KR101215201B1 - Composition for preventing or treating ischemic disease comprising X-chromosome linked inhibitor of apoptosis - Google Patents

Abstract

본 발명은 XIAP(X-chromosome linked inhibitor of apoptosis) 단백질 또는 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 허혈성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물에 관한 것이다. XIAP는 전단응력에 대한 FAK 576Tyr 인산화를 유도하고 그 결과 ERK 활성을 유도함으로써, 결과적으로 항 동맥경화 및 혈관확장을 촉진시켜 허혈성 질환 치료 또는 예방 효과를 달성할 수 있다. The present invention relates to a composition for treating or preventing an ischemic disease comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a XIAP protein or an X-chromosome linked inhibitor of apoptosis (XIAP) protein. XIAP induces FAK 576Tyr phosphorylation on shear stress and consequently induces ERK activity, thereby promoting anti-arteriosclerosis and vasodilation, thereby achieving a therapeutic or prophylactic effect of ischemic disease.

Description

ＸＩＡＰ 단백질을 포함하는 허혈성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 {Composition for preventing or treating ischemic disease comprising X-chromosome linked inhibitor of apoptosis}Composition for preventing or treating ischemic disease comprising X-chromosome linked inhibitor of apoptosis}

본 발명은 XIAP(X-chromosome linked inhibitor of apoptosis) 단백질 또는 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 허혈성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for treating or preventing an ischemic disease comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a XIAP protein or an X-chromosome linked inhibitor of apoptosis (XIAP) protein.

허혈(Ischemia)이란 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈류 공급 감소 상태를 말하며, 궁극적으로 비가역적인 손상, 즉 세포 및 조직의 괴사로 이어지게 된다. 특히, 심장, 뇌는 혈류 공급 부족에 가장 민감한 신체 기관으로서, 조직 상에 허혈이 발생하면 허혈성 캐스캐이드라고 불리우는 일련의 과정들이 촉발되어 조직이 영구적으로 손상된다. 상기와 같은 허혈 증상을 나타내는 질환을 허혈성 질환이라 하고, 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과, 뇌졸중 및 말초혈관질환 등의 혈관질환을 포함한다.Ischemia is a condition of reduced blood flow to body organs, tissues or sites, which ultimately leads to irreversible damage, ie necrosis of cells and tissues. In particular, the heart and brain are the most organs of the body that are most sensitive to a lack of blood supply, and when ischemia develops on a tissue, a series of processes called ischemic cascades are triggered, permanently damaging the tissue. Diseases exhibiting such ischemic symptoms are called ischemic diseases and include heart diseases such as heart failure, hypertensive heart disease, arrhythmia, congenital heart disease, myocardial infarction and angina pectoris, and vascular diseases such as stroke and peripheral vascular disease.

허혈성 질환은 여러 가지 원인에 의하여 야기될 수 있으며, 예를 들면, 동맥경화, 저혈압, 혈관외부로부터의 혈관 압박(예를 들어, 혈관 외부의 암에 의한 혈관 압박), 혈전, 색전증, 사고로 인한 뇌혈관 손상, 뇌일혈, 뇌경색, 동정맥 기형, 말초 동맥 폐색 질환 등에 의하여 허혈 증상이 나타날 수 있다. Ischemic diseases can be caused by a variety of causes, including, for example, arteriosclerosis, hypotension, vascular compression from outside the vessel (eg, vascular compression from cancer outside the vessel), thrombosis, embolism, accidents Ischemic symptoms may occur due to cerebrovascular injury, cerebral hemorrhage, cerebral infarction, arteriovenous malformations, and peripheral arterial occlusion disease.

동맥경화증, 특히 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis)이란 콜레스테롤, 인지질, 칼슘 등을 함유한 지방성 물질(plaque)이 혈관 내막에 축적되어 동맥이 단단해져 탄력성을 잃고 좁아져서 혈액공급이 저해되거나 압력이 높아져 동맥이 파열, 박리 등이 일어나는 상태를 말한다. 이에 따라 혈액 공급이 감소되어 영양분과 산소가 부족하게 되어 허혈성 혈관계 질환의 주요 원인이 된다(Libby P, et al., Circulation, 86(6), 47-52, 1992; Lundgren CH, et al., Circulation, 90(4), 1927-1934, 1994; Harker, et al., Ann. NY Acad. Sci., 275, 321-329, 1976). 따라서, 상기 허혈성 질환을 치료하기 위하여, 원인이 되는 증상을 치료하거나, 혈관을 생성, 확장시키는 치료가 연구되고 있다.
Atherosclerosis, especially atherosclerosis, is a fatty substance (plaque) containing cholesterol, phospholipids, and calcium that accumulates in the vascular lining, hardening the arteries, losing elasticity and narrowing, impeding blood supply or increasing pressure, causing the arteries to rupture. , A state in which peeling or the like occurs. This results in a decrease in blood supply and a lack of nutrients and oxygen, which is a major cause of ischemic vascular disease (Libby P, et al., Circulation, 86 (6), 47-52, 1992; Lundgren CH, et al., Circulation, 90 (4), 1927-1934, 1994; Harker, et al., Ann.NY Acad. Sci., 275, 321-329, 1976). Therefore, in order to treat the ischemic disease, a treatment for treating a causative symptom or generating and expanding blood vessels has been studied.

한편, 혈관 내에서 피의 흐름으로 인하여 발생되는 물리적인 힘 중에서 마찰력으로 기인한 전단 응력(shear stress)은 항상 혈류에 노출되어 있는 내피세포 기능의 중요한 조절인자로서 여러 가지 주변분비(paracrine) 인자나 자가분비(autocrine)인자의 생산을 조절하고 있다. 이런 자가분비 인자나 측분비 인자의 생산조절을 통해 전단 응력은 혈관의 톤(tone), 혈관벽 리모델링, 피 속에 존재하는 세포들과 혈관 내막과의 결합작용, 지혈작용 등을 유지 및 조절하고 있다.On the other hand, shear stress due to friction among physical forces generated by blood flow in blood vessels is an important regulator of endothelial cell function that is always exposed to the bloodstream. It regulates the production of autocrine factors. Shear stress maintains and regulates the tone of blood vessels, the remodeling of blood vessels, the binding of blood cells to the vascular lining, and the hemostatic action through the regulation of production of these autosecretory or lateral secretion factors.

흥미롭게도 동맥경화 발생이 높게 일어나고 있는 부위가 불안정한 전단 응력이 노출되어 있는 곳이거나 아주 낮은 전단 응력이 노출되는 곳과 일치하고 있는 현상이 관찰되면서(Davies PF, Physiological review 75(3):519-60, 1995) 전단 응력의 중요성은 인식되어 왔는데, 동맥경화의 발생빈도가 낮은 부위에서는 혈관 내피층에 전단 응력이 강하게 노출되고, 동맥경화반이 빈번하게 검출되는 부위에서는 전단 응력의 노출정도가 약하다. 즉, 혈관에 높은 전단 응력이 노출되면 동맥경화의 발생을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한 전단 응력은 혈관의 확장과 수축에 중요한 역할을 하고 있는 산화질소(NO), 프로스타사이클린(prostacyclin), 엔도테린(endothelin) 등의 농도를 조절하여 혈관의 직경을 조절하고 있다. 구체적으로는 전단 응력은 혈관확장과 관련 있는 물질(eNOS, prostacyclin 등)은 그 농도를 증가시키고, 혈관 수축조절인자(endothelin 등)들의 농도를 저하 시킨다.
Interestingly, the site where the occurrence of atherosclerosis is high coincides with the location where unstable shear stress is exposed or where very low shear stress is exposed (Davies PF, Physiological review 75 (3): 519-60). , 1995) The importance of shear stress has been recognized. Shear stress is strongly exposed to the vascular endothelium at low incidence of arteriosclerosis, and weak at the site where arterial plaques are frequently detected. In other words, exposure of high shear stress to blood vessels is known to inhibit the occurrence of atherosclerosis. Shear stress also regulates the diameter of blood vessels by controlling the concentrations of nitric oxide (NO), prostacyclin, and endothelin, which play an important role in blood vessel expansion and contraction. Specifically, shear stress increases the concentration of substances related to vasodilation (eNOS, prostacyclin, etc.) and decreases the concentration of vasoconstrictors (endothelin, etc.).

FAK(focal adhesion kinase)는 FA(focal adhesion)에서 활성 형태로 발견되었고 간접적으로 인테그린을 통하여 세포외 기질과 접착하고, 세포수준에서 세포 확산, 부착, 다양한 세포 신호 전달의 조절을 포함하는 다양한 세포 기능에 관련된 것으로 알려져 있다. 그 중, 전단 응력이 노출되면 내피세포에서의 세포골격이 재배열되는데, 이 과정에서 FAK가 부위 특이적으로 인산화되고, FA 단백질이 재배열되는 것으로 알려져 있다. 최근 동물 모델 연구는 FAK가 심혈관체계, 심장 비대, 혈관형성의 발생에 있어 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다. FAK는 인테그린, Src 키나아제, p130Cas, 파실린을 포함한 다양한 분자와 상호작용하여 다양한 세포적 활성에 관여한다. FAK (focal adhesion kinase) is found in active form in focal adhesion (FA) and indirectly adheres to extracellular matrix through integrins, and various cellular functions, including cell proliferation, adhesion and regulation of various cellular signals at the cellular level It is known to be related. Among them, when the shear stress is exposed, the cytoskeleton in endothelial cells is rearranged. In this process, FAK is site-specific phosphorylated and FA protein is rearranged. Recent animal model studies have confirmed that FAK plays an important role in the development of cardiovascular system, cardiac hypertrophy and angiogenesis. FAK is involved in a variety of cellular activities by interacting with a variety of molecules, including integrins, Src kinases, p130Cas, and pacillin.

FAK에 의해 조절되는 다양한 혈관 기능은 부위 특이적인 FAK 인산화와 연관되어 있다. 다른 위치에서의 티로신 인산화는 상이한 경로를 통해서 이루어지며, 상이한 세포기능에 영향을 미친다. 예를 들어, Tyr-397는 Src 패밀리 티로신 키나아제와 상호작용을 할 수 있도록 하는 자동인산화 부위이고, Tyr-576/577과 -925는 Src 키나아제에 의해 인산회되며, Tyr-576/577의 인산화는 FAK 의 키나아제 활성을 높인다. FAK 인산화는 VEGF과 기계적 힘 등을 포함하는 많은 자극에 의해 조절된다. 구체적으로, 인간 폐동맥내피세포에서, 전단응력은 Tyr-576 인산화를 증가시키지만 Tyr-397 인산화는 증가시키지 않는 것으로 보고되었다.
Various vascular functions regulated by FAK are associated with site specific FAK phosphorylation. Tyrosine phosphorylation at different positions occurs through different pathways and affects different cellular functions. For example, Tyr-397 is an autophosphorylation site that allows for interaction with Src family tyrosine kinases, Tyr-576 / 577 and -925 are phosphate ashed by Src kinase, and Tyr-576 / 577 phosphorylation is Enhances the kinase activity of FAK. FAK phosphorylation is regulated by many stimuli, including VEGF and mechanical forces. Specifically, in human pulmonary endothelial cells, shear stress has been reported to increase Tyr-576 phosphorylation but not Tyr-397 phosphorylation.

한편, XIAP는 지질뗏목(lipid raft) 및 비 지질뗏목 부위에서 모두 관찰되는 단백질로서, 암세포주에서 프로-카스파제의 분열을 억제하고 핵 인자-kB(NF-kB)와 MAP 키나아제를 포함하는 많은 세포 신호 분자를 조절해서 세포 죽음(apoptosis)을 억제한다고 알려져있다. 또한, XIAP는 산화질소 생산을 촉진해서 세포생존 인자로서 작용을 한다. XIAP에 의해 유도된 NO 생산은 내피 산화질소 합성 효소(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)의 활성화에 의해 일어난다. XIAP는 eNOS에 대한 카베오닌-1의 억제효과를 저해함으로써 eNOS를 활성화한다. 그러나, XIAP가 전단응력과 관련된 혈관 확장 및 항동맥경화 작용을 할 수 있다는 것에 대해서는 알려진 바가 없다.
On the other hand, XIAP is a protein observed in both the lipid raft and non-lipid raft sites, and inhibits pro-caspase cleavage in cancer cell lines and contains many nuclear factor-kB (NF-kB) and MAP kinases. It is known to suppress cell death by regulating cell signaling molecules. In addition, XIAP promotes nitric oxide production and acts as a cell survival factor. NO production induced by XIAP is caused by activation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS). XIAP activates eNOS by inhibiting the inhibitory effects of carveonin-1 on eNOS. However, it is not known that XIAP may have vasodilation and anti-arteriosclerosis effects associated with shear stress.

본 발명자는 전단 응력에 반응하여 FA로 FAK가 유인되고 FAK Tyr-576 가 인산화되어 ERK가 활성화 되는 것에 XIAP가 결정적 역할을 한다는 것을 발견함으로써 XIAP 과발현으로 전단응력과 관련된 혈관 확장 및 항동맥경화 효과를 달성할 수 있다는 것을 발견하고서 본 발명을 완성하였다.The inventors found that XIAP plays a critical role in facilitating FAK to FA and phosphorylating FAK Tyr-576 in response to shear stress, thereby activating ERK. The present invention has been accomplished by finding that it can be achieved.

본 발명의 목적은 XIAP 단백질, XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 또는 XIAP 단백질 발현 재조합 벡터를 포함하는 허혈성 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는, 항 동맥경화 또는 혈관확장 작용을 통하여 허혈성 질환의 치료 또는 예방을 할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a composition for the treatment or prevention of ischemic diseases comprising a XIAP protein, a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a XIAP protein or a XIAP protein expressing recombinant vector. More specifically, the present invention provides a composition capable of treating or preventing ischemic diseases through anti-arteriosclerosis or vasodilation.

또한, 본 발명의 목적은 XIAP 단백질 발현량의 증가를 나타내는 화합물을 확인하여 허혈성 질환을 치료하는 물질을 검정하는 방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a method for identifying a compound exhibiting an increase in the amount of XIAP protein expression and assaying a substance for treating ischemic disease.

하나의 양태로서, 본 발명은 XIAP 단백질을 포함하는, 허혈성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing ischemic disease, comprising a XIAP protein.

본 발명의 조성물에 사용되는 XIAP 단백질은 효모, 식물 또는 동물 유래의 모든 XIAP 단백질을 포함하고, 바람직하게는 동물, 더욱 바람직하게는 인간 유래의 XIAP 단백질을 포함한다. 야생형(wild type)의 XIAP 단백질을 포함하여, FAK 의 Tyr-576 인산화를 촉진하는 기능을 하는 한 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의한 XIAP 단백질의 변이체를 포함한다. 하나의 구체적 예시로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 XIAP 단백질을 들 수 있으며, 이러한 서열의 치환, 삽입, 결실 변이체도 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다. XIAP proteins used in the compositions of the present invention include all XIAP proteins from yeast, plant or animal, preferably XIAP proteins from animals, more preferably humans. Variants of XIAP protein by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or combinations thereof, including wild type XIAP proteins, as long as they function to promote Tyr-576 phosphorylation of FAK. As one specific example, there may be mentioned XIAP proteins having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and substitution, insertion, and deletion variants of such sequences can also be used in the compositions of the present invention.

서열번호 1SEQ ID NO: 1 mtfnsfegsk tcvpadinke eefveefnrl ktfanfpsgs pvsastlara gflytgegdt
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prelasagly ytgigdqvqc fccggklknw epcdrawseh rrhfpncffv lgrnlnirse
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fhcgggltdw kpsedpweqh akwypgckyl leqkgqeyin nihlthslee clvrttektp
sltrriddti fqnpmvqeai rmgfsfkdik kimeekiqis gsnykslevl vadlvnaqkd
smqdessqts lqkeisteeq lrrlqeeklc kicmdrniai vfvpcghlvt ckqcaeavdk
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XIAP 단백질의 변이체란 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 삽입은 통상적으로 약 1개 내지 20개 아미노산의 연속 서열로 이루어지나, 보다 큰 삽입도 가능할 수 있다. 결실은 통상적으로 약 1개 내지 30개의 잔기로 이루어지나, 일부의 경우에는 도메인중 하나가 결실될 수 있는 것과 같이 보다 큰 결실 또한 가능할 수 있다. 이런 변이체는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2d Ed., 1989). 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.A variant of a XIAP protein refers to a protein in which the amino acid sequence of the wild type and one or more amino acid residues differ in sequence. Insertion typically consists of a contiguous sequence of about 1 to 20 amino acids, although larger insertions may be possible. Deletion typically consists of about 1 to 30 residues, but in some cases larger deletions may also be possible, such as one of the domains may be deleted. Such variants can be prepared by chemical peptide synthesis methods known in the art or by recombinant methods based on DNA sequences (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2d Ed. , 1989). Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art (H. Neurode, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.

또한, XIAP 단백질은 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화 (glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification) 될 수도 있다.In addition, the XIAP protein may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation and the like in some cases.

상기 변이체 또는 수식체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이나, 필요에 따라서는 이의 단백질의 특성을 변형시킨 변이체 또는 수식체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질이다.The variant or modification may be a functional equivalent that exhibits the same biological activity as a natural protein, or may be a variant or modification that modifies the properties of the protein as needed. Preferably, the protein has increased structural stability against heat, pH, etc., or increased protein activity due to variation and modification on amino acid sequence.

XIAP 단백질은 당 분야에 널리 공지된 방법으로 천연에서 추출 및 정제하여 얻을 수 있다. 달리는, XIAP 단백질의 서열이 밝혀져 있으므로 화학적 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963)하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩타이드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, XIAP을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 XIAP이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 XIAP을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.XIAP proteins can be obtained by extraction and purification in nature by methods well known in the art. Alternatively, the sequence of the XIAP protein is known and can be obtained by chemical synthesis (Merrifleld, J. Amer. Chem. Soc .. 85: 2149-2156, 1963) or by using genetic recombination techniques. When prepared by chemical synthesis, it can be obtained using a polypeptide synthesis method well known in the art. When using recombinant technology, nucleic acid encoding XIAP is inserted into an appropriate expression vector, the vector is transformed into a host cell, the host cell is cultured so that XIAP is expressed, and XIAP is recovered from the host cell. Can be.

XIAP 단백질을 발현시키기 위한 발현벡터는 통상의 모든 발현 벡터를 다 사용할 수 있다. 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 사용될 수 있는 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 이중 이. 콜라이가 가장 일반적으로 사용된다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.As the expression vector for expressing the XIAP protein, any conventional expression vector can be used. Depending on the host cell, the expression level and expression of the protein are different. Therefore, the host cell may be selected and used according to the purpose. Host cells that can be used include Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, Proteus mirabilis or Staphylococcus Prokaryotic host cells, such as Staphylococcus, are but are not limited to these. Double teeth. E. coli is the most commonly used. In addition, fungi (eg Aspergillus), yeast (eg Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae) Cells derived from higher eukaryotes, including lower eukaryotic cells such as Schizosaccharomyces and Neurospora crassa, insect cells, plant cells, mammals and the like, can be used as host cells.

단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다. (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).Proteins are expressed in selected host cells and then subjected to conventional biochemical separation techniques, such as treatment with protein precipitants (salting), centrifugation, sonication, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography for isolation and purification. (Gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like can be used. In order to separate proteins of high purity, these are usually used in combination. (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA (1990)).

또 다른 양태로서, 본 발명은 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 허혈성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for treating or preventing ischemic disease comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a XIAP protein.

본 발명의 조성물에서 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.The nucleotide sequence encoding the XIAP protein in the composition of the present invention is a nucleotide sequence encoding a XIAP protein in the wild type or variant form as described above, wherein one or more bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof. It can be isolated from nature or prepared using chemical synthesis.

XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.When chemically synthesizing a nucleotide sequence encoding a XIAP protein, the synthesis is well known in the art, for example, as described in Engels and Uhlmann, Angew Chem Int Ed Eng., 37: 73-127, 1988. Methods can be used, such as tryster, phosphite, phosphoramidite and H-phosphate methods, PCR and other autoprimer methods, oligonucleotide synthesis on solid supports, and the like.

XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 하나의 구체적 예시로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 들 수 있다.One specific example of the nucleotide sequence encoding the XIAP protein includes a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

상기한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다.The nucleic acid having the above nucleotide sequence may be single or double stranded, and may be a DNA molecule (genomic, cDNA or synthetic) or an RNA molecule.

바람직한 양태에서, XIAP 단백질 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 이를 발현하는 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 벡터에 제공된다.In a preferred embodiment, the nucleotide sequence encoding the XIAP protein is provided to a recombinant expression vector operably linked to the vector expressing it.

본 발명에서 “벡터”란 목적 유전자를 코딩하는 핵산 서열(예: DNA, RNA 등)을 숙주 세포로 도입하기 위한 수단을 의미한다. 본 발명에서 “발현 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.In the present invention, the term "vector" means a means for introducing a nucleic acid sequence (eg, DNA, RNA, etc.) encoding a gene of interest into a host cell. As used herein, an “expression vector” refers to a gene construct that is capable of expressing a protein of interest or RNA of interest in a suitable host cell and comprises an essential regulatory element operably linked to express a gene insert.

본 발명에서 “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.In the present invention, "operably linked" refers to a functional linkage of a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA of interest to perform a general function. A promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA can be operably linked to affect the expression of the coding sequence.Operative linkage with recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art. Site-specific DNA cleavage and ligation uses enzymes generally known in the art, and the like.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.Vectors of the invention include plasmid vectors, cosmid vectors, viral vectors and the like. Suitable expression vectors include signal or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals, enhancers and can be prepared in various ways depending on the purpose. Initiation and termination codons are generally considered to be part of the nucleotide sequence encoding the immunogenic target protein and must be functional in the subject and be in frame with the coding sequence when the gene construct is administered. The promoter of the vector may be constitutive or inducible. The expression vector also includes a selectable marker for selecting a host cell containing the vector and, in the case of a replicable expression vector, a replication origin. The vector may be self-replicating or integrated into the host DNA.

재조합 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma cirus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등의 재조합 바이러스 벡터를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 레트로바이러스의 경우, 숙주세포의 염색체내로 비가역적으로 융합되기 때문에 유전자 발현이 장기간 지속되는 장점이 있다. 아데노바이러스의 경우, 일반적인 유전자 치료 연구에서 가장 많이 사용되어 온 시스템으로 다양한 종류의 포유류 세포에 사용가능하다. 아데노 관련 바이러스의 경우, 유전자를 전달하는 숙주 세포의 범위가 넓고 반복 투여시 면역 부작용이 적으며 유전자 발현 기간이 긴 장점이 있다. 헤르페스 심플렉스 바이러스의 경우 신경조직에 친화성이 큰 바이러스로서, 신경세포의 정상기능에 영향을 미치지 않고 핵중에서 염색체 외부에 안정한 염색체 부체(episomal element)로 존재한다. 복제-결핍 헤르페스 심플렉스 바이러스를 유전자 전이에 사용하여 리포터 유전자의 발현기간을 연구한 결과 신경계에서 1년 이상 발현이 지속된다고 보고되었다.Recombinant vectors are retroviruses such as Human immunodeficiency virus HIV (Murine leukemia virus) Avian sarcoma / leukosis (ASLV), Spleen necrosis virus (SNV), Rus sarcoma cirus (RSV), and Mouse mammary (MMTV). tumor viruses, and the like, but may include, but are not limited to, recombinant viral vectors such as Adenovirus, Adeno-associated virus, and Herpes simplex virus. Retroviruses have the advantage of long-term gene expression because they are irreversibly fused into the chromosome of the host cell. Adenoviruses are the most commonly used systems in general gene therapy research and can be used in a wide variety of mammalian cells. In the case of adeno-associated virus, there is a wide range of host cells that deliver genes, fewer side effects of immunity upon repeated administration, and long gene expression periods. The herpes simplex virus is a virus having a high affinity for neural tissues and exists as a stable episomal element outside the chromosome in the nucleus without affecting the normal function of nerve cells. Replication-deficient herpes simplex virus was used for gene transfer and studies of the reporter gene expression period reported that expression in the nervous system persists for at least one year.

XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 직접 주사하거나 (Wolff et al., Science, 247:1465-8, 1990: Wolff et al., J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하여 허혈성 질환을 치료 또는 예방의 목적으로 환자 세포 안으로 전달될 수 있다. 리포좀은 유전자 전달을 위하여 DOTMA나 DOTAP등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성된다 이 복합체는 세포내로 엔도사이토시스 되어 엔도좀내에 체류하게 되다(Schaefer-Ridder M et al., Sceience. 215(4529):166-168, 1982; Hodgson et al., Nat Biotechnol., 14(3):339-342, 1996). 엔도좀에서 유입된 유전자가 세포질을 거쳐 핵으로 이동하는 정도가 유전자 전이와 치료 효율을 결정하게 된다. 이런 유전자 전이 방법은 면역원성이 낮아서 반복 투여가 가능하고 안전성이 높은 장점이 있으나 유전자 발현 효율이 낮다는 단점이 있다. 유전자 수송에 사용되는 양이온성 고분자로는 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 키토산(chitosan)등이 있다(Hashida, Br J Cancer., 90(6):1252-1258, 2004; Wiseman, Gene Ther., 10(19):1654-1662, 2003; Koping-Hoggard, Gene Ther.,8(14):1108-1121, 2001). 유전자를 양이온성 고분자와 복합체 형태로 체내 투여할 경우 유전자의 체내 체류시간 및 발현 지속시간이 네이키드 DNA(naked DNA)에 비하여 현저히 증가하는 것으로 밝혀졌다.Nucleic acids having a nucleotide sequence encoding a XIAP protein can be directly injected into known methods in the art, such as naked DNA in vector form (Wolff et al., Science, 247: 1465-8, 1990: Wolff et al. , J Cell Sci. 103: 1249-59, 1992), liposomes, cationic polymers and the like can be delivered into patient cells for the purpose of treating or preventing ischemic diseases. Liposomes are phospholipid membranes prepared by mixing cationic phospholipids such as DOTMA or DOTAP for gene transfer. Nucleic acid-liposomal complexes are formed when cationic liposomes and anionic nucleic acids are mixed in a proportion. Cis and become endosomes (Schaefer-Ridder M et al., Sceience. 215 (4529): 166-168, 1982; Hodgson et al., Nat Biotechnol., 14 (3): 339-342, 1996) . The degree of gene transfer from the endosome to the nucleus through the cytoplasm determines gene transfer and treatment efficiency. This gene transfer method has the advantage of low immunogenicity, repeated administration and high safety, but low gene expression efficiency. Cationic polymers used for gene transport include poly-L-lysine, spermine, polyethylenimine (PEI) and chitosan (Hashida, Br J Cancer). , 90 (6): 1252-1258, 2004; Wiseman, Gene Ther., 10 (19): 1654-1662, 2003; Koping-Hoggard, Gene Ther., 8 (14): 1108-1121, 2001). When the gene is administered in the form of a complex with a cationic polymer, the residence time and expression duration of the gene have been found to be significantly increased compared to naked DNA.

또 다른 양태로서, 본 발명은 약리학적 유효량의 XIAP 단백질, XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 또는 XIAP 단백질 발현 재조합 벡터를 허혈성 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여하여, 허혈성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.In another embodiment, the present invention provides a method for treating ischemic disease by administering a pharmacologically effective amount of XIAP protein, a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a XIAP protein, or a XIAP protein expressing recombinant vector to a subject in need of treatment or prevention of ischemic disease. Provide a way to prevent it.

본 발명의 치료방법에 사용되는 XIAP 단백질, XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 또는 XIAP 단백질 발현 재조합 벡터는 상술한 바와 같다.The XIAP protein, nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the XIAP protein, or XIAP protein expression recombinant vector used in the treatment method of the present invention is as described above.

상기한 바와 같은 XIAP 단백질, XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 또는 XIAP 단백질 발현 재조합 벡터를 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 허혈성 질환을 치료 또는 예방하는데 사용된다. The pharmaceutical composition of the present invention comprising a XIAP protein as described above, a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a XIAP protein, or a XIAP protein expressing recombinant vector is used to treat or prevent ischemic disease.

본 발명에서, "허혈"은 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈류 공급 감소 상태를 말한다. 본 발명에서, “허혈성 질환”이란, 허혈 증상을 나타내는 질환으로서, 궁극적으로 비가역적인 세포 및 조직의 손상을 동반하는 질환을 말한다. 상기 허혈성 질환으로는, 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과, 뇌졸중 및 말초혈관질환 등의 혈관질환을 포함할 수 있다. 본 발명에서 “혈관내피세포”는 혈관의 내부표면을 둘러싸고 있는 얇은 층을 형성하고 있는 세포들이다.In the present invention, "ischemic" refers to a reduced state of blood flow to body organs, tissues or sites. In the present invention, "ischemic disease" refers to a disease exhibiting ischemic symptoms and ultimately accompanied by irreversible damage to cells and tissues. The ischemic disease may include heart disease such as heart failure, hypertensive heart disease, arrhythmia, congenital heart disease, myocardial infarction and angina, and vascular diseases such as stroke and peripheral vascular disease. In the present invention, "vascular endothelial cells" are cells that form a thin layer surrounding the inner surface of blood vessels.

하나의 양태로서, 본 발명은 항동맥경화 또는 혈관확장을 촉진하는, 허혈성 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
In one aspect, the present invention relates to a composition for treating or preventing ischemic diseases that promotes anti-arteriosclerosis or vasodilation.

본 발명의 구체적 실시예에서, 전단응력이 FAK Tyr-576 인산화를 자극하여 FAK의 키나아제 활성을 증가시키고, Tyr-925의 인산화 및 Tyr-397 인산화에는 큰 영향이 없음을 확인하였다(도 1). 또한, XIAP 녹다운은 전단 응력에 의해 증가되는 FAK Tyr-576 인산화를 저해하지만, Tyr-925와 Tyr-397 인산화에는 영향이 없음을 확인하였고, XIAP 녹다운은 전단 응력에 의해 자극된 ERK 활성을 감소시킴을 확인하였다(도 2). 따라서, 전단 응력 동안 XIAP는 Tyr-576 인산화에 필요하고 그 결과 BAECs에서 ERK 활성을 조절한다는 것을 확인하였다. 또한, 특이적으로 Tyr 576 인산화를 방해하는 약물(DCA)을 이용하여, Tyr-576인산화는 전단 응력 의존적인 ERK 활성에 영향을 미치는 것을 확인하였다(도 3). 또한, 전단 응력에 반응하는 Tyr-576 인산화와 ERK 활성에 있어서 Src 키나아제의 중요한 역할을 하며, XIAP가 FAK를 세포질 내에 유지시키고 Src 키나아제 와의 상호작용을 가능하게 하기 위하여 필수적임을 확인하였다(도 4). 한편, 이소성(ectopic) XIAP 발현은 전단 응력에 대한 ERK 활성을 과활성화시켰다. 상기와 같은 결과를 통하여, XIAP가 전단응력에 대한 FAK 576Tyr 인산화를 유도함으로써, 결과적으로 항 동맥경화 및 혈관확장을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.
In a specific embodiment of the present invention, the shear stress stimulated FAK Tyr-576 phosphorylation to increase the kinase activity of FAK, it was confirmed that there is no significant effect on Tyr-925 phosphorylation and Tyr-397 phosphorylation (Fig. 1). In addition, XIAP knockdown inhibited FAK Tyr-576 phosphorylation, which was increased by shear stress, but did not affect Tyr-925 and Tyr-397 phosphorylation. XIAP knockdown reduced ERK activity stimulated by shear stress. It was confirmed (Fig. 2). Thus, it was confirmed that during shear stress XIAP is required for Tyr-576 phosphorylation and consequently regulates ERK activity in BAECs. In addition, using a drug that specifically interferes with Tyr 576 phosphorylation (DCA), it was confirmed that Tyr-576 phosphorylation affects shear stress dependent ERK activity (FIG. 3). In addition, it plays an important role of Src kinase in Tyr-576 phosphorylation and ERK activity in response to shear stress, confirming that XIAP is essential for maintaining FAK in the cytoplasm and enabling interaction with Src kinase (FIG. 4). . On the other hand, ectopic XIAP expression overactivated ERK activity against shear stress. Through the above results, it was confirmed that XIAP induces FAK 576Tyr phosphorylation on shear stress, and as a result, can promote anti-arteriosclerosis and vasodilation.

본 발명에서, 용어 "치료 또는 예방" 이란 XIAP 단백질, XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 또는 XIAP 단백질 발현 재조합 벡터를 포함하는 조성물을 이용함으로써, 허혈성 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하는 모든 행위를 말하며, 특히 "치료"는 상기 조성물을 사용하여 허혈성 질환을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. In the present invention, the term “treatment or prophylaxis” refers to the use of a composition comprising a XIAP protein, a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a XIAP protein, or a XIAP protein expressing recombinant vector, thereby inhibiting or alleviating the clinical situation associated with an ischemic disease. Refers to all actions, in particular "treatment" means all actions that improve or beneficially modify ischemic disease using the composition.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.The composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers can be used as oral administration binders, suspending agents, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, flavorings, etc., in the case of injections, buffers, preservatives, analgesic Topical agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be used in combination, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used. Formulations of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in a variety of ways by mixing with pharmaceutically acceptable carriers as described above. For example, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like in the case of oral administration. In the case of injections, it can be prepared in unit dosage ampoules or in multiple dosage forms.

본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내주사 주입방식일 수 있다. By "administration" in the present invention is meant to introduce the pharmaceutical composition of the present invention to the patient in any suitable way, the route of administration of the composition of the present invention via various oral or parenteral routes as long as the target tissue can be reached. May be administered. Parenteral administration can be subcutaneous, intravenous, intramuscular or intrathoracic infusion.

본 발명에서 “치료학적으로 유효한 양”은 특정 환자에 대하여 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 바람직하게 상기 약제학적 조성물의 투여량이 체중 kg 약 100 mg 내지 약 200 mg의 범위에서 사용될 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.In the present invention, a "therapeutically effective amount" refers to a specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved for a particular patient, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general state of health, sex of the patient. And various factors and similar factors well known in the medicinal art, including diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or concurrent with the specific composition. It will be apparent to those skilled in the art that the appropriate total daily dose may be determined by the practitioner within the scope of sound medical judgment. Preferably, the dosage of the pharmaceutical composition may be used in the range of about 100 mg to about 200 mg of body weight, and may be administered once or in divided doses. However, the dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.

또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) XIAP 단백질 발현 세포를 배양하는 단계, (b) 단계 (a)의 세포를 XIAP 단백질의 발현을 촉진시키는 후보 화합물과 접촉시키는 단계, (c) 단계 (b)에서의 XIAP 단백질의 발현량을 후보 화합물과 접촉시키지 않은 대조군의 발현량과 비교하는 단계, 및(d) XIAP 단백질 발현량의 증가를 나타내는 화합물을 확인하는 단계를 포함하여, XIAP 단백질의 발현을 촉진시켜 허혈성 질환을 치료하는 물질을 검정하는 방법에 관한 것이다.In another embodiment, the present invention provides a method of treating a XIAP protein expressing cells, (b) contacting the cells of step (a) with a candidate compound that promotes expression of XIAP protein, (c) step (b) Promoting the expression of the XIAP protein, including comparing the expression level of the XIAP protein with the expression level of the control group not contacted with the candidate compound, and (d) identifying the compound that exhibits an increase in the expression level of the XIAP protein. To assay for substances that treat ischemic diseases.

XIAP 단백질의 발현량의 차이는 단백질 수준 또는 mRNA 수준에서 확인할 수 있다.Differences in the amount of XIAP protein expression can be seen at the protein or mRNA levels.

단백질 발현량의 수준은 각각의 단백질을 겔에 로딩한 후 전기 영동을 통해서 확인할 수 있으나, 바람직하게는 XIAP 단백질에 대한 항체를 이용한 항원-항체 복합체 형성량을 통해 면역검정법으로 확인할 수 있다. 이러한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, RIA, 면역침전 분석법 등이 있다.The level of protein expression can be confirmed by electrophoresis after loading each protein into the gel, but preferably by immunoassay through antigen-antibody complex formation using an antibody against XIAP protein. Such assays include Western blot, RIA, immunoprecipitation assay, and the like.

상기 검출 방법에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.In the detection method, the amount of antigen-antibody complex formed can be quantitatively measured through the magnitude of a signal of a detection label. Such a detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not necessarily limited thereto.

항원-항체 복합체 형성을 검출하기 위해 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법을 이용할 수 있으며, 반드시 이들로만 제한되는 것은 아니다.Colorimetric method, electrochemical method, fluorimetric method, luminometry, particle counting method, visual assessment and the like to detect antigen-antibody complex formation. A method selected from the group consisting of scintillation counting methods may be used, but is not limited thereto.

mRNA 발현량의 수준은 XIAP 단백질에 특이적인 프라이머를 이용하여 확인할 수 있다. 구체적인 분석 방법으로는 RT-PCR 또는 노던 블랏 등이 있다. 밴드의 패턴과 강도를 확인함으로써 XIAP의 mRNA로의 전사를 정량적으로 측정할 수 있는 간편한 분석방법인 RT-PCR이 바람직하다.
The level of mRNA expression level can be confirmed using primers specific for XIAP protein. Specific analysis methods include RT-PCR or Northern blot. RT-PCR, which is a simple assay that can quantitatively measure the transcription of XIAP to mRNA by identifying the pattern and intensity of the band, is preferred.

XIAP는 전단응력에 대한 FAK 576Tyr 인산화를 유도하고 그 결과 ERK 활성을 유도하므로, 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 항 동맥경화 및 혈관확장을 촉진시켜 허혈성 질환 치료 또는 예방 효과를 달성할 수 있다. Since XIAP induces FAK 576Tyr phosphorylation on shear stress and consequently induces ERK activity, the composition according to the present invention can be used to promote anti-arteriosclerosis and vasodilation to achieve the treatment or prevention of ischemic disease.

도 1은 전단 응력이 FAK Tyr-576 인산화를 높인다는 것을 보여주는 실험 결과이다. BAECs의 단일층이 지시된 시간 동안 전단응력에 노출되었다.(10dyn/cm²) A. 세포 용해물은 항-pY397 FAK, 항-pY576 FAK, 항-pY925 FAK, 또는 항-FAK 항체로 면역블로팅 되었다. B. 블롯이 정량되어 그래프 (means±S.E., n=3)로 구성되었다.
도 2는 XIAP 녹다운이 전단응력에 의해 향상되는 FAK Tyr-576 인산화를 저해한다는 것을 보여주는 실험 결과이다. BAECs은 대조군 또는 XIAP siRNA로 형질감염되었다. A. 웨스턴 블로팅은 항-XIAP 및 항-액틴 항체를 사용하여 수행되었다. B-C. siRN로 형질 감염된 BAECs를 지정된 시간 동안 전단응력에 노출시켰다.(10dyn/cm²). 세포용해물 내 단백질은 항-pERK, 항-ERK, 항-pY397 FAK, 항-pY576 FAK, 항-pY925 FAK, 또는 항-FAK 항체를 사용해 면역블로팅 되었다.
도 3은 DCA가 전단 응력에 의하여 향상되는 FAK Tyr-576 인산화를 저해한다는 것을 보여주는 실험 결과이다. BAECs 는 DCA 로 1시간동안 처리하였다. A. 항-pY397 FAK, 항-pY576 FAK, 항-pY925 FAK, 항-FAK 항체를 이용해 면역블로팅하였다. B. 블롯이 정량되어 그래프 (means±S.E., n=3)로 구성되었다. C. BAECs는 운반체대조군 또는 DCA로 전처리를 한 후 전단응력에 노출시켰다(10dyn/cm²). 세포 용해물은 항-pERK 또는 항-ERK 항체로 검출되었다. D. 블롯이 정량되고 그래프 (means±S.E., n=3). *P<0.05로 구성되었다.
도 4는 XIAP가 FAK 와 Src 키나아제 상호작용에 필수적이라는 것을 보여주는 실험 결과이다. BAECs는 PP2로 30 분동안 전처리 되고 전단응력에 (10dyn/cm²) 노출되었다. A. 웨스턴 블로팅이 다양한 항체로 수행되었다. B. 블롯이 정량되어 그래프 (means±S.E., n=3)*P<0.05 로 구성되었다. C-D. BAECs는 대조군 또는 XIAP siRNA로 형질 감염되어 전단응력에 노출되지 않거나(C) 노출되었다(D). 그 후, 세포는 항-FAK 나 항-Src 키나아제 항체로 검출되었다.1 is an experimental result showing that shear stress increases FAK Tyr-576 phosphorylation. Monolayers of BAECs were exposed to shear stress for the indicated times (10 dyn / cm ² ). A. Cell lysates were immunoblotted with anti-pY397 FAK, anti-pY576 FAK, anti-pY925 FAK, or anti-FAK antibodies. Was put. B. Blots were quantified and plotted as graphs (means ± SE, n = 3).
2 is an experimental result showing that XIAP knockdown inhibits FAK Tyr-576 phosphorylation enhanced by shear stress. BAECs were transfected with control or XIAP siRNA. A. Western blotting was performed using anti-XIAP and anti-actin antibodies. BC. BAECs transfected with siRN were exposed to shear stress for a designated time (10 dyn / cm ² ). Proteins in lysates were immunoblotted using anti-pERK, anti-ERK, anti-pY397 FAK, anti-pY576 FAK, anti-pY925 FAK, or anti-FAK antibodies.
3 is a DCA Improved by shear stress Experimental results show that it inhibits FAK Tyr-576 phosphorylation. BAECs were treated with DCA for 1 hour. A. Immunoblotting with anti-pY397 FAK, anti-pY576 FAK, anti-pY925 FAK, anti-FAK antibodies. B. Blots were quantified and plotted as graphs (means ± SE, n = 3). C. BAECs were exposed to shear stress after pretreatment with vehicle control or DCA (10 dyn / cm ² ). Cell lysates were detected with anti-pERK or anti-ERK antibodies. D. Blots were quantified and graphed (means ± SE, n = 3). * P <0.05.
4 is Experimental results show that XIAP is essential for FAK and Src kinase interactions. BAECs were pretreated with PP2 for 30 minutes and exposed to shear stress (10dyn / cm ² ). A. Western blotting was performed with various antibodies. B. Blots were quantified and consisted of graph (means ± SE, n = 3) * P <0.05. CD. BAECs were transfected with a control or XIAP siRNA and were not exposed to shear stress ( C ) or exposed ( D ). The cells were then detected with anti-FAK or anti-Src kinase antibodies.

실시예Example 1 : 세포배양 1: cell culture

소의 하부가슴대동맥에서 채취한 소의 대동맥 내피 세포(BAECs)를 항생제(페니실린/스트레토마이신)와 20% 우태아혈청(FBS, Wel GENE Inc)을 포함하는 성장배지(DMEM, Wel GENE Inc) 에서 37°C, 5% CO₂ 에서 배양하였다. 본 실시예에서 세포는 3 내지 10 패시지(passage)를 사용하였다.
Bovine aortic endothelial cells (BAECs) from bovine lower thoracic aorta were harvested in growth medium (DMEM, Wel GENE Inc) containing antibiotics (penicillin / stretomycin) and 20% fetal bovine serum (FBS). Incubated at ° C, 5% CO ₂ . In this example, the cells used 3 to 10 passages.

실시예Example 2:  2: xiapxiap siRNAsiRNA 이용한  Used BAECs 의Of BAECs 형질감염 Transfection

BAECs 를 항생제없이 30~50%의 confluency 까지 배양했다. 그 후, 세포를 Invitrogen Life Technologies의 300 pmol/mL의 이중 올리고뉴클레오티드 Stealth siRNAs로 형질 감염시켰다. Stealth siRNAs의 타겟 서열은 5’-GCAGATTATGAAGCACGGATCTTTA-3’였다.
BAECs were cultured up to 30-50% confluency without antibiotics. Cells were then transfected with 300 pmol / mL double oligonucleotide Stealth siRNAs from Invitrogen Life Technologies. The target sequence of Stealth siRNAs was 5'-GCAGATTATGAAGCACGGATCTTTA-3 '.

실시예Example 3: 약물처리 3: drug treatment

BAECs 를 90% confluency 까지 유리 슬라이드에서 배양하고, 기아 배양액(0.5% FBS 포함 DMEM)에서 2시간 동안 기아 처리하였다. 약물처리를 위하여, BAECs 를 지정된 시간동안 100 μM 디옥시콜릭산(DCA)이나 30 μM PP2 ((4-아미노-5-(4-클로로페닐)-7-(t-부틸)피라졸로[3,4-d]피리미딘))로 전처리를 하였다.
BAECs were incubated on glass slides up to 90% confluency and starved for 2 hours in starvation broth (DMEM with 0.5% FBS). For drug treatment, BAECs were treated with either 100 μM deoxycholic acid (DCA) or 30 μM PP2 ((4-amino-5- (4-chlorophenyl) -7- ( t -butyl) pyrazolo [3,3) for a specified time period. 4- d ] pyrimidine)).

실시예Example 4:  4: 전단응력Shear stress 노출 exposure

BAECs 단일층을 포함하는 유리슬라이드를 평행판 전단 챔버에 모았다. 플로우(flow)를 발생시키기 위하여, 플로우 루프 시스템(flow loop system)을 사용하였다. 상기 평행판 챔버를 플로우 회로에 연결하여 플로우를 내피세포 표면에 부과하였다. 실험동안 상기 플로우 챔버 및 플로우 루프를 조직배양기 (37℃, 5% CO₂) 내에 보관하였다. 박동이 없는 전단응력은 세포로 전달되는 기아 배양액의 유체 속도를 변화함으로써 조절하였다.
Glass slides comprising a BAECs monolayer were collected in a parallel plate shear chamber. In order to generate the flow, a flow loop system was used. The parallel plate chamber was connected to a flow circuit to impose flow on the endothelial cell surface. The flow chamber and flow loop were stored in a tissue incubator (37 ° C., 5% CO ₂ ) during the experiment. The pulsatile shear stress was controlled by varying the fluid velocity of the starvation broth delivered to the cells.

실시예Example 5: 세포  5: cells 용해물Melt 준비 Ready

다양한 자극으로 전처리된 BAECs 를 차가운 인산 완충액(PBS)으로 씻어내었고, 그 후 단백질효소 저해제 칵테일을 포함하는 용해 버퍼(pH 7.4의 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM vanadate, 1% Triton X-100, 10% glycerol and 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride)내에 수확하였다. 그 후에 용해 물질을 원심력과 분쇄에 의해 얻었다. 세포 내 단백질 양은 Micro BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Scientific)로 측정했다.
BAECs pretreated with various stimuli were washed with cold phosphate buffer (PBS) and then lysis buffer containing a proteinase inhibitor cocktail (50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM vanadate, 1% Triton X- in pH 7.4). 100, 10% glycerol and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride) were harvested. Thereafter, the dissolved material was obtained by centrifugal force and grinding. Intracellular protein levels were measured with the Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific).

실시예Example 6 :  6: 웨스턴Western 블로팅Blotting

세포 용해물 내 단백질(25μg)을 10% SDS-PAGE로 분석하고, polyvinylidene difluoride (PVDF) 막(Bio-rad)으로 옮기고, XIAP (BD Biosciences), pY397 FAK (Millipore), pY576 FAK (Millipore), pY925 FAK (Cell signaling), FAK (Millipore), 또는 ERK 1/2 (Cell signaling)에 특이적인 항체로 면역블롯하였다. 그 후 막을 HRP로 접합된 2차 항체와 함께 배양하였고, 증진된 화학발광 탐지 키트 (Amersham)로 현상하였다.
Protein in cell lysate (25 μg) was analyzed by 10% SDS-PAGE, transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-rad), XIAP (BD Biosciences), pY397 FAK (Millipore), pY576 FAK (Millipore), pY925 was immunoblotted with antibodies specific for Cell signaling (FAK), Millipore (FAK), or Cell signaling (ERK 1/2). The membranes were then incubated with secondary antibodies conjugated with HRP and developed with an enhanced chemiluminescence detection kit (Amersham).

실시예Example 7 : 세포독성 분석 7: cytotoxicity assay

BAECs를 90% confluency 까지 배양하고 2시간 동안 혈청기아 상태로 두었다. 세포독성분석을 위하여, 세포는 다양한 약물로 전처리되었고, 제조사 프로토콜(ITSBIO)에 따라 EZ-Cytox 세포 생존 분석 키트 용액에서 배양되었다. 생균은 480nm에서 염료를 흡수를 측정할 수 있는 다중 웰 분광 광도계를 사용해 정량했다.
BAECs were incubated to 90% confluency and left serum starved for 2 hours. For cytotoxicity assays, cells were pretreated with various drugs and incubated in EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit solution according to manufacturer protocol (ITSBIO). Probiotics were quantified using a multi-well spectrophotometer capable of measuring absorption at 480 nm.

실시예Example 8 :  8 : 면역현광검사Immunofluorescence

BAECs를 4% paraformaldehyde로 15분간 고정시키고 0.5% Tween 20 포함된 PBS에서 10분간 투과시키고, 2% BSA와 0.1% Tween 20이 포함된 PBS에서 1시간 동안 차단시겼다. 그 후에, 세포를 항-FAK (Millipore) 와 항-Src 키나아제 (Cell signaling) 항체 로 4°C에서 밤새 배양하고, Alexa 488-접합된 염소 항-마우스항체(Invitrogen Life Technologies)와 Alexa 555-접합된 염소 항-토끼항체(Invitrogen Life Technologies)로 1시간동안 배양하였다. Slow-Fade mounting medium를 사용하여 시료를 mounting 한 후, 공초점 레이저 현미경(Carl Zeiss-LSM 510)으로 세포를 관찰했다.
BAECs were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes, permeated in PBS containing 0.5% Tween 20 for 10 minutes, and blocked for 1 hour in PBS containing 2% BSA and 0.1% Tween 20. The cells are then incubated overnight at 4 ° C with anti-FAK (Millipore) and anti-Src kinase (Cell signaling) antibodies and Alexa 555-conjugated with Alexa 488-conjugated goat anti-mouse antibody (Invitrogen Life Technologies) Incubated with goat anti-rabbit antibody (Invitrogen Life Technologies) for 1 hour. After mounting the sample using a slow-fade mounting medium, the cells were observed with a confocal laser microscope (Carl Zeiss-LSM 510).

결과result

1. One. 전단응력이Shear stress FAKFAK TyrTyr -576 인산화를 자극함을 확인.-576 found to stimulate phosphorylation.

전단응력이 FAK의 티로신 인산화를 조절하는지의 여부를 결정하기 위하여 우리는 BAECs를 전단응력에 노출 후에 웨스턴 블라팅을 행했다. 도 1에서 보여진 것과 같이 전단응력은 FAK의 Tyr-576과 Tyr-925의 인산화를 높이는 반면에 Tyr-397 인산화에는 영향이 없었다. 전단응력에 노출된 후 1분 후에, Tyr-576 인산화가 약 5배 만큼 증가한 것으로 보이고, 이 수준이 노출 후 30분까지 지속되었다. 대조적으로, Tyr-925 는 전단 응력에 의해 단지 일시적으로 인산화 되었다. 전단응력에 노출 후 1분에 Tyr-925 인산화가 최대였고, 5분 후 기본 수준까지 감소하였다(도 1). FAK Tyr-576 인산화의 빠른 조절에 의하면 전단응력에 의해 자극된 FAK 인산화가 전단응력 반응 초기에 일어나는 것으로 보인다. Tyr-576 인산화는 전단응력에 의해 빠르게 증가된다고 확인하였다. 이러한 인산화는 FAK의 키나아제 활성을 높이는 것임을 고려하면, 전단응력은 FAK의 키나아제 활성을 증가시키는 것으로 보인다.
To determine whether shear stress regulates tyrosine phosphorylation of FAK, we performed western blotting after exposing BAECs to shear stress. As shown in FIG. 1, the shear stress increased the phosphorylation of Tyr-576 and Tyr-925 of FAK, while there was no effect on Tyr-397 phosphorylation. One minute after exposure to shear stress, Tyr-576 phosphorylation appeared to increase by about five-fold, and this level lasted up to 30 minutes after exposure. In contrast, Tyr-925 was only temporarily phosphorylated by shear stress. Tyr-925 phosphorylation peaked at 1 minute after exposure to shear stress and decreased to baseline after 5 minutes (FIG. 1). Rapid control of FAK Tyr-576 phosphorylation suggests that FAK phosphorylation stimulated by shear stress occurs early in the shear stress response. Tyr-576 phosphorylation was confirmed to increase rapidly by shear stress. Considering that phosphorylation increases the kinase activity of FAK, shear stress seems to increase the kinase activity of FAK.

2. 2. XIAPXIAP 녹다운은 전단 응력에 의해  Knockdown is caused by shear stress 증가되는Increased FAKFAK TyrTyr -576 인산화를 저해하지만, Inhibits -576 phosphorylation, TyrTyr -925 인산화에는 영향이 없음을 확인.-925 Phosphorylation was not affected.

XIAP 녹다운은 FAK를 인테그린 a5 복합체 밖으로 분리시키고, 더나아가, 전단 응력에 의해 유도되는 ERK활성을 감소시켰다. XIAP 녹다운은 전단 응력에 의해 향상되는 FAK Tyr-576 인산화를 저해하였으나, Tyr-925와 Tyr-397 인산화에는 영향이 없었다(도 2). 또한, XIAP 녹다운은 전단 응력에 의해 자극된 ERK 활성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 전단 응력 동안 XIAP는 Tyr-576 인산화에 필요하고 그 결과 BAECs에서 ERK 활성을 조절한다는 것을 확인하였다.
XIAP knockdown separated FAK out of the integrin a5 complex and further reduced ERK activity induced by shear stress. XIAP knockdown inhibited FAK Tyr-576 phosphorylation enhanced by shear stress, but did not affect Tyr-925 and Tyr-397 phosphorylation (FIG. 2). In addition, XIAP knockdown was found to reduce ERK activity stimulated by shear stress. Thus, it was confirmed that during shear stress XIAP is required for Tyr-576 phosphorylation and consequently regulates ERK activity in BAECs.

3. 3. TyrTyr -- 576인산화는576 Phosphorylation 전단 응력 의존적인   Shear stress dependent ERKERK 활성에 영향을 미치는 것을 확인. See what affects activity.

특이적으로 Tyr 576 인산화를 방해하는 약물(DCA)로 전처리한 BAECs에서 전단 응력에 의해 자극된 ERK 활성을 측정하는 실험을 수행하였다. DCA는 직장내 상피성 암 HCA-7에서 Tyr-576 인산화를 감소시키지만 Tyr-397 인산화는 감소시키지 않는 것으로 알려져 있다(Khare et al.). DCA 전처리는 전단 응력에 의해 향상되는Tyr-576의 인산화(도 3A-B) 및 전단 응력에 의해 자극되는 ERK 활성(도 3C-D) 모두를 저해하였다. DCA의 세포 독성 부작용을 제외시키기 위해서 BAECs 내 DCA의 세포독성 실험을 하였고, 그 결과 상기 실험 조건 하에서는, DCA 의 독성이 나타나지 않음을 확인하였다. 실험 결과를 통하여 FAK Tyr-576 인산화는 전단 응력에 의해 자극되는 ERK 활성을 조절한다는 것을 확인하였다.
Experiments were performed to measure ERK activity stimulated by shear stress in BAECs pretreated with drugs that specifically disrupt Tyr 576 phosphorylation (DCA). DCA is known to reduce Tyr-576 phosphorylation but not Tyr-397 phosphorylation in rectal carcinoma HCA-7 (Khare et al.). DCA pretreatment inhibited both phosphorylation of Tyr-576 enhanced by shear stress (FIGS. 3A-B) and ERK activity stimulated by shear stress (FIG. 3C-D). In order to exclude the cytotoxic side effects of DCA, a cytotoxicity test of DCA in BAECs was conducted. As a result, it was confirmed that the toxicity of DCA was not observed under the above experimental conditions. The experimental results confirmed that FAK Tyr-576 phosphorylation regulates ERK activity stimulated by shear stress.

4. 4. XIAPXIAP 가 end FAKFAK 를 세포질 내에 유지시키고 Keeps in the cytoplasm SrcSrc 키나아제Kinase 와의With 상호작용을 가능하게 하기 위하여 필수적임을 확인. Identify necessary to enable interaction.

FAK의 인산화된 Tyr-397 는 Src 키나아제를 유인하는데 중요하다고 알려져있다. 상기 유인된 Src 키나아제는 Tyr-576을 포함한 FAK의 다른 티로신을 인산화하는 것이 확인되었다. 도 4A-B에서 확인되는 바와 같이, Src 키나아제 억제제인 PP2는 전단 응력에 의해 향상되는 Tyr-576 인산화 및 ERK 활성을 현저히 저해하였다. 그러나, PP2는 전단 응력에 의해 향상되는 Tyr-925 인산화에는 영향을 주지 않았다. 상기 결과는 전단 응력에 반응하는 Tyr-576 인산화와 ERK 활성에 있어서 Src 키나아제의 중요한 역할을 보여준다. Phosphorylated Tyr-397 of FAK is known to be important in attracting Src kinases. The attracted Src kinase was found to phosphorylate other tyrosine of FAK, including Tyr-576. As seen in FIGS. 4A-B, Src kinase inhibitor PP2 significantly inhibited Tyr-576 phosphorylation and ERK activity enhanced by shear stress. However, PP2 did not affect Tyr-925 phosphorylation enhanced by shear stress. The results show an important role of Src kinase in Tyr-576 phosphorylation and ERK activity in response to shear stress.

또한, XIAP 녹다운 세포에서 전단응력에 노출된 후 FAK가 핵 안으로 전위하는 것을 확인하였다. 대조적으로, 야생형 세포에서는 전단응력 노출 후 FAK가 시토졸 내에서 관찰되었다(도 4C-D). 따라서 XIAP가 FAK와 Src 키나아제 간 상호작용을 조절한다는 것을 확인하였다.In addition, it was confirmed that FAK translocation into the nucleus after exposure to shear stress in XIAP knockdown cells. In contrast, FAK was observed in cytosol after shear stress exposure in wild-type cells (FIG. 4C-D). Therefore, it was confirmed that XIAP regulates the interaction between FAK and Src kinase.

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims (8)

XIAP(X-chromosome linked inhibitor of apoptosis) 단백질을 포함하는, 항동맥경화 또는 혈관확장 조성물.An anti-arteriosclerosis or vasodilator composition comprising a XIAP (X-chromosome linked inhibitor of apoptosis) protein. 제1항에 있어서, 상기 XIAP 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 조성물.The composition of claim 1, wherein the XIAP protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 삭제delete XIAP (X-chromosome linked inhibitor of apoptosis) 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는, 항동맥경화 또는 혈관확장 조성물.An anti-arteriosclerosis or vasodilation composition comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a XIAP (X-chromosome linked inhibitor of apoptosis) protein. 제4항에 있어서, 상기 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산이 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 재조합 벡터인 조성물.The composition of claim 4, wherein the nucleic acid having the nucleotide sequence encoding the XIAP protein is a recombinant vector having the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 삭제delete 삭제delete (a) XIAP (X-chromosome linked inhibitor of apoptosis) 단백질 발현 세포를 배양하는 단계,
(b) 단계 (a)의 세포를 XIAP 단백질의 발현을 촉진시키는 후보 화합물과 접촉시키는 단계,
(c) 단계 (b)에서의 XIAP 단백질의 발현량을 후보 화합물과 접촉시키지 않은 대조군의 발현량과 비교하는 단계, 및
(d) XIAP 단백질 발현량의 증가를 나타내는 화합물을 확인하는 단계를 포함하여, 항동맥경화 또는 혈관확장 효과를 갖는 물질을 검정하는 방법.
(a) culturing X-chromosome linked inhibitor of apoptosis (XIAP) protein expressing cells,
(b) contacting the cells of step (a) with a candidate compound that promotes expression of the XIAP protein,
(c) comparing the expression level of the XIAP protein in step (b) with the expression level of the control group not contacted with the candidate compound, and
(d) identifying a compound that exhibits an increase in the amount of XIAP protein expression, wherein the agent has an anti-arteriosclerosis or vasodilator effect.

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