lmg/kg, 복강내; 매일)로 처리하였다. 대조군(n=4)에게 단독의 비히클(Tween 20 1%, DMSO 25%, 74% PBS)을 투여하였다. 또 다른 실험군은 7주 동안 처리된 5개월 내지 6개월령의 동물로 이루어졌다. 이들 동물의 하위그룹을 BL BL lmg/kg로 매일(n=5); BL 10 mg/kg로 매일(n=3; 2마리가 사망하였기 때문에); BL 10 mg/kg로 매주(n=4; 1마리 사망) 처리하고, LQ12 10 mg/kg로 매일(n=5), LQ12 10 mg/kg로 매주(n=5) 처리하였다. 5마리의 추가 동물에게 동일한 기간 동안 비히클만을 투여하였다. 처리가 완료된 후, 동물을 K. U. L.(벨기에) 가이드라인에 따라서 안락사시켰다. 뇌를 꺼내어 APP 종의 생화학적 분석용으로 표본 제작하였다.Transgenic mice carrying the V717I mutation were treated with BL (lmg / kg, intraperitoneal; daily) for about three weeks (n = 4) at 17 weeks (n = 4). The control group (n = 4) was administered with vehicle alone (Tween 20 1%, DMSO 25%, 74% PBS). Another experimental group consisted of animals between 5 and 6 months of age treated for 7 weeks. Subgroups of these animals were daily at BL BL lmg / kg (n = 5); Daily at 10 mg / kg BL (n = 3; because two died); Treatment with BL 10 mg / kg weekly (n = 4; one death), daily with LQ12 10 mg / kg (n = 5), weekly with LQ12 10 mg / kg (n = 5). Five additional animals received vehicle only for the same time period. After treatment was complete, animals were euthanized according to K. U. L. (Belgium) guidelines. Brains were taken out and sampled for biochemical analysis of APP species.

APPAPP tgtg 마우스의  Mouse 뇌내의In the brain APPAPP 프로세싱의 생화학적 분석 Biochemical Analysis of Processing

면역블롯 분석. APP 매개의 중간체의 생화학적 분석은 드와처(Dewachter) 등에 의해 다른 문헌[참조: Aging increased amyloid peptide and caused amyloid plaques in brain of old APP/V717I transgenic mice by a different mechanism than mutant presenilinl. J Neurosci. 2000; 20: 6452- 8.]에도 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 뇌를 20 mM Tris-HCl(pH 8.5) 및 프로테이나제 억제제의 혼합물(제조원: Roche, Darmstadt, Germany)을 함유하는 빙냉 완충액 6.5 용적 속에서 균질화시켰다. 4℃에서 135,000 x g로 1시간 동안 원심분리한 후, 특수화된 ELISA로 가용성 아밀로이드 펩타이드를 분석하기 전에 상청액을 2시간 동안 200,000x g로 다시 원심분리하였다. 제1 원심분리로부터의 펠렛을 2% Triton X-100, 2% Nonidet P40 및 프로테이나제 억제제를 함유하는 TBS 속에 재현탁시키고 1시간 동안 4℃에서 100,000 x g로 원심분리하였다. 상기 단백질 분획을 막-결합형 APP의 분석을 위해 사용하였다. 막 결합형 APP의 웨스턴 블롯팅을 모노클로날 항체 8E5를 이용하여 막 결합형 단백질을 함유하는 상기 단백질 분획에 대해 수행하였다. 전체 분비된 APP 및 α-세크레타제 분해된 분비된 APP-α를 각각 모노클로날 항체 8E5 및 모노클로날 항체 JRF14를 이용하여 제1 원심분리의 상청액에 대한 웨스턴 블롯팅 분석으로 검출하였다. 단백질을 최종 농도의 2% SDS, 1% 2-ME를 하유하는 샘플 완충액 속에서 변성시키고 환원시킨 다음, 8% TRIS 글리신 겔(제조원: Novex, San Diego, CA)상에서 분리시켰다. 적절한 2차 항체와 함께 항온처리한 후, 모든웨스턴 블롯을 ECL 검출 시스템으로 현상하고 사진으로 기록하였다. 일련의 희석된 샘플의 적용은 정량화를 가능하게 하였다. 필름의 농도계 주사 및 정규화는 평면 광학 밀도 스캐너 및 분석 및 측정 전용 소프트웨어(Image Master; 제조원: Pharmacia, Uppsala, Sweden)를 사용하여 수행하였다. Immunoblot analysis. Biochemical analysis of APP-mediated intermediates is described by Dewachter et al. In Aging increased amyloid peptide and caused amyloid plaques in brain of old APP / V717I transgenic mice by a different mechanism than mutant presenilinl. J Neurosci. 2000; 20: 6452-8. Briefly, brains were homogenized in 6.5 volumes of ice cold buffer containing a mixture of 20 mM Tris-HCl (pH 8.5) and proteinase inhibitor (Roche, Darmstadt, Germany). After centrifugation at 135,000 × g for 1 hour at 4 ° C., the supernatant was centrifuged again at 200,000 × g for 2 hours before analysis of the soluble amyloid peptide by specialized ELISA. Pellets from the first centrifugation were resuspended in TBS containing 2% Triton X-100, 2% Nonidet P40 and proteinase inhibitors and centrifuged at 100,000 × g at 4 ° C. for 1 hour. The protein fraction was used for the analysis of membrane-bound APP. Western blotting of membrane bound APP was performed on the protein fraction containing membrane bound protein using monoclonal antibody 8E5. Total secreted APP and α-secretase digested secreted APP-α were detected by Western blotting analysis on the supernatant of the first centrifugation using monoclonal antibody 8E5 and monoclonal antibody JRF14, respectively. Proteins were denatured and reduced in sample buffer containing 2% SDS, 1% 2-ME at the final concentration and then separated on 8% TRIS glycine gel (Novex, San Diego, Calif.). After incubation with the appropriate secondary antibody, all Western blots were developed with an ECL detection system and photographed. Application of a series of diluted samples allowed for quantification. Densitometer scanning and normalization of the film was performed using a planar optical density scanner and software dedicated to analysis and measurement (Image Master; Pharmacia, Uppsala, Sweden).

아밀로이드 펩타이드의 ELISA . 단백질 추출물을 역상 컬럼(C18-Sep-pack 카트리지; Waters Corporation, Milord, MA)에 적용하고 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 증가되는 농도의 아세토니트릴(5, 25 및 50%)로 세척하였다. 마지막 분획은 아밀로이드 펩타이드를 함유하였으며 이를 진공하에 밤새 건조시키고 ELISA에서 측정하기 위해 용해시켰다. 사람 Aβ40 및 Aβ42 펩타이드에 대한 스웨덴식 ELISA를 각각 포획 항혈청 JRF/cAβl4O/lO 및 21F12를 사용하여 수행하고 이를 각각 모노클로날 항체 JRFcAβtot/14hrpo 및 3D6를 사용하여 현상하였다[참조: Vanderstichele H, Van Kerschaver E, Hese C, Davidsson P, Buyse MA, Andreansen N, Minthon L, Wallin A, Blennow K, Vanmechelen E. Standardization of measurements of beta-amyloid (1-42) in cerebrospinal fluid and plasma. Amyloid 2000; 7: 245-258]. Of amyloid peptide ELISA . The protein extract was applied to a reversed phase column (C18-Sep-pack cartridge; Waters Corporation, Milord, Mass.) And washed with increasing concentrations of acetonitrile (5, 25 and 50%) containing 0.1% trifluoroacetic acid. The last fraction contained amyloid peptides which were dried overnight under vacuum and dissolved for measurement in ELISA. Swedish ELISAs for human Aβ40 and Aβ42 peptides were performed using capture antiserum JRF / cAβl4O / lO and 21F12, respectively, and developed using the monoclonal antibodies JRFcAβtot / 14hrpo and 3D6, respectively. Vanderstichele H, Van Kerschaver E, Hese C, Davidsson P, Buyse MA, Andreansen N, Minthon L, Wallin A, Blennow K, Vanmechelen E. Standardization of measurements of beta-amyloid (1-42) in cerebrospinal fluid and plasma. Amyloid 2000; 7: 245-258.

생화학적 평가 전에 표준 전반적 건강 평가 및 개방 영역(open field) 시험을 모든 동물에서 수행하였다. 또한, 주사 다음에 일어나는 복부 수축을 측정하기 위해 다음과 같은 반정량적 임시 스코어를 고안하였다(+ = 약함, ≤ 2분 ; ++: 강함, ≥분; +++ : 매우 강함, ≥1.2분).
Standard global health assessments and open field testing were performed in all animals prior to biochemical assessment. In addition, the following semiquantitative temporary scores were devised to measure abdominal contraction following injection (+ = weak, ≤ 2 minutes; ++: strong, ≥ minutes; +++: very strong, ≥ 1.2 minutes) .

실시예Example IVIV : : 브리오스타틴을Bryostatin 이용한 유전자 전이 동물 및  Used gene transfer animals and 생체내In vivo 시험 exam

유사한 과정/시험 및 프로토콜을 사용한 제2 유전자 전이 연구를 V717I 돌연변이, 및 가속화된 아밀로이드 형성을 유발하는 프레세닐린-1(PS1) 돌연변이를 보유한 이중 유전자 전이 마우스를 다음과 같은 주요 차이점과 함께 사용하여 수행하였다. 처리된 마우스 및 대조군 마우스를 포함한 약 40마리의 마우스를 사용하였다. 처리는 약 3주령에서 시작하였으며 브리오스타틴-1을 사용하여 주 3회 40㎍/kg로 복강내 처리하는 것으로 이루어졌다. 대조군에게는 비히클만을 투여하였다. 처리는 미처리된 동물의 질병률이 실험 종료를 필요로하기 전 약 7개월 동안 지속하였다(도 10 참조). 처리된 동물과 미처리된 동물 사이의 행동상의 차이는 수중 시험을 사용한 경우에 유의적이지 않은 한편(도 11 참조), 처리된 동물은 가용성 Aβ-40의 감소(도 12 참조)와 가용성 Aβ-42의 감소(도 13 참조)를 나타냈다. 또한, 처리된 마우스는 도 14에 도시된 바와 같이 전반적으로 소량의 총 APP를 나타냈으며, 도 14에서 티오플라반 S 염색은 대조군에 비해서 플라크 부하%의 감소를 나타낸다.A second gene transfer study using similar procedures / tests and protocols was carried out using dual gene transfer mice with V717I mutations and presenilin-1 (PS1) mutations that result in accelerated amyloid formation with the following key differences: Was performed. About 40 mice were used, including treated mice and control mice. Treatment started at about 3 weeks of age and consisted of intraperitoneal treatment with bryostatin-1 at 40 μg / kg three times a week. The control group received vehicle only. Treatment lasted for about 7 months before morbidity in untreated animals required termination of the experiment (see FIG. 10). The difference in behavior between the treated and untreated animals was not significant when the underwater test was used (see FIG. 11), whereas the treated animals had a decrease in soluble Aβ-40 (see FIG. 12) and soluble Aβ-42 Decrease (see FIG. 13). In addition, the treated mice generally showed a small amount of total APP as shown in FIG. 14, and in FIG. 14, thioflavan S staining showed a decrease in% plaque load compared to the control.

상기 실험의 논의Discussion of the above experiment

sAPPα 분비: AD 세포주 AG06848를 0.1 nM 브리오스타틴으로 처리한지 3시간 후, 모든 다른 조건과 비교해 sAPPα의 급격한 증가가 있었다(전체 ANOVA, p< 0.0001)(도 1A, 검정색 막대). 이러한 효과는 또한 동일한(0.1nM) 농도에서 사용되는 다른 PKC 활성화제인 BL보다 유의적으로 높은 것이다(p< 0.01, 터키 사후 검정). 0.1nM의 BL은 분비에 대한 실질적 영향을 갖지 않았으며 단독의 DMSO와 상이하지 않았다. PKC 차단제인 100nM의 스타우로스포린에 의한 전처리는 0.1nM 브리오스타틴의 효과를 소멸시켰다(도 1A, 가장 우측의 막대). 연령이 유사한(age-matched) 대조군으로부터의 2개의 세포주를 또한 사용하였다. (모아진) 이들 세포주에서, 브리오스타틴(0.1nM)은 또한 sAPPα의 분비를 유의적으로(단독의 DMSO와 비교하여, p< 0.05, 터키 사후 검정) 증가시켰지만, AD 세포주에서는 상당히 적은 정도로 증가시켰다(도 1A, 빗금친 막대; p< 0.05 터키 사후 검정). 시간-경과 실험(도 1B, 삽입물)은 0.1nM 브리오스타틴과 15분 동안 항온처리한 후 sAPPα의 현저한 증가를 나타냈다. 점진적이고 비례적인 증가는 30분째 및 60분째에서 관찰되었다. 2시간 및 3시간의 항온처리 기간은 분비된 sAPPα의 양의 측면에서 60분간의 항온처리와 유의적으로 상이하지 않았다. 보다 낮은 농도의 브리오스타틴 0.01nM은 단지 60분 동안의 항온처리 후에도 sAPPα분비의 상당한 증가를 산출하였다. 그러나, 낮은 농도(0.01 nM)의 효과는 항온처리 2시간째 및 3시간째에서 높은 농도(0.1 nM 브리오스타틴)와 구별할 수 없었다(도 1B). 다양한 실험 조건 및 세포주하에서의 sAPPα의 분비를 예시하는 대표적 면역블롯은 도 1C에 도시되어 있다. sAPPα Secretion: After 3 hours of treatment with AD cell line AG06848 with 0.1 nM bryostatin, there was a sharp increase in sAPPα compared to all other conditions (total ANOVA, p <0.0001) (FIG. 1A, black bars). This effect is also significantly higher than BL, another PKC activator used at the same (0.1 nM) concentration (p <0.01, post-Turkish assay). The 0.1 nM BL had no substantial effect on secretion and did not differ from DMSO alone. Pretreatment with 100 nM staurosporin, a PKC blocker, extinguished the effect of 0.1 nM bryostatin (FIG. 1A, rightmost bar). Two cell lines from age-matched controls were also used. In these cell lines, bryostatin (0.1 nM) also significantly increased the secretion of sAPPα (p <0.05, post-Turkish assay, compared to single DMSO), but significantly to a lesser extent in AD cell lines ( 1A, hatched bars; p <0.05 Turkey Post Assay). Time-lapse experiments (FIG. 1B, insert) showed a significant increase in sAPPα after 15 min incubation with 0.1 nM bryostatin. Gradual and proportional increase was observed at 30 and 60 minutes. The incubation period of 2 hours and 3 hours was not significantly different from the 60 minute incubation in terms of the amount of secreted sAPPα. Lower concentrations of bryostatin 0.01 nM yielded a significant increase in sAPPα secretion even after incubation for only 60 minutes. However, the effect of low concentrations (0.01 nM) was indistinguishable from high concentrations (0.1 nM bryostatin) at 2 and 3 hours of incubation (FIG. 1B). Representative immunoblots illustrating the secretion of sAPPα under various experimental conditions and cell lines are shown in FIG. 1C.

PKC 전위: α이소자임의 세포질 및 막-결합된 성분의 수준을 0.1nM 및 0.01nM의 브리오스타틴과 함께 (다양한 시점에서) 항온처리한 후 측정하였다. 미립자/가용성(P/S) 면역반응성의 비로서 측정된, PKC α-이소자임의 막 결합된 성분의 상대적 증가(단독의 DMSO와 비교해)가 있었다. 이러한 증가는 가장 일관적이며 30분간의 항온처리 후에 단독의 DMSO와 유의적으로 상이하였다(p=0.411; 양측 t-검정). P/S는 점진적으로 감소되지만 180분 동안의 항온처리 후에도 단독의 DMSO보다 높은(통계학적으로 유의적이지는 않음) 상태를 유지하였다(도 5A). 단기간의 항온처리(5분)은 일관적이거나 단독의 DMSO와 유의적으로 상이한 전위를 유도하지 않았다(제시하지 않음). 0.01nM 브리오스타틴의 효과는 훨씬 덜 현저하며 느렸고, P/S 비 값은 120분 동안의 항온처리에서 최대였다. 다른 PKC 이소자임의 전위 수준은 0.1nM 브리오스타틴과 30분 동안 항온처리한 경우에 평가하였다. (막-결합된 및 세포질 분획 둘다의) 명백한 면역반응성은 ε, β 및 δ-이소엔자임에 대한 특이적 항체로 검출하였다. S/P 비는 모든 경우에 단독의 DMSO보다 높았으며 PKC-α의 수준과 유사하였다(도 5B). PKC potential: The levels of cytoplasmic and membrane-bound components of αisozyme were measured after incubation (at various time points) with bryostatin at 0.1 nM and 0.01 nM. There was a relative increase in the membrane bound component of PKC α-isozyme (compared to sole DMSO), measured as the ratio of particulate / soluble (P / S) immunoreactivity. This increase was the most consistent and significantly different from DMSO alone after 30 minutes of incubation (p = 0.411; bilateral t-test). P / S gradually decreased but remained higher than DMSO alone (not statistically significant) even after incubation for 180 minutes (FIG. 5A). Short-term incubation (5 minutes) did not induce a potential that was consistent or significantly different from DMSO alone (not shown). The effect of 0.01 nM bryostatin was much less pronounced and slower, and the P / S ratio value was maximum at incubation for 120 minutes. Potential levels of other PKC isozymes were evaluated when incubated with 0.1 nM bryostatin for 30 minutes. Obvious immunoreactivity (both membrane-bound and cytoplasmic fractions) was detected with specific antibodies against ε, β and δ-isoenzymes. S / P ratio was higher than DMSO alone in all cases and was similar to the level of PKC-α (FIG. 5B).

행동( MWM ): 브리오스타틴을 투여한 그룹의 학습 곡선은 대조군보다 유의적으로 급속하였다. 탈출 잠복기는 초기 시험으로부터 명백히 감소되었으며 3번째 시행부터는 대조군보다 낮았다. 사분역 선호도 시험은 그룹 둘다에서 정체를 나타냈지만 브리오스타틴 처리군은 대조군에 비해서 현저하게 증진되었다. 도 3 내지 4C는 이러한 결과를 요약한 것이다. Behavioral ( MWM ): Learning curve of the group receiving bryostatin was significantly faster than the control. The escape latency was clearly reduced from the initial trial and was lower than the control from the third trial. The quadrant preference test showed congestion in both groups, but the bryostatin treated group was significantly enhanced compared to the control group. 3-4C summarize these results.

유전자 전이 동물: 3주령에서부터 17주 동안 BL로처리된 유전자 전이 마우스는 sAPP-α의 현저한 증가 및 수반되는 Aβ40의 비례적 감소를 나타냈다(도 6A 및 6B). 막 결합된 APP인 Aβ42의 양 및 전체 분비된 sAPP(sAPPα+ sAPPβ)에는 차이가 없었다. 동물은 전반적 건강에 있어 차이를 나타내지 않았으며 체중 증가는 그룹 둘다에서 유사하였다. 주사는 다양한 복부 수축(가역적)을 유발하였으며 그 횟수는 그룹 둘다에서 유사하였다. 강도는 BL-처리군에서 다소 상승되었다(데이타는 제시하지 않음). 또한, BL 처리된 동물은 개방 영역 시험 스코어의 증가를 나타냈는데 이는 통계학적 유의성에 부합되지 않는 것이었다(제시하지 않음). Transgenic Animals: Transgenic mice treated with BL for 3 to 17 weeks showed a significant increase in sAPP-α and a concomitant decrease in Aβ40 (FIGS. 6A and 6B). There was no difference in the amount of membrane-bound APP, Aβ 42 and total secreted sAPP (sAPPα + sAPPβ). The animals showed no difference in overall health and weight gain was similar in both groups. Injections caused various abdominal contractions (reversible) and the number of times was similar in both groups. The intensity was somewhat elevated in the BL-treated group (data not shown). In addition, BL treated animals showed an increase in open area test scores, which did not match statistical significance (not shown).

이후의 연령(6개월령)에서 단기간(약 7주) 동안 처리된 동물은 APP 종에 있어 어떠한 변화도 나타내지 않았다. 그러나, 장기간 처리(이전 단락)에 대해 기술한 바와 동일한 방향의 일반적 경향(작은 변화)이 있었다. BL 10 mg/kg(매일 및 매주)로 처리된 동물 및 매일 LQ12 10 mg/kg(도 7B, 검정색 막대)로 처리된 동물에서 sAPPα가 다소 증가되었다. BL lmg/kg (매일) 및 LQ12 10 mg/kg(매주)는 효과가 없었다(도 5A, 패턴 막대). Aβ40의 약간의 감소는 매주 10 mg/kg에서 BL로 처리된 동물(n=5) 및 LQ12로 처리된 동물(n=5)에서 관찰되었다(도 7B, 검정색 막대). 처리군에서는 Aβ42의 두드러진 유의적 변화가 없었다. 마찬가지로, 전체 가용성 APP 및 막-결합된 APP의 유의적 변화도 없었다. 복부 수축 및 뒷발의 이완은 주사시에 보다 연령이 많은 동물에서 관찰되었다(가역적). 이는 용량과 관련되는 것으로 보이지만, 보다 정확한 평가를 위한 명백한 시스템이 시행되지 않았다. 전반적 건강 및 체중도 정상이었다. 실험 과정 동안 몇마리(2 내지 3마리) 동물들은 사망하였으며(전체의 7.8%), 그 이유는 처리와 관련되는 것으로 보이지 않는다. 개방 영역 시험에서는 차이가 없었다(제시하지 않음).Animals treated for short periods (about 7 weeks) at later ages (6 months of age) showed no change in APP species. However, there was a general tendency (small change) in the same direction as described for long term treatment (previous paragraph). There was a slight increase in sAPPα in animals treated with BL 10 mg / kg (daily and weekly) and animals treated with daily LQ12 10 mg / kg (FIG. 7B, black bars). BL lmg / kg daily and LQ12 10 mg / kg weekly were ineffective (FIG. 5A, pattern bars). A slight decrease in Aβ40 was observed in animals treated with BL (n = 5) and LQ12 treated animals (n = 5) at 10 mg / kg weekly (FIG. 7B, black bars). There was no significant change in Aβ42 in the treated group. Likewise, there was no significant change in total soluble APP and membrane-bound APP. Abdominal contractions and hind limb relaxation were observed in older animals at the time of injection (reversible). This seems to be dose related, but no clear system has been implemented for a more accurate assessment. Overall health and weight were also normal. During the course of the experiment several (2 to 3) animals died (7.8% of the total) and the reason does not appear to be related to treatment. There was no difference in the open area test (not shown).

그러나, 브리오스타틴-1 처리는 Aβ-40, Aβ-42 및 전체 APP 둘다에서 두드러진 변화를 나타냈다(도 12 내지 14 참조). 또한, 브리오스타틴-1로 처리된 동물은 시간에 따라 보다 큰 수명%를 나타냈다(도 10 참조).However, bryostatin-1 treatment showed marked changes in both Aβ-40, Aβ-42 and total APP (see FIGS. 12-14). In addition, animals treated with bryostatin-1 showed greater percent lifespan over time (see FIG. 10).

이러한 결과는 AD 병태생리학에서의 PKC의 역활을 입증한다. 이러한 결과는 추가로 공통된 APP 풀(pool)이 있음을 입증한다. 따라서, 하나의 효소 경로의 증가는 또 다른 효소에 대한 보다 적은 기질을 초래한다. 상기 경우, 아밀로이드형성성 및 독성 단편(Aβ40)의 감소는 APP의 비병원성 α-세크레타제 프로세싱을 증가시킴으로써 달성된다. 전체 분비된 APP(α+ β생성물)가 처리된 동물과 미처리된 동물 사이에 상이하지 않다는 사실은 판단과 부합되며 판단을 확인시킨다. 또한, sAPPα의 증가는 상승된 전체 APP(또는 증가된 발현)의 결과가 아닌 것으로 보이는데, 이는 막 결합형 APP가 두 그룹 모두에서 유사하기 때문이다.These results demonstrate the role of PKC in AD pathophysiology. These results further demonstrate that there is a common APP pool. Thus, an increase in one enzyme pathway results in less substrate for another enzyme. In this case, reduction of amyloidogenic and toxic fragments (Aβ40) is achieved by increasing the nonpathogenic α-secretase processing of APP. The fact that the total secreted APP (α + β product) is not different between the treated and untreated animals is consistent with the judgment and confirms the judgment. In addition, the increase in sAPPα does not appear to be the result of elevated total APP (or increased expression), because membrane bound APP is similar in both groups.

가장 현저한 "유익한" 효과는 이른 연령에서 오랜 기간 동안 처리를 시작한 동물에서 관찰되었다는 것을 주지하는 것이 중요하다. 이는 독성 단편의 장기간 효과를 예방하는 것이 치료요법의 중요한 목적이여야 함을 제시한다. 노령의 동물에서 수득된 결과로 제시되는 바와 같이, 보다 노령에서 및 (심지어 임상적 징후도 없는) 질환 진행의 경과에서 보다 늦은 중재는 독성 단편에 의한 손상을 예방하는데 있어 훨씬 적은 영향을 줄 것이다. 또한, 이러한 특정 유전자 전이 모델이 먼저 생화학적 변경을 유발한 다음, 인지 결핍을 유발하고, 훨씬 나중에 아밀로이드 침착 및 플라크를 유발한다는 것이 중요하게 언급된다. 시험관내 연구와 일치하여 이러한 순서는 아밀로이드 종이 어떠한 현저한 침착이 일어나기 전에도 유해할 수 있음을 보여준다.It is important to note that the most significant "beneficial" effect was observed in animals that started treatment for a long time at an early age. This suggests that preventing the long-term effects of toxic fragments should be an important goal of therapy. As shown by the results obtained in older animals, later interventions in older age and in the course of disease progression (even without clinical signs) will have much less impact in preventing damage by toxic fragments. It is also important to note that this particular gene transfer model first induces biochemical alteration, then induces cognitive deficiency, and much later in amyloid deposition and plaque. Consistent with in vitro studies, this sequence shows that amyloid species can be harmful before any significant deposition occurs.

브리오스타틴 투여(뇌실내) 후 MWM 실험에서 정상 랫트의 개선된 수행능력을 나타내는 결과는 PKC 활성화가 추가된 치료 효과로서 인지 증진을 유발할 수 있음을 입증한다. 또한, 분비된 APP는 그 자체로 정상 및 기억상실 마우스의 기억력을 개선시킬 수 있다. 이러한 실험과 모델은 특히 브리오스타틴-1을 통한 PKC 조절이 sAPP의 증가 및/또는 기억력의 개선을 초래할 수 있음을 입증한다. 이러한 실험과 모델은 또한 PKC 활성화를 포함하는 섭생을 사용하여 독성 단편의 축적을 예방하고 기억력 감퇴를 예방할 수 있음을 입증한다.
Results showing improved performance of normal rats in MWM experiments after bryostatin administration (intraventricular) demonstrate that PKC activation can induce cognitive enhancement as an added therapeutic effect. In addition, secreted APP can improve the memory of normal and amnesia mice by themselves. These experiments and models demonstrate that PKC regulation, particularly through bryostatin-1, can lead to an increase in sAPP and / or an improvement in memory. These experiments and models also demonstrate that regimens involving PKC activation can be used to prevent accumulation of toxic fragments and to prevent memory loss.

Claims (24)

브리오스타틴-1 내지 브리오스타틴-18 중 어느 하나의 브리오스타틴과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 사람 또는 동물의 인지능력을 증진시키기 위한 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition for enhancing the cognitive ability of a human or animal, comprising bryostatin of any one of bryostatin-1 to bryostatin-18 and a pharmaceutically acceptable carrier. 제1항에 있어서, 브리오스타틴이 PKCα, PKCγ 및 PKCε를 선택적으로 활성화시키는 약제학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 1, wherein bryostatin selectively activates PKCα, PKCγ, and PKCε. 삭제delete 제1항에 있어서, 증진되는 인지능력이 학습력, 기억력 또는 주의력인 약제학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the enhanced cognitive ability is learning, memory or attention. 제1항에 있어서, 동물이 영장류인 약제학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the animal is a primate. 제1항에 있어서, 동물이 비영장류인 약제학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the animal is a non-primate. 제1항에 있어서, 브리오스타틴이 알쯔하이머병, 다발경색 치매, 파킨슨병을 동반하거나 동반하지 않은 알쯔하이머병의 루이소체(Lewy-body) 변이, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jakob disease), 코르사코프병(Korsakow's disorder), 주의력 결핍성 과잉행동 장애, 연령, 전기경련요법, 뇌 손상, 졸중, 마취 사고, 두부 손상, 저혈당증, 일산화탄소 중독, 리튬 중독 또는 비타민 결핍증의 인지 손상을 치료하기에 유효한 양으로 존재하는 약제학적 조성물.The method according to claim 1, wherein the bryostatin is Alzheimer's disease, multiple infarct dementia, Lewy-body variation of Alzheimer's disease with or without Parkinson's disease, Creutzfeld-Jakob disease, Korsakoff disease ( Korsakow's disorder), attention deficit hyperactivity disorder, age, electrospasm, brain damage, stroke, anesthesia accident, head injury, hypoglycemia, carbon monoxide poisoning, lithium poisoning, or cognitive impairment of vitamin deficiency Pharmaceutical compositions. 제1항에 있어서, 브리오스타틴이 sAPP의 증가를 유발하기에 유효한 양으로 투여되는 약제학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 1, wherein bryostatin is administered in an amount effective to cause an increase in sAPP. 제1항에 있어서, 브리오스타틴이 이온 채널 활성을 회복시키기에 유효한 양으로 투여되는 약제학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 1, wherein bryostatin is administered in an amount effective to restore ion channel activity. 제9항에 있어서, 이온 채널이 K⁺ 또는 Ca⁺⁺ 채널인 약제학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 9, wherein the ion channel is a K ⁺ or Ca ⁺⁺ channel. 삭제delete 브리오스타틴-1 내지 브리오스타틴-18 중 어느 하나의 브리오스타틴과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 신경 종양을 치료하기 위한 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition for treating a neuronal tumor comprising bryostatin of any one of bryostatin-1 to bryostatin-18 and a pharmaceutically acceptable carrier. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 브리오스타틴이 α-세크레타제를 증가시키기에 유효한 양으로 투여되는 약제학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 1, wherein bryostatin is administered in an amount effective to increase α-secretase. 삭제delete 제16항에 있어서, 브리오스타틴이 아밀로이드 플라크 형성을 감소시키기에 유효한 양으로 존재하는 약제학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 16, wherein bryostatin is present in an amount effective to reduce amyloid plaque formation. 브리오스타틴-1 내지 브리오스타틴-18 중 어느 하나의 브리오스타틴과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 알쯔하이머병을 치료하기 위한 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition for treating Alzheimer's disease, comprising bryostatin of any one of bryostatin-1 to bryostatin-18 and a pharmaceutically acceptable carrier. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 브리오스타틴-1 내지 브리오스타틴-18 중 어느 하나의 브리오스타틴과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 저산소증을 치료하기 위한 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition for treating hypoxia comprising bryostatin of any one of bryostatin-1 to bryostatin-18 and a pharmaceutically acceptable carrier. 삭제delete

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