KR101214177B1 - Epitope of CD66c specific to lung adenocarcinoma and antibody recognizing the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD66c의 폐선암 특이적 에피토프 및 이를 인식하는 항체에 대한 것으로, CD66c에서 폐선암에 특이적인 에피토프를 밝히고 이를 인식하는 항체, 이를 생산하는 세포주 및 이를 이용한 폐선암 진단 또는 폐선암 예방 또는 치료 용도에 대한 것이다. 상기 CD66c 에피토프는 폐선암 세포에 특이적인 것으로, 이를 인식하는 항체 또는 이의 항체 절편은 폐선암 세포를 진단하거나 이를 치료 또는 예방하는 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a lung adenocarcinoma-specific epitope of CD66c and an antibody that recognizes the same, an antibody that identifies and recognizes an epitope specific to lung adenocarcinoma in CD66c, a cell line producing the same, and the diagnosis or treatment of lung adenocarcinoma using the same It is about use. The CD66c epitope is specific for lung adenocarcinoma cells, and an antibody or antibody fragment thereof that recognizes the CD66c epitope may be usefully used as a composition for diagnosing, treating or preventing lung adenocarcinoma cells.

Description

ＣＤ66ｃ의 폐선암 특이적 에피토프 및 이를 인식하는 항체{Epitope of CD66c specific to lung adenocarcinoma and antibody recognizing the same}CD66c specific adenocarcinoma specific epitope and antibody recognizing the same {Epitope of CD66c specific to lung adenocarcinoma and antibody recognizing the same}

본 발명은 CD66c의 폐선암 특이적 에피토프 및 이를 인식하는 항체에 대한 것으로, CD66c에서 폐선암에 특이적인 에피토프를 밝히고 이를 인식하는 항체, 이를 생산하는 세포주 및 이를 이용한 폐선암 진단 또는 폐선암 예방 또는 치료 용도에 대한 것이다.The present invention relates to a lung adenocarcinoma-specific epitope of CD66c and an antibody that recognizes the same, an antibody that identifies and recognizes an epitope specific to lung adenocarcinoma in CD66c, a cell line producing the same, and the diagnosis or treatment of lung adenocarcinoma using the same It is about use.

폐암은 빈번히 발생하는 암 중의 하나로 전 세계적으로 생명을 위협하는 암의 하나로 알려져 있다. 전 세계적으로 약 120만명 정도가 폐암에 걸리며 이를 통해 사망하는 환자는 전체 암 사망률의 25%를 차지하고 있다. 또한 한국에서는 폐암의 발생율과 치사율이 점차적으로 증가하는 추세로 2008년에 발표된 한국중앙암등록본부 자료에 의하면 2003년 내지 2005년에 우리나라에서는 연 평균 132,941건의 암이 발생했는데, 그 중 폐암은 남녀를 합쳐서 연 평균 16,123건으로 전체 암 발생의 12.1%로 2위를 차지하였다.(보건복지가족부 중앙암등록본부 2008년 10월 15일 발표 자료)Lung cancer is one of the most frequently occurring cancers and is known as a life-threatening cancer worldwide. Around 1.2 million people worldwide develop lung cancer, which accounts for 25% of all cancer deaths. In Korea, the incidence and mortality rate of lung cancer is gradually increasing. According to the Korea Central Cancer Registry released in 2008, an average of 132,941 cancers occurred in Korea between 2003 and 2005. Combined, the annual average was 16,123 cases, ranking 2nd with 12.1% of all cancer cases.

폐암은 초기인 IA stage에서 조기 발견되는 경우 5년 생존율이 80%가량으로 알려져 있다.(Mulshine, J.L. and Sullivan, D.C. Clinical practice. Lung cancer screening. N. Engl . J. Med. 2005;352:2714-2720) 따라서 새로운 폐암의 특이적인 생체학적 표지의 발견에 있어 조기 발견이 가능한 표지를 찾는 것이 중요하다. 특히 폐암은 대표적인 불균질성 종양으로 다양한 형태의 치료에 대한 반응과 예후에 차이가 있다. 의학적으로는 크게 소세포성암(small cell lung cancer)과 비소세포성암(non-small cell lung cancers(NSCLC)) 두 개의 그룹으로 나뉘어 지며, 다시 비소세포성암은 세부적으로 폐선암(lung adenocarcinoma), 편평상피암(squamous cell carcinoma), 대세포암 (large cell carcinoma)으로 나뉘어 진다.Lung cancer is the 5-year survival rates when early detection in the early stage of IA known as about 80% (Mulshine, JL and Sullivan , DC Clinical practice Lung cancer screening N. Engl J. Med 2005; 352:..... 2714 Therefore, it is important to find markers that can be detected early in the detection of specific biomarker markers for new lung cancer. Lung cancer, in particular, is a heterogeneous tumor, which differs in response and prognosis for various forms of treatment. Medically, it is divided into two groups, small cell lung cancer and non-small cell lung cancers (NSCLC) .Non-small cell cancers are divided into lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. It is divided into squamous cell carcinoma and large cell carcinoma.

한편 CD66c는 CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 또는 NCA(non-specific cross-reacting glycoprotein antigen)-90으로도 알려져 있으며, 폐암, 췌장암, 유방암, 직장암, 간암 등의 환자에서 혈액내의 CD66c의 양이 높게 나타나는 것으로 알려져 있다. 상기 CD66c는 세포 접착(cell adhesion)과 연관된 중요한 단백질로 호중성 백혈구(neutrophils)의 경우 사이토카인(cytokine)에 의해 활성화된 내피세포(endothelial cell)와의 접착에 관여하는 것으로 알려져 있다.CD66c, also known as Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 (CEACAM6) or non-specific cross-reacting glycoprotein antigen (NCA) -90, is known as CD66c in the blood of patients with lung cancer, pancreatic cancer, breast cancer, rectal cancer, liver cancer, etc. It is known that the amount is high. The CD66c is an important protein associated with cell adhesion and is known to be involved in adhesion to endothelial cells activated by cytokines in the case of neutrophils.

또한 정상세포의 경우 세포 접착이 이뤄지지 않을 경우 세포 자멸이 이뤄지는데 이런 작용을 아노이키스(anoikis)라 한다. 그러나 종양세포의 경우 이러한 아노이키스에 대해 저항력을 갖고 있으며 이로 인해 암발생과 암전이가 촉진된다. 상기 CD66c는 아노이키스를 억제한다는 보고가 있으며, CD66c의 발현을 조절함으로써 암세포의 악성 표현형(malignant phenotype)이 변한다는 보고도 있다. 또한 CD66c 유전자를 small interfering RNA를 이용해 silencing 시켜 단백질의 발현을 억제 했을 경우 아노이키스가 증가되어 in vivo상에서 암전이가 억제된다는 실험결과도 보고되고 있다. 결국 CD66c의 기능을 억제하는 것이 암전이를 억제하는데 중요한 작용을 할 수 있다.In addition, in the case of normal cells, if cell adhesion is not achieved, apoptosis occurs. This action is called anikis (anoikis). However, tumor cells are resistant to these anoikis, thereby promoting cancer development and cancer metastasis. It has been reported that CD66c inhibits anoikis, and that malignant phenotype of cancer cells is changed by regulating the expression of CD66c. In addition, the results of silencing CD66c gene using small interfering RNA to inhibit the expression of protein have been reported to increase the anokis and inhibit the cancer metastasis in vivo. After all, inhibiting the function of CD66c can play an important role in inhibiting cancer metastasis.

이에 본 발명자들은 폐선암 세포에서 발현되는 CD66c에 대한 항체를 개발하기 위해, CD66c의 재조합 항원으로 폐선암 세포주를 면역화함으로써 폐선암에 특이적인 CD66c에 대한 항체를 개발하고 이의 에피토프를 밝힘으로써 본 발명을 성하였다. In order to develop an antibody against CD66c expressed in lung adenocarcinoma cells, the present inventors have developed the present invention by developing an antibody against CD66c specific for lung adenocarcinoma and revealing an epitope thereof by immunizing a lung adenocarcinoma cell line with a recombinant antigen of CD66c. I did it.

따라서 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CD66c(Cluster of Differentiation 66c)의 에피토프(epitope)인 폴리펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a polypeptide that is an epitope of CD66c (Cluster of Differentiation 66c) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO.

또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 에피토프(epitope)로 인지하는 항체 또는 항체 절편을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is also an object of the present invention to provide an antibody or antibody fragment that recognizes the polypeptide as an epitope.

또한 본 발명은 상기 항체 또는 항체 절편을 생산하는 세포주를 제공하는 것을 목적으로 한다.It is also an object of the present invention to provide a cell line for producing the antibody or antibody fragment.

또한 본 발명은 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 함유하는 폐선암 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a composition for diagnosing lung adenocarcinoma containing the lung cancer specific antibody or antibody fragment as an active ingredient.

또한 본 발명은 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 함유하는 폐선암 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a lung adenocarcinoma diagnostic kit containing the lung adenocarcinoma-specific antibody or antibody fragment as an active ingredient.

또한 본 발명은 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 함유하는 폐선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating lung cancer, comprising the lung cancer specific antibody or antibody fragment as an active ingredient.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CD66c(Cluster of Differentiation 66c)의 에피토프(epitope)인 폴리펩타이드를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a polypeptide which is an epitope of CD66c (Cluster of Differentiation 66c) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO.

또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 에피토프(epitope)로 인지하는 항체 또는 항체 절편을 제공한다.The present invention also provides an antibody or antibody fragment that recognizes the polypeptide as an epitope.

또한 본 발명은 상기 항체 또는 항체 절편을 생산하는 세포주를 제공한다.The present invention also provides a cell line for producing the antibody or antibody fragment.

또한 본 발명은 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 함유하는 폐선암 진단용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for diagnosing lung adenocarcinoma containing the lung cancer specific antibody or antibody fragment as an active ingredient.

또한 본 발명은 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 함유하는 폐선암 진단 키트를 제공한다.The present invention also provides a lung adenocarcinoma diagnostic kit containing the lung cancer specific antibody or antibody fragment as an active ingredient.

또한 본 발명은 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 함유하는 폐선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lung adenocarcinoma containing the lung cancer specific antibody or antibody fragment as an active ingredient.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically.

본 발명에서 CD66c(Cluster of Differentiation 66c)는 CEACAM 6 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 또는 NCA(non-specific cross-reacting glycoprotein antigen)-90으로도 알려진 단백질로, 세포 접착(cell adhesion)과 연관된 중요한 단백질로 알려져 있으며 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열(Genebank Protein No. AAH05008)로 표시될 수 있다. In the present invention, CD66c (Cluster of Differentiation 66c) is a protein also known as CEACAM 6 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) or NCA (non-specific cross-reacting glycoprotein antigen) -90, cell adhesion and It is known to be an important protein involved and may be preferably represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (Genebank Protein No. AAH05008).

본 발명에서 에피토프는 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원결정부위로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 선형 에피토프(linear epitope)일 수 있다. In the present invention, the epitope is an epitope that is specifically recognized by an antibody, but is not limited thereto. Preferably, the epitope may be a linear epitope.

본 발명에서 항체는 면역글로불린 유전자로부터의 골격부(framwork) 영역을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 의미하는데, 항체는 항원에 특이적으로 결합하여 이를 인식한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라, 다수의 면역글로불린 가변 영역 유전자들을 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이들은 차례로, 각각, 면역글로불린 클래스, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의된다. 특히 본 발명에서 항체는 키메릭 항체, 인간화 항체를 모두 포함한다.In the present invention, an antibody refers to a polypeptide, or a fragment thereof, comprising a framework region from an immunoglobulin gene, wherein the antibody specifically binds to and recognizes an antigen. Recognized immunoglobulin genes include kappa, lambda, alpha, gamma, delta, epsilon and mu constant region genes, as well as a number of immunoglobulin variable region genes. Light chains are classified as either kappa or lambda. Heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta or epsilon, which in turn define immunoglobulin classes, IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, respectively. In particular, the antibody in the present invention includes both chimeric and humanized antibodies.

본 발명에서 키메릭 항체는 가변 영역 서열들이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열들이 다른 종으로부터 유래된 항체들, 예를 들어, 가변 영역 서열들이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열들이 인간 항체로부터 유래된 항체를 의미한다.In the present invention, chimeric antibodies are antibodies in which variable region sequences are derived from one species and constant region sequences are derived from another species, eg, variable region sequences are derived from mouse antibodies and constant region sequences are derived from human antibodies. Mean antibody.

본 발명에서 인간화 항체란 인간에서 면역성이 적으면서 비인간 항체의 활성을 보유하는 항체를 의미한다. 이는, 예를 들어, 비인간 CDR 영역을 유지시키고, 항체의 나머지 부분을 인간 대응부(counterparts)로 치환함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌들이 참조된다: Morrison et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81:6851-6855(1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994).In the present invention, the humanized antibody refers to an antibody that retains the activity of a non-human antibody while having low immunity in humans. This can be prepared, for example, by maintaining non-human CDR regions and replacing the rest of the antibody with human counterparts. For example, reference is made to Morrison et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81: 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31 (3): 169-217 (1994).

본 발명에서 항체 절편은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)를 포함하여 CD66c 에피토프를 선택적으로 인식할 수는 것이면 이에 제한이 없으나, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv 및 CDR로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 특히, 상기 scFv는 상기 중쇄 가변부위(VH) 및 경쇄 가변부위(VL)를 링커 폴리펩타이드로 연결하여 단쇄(single chain)로 만든 항체 절편이다.In the present invention, the antibody fragment may include, but is not limited to, if the CD66c epitope is selectively recognized, including the antibody light chain variable region (V L ) and the antibody heavy chain variable region (V H ), but Fab, Fab ′, F (ab ′). ), ScFv, dsFv and CDR may be selected from the group consisting of. In particular, the scFv is an antibody fragment made of a single chain by linking the heavy chain variable region (V H ) and light chain variable region (V L ) with a linker polypeptide.

본 발명에서 단클론 항체는 당해 분야에 공지된 용어이며, 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도로 특이적인 항체이다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 본 발명의 단클론 항체는 통상적인 클로닝 및 세포 융합 기술들을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 관심 대상의 면역원(항원)을 야생형이나 육종된 마우스(예를 들면, BALB/c)에 투여하여 천연 또는 사람 단클론 항체를 생산할 수 있다. 이러한 항원은 단독으로 투여되거나, 애주번트와 혼합하여 투여되거나, 벡터로부터 발현될 수 있으며 DNA 또는 융합 단백질로서 면역 반응을 유도할 수 있다. 융합 단백질은 면역 반응에 의도된 펩타이드와 커플링된 담체 단백질, 예를 들면, β-갈락토시다제, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 및 소 혈청 알부민을 포함하며, 담체 단백질은 이에 제한되지는 않는다. 상기의 경우에 펩타이드는 담체 단백질에 대해서 합텐(hapten)으로 작용한다.Monoclonal antibodies in the present invention are terms known in the art and are highly specific antibodies directed against a single antigenic site. Unlike polyclonal antibodies, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), monoclonal antibodies are directed against a single determinant on an antigen. Monoclonal antibodies of the invention can be prepared using conventional cloning and cell fusion techniques. For example, an immunogen of interest (antigen) can be administered to wild type or breeding mice (eg BALB / c) to produce natural or human monoclonal antibodies. Such antigens can be administered alone, in admixture with an adjuvant, can be expressed from a vector and can elicit an immune response as a DNA or fusion protein. Fusion proteins include carrier proteins coupled with peptides intended for an immune response, such as β-galactosidase, glutathione S-transferase, keyhole limpet hemocyanin (KLH), and bovine serum albumin, Carrier proteins are not limited thereto. In this case the peptide acts as a hapten for the carrier protein.

상기 단클론 항체 제조 방법을 간략히 설명하면 다음과 같다. 동물을 부스팅시킨 후, 비장을 제거하고 비장 세포를 추출하여 당해 분야에 공지된 방법[Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)]]으로 골수종 세포와 융합시킨다. 수득되는 하이브리드 세포를 통상적인 방법, 예를 들면, 제한 희석으로 클로닝하고, 목적하는 단클론 항체를 생산하는 수득된 클론을 배양하는 것이다. 단클론 항체는 항원-항체 결합을 사용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한, 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 또 다른 장점을 갖는다.Briefly describing the monoclonal antibody production method is as follows. After boosting the animal, the spleen is removed and the spleen cells are extracted by methods known in the art [Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)]. The hybrid cells obtained are cloned by conventional methods, for example by limiting dilution, and the resulting clones are cultured to produce the desired monoclonal antibody. Monoclonal antibodies have the advantage of improving the selectivity and specificity of diagnostic and analytical assays using antigen-antibody binding, and because they are synthesized by hybridoma culture, they also have another advantage that they are not contaminated by other immunoglobulins. Have

본 발명에서 하이브리도마 세포는 당해 분야에 공지되어 있으며, 항체 생산 세포와 불멸 세포, 예를 들면 골수종 세포와의 융합에 의해서 형성된 세포를 의미한다. 상기 하이브리드 세포는 항체를 지속적으로 공급할 수 있다.Hybridoma cells in the present invention are known in the art and refer to cells formed by fusion of antibody producing cells with immortal cells, such as myeloma cells. The hybrid cell can continuously supply the antibody.

본 발명에서 다클론 항체는 본 발명의 에피토프가 포함된 항원, 바람직하게는 서열번호 2의 CD66c의 일부분을 항원으로 하여, 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. In the present invention, the polyclonal antibody is a conventional antigen containing an epitope of the present invention, preferably a part of CD66c of SEQ ID NO: 2 as an antigen, injected into an animal and collected from the animal to obtain a serum containing the antibody. Can be produced by the method. Such polyclonal antibodies can be purified by any method known in the art and can be made from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cattle, dogs and the like.

본 발명에서 사용되는 검출 표지제는 항원-항체의 반응 결과물의 검출을 위한 표지를 의미하며, 구체적인 예로는 방사성 동위원소 표지, 효소, 화학발광화합물(chemoluminescent compound), 플루오레세인, 피코빌리프로테인, 희토류 킬레이트, 로다민 등과 같은 형광 물질, 효소 보조인자(enzyme cofactor), 바이오틴 등을 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
The detection label used in the present invention means a label for detection of the reaction product of the antigen-antibody, specific examples include radioisotope labels, enzymes, chemoluminescent compounds, fluorescein, picobiliprotein, Fluorescent materials such as rare earth chelates, rhodamines, enzyme cofactors, biotin, and the like, but are not necessarily limited thereto.

본 발명에서 CD66c의 에피토프로 밝혀 낸 폴리펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다. The polypeptide found to be an epitope of CD66c in the present invention is characterized by being represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

상기 CD66c의 에피토프는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 폐선암에 특이적인 것일 수 있다.The epitope of CD66c is not limited thereto, but may preferably be specific for lung adenocarcinoma.

본 발명의 일실시예에서 CD66c의 재조합 항원(<실시예 1> 참조)으로 폐선암 세포주를 면역화함으로써 폐선암에 특이적인 CD66c에 대한 단클론 항체를 먼저 개발(<실시예 2> 참조)하고, 이의 에피토프가 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시됨을 최초로 밝힌 것이다.(<실시예 3> 참조). 특히 본 발명의 CD66c의 에피토프는 종래 CD66c의 항체로 알려진 9A6(Santa cruz biotechnology) 또는 AP11(Dinona) 항체 와 달리, 본 발명의 단클론 항체(8F5)에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프이다.(<실시예 3> 참조)In one embodiment of the invention, a monoclonal antibody against CD66c specific for lung adenocarcinoma is first developed (see <Example 2>) by immunizing a lung adenocarcinoma cell line with a recombinant antigen of CD66c (see <Example 1>), and its This is the first time that an epitope is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO. 7 (see <Example 3>). In particular, the epitope of the CD66c of the present invention is an epitope specifically recognized by the monoclonal antibody (8F5) of the present invention, unlike the 9A6 (Santa cruz biotechnology) or AP11 (Dinona) antibody known as the antibody of the conventional CD66c. See Example 3)

따라서 본 발명의 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CD66c의 에피토프는 폐선암에 특이적인 항체 형성을 유도하기 위한 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.Therefore, the epitope of CD66c represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 of the present invention can be used as an active ingredient of a composition for inducing antibody formation specific to lung adenocarcinoma.

상기 CD66c의 에피토프는 생체시료로부터 분리하거나, 화학적으로 합성하거나 또는 유전공학기술로 생산할 수 있으며, 상기한 방법은 공지의 기술로 용이하게 실시할 수 있다.
The epitope of the CD66c can be isolated from a biological sample, chemically synthesized or produced by genetic engineering techniques, and the method can be easily carried out by known techniques.

한편 본 발명의 항체 또는 항체 절편은 본 발명의 에피토프를 인지하는 것을 특징으로 한다. Meanwhile, the antibody or antibody fragment of the present invention is characterized by recognizing the epitope of the present invention.

본 발명의 항체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있으며, 상기 단클론 항체는 보다 바람직하게는 하이브로도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00230)에 의해 생산된 것일 수 있다. The antibody of the present invention is not limited thereto, but may preferably be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and the monoclonal antibody may be more preferably produced by hybridoma cells (Accession Number: KCLRF-BP-00230). have.

특히 본 발명의 항체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 IgG1에 속하며, 카파(kappa) 경쇄를 포함한 것으로 분류될 수 있다.(<실시예 2-2> 참조)In particular, the antibody of the present invention is not limited thereto but preferably belongs to IgG1, and may be classified as including a kappa light chain (see <Example 2-2>).

본 발명의 항체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 폐선암에 특이적인 항체일 수 있다. The antibody of the present invention may be, but is not limited to, an antibody specific for lung adenocarcinoma.

본 발명의 일실시예에서는 폐선암에 특이적인 항체를 제조하기 위해, 서열번호 2로 표시되는 CD66c의 일부와 사람의 면역글로불린 G의 Fc의 재조합 항원으로 폐선암 세포주를 면역하고, 상기 항원에 대해 특이적인 항체를 스크리닝함으로써, 본 발명의 항체를 개발한 것이다.(<실시예 2> 참조)In one embodiment of the present invention, in order to produce an antibody specific for lung adenocarcinoma, a part of CD66c represented by SEQ ID NO: 2 and a recombinant antigen of Fc of human immunoglobulin G are immunized to a lung adenocarcinoma cell line, and By screening for specific antibodies, the antibodies of the present invention were developed (see <Example 2>).

한편 본 발명의 세포주는 상기 항체 또는 항체 절편을 생산하는 것을 특징으로 한다. Meanwhile, the cell line of the present invention is characterized by producing the antibody or antibody fragment.

상기 세포주는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 기탁번호가 KCLRF-BP-00230인 하이브리도마 세포일 수 있다. 상기 하이브리도마 세포는 상기 단클론 항체를 생산하는 세포로 이의 제조방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 바람직하게는 항체 생산 세포와 불멸 세포, 예를 들면 골수종 세포와의 융합에 의해 제조될 수 있다. 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 CD66c 항원이 주입된 세포(바람직하게는 CHO-K1 세포)와 폐암 세포주를 면역시킨 마우스 비장과의 세포 융합을 통해 제조될 수 있다.The cell line may be, but is not limited to, a hybridoma cell with preferably Accession Number KCLRF-BP-00230. The hybridoma cells are cells producing the monoclonal antibody, and a method for producing the same is known in the art, and preferably, may be prepared by fusion of antibody-producing cells with immortal cells, for example, myeloma cells. Although not limited thereto, it may be preferably prepared through cell fusion of cells injected with the CD66c antigen (preferably CHO-K1 cells) and mouse spleens immunized with lung cancer cell lines.

상기 하이브리도마 세포는 한국세포주연구재단(Korean Cell Line Research Foundation, KCLRF)에 '8F5'로 2010년 2월 22일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00230로 기탁된 것이다.
The hybridoma cells were deposited with the accession number KCLRF-BP-00230 on February 22, 2010 as '8F5' to the Korean Cell Line Research Foundation (KCLRF).

한편 본 발명의 폐선암 진단용 조성물은 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.Meanwhile, the composition for diagnosing lung adenocarcinoma of the present invention is characterized in that it contains the lung cancer specific antibody or antibody fragment as an active ingredient.

상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편은 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CD66c(Cluster of Differentiation 66c)의 에피토프(epitope)을 특이적으로 인식하여, CD66c 항원을 효과적으로 검출할 수 있으며, 특히 CD66c 항원이 발현되는 폐선암을 효과적으로 검출할 수 있다.(<실시예 4> 참조) The lung adenocarcinoma-specific antibody or antibody fragment specifically recognizes an epitope of CD66c (Cluster of Differentiation 66c) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, thereby effectively detecting the CD66c antigen, in particular the CD66c antigen This expressed lung adenocarcinoma can be effectively detected. (See <Example 4>.)

상기 진단용 조성물에 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 사용하는 경우, 상기 항체 또는 항체 절편은 효소, 방사선동위원소, 형광물질, 크로모젠(chromogen) 및 염색물질로 이루어진 군으로부터 선택된 표지 물질들로 표지될 수 있다. 상기 형광물질로 플루오레센 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate: FITC), 피코에 리트린(phycoerythrin: PE), 알로피코사이아닌 (allophycocyanin, APC) 또는 바이오틴(biotin) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.When the lung adenocarcinoma specific antibody or antibody fragment is used in the diagnostic composition, the antibody or antibody fragment is selected from the group consisting of enzymes, radioisotopes, fluorescent materials, chromogens, and staining materials. Can be labeled. Fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), allophycocyanin (allophycocyanin, APC) or biotin may be used as the fluorescent material, but is not limited thereto. It is not.

상기 진단용 조성물에는 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편 외에 면역학적 분석에 사용되는 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제가 포함될 수 있다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 상기 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 락텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
The diagnostic composition may include a carrier used for immunological analysis in addition to the lung adenocarcinoma-specific antibody or antibody fragment, a detection label that can generate a detectable signal, a dissolving agent, and a cleaning agent. In addition, when the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator. Such carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers (eg PBS) or insoluble carriers known in the art such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyesters, polyacrylonitrile , Fluorine resins, crosslinked dextran, polysaccharides, polymers such as magnetic fine particles plated metals on lactex, other papers, glass, metals, agarose and combinations thereof.

한편 본 발명의 진단키트는 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 포함하여 폐선암을 효과적으로 진단할 수 있다.Meanwhile, the diagnostic kit of the present invention may effectively diagnose lung cancer by including the lung cancer specific antibody or antibody fragment as an active ingredient.

본 발명에 사용하기 위한 키트 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는, 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다. 면역크로마토그래피법을 이용한 진단은, 검체의 혈청 중에 들어 있는 항원이 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)에 결합된 표식자 항체(tracer antibody)와 반응한 다음, 모세관 현상에 의해 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인의 미세구멍(micropore)을 통하여 이동하는 도중에 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 포획 항체(capture antibody)와 결합하여 발색띠를 형성함으로써, 양성 및 음성을 육안으로 판별 가능하도록 할 수 있다.Kit systems for use in the present invention include, but are not limited to, ELISA plates, dip-stick devices, immunochromatography and radiation split immunoassay devices, flow-through devices, and the like. Preferably, a diagnostic kit in the form of a strip or a device using immunochromatography can be used. Diagnosis using immunochromatography involves the reaction of an antigen in the serum of a sample with a tracer antibody bound to colloidal gold particles, followed by a nitrocellulose membrane by capillary action. While moving through the micropores of the microorganisms, a color band is formed by combining with a capture antibody fixed to the inner surface of the micropores, thereby making it possible to visually discriminate the positive and the negative.

상기 키트는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 효소연관 면역분석법(ELISA) 또는 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)을 이용할 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이 샌드위치 면역분석법 및 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)을 사용하는 경우 본 발명의 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 이용하여 항체 쌍을 제조하고 이를 이용하여 폐선암을 효과적으로 진단할 수 있다.The kit may include, but is not limited to, enzyme-linked immunoassay (ELISA) or lateral flow immunographic assay. As described above, when using sandwich immunoassay and lateral flow immunographic assay, antibody pairs are prepared using lung cancer specific antibodies or antibody fragments of the present invention, and lung cancer is prepared using the same. It can be diagnosed effectively.

상기 본 발명의 키트에는 통상적으로 키트에 사용되는 것이라면 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 ELSIA를 이용한 것이라면 고체상 지지체, 본 발명의 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편, 항원과의 반응을 위한 효소표지항체액 및 효소반응을 나타내는 발색액을 함유하는 효소-연관 면역분석용(ELSIA) 반응액을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 효소표지항체액은 goat anti-mouse Ig-HRP일 수 있으며, 발색액은 테트라 메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine, TMB)일 수 있으며, 반응차단용액은 HCl 또는 H2SO4일 수 있다.
The kit of the present invention is not limited thereto, as long as it is typically used in the kit. For example, if ELSIA is used, a solid-phase support, a lung cancer-specific antibody or antibody fragment of the present invention, an enzyme-labeled antibody solution for reaction with an antigen And an enzyme-linked immunoassay (ELSIA) reaction solution containing a coloring solution that exhibits an enzyme reaction. More specifically, the enzyme-labeled antibody solution may be goat anti-mouse Ig-HRP, the coloring solution may be tetramethylbenzidine (TMB), and the reaction blocking solution may be HCl or H 2 SO 4 .

한편 본 발명의 폐선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.Meanwhile, the pharmaceutical composition for preventing or treating lung adenocarcinoma of the present invention is characterized by containing the lung cancer specific antibody or antibody fragment as an active ingredient.

본 발명의 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편은 종양 특히 폐선암 억제 효능이 매우 우수하다.(<실험예 5> 참조) Lung adenocarcinoma-specific antibodies or antibody fragments of the present invention are very excellent in suppressing tumors, particularly lung adenocarcinoma (see <Experiment 5).

따라서 본 발명의 약학적 조성물은 상기 폐선암 특이적 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 함유함으로써 폐선암 예방 또는 치료용으로 효과적으로 이용될 수 있다. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be effectively used for preventing or treating lung adenocarcinoma by containing the lung adenocarcinoma specific antibody or antibody fragment as an active ingredient.

본 발명의 약학적 조성물 내의 유효성분으로서의 상기 항체 또는 항체 절편의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%, 더 바람직하게는 1 내지 20 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The content of the antibody or antibody fragment as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately controlled according to the use form and purpose, patient condition, type and severity of symptoms, preferably 0.1 to 50% by weight, more preferably Preferably it may be 1 to 20% by weight, but is not limited thereto.

본 발명의 약학적 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention can be administered to a mammal, including humans, by various routes. The mode of administration can be any of the routinely used methods and can be administered, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection. The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral dosage forms, transdermals, suppositories, and sterile injectable solutions in accordance with conventional methods. Can be formulated and used.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 원지, 고본 및 용안육 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further contain an adjuvant such as a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable carrier, excipient and diluent in addition to the extract. Examples of carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium Silicates, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants can be used. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, and the like in the original, solid and long-eye extracts. It may be prepared by mixing sucrose or sucrose or lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate talc are also used. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. In addition to water and liquid paraffin, simple diluents commonly used, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included . Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, transdermal agents and the like. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.

본 발명의 약학적 조성물은 사람에게 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강내 또는 혀밑 투여될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제 (예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔(witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유(apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물) 와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone to a person, but generally may be administered in admixture with a pharmaceutical carrier selected in view of the mode of administration and standard phamaceutical practice. For example, the pharmaceutical compositions of the present invention may be in the form of tablets containing starch or lactose, or in the form of capsules containing alone or excipients, or elixirs or suspending agents containing chemicals that flavor or color. Oral, oral or sublingual. Such liquid preparations may be suspending agents (e.g., semisynthetic glycerides such as methylcellulose, witepsol or mixtures of apricot kernel oil with PEG-6 esters or PEG-8 with caprylic / capric Pharmaceutically acceptable additives such as glyceride mixtures such as mixtures of glycerides).

본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 1 내지 20 ㎎/kg, 바람직하게는 5 내지 10㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상기 사용량의 범위를 벗어나면 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 바람직하다.The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, weight, sex, dosage form, health condition and degree of disease of the patient, and may be administered once or several times a day at regular intervals. For example, the daily dosage may be 1 to 20 mg / kg, preferably 5 to 10 mg / kg, based on the active ingredient content. The above dosages are illustrative of the average case and may be high or low depending on individual differences. If the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is less than the dose, a significant effect is not obtained, and if it exceeds the above, it is uneconomical and there is a concern that undesirable side effects may occur if it is out of the range of the amount used. Since it may arise, it is preferable to set it as said range.

본 발명의 CD66c 에피토프는 폐선암 세포에 특이적인 것으로, 이를 인식하는 항체 또는 이의 절편은 폐선암 세포를 진단하거나 이를 치료 또는 예방하는 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.The CD66c epitope of the present invention is specific for lung adenocarcinoma cells, and antibodies or fragments thereof which recognize the same may be usefully used as a composition for diagnosing, treating or preventing lung adenocarcinoma cells.

도 1은 CD66c 재조합 부위를 설정한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 pSegTag-CD66c-HuIgFc 클로닝을 제작한 모식도를 나타낸 그림이다.
도 3은 pSegTagB-CD66c-HuIgFc 클로닝을 확인한 결과이다.
도 4는 형질전환된 CHO-K1 세포주에서 CD66c-HuIgFc 재조합 항원이 발현되는지 여부를 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 5 정제된 CD66c-HuIgFc 재조합 항원를 확인한 western blot 결과이다.
도 6 재조합 CD66c-HuIgFc의 CD66c activity를 확인한 결과이다.
도 7 폐선암 특이 CD66c에 대한 단클론 항체의 개발 모식도이다.
도 8 A549세포 면역쥐 혈청의 A549 cell에 대한 역가를 확인한 결과이다.
도 9 A549세포 면역쥐 혈청의 CD66c-HuIgFcd 대한 역가를 확인한 결과이다.
도 10 8F5와 AP11의 western blotting 결과를 비교한 결과이다.
도 11 말초혈액에서의 8F5 단클론 항체의 결합 여부를 분석한 결과이다.
도 12 CD66c-HuIgFc에 대한 ELISA 분석결과이다.
도 13 폐암 조직에서의 8F5 염색 여부를 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 단클론 항체의 에피토프를 MOLDI-TOF를 수행하여 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명의 단클론 항체의 에피토프를 검증하기 위한 방법을 나타낸 모식도이다.
도 16은 본 발명의 단클론 항체의 에피토프를 검증한 결과이다.
도 17은 본 발명의 MOLDI-TOF를 통해 밝혀 낸 본 발명의 에피토프와 이를 검증한 결과를 대조한 모식도이다.
도 18은 본 발명의 단클론 항체를 이용한 CD66c 항원이 포함된 폐선암을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 단클론 항체의 항암 활성을 나타낸 결과이다.1 is a diagram showing the result of setting up a CD66c recombination site.
2 is a diagram showing a schematic diagram of pSegTag-CD66c-HuIgFc cloning.
3 shows the results of confirming pSegTagB-CD66c-HuIgFc cloning.
Figure 4 shows the results confirmed by ELISA whether the CD66c-HuIgFc recombinant antigen is expressed in the transformed CHO-K1 cell line.
5 is a result of western blot confirming the purified CD66c-HuIgFc recombinant antigen.
6 shows the results of confirming CD66c activity of recombinant CD66c-HuIgFc.
7 is a schematic diagram of the development of a monoclonal antibody against lung adenocarcinoma-specific CD66c.
8 is a result of confirming the titer of the A549 cell immune rat serum to A549 cell.
Figure 9 shows the result of confirming the titer of CD66c-HuIgFcd in the serum of A549 cells.
10 is a result of comparing western blotting results of 8F5 and AP11.
11 shows the result of analyzing the binding of 8F5 monoclonal antibody in peripheral blood.
12 ELISA analysis of CD66c-HuIgFc.
13 shows the result of confirming whether 8F5 staining in lung cancer tissue.
14 shows the results obtained by performing the MOLDI-TOF epitope of the monoclonal antibody of the present invention.
15 is a schematic diagram showing a method for verifying epitopes of monoclonal antibodies of the present invention.
Figure 16 shows the results of verifying the epitope of the monoclonal antibody of the present invention.
17 is a schematic diagram comparing the epitope of the present invention found through MOLDI-TOF of the present invention and the result of verifying the same.
Figure 18 shows the result of detecting the lung adenocarcinoma containing the CD66c antigen using the monoclonal antibody of the present invention.
19 shows the anticancer activity of the monoclonal antibody of the present invention.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<< 실시예Example 1> 1>

CD66cCD66c 및  And HumanHuman immunoglobulinimmunoglobulin FcFc regionregion 인 sign CC HH 22 -- CC HH 33 가 end 결합된Combined 재조합 항원( Recombinant antigen ( CD66cCD66c -- HuIgFcHuIgFc )의 제조Manufacturing

<1-1><1-1> 유전자 gene 클로닝Cloning

CD66c-HuIgFc 재조합 항원을 얻기 먼저 CD66c 전체 cDNA(서열번호: 1)중에서 소수성 부분을 제거한 34 내지 310aa 영역(서열번호: 2)을 설정(도 1)하여 CD66c 유전자에 대한 프라이머를 제작하고, 사람의 면역글로불린 G의 Fc (Human immunoglobulin Fc region CH2-CH3; HuIgFc)부분, 구체적으로 서열번호 11로 표시되는 염기성을 가지는 부분에 대한 프라이머를 제작하였다(표 1). 전체적인 클로닝 과정에 대한 모식도는 도 2에 표시하였다.Obtaining the CD66c-HuIgFc Recombinant Antigen First, a primer for the CD66c gene was prepared by constructing 34 to 310aa region (SEQ ID NO: 2) from which the hydrophobic portion was removed from the entire CD66c cDNA (SEQ ID NO: 1) (Fig. 1). Primers were prepared for the Fc (Human immunoglobulin Fc region C H 2 -C H 3; HuIgFc) portion of immunoglobulin G, specifically, the portion having basicity represented by SEQ ID NO: 11 (Table 1). A schematic diagram of the overall cloning process is shown in FIG. 2.

GeneGene PrimerPrimer SEG IDSEG ID SequenceSequence CD66cCD66c Hnd66c 5'Hnd66c 5 ' SEG ID No: 3SEG ID No: 3 　AAG CTT AAG CTC ACT ATT GAA TCC ACGAAG CTT AAG CTC ACT ATT GAA TCC ACG 66cEcRV 3'66cEcRV 3 ' SEG ID No: 4SEG ID No: 4 　GAT ATC AGT GAC TGT GGT CCT ATT GAGAT ATC AGT GAC TGT GGT CCT ATT GA Human Ig Fc
　(CH2-CH3)Human Ig Fc
(CH2-CH3) EcrVFc 5'EcrVFc 5 ' SEG ID No: 5SEG ID No: 5 　GAT ATC GAC GTC GAG TCC AAA TCT TGTGAT ATC GAC GTC GAG TCC AAA TCT TGT FcXhO1 3'FcXhO1 3 ' SEG ID No: 6SEG ID No: 6 　CTC GAG TTT ACC CGG AGA CAG GGA GA CTC GAG TTT ACC CGG AGA CAG GGA GA

상기 CD66c 유전자는 사람의 폐선암 세포주인 A549(ATCC CCL-185)로부터 QIAGEN RNEasy Mini spin kit를 이용하여 RNA를 추출하고 상기 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 실시함으로써 수득하였다. 구체적으로 상기 RT-PCR은 Novagen first cDNA synthesis kit를 이용하였으며 보다 구체적으로 RNA 1ug과 Oligo d(T) primer 1ul(10pmol/ul)를 넣어 70℃에서 10분간 반응시킨 후 냉각 시키고 5X buffer, 100mM DTT, reverse transcriptase를 넣어 37℃에서 1시간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 이렇게 합성된 cDNA를 표 1의 프라이머로 Bioneer의 PCR premix를 이용해 PCR을 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 2분간 30 cycles을 돌아 증폭시켜 CD66c 유전자를 확보하였다.The CD66c gene was obtained by extracting RNA from a human lung adenocarcinoma cell line A549 (ATCC CCL-185) using a QIAGEN RNEasy Mini spin kit and performing RT-PCR using the primers described in Table 1 above. Specifically, the RT-PCR was a Novagen first cDNA synthesis kit, and more specifically, RNA 1ug and Oligo d (T) primer 1ul (10pmol / ul) was added to the reaction for 10 minutes at 70 ℃ and then cooled and 5X buffer, 100mM DTT cDNA was synthesized by adding reverse transcriptase and reacting at 37 ° C. for 1 hour. Thus synthesized cDNA using a Bioneer PCR premix as a primer of Table 1 PCR amplified by 30 cycles for 1 minute at 94 ℃, 1 minute at 60 ℃, 2 minutes at 72 ℃ to secure the CD66c gene.

상기 실험결과, CD66c 전체 cDNA 중에서 소수성 부분이 제거된 영역을 암호화할 수 있는 CD66c 유전자에 대한 약 850bp 크기의 DNA를 확인하였으며(도 3a) 이를 pGEM T(Promega,USA) 벡터에 클로닝하고 제한효소 EcoRI으로 확인한 후 시퀀싱을 통해 서열번호 8의 염기서열임을 확인하였다. As a result of the experiment, about 850 bp of DNA for the CD66c gene encoding the hydrophobic region of the entire CD66c cDNA was identified (FIG. 3a) and cloned into a pGEM T (Promega, USA) vector and the restriction enzyme EcoR Confirmed by I and confirmed by sequencing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.

또한 상기 Human Ig Fc 영역(HuIgFc)은 human B 세포(ATCC CTL-1834)로부터 얻은 RNA를 QIAGEN RNEasy Mini spin kit로 추출하고 상기 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 상기 RT-PCR을 실시함으로써 수득하였다.In addition, the Human Ig Fc region (HuIgFc) was obtained by extracting RNA from human B cells (ATCC CTL-1834) with a QIAGEN RNEasy Mini spin kit and performing the RT-PCR using the primers described in Table 1 above.

상기 CD66c 유전자가 클로닝된 pGEM T-CD66c gene을 제한효소(Promega, USA) HindIII와 EcoRV로 잘라 insert를 준비하고 HuIgFc는 EcoRV와 XhoI로 잘라 두 개의 insert를 준비하였다. 발현 벡터로 Igk 리더 서열(leader sequence)를 갖고 있는 pSegTagB(invitrogen, USA) 벡터를 제한효소 HindIII와 XhoI으로 잘라 준비하여 두 개의 insert를 동시에 넣어 클로닝을 수행하였다. PGEM T-CD66c gene cloned with the CD66c gene was cut with restriction enzymes (Promega, USA) Hind III and EcoR V to prepare an insert, and HuIgFc was cut with EcoR V and Xho I to prepare two inserts. A pSegTagB (invitrogen, USA) vector having an Igk leader sequence as an expression vector was cut with restriction enzymes Hind III and Xho I and cloned by inserting two inserts simultaneously.

최종 pSegTagB-CD66c-HuIgFc 재조합 유전자는 제한 효소 BglII로 처리하여 1300bp의 DNA 절편이 나타남을 확인함으로써 CD66c-HuIgFc 재조합 유전자가 클로닝 되었음을 최종 확인하였다.(도 3b)
The final pSegTagB-CD66c-HuIgFc recombinant gene was treated with the restriction enzyme Bgl II to confirm that the DNA fragment of 1300 bp appeared to confirm that the CD66c-HuIgFc recombinant gene was cloned (FIG. 3b).

<1-2><1-2> 형질전환Transformation

상기 <실시예 1-1>에서 제조된 pSecTag-CD66c-HuIgFc DNA로 CHO-K1 세포(ATCC CRL-9618)에 형질 전환하여 재조합 항원을 발현하는 세포주를 개발하였다. 자세한 실험방법은 아래와 같다.PSecTag-CD66c-HuIgFc DNA prepared in Example 1-1 was transformed into CHO-K1 cells (ATCC CRL-9618) to develop a cell line expressing a recombinant antigen. Detailed experimental method is as follows.

먼저 형질전환 하루 전날 CHO-K1 세포를 6-웰 플레이트에 1x106cells/ml의 농도로 접종하고 10% Fetal bovine serum(Gibco, USA)가 들어있는 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle`s medium, Gibco, USA) 3ml를 넣어 37℃, 5% CO2 조건에서 18시간 동안 배양하였다. 상기 <실시예 1-1>에서 제조된 pSecTag-CD66c-HuIgFc DNA를 Effectene transfection reagent 키트(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 CHO-K1 세포에 형질전환하였다. First, the day before transformation, CHO-K1 cells were inoculated in 6-well plates at a concentration of 1 × 10 6 cells / ml, and DMEM medium containing 10% Fetal bovine serum (Gibco, USA) (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, USA) 3ml was added and incubated for 18 hours at 37 ℃, 5% CO 2 conditions. PSecTag-CD66c-HuIgFc DNA prepared in Example 1-1 was transformed into CHO-K1 cells using an Effectene transfection reagent kit (QIAGEN, Hilden, Germany).

상기 형질전환한지 3일 후, 상층액을 취하여 CD66c와 HuIg를 이용한 ELISA assay를 실시하여 발현되는 CD66c-HuIgFc의 양을 확인하고 안정적인 세포주를 만들기 위해 150ug/ml의 Zeocin (Gibco, USA)을 이용해 선별과정을 진행하였다. 선별과정 진행 후 최종적인 세포주를 확립하기 위해 제한 희석(limiting dilution)을 실시하여 단일 콜로니(single colony)를 확보하였다.
Three days after the transformation, the supernatant was taken and subjected to ELISA assay using CD66c and HuIg to confirm the amount of CD66c-HuIgFc expressed and selected using 150 ug / ml Zeocin (Gibco, USA) to make a stable cell line. The process was carried out. After the screening process, limiting dilution was performed to establish a final cell line to obtain a single colony.

<1-3><1-3> 재조합 항원의 정제Purification of Recombinant Antigens

CD66c-HuIgFC 재조합 항원의 경우, 이를 발현하는 상기 <실시예 1-2> 세포주의 상층액을 Protein G-affinity chromatography에 적용함으로써 손쉽게 정제를 할 수 있다. 자세한 실험방법은 아래와 같다.In the case of the CD66c-HuIgFC recombinant antigen, the supernatant of the cell line expressing the same can be easily purified by applying the protein G-affinity chromatography. Detailed experimental method is as follows.

상기 <실시예 1-2>에서 선택된 형질전환 세포주를 배양한 상층액을 수집하고 여기에 protein G-agarose(Thermo Fisher Scientific Inc. USA)를 넣어 4℃에서 밤새 결합시킨 후 이를 컬럼에 패킹(packing)하고 15ml의 wash buffer(20mM Phosphate buffer pH7.2)를 이용해 수세하였다. 이후, 컬럼에 5ml의 희석버퍼(Elution Buffer, 0.1M Glycine pH 2.9)를 넣어 1 ml 정도의 분획(fractions)을 받고 바로 100ul의 중화버퍼(Neutralizing buffer, 1M TrisCl pH 8.0)를 넣어 중화시켜 정제된 CD66c-HuIgFc 재조합 단백질을 수득하였다. The supernatant of the transformed cell line selected in <Example 1-2> was collected, and the protein G-agarose (Thermo Fisher Scientific Inc. USA) was added thereto to bind overnight at 4 ° C, and then packed on a column. ) And washed with 15 ml of wash buffer (20 mM Phosphate buffer pH 7.2). Thereafter, 5 ml of dilution buffer (Elution Buffer, 0.1M Glycine pH 2.9) was added to the column to receive 1 ml of fractions, and 100ul of neutralizing buffer (1M TrisCl pH 8.0) was neutralized and purified. CD66c-HuIgFc recombinant protein was obtained.

상기 확보한 재조합 단백질은 280nm의 흡광도를 측정한 다음, 용리(elution)시키고 Phosphate buffered saline(PBS)용액으로 투석한 후 BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific Inc. USA)를 이용해 농도를 측정하였다.The obtained recombinant protein was measured for absorbance at 280 nm, eluted, and dialyzed with Phosphate buffered saline (PBS) solution, followed by concentration using a BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc. USA).

상기와 같이 Protein G-affinity chromatography를 이용해 정제된 항원 2ug, 5ug, 10ug을 10% Tris-glycine 겔에 로딩한 후 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)에 옮기고 human Ig-HRP로 검출하는 western blot을 실시하여 분자량 105kDa의 단백질을 확인하였다.(도 5)
As described above, 2ug, 5ug, and 10ug of purified antigen were loaded onto 10% Tris-glycine gel by protein G-affinity chromatography, transferred to nitrocellulose membrane, and western blot was detected by human Ig-HRP. The protein of molecular weight 105kDa was confirmed. (FIG. 5)

<1-4><1-4> 형질전환 세포주에서 재조합 항원의 Of recombinant antigens in transgenic cell lines 발현여부Expression 확인 Confirm

상기 <실시예 1-2>에서 형질전환된 CHO-K1 세포주에서 CD66c-HuIgFc 재조합 항원의 발현을 확인하기 위해, CD66c에 대한 항체인 AP11, HuIgFc에 대한 항체인 Goat anti-human Fc fragment와 Goat anti-human Ig를 이용한 세 가지 sandwich ELISA를 이용하였다.(표 2 참조, mAb: monoclonal antibody)In order to confirm the expression of the CD66c-HuIgFc recombinant antigen in the CHO-K1 cell line transformed in <Example 1-2>, Goat anti-human Fc fragment and Goat anti, which are antibodies to AP11 and HuIgFc, to CD66c Three sandwich ELISAs using human Ig were used (see Table 2, mAb: monoclonal antibody).

　 method #1method # 1 method #2method # 2 method #3method # 3 coatingcoating anti-CD66c mAb (AP11)anti-CD66c mAb (AP11) anti-Human Ig Fcanti-Human Ig Fc anti-Human Iganti-Human Ig detectingdetecting anti-Human Ig Fc-HRPanti-Human Ig Fc-HRP Mouse anti-CD66c mAbMouse anti-CD66c mAb Goat anti-mouse IgM-HRPGoat anti-mouse IgM-HRP

구체적으로 96-웰 마이크로타이터 플레이트(microtitration plates, Maxisorp; Nunc, Roskilde, Denmark)에 100ng/웰의 AP11 mAb(DINONA, Korea) 및 400ng/웰의 Goat anti-human Fc fragment, Goat anti-human Ig 항체를 각각 PBS 버퍼에 희석하여 넣어준 후 37℃에서 한 시간 동안 배양하여 코팅하였다. 이후, 1x블로킹 버퍼(blocking buffer, Sigma)를 웰당 200ul씩 넣어 37℃에서 한 시간 동안 배양시켜 블로킹하였다. 블로킹된 웰에 상기 <실시예 1-2>에서 형질전환된 CHO-K1 세포주의 배양 상층액을 100ul 넣은 후 37℃에서 한 시간 동안 배양시켜 코팅된 항체와 결합을 유도하고 결합하지 않는 항체는 PBS로 세 번 수세하여 제거하였다. 상기 AP11 mAb와 상층액이 결합된 웰에 Hydroperoxidase(HRP) conjugated goat anti-human Fc fragment specific Ab(Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA)를 넣어준 후 37℃에서 30분간 반응시키고, anti-human Ig Fc와 anti-human Ig와 상층액이 결합된 웰에 mouse anti-CD66c mAb를 넣어준 후, 37℃에서 1시간 반응시키고 PBS로 세 번 수세한 뒤 HRP conjugated goat anti mouse IgM (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA)을 넣어 37℃에서 30분간 반응시켰다. 상기와 같이 HRP를 결합시킨 후 웰을 PBS로 수세하여 결합하지 않은 HRP conjugate를 제거하고, TMB(3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidene) 기질 용액을 웰당 50ul씩 넣은 후 실온에서 10분간 반응시킨 다음, 2N 황산으로 반응을 중지하였다. 반응 정도는 ELISA reader를 이용해 450nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 4에 기재하였다. 이때 대조군으로 pSegTag vector만 형질전환 시켜 얻은 세포 상층액과 HuIgFc가 결합된 다른 항원PD1((주)다이노나)을 사용하였다.Specifically, 100ng / well of AP11 mAb (DINONA, Korea) and 400ng / well of Goat anti-human Fc fragment, Goat anti-human Ig on 96-well microtitration plates (Maxisorp; Nunc, Roskilde, Denmark) Each antibody was diluted in PBS buffer and then coated by incubating at 37 ° C. for one hour. Then, 1 × blocking buffer (blocking buffer, Sigma) was added to 200ul per well and incubated at 37 ° C. for one hour for blocking. 100 μl of the culture supernatant of the transformed CHO-K1 cell line in the blocked well was incubated at 37 ° C. for one hour to induce binding to the coated antibody and not to bind the antibody. Washed with water three times. Hydroperoxidase (HRP) conjugated goat anti-human Fc fragment specific Ab (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) was added to the wells in which the AP11 mAb and the supernatant were combined, followed by reaction at 37 ° C. for 30 minutes, and anti-human After injection of mouse anti-CD66c mAb into a well combined with Ig Fc and anti-human Ig, the supernatant was reacted for 1 hour at 37 ° C, washed three times with PBS, and then HRP conjugated goat anti mouse IgM (Jackson Immuno Research Laboratories). , West Grove, PA) was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After binding HRP as described above, the wells were washed with PBS to remove unbound HRP conjugate, and 50 μl of TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidene) substrate solution was added per well for 10 minutes at room temperature. The reaction was then stopped with 2N sulfuric acid. The degree of reaction was measured by absorbance at 450nm using an ELISA reader and the results are shown in FIG. At this time, the cell supernatant obtained by transforming only the pSegTag vector and another antigen PD1 (Dinona Co., Ltd.) combined with HuIgFc were used.

상기 도 4에 기재한 바와 같이, 상기 <실시예 1-2>에서 형질전환된 CHO-K1 세포주에서 CD66c-HuIgFc 재조합 항원이 발현되고 있음을 알 수 있다.
As shown in FIG. 4, it can be seen that the CD66c-HuIgFc recombinant antigen is expressed in the CHO-K1 cell line transformed in Example 1-2.

<1-5><1-5> 재조합 항원의 기능 확인Functional check of recombinant antigens

상기 <실시예 1-3>에서 정제된 재조합 항원(CD66c-HuIgFc)이 CD66c 항원으로써 기능을 하는지 여부를 확인하기 위해, anti-CD66c 항체인 AP11이 A549 세포 표면에 결합하는 것을 상기 재조합 항원이 방해하는지를 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용해 확인하고 그 결과를 도 6에 기재하였다. In order to confirm whether the recombinant antigen (CD66c-HuIgFc) purified in Example 1-3 functions as a CD66c antigen, the recombinant antigen prevents the binding of the anti-CD66c antibody AP11 to the A549 cell surface. It was confirmed by flow cytometry and the results are shown in FIG. 6.

구체적으로 상기 재조합 항원 0ug, 10ug, 50ug, 100ug과 AP11 항체를 4℃에서 30분간 결합시킨 후 이를 A549 세포에 넣어 4℃에서 30분간 반응시키고 PBS 3ml을 넣어 1500rpm에서 3분간 원심 분리하여 수세하였다. 결합된 항체를 확인하기 위해, 이차 항체인 goat anti-Mouse IgM FITC (Dinona)을 200배 희석하여 넣은 후 4℃에서 15분간 반응시킨 후 PBS 3ml로 위와 동일한 방법으로 수세한 후 유세포 분석기로 측정하였다.Specifically, the recombinant antigens 0ug, 10ug, 50ug, 100ug and AP11 antibody were combined for 30 minutes at 4 ° C, and then reacted with A549 cells for 30 minutes at 4 ° C, followed by centrifugation at 1500 rpm for 3 minutes and washing with 3ml of PBS. To identify the bound antibody, 200-fold diluted goat anti-Mouse IgM FITC (Dinona), a secondary antibody, reacted at 4 ° C. for 15 minutes, washed with PBS 3ml in the same manner as above, and measured by flow cytometry. .

상기 도 6에 기재한 바와 같이, CD66c-HuIgFc를 첨가하지 않은 경우 양성이 나온 반면(도 6b), 상기 재조합 항원(CD66c-HuIgFc) 10ug, 50ug, 100ug와 anti-CD66c mAb를 먼저 결합시킨 후, A549 세포에 결합시킨 경우, 투여량에 비례하여 블로킹 현상이 발생함을 알 수 있다.(도 6c, d, e)
As shown in FIG. 6, when the CD66c-HuIgFc was not added (FIG. 6B), the recombinant antigen (CD66c-HuIgFc) 10ug, 50ug, 100ug and anti-CD66c mAb were first bound, When bound to A549 cells, it can be seen that the blocking phenomenon occurs in proportion to the dose (Fig. 6C, d, e).

<< 실시예Example 2> 2>

폐선암Lung adenocarcinoma 특이적  Specific 단클론Monoclonal 항체의 개발 Development of Antibodies

<2-1><2-1> 하이브리도마Hybridoma 세포 및  Cells and 단클론Monoclonal 항체의 제조 Preparation of antibodies

폐선암에서 직접 발현되는 특이적인 CD66c에 대한 단클론 항체를 개발하기 위해, 상기 재조합 CD66c-HuIgFc를 직접 면역화하지 않고 폐선암 A549 세포주를 면역화한 후 boosting 단계에서 상기 재조합 CD66c-HuIgFc을 주입함으로써 CD66c에 대한 항체를 증폭시켰으며, 하이브리도마 선별 과정에서 CD66c-HuIgFc와 A549 세포에 모두 양성인 항체를 골라 폐선암에서 발현되는 CD66c에 대한 항체를 선별하였다.(도 7 참조)To develop monoclonal antibodies against specific CD66c expressed directly in lung adenocarcinoma, immunizing the lung adenocarcinoma A549 cell line without directly immunizing the recombinant CD66c-HuIgFc and then injecting the recombinant CD66c-HuIgFc in the boosting step against CD66c Antibodies were amplified, and antibodies against CD66c expressed in lung adenocarcinoma were selected by selecting antibodies positive for both CD66c-HuIgFc and A549 cells during hybridoma screening (see FIG. 7).

폐선암 특이적 단클론 항체를 개발하기 위하여 6 주령의 Balb/c 암 컷 마우스 한 마리당 폐선암 세포주인 A549(ATCC CCL-185)를 1x107의 수만큼 마우스 복강(IP; intraperitoneal cavity)으로 3주간의 간격으로 세 번 주입하고 정맥에서 혈액 검체를 취하여 혈청을 분리하였다. 상기 분리된 혈청에 상기 <실시예 1>에서 정제된 CD66c-HuIgFc를 100ng/웰을 넣어 37℃에서 1시간 반응시켜 코팅하고 차단 버퍼(blocking buffer, sigma)를 웰당 200ul씩 넣고 37℃에서 1시간 반응시켜 차단하였다. 이렇게 코팅된 플레이트에 분리한 혈청을 희석하여 넣고 37℃에서 1시간 반응시키고 결합하지 않은 항체를 PBS로 수세하였다. 마지막으로 결합되어있는 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat anti-Mouse Ig-HRP(Jackson)을 2000배 희석하여 웰당 100ul씩 넣은 후 37℃에서 반응시킨 후 PBS로 수세하고 TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)를 웰당 50ul로 넣어 실온에서 10분간 반응시킨 후 2N H2SO4(sigma)로 반응을 중지시킨 후 450nm에서의 흡광도를 측정함으로써 역가를 확인하고, A549 세포에 희석한 혈청을 넣고 4℃에서 30분간 반응시킨 후 PBS 3ml을 넣고 1500rpm에서 3분간 원심분리하여 결합하지 않은 항체를 수세하고 결합된 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat anti-Mouse Ig-FITC(Dinona)을 200배 희석하여 넣은 후 4℃에서 15분간 반응 시킨 후 PBS 3ml로 위와 동일한 방법으로 수세한 후 유세포 분석기로 측정하여 CD66c에 대한 역가를 확인하고 그 결과를 도 8 및 도 9에 기재하였다. 구체적으로 세포 융합을 실시하기 3일 전 50 ug anti-CD40 agonist mAb를 넣어 면역반응을 증가시키고 100ug CD66c-HuIgFc를 주입하여 CD66c에 대한 항체가 증폭되도록 유도하였다.Lung cancer-specific to the 6-week-old Balb / c female cut mice maridang lung cancer cell line A549 (ATCC CCL-185) to develop a monoclonal antibody mouse abdominal cavity by the number of 1x10 7; a (IP intraperitoneal cavity) for three weeks Serum was isolated by injecting three times at intervals and taking a blood sample from the vein. 100ng / well of the CD66c-HuIgFc purified in <Example 1> was added to the separated serum and reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then coated with 200ul of blocking buffer (sigma) per well for 1 hour at 37 ° C. Reaction was blocked. The serum was diluted in the coated plate and reacted at 37 ° C. for 1 hour, and the unbound antibody was washed with PBS. Finally, to confirm the antibody bound to the secondary antibody goat anti-Mouse Ig-HRP (Jackson) diluted 2000 times and put in 100ul per well and reacted at 37 ℃ and washed with PBS and TMB (3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine) was added at 50ul per well and reacted at room temperature for 10 minutes. After stopping the reaction with 2N H 2 SO 4 (sigma), the titer was confirmed by measuring the absorbance at 450nm and diluted in A549 cells. Serum was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. Then, 3 ml of PBS was added and centrifuged at 1500 rpm for 3 minutes to wash the unbound antibody, and to confirm the bound antibody, goat anti-Mouse Ig-FITC (Dinona) was used. After diluting 200 times, the reaction was performed at 4 ° C. for 15 minutes, washed with PBS 3ml in the same manner as above, and measured by flow cytometry to confirm the titer on CD66c. The results are described in FIGS. 8 and 9. Specifically, three days before cell fusion, 50 ug anti-CD40 agonist mAb was added to increase the immune response and 100 ug CD66c-HuIgFc was injected to induce amplification of the antibody against CD66c.

상기 도 8 및 도 9에 기재한 바와 같이, A549 세포에 대한 역가를 유세포분석기로 확인한 결과 모두 높게 나타난 것을 확인하였고(도 8), CD66c에 대한 항원을 직접 면역화하지 않았음에도 A549 세포를 면역화한 혈청에서 CD66c-HuIgFc에 대한 양성이 높게 나타난 것을 확인하였다(도 9). As shown in FIG. 8 and FIG. 9, the titers of A549 cells were confirmed to be high as a result of flow cytometry (FIG. 8). Serum immunized with A549 cells even though the antigens against CD66c were not directly immunized. It was confirmed that the positive for CD66c-HuIgFc was shown in (Fig. 9).

상기와 같이 면역화된 쥐의 비장을 절제하여 단일 세포 부유액을 수득하고 RPMI(GIBCO)으로 2회 정도 세척한 후, 0.4% trypan blue(sigma)를 1:1(v/v)으로 섞은 후 현미경으로 염색되지 않은 세포를 측정하는 트립판 블루(tryphan blue) 염색법으로 세포수를 계수하였다. 세포융합 partner 세포로는 SP2/0 (ATCC CRL-1581) 또는 X63 moue myeloma 세포주(ATCC CRL-1580)를 사용하였으며 상기 비장세포와 동일하게 세척 후 세포수를 계수하였다.The spleens of the immunized rats were excised to obtain single cell suspension, washed twice with RPMI (GIBCO), mixed with 0.4% trypan blue (sigma) at 1: 1 (v / v), and then microscopically. Cell counts were counted by tryphan blue staining, which measures unstained cells. SP2 / 0 (ATCC CRL-1581) or X63 moue myeloma cell line (ATCC CRL-1580) was used as cell fusion partner cells and the number of cells after washing was counted in the same manner as the splenocytes.

상기 골수(myeloma) 세포와 비장세포는 1:5의 비율로 혼합하고 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 미리 37℃로 예열된 50% PEG(polyethylene glycol) 1500 1ml을 1분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 약 1분 정도 정체시켰다가 RPMI 배지를 서서히 추가하여 단계적으로 희석하였다. 이를 원심 분리한 후 1xHAT이 포함된 RPMI(20%FBS, hypoxanthine-aminopterin-thymidine)에 부유시키고, 96-웰 플레이트에 100ul/웰로 분주한 후 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 상기 융합 후 일정기간 HAT feeding을 진행하고, 군락을 형성한 웰이 관찰되면 배양 상층액을 폐선암 세포주인 A549 세포에 하이브리도마 배양 상층액을 100ul씩 넣고 4℃에서 30분간 반응시킨 후 PBS 3ml을 넣고 1500rpm에서 3분간 원심분리하여 결합하지 않은 항체를 수세하고 결합된 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat anti-Mouse Ig-FITC (Dinona)을 200배 희석하여 넣은 후 4℃에서 15분간 반응시킨 후 PBS 3ml로 위와 동일한 방법으로 수세한 후 유세포 분석기로 측정하였고 CD66c-HuIgFc를 이용해 정제된 CD66c-HuIgFc를 100ng/웰을 넣어 37℃에서 1시간 반응시켜 코팅하고 차단 버퍼(blocking buffer, sigma)를 웰당 200ul씩 넣고 37℃에서 1시간 반응 시켜 차단하였다. 이렇게 코팅된 플레이트에 하이브리도마 배양 상층액을 웰당 100ul씩 넣고 37℃에서 1시간 반응시키고 결합하지 않은 항체를 PBS로 수세하였다. 마지막으로 결합되어있는 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat anti-Mouse Ig-HRP(Jackson)을 2000배 희석하여 well당 100ul씩 넣은 후 37℃에서 반응시킨 후 PBS로 수세하고 TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)를 웰당 50ul 넣어 실온에서 10분간 반응시킨 후 2N H2SO4(sigma)로 반응을 중지 시킨 후 450nm에서의 흡광도를 측정함으로써 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 실시하였다. The myeloma cells and splenocytes were mixed at a ratio of 1: 5 and the supernatant was removed after centrifugation. 1 ml of 50% PEG (polyethylene glycol) 1500, previously preheated to 37 ° C., was slowly added over 1 minute. It was allowed to stand for about 1 minute and then diluted gradually by adding RPMI medium slowly. After centrifugation, the mixture was suspended in RPMI (20% FBS, hypoxanthine-aminopterin-thymidine) containing 1xHAT, and was incubated in a 37-well 5% CO 2 incubator after dispensing at 100ul / well in a 96-well plate. After the fusion, the HAT feeding was performed for a certain period of time, and when the wells that formed the colonies were observed, the culture supernatant was added 100ul of hybridoma culture supernatant to A549 cells, which are lung adenocarcinoma cell lines, and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. And centrifuged at 1500 rpm for 3 minutes to wash the unbound antibody, and 200-fold dilution of the secondary antibody goat anti-Mouse Ig-FITC (Dinona) was carried out for 15 minutes at 4 ° C. After washing with PBS 3ml in the same manner as above, and measured by flow cytometry, the purified CD66c-HuIgFc using CD66c-HuIgFc was added to 100ng / well and reacted for 1 hour at 37 ℃ coating and the blocking buffer (sigma) 200ul per well was blocked by reacting for 1 hour at 37 ℃. 100 μl per well of the hybridoma culture supernatant was added to the coated plate and reacted at 37 ° C. for 1 hour, and the unbound antibody was washed with PBS. Finally, to confirm the antibody bound to the secondary antibody goat anti-Mouse Ig-HRP (Jackson) diluted 2000 times and put in 100ul per well, reacted at 37 ℃ and washed with PBS and TMB (3,3 ' 50 μl of 5,5'-Tetramethylbenzidine per well was reacted at room temperature for 10 minutes, followed by 2 N H 2 SO 4 (sigma), followed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) by measuring absorbance at 450 nm. It was.

상기 두 가지 방법에서 모두 양성을 보이는 8F5 단클론 항체를 선별하고, 최종적으로 제한 희석(limiting dilution)을 통해 단일 콜로니의 8F5 mAb 를 발현하는 하이브리도마 세포를 확보하였다.
In both methods, 8F5 monoclonal antibodies positive were selected and finally, hybridoma cells expressing a single colony of 8F5 mAb were obtained through limiting dilution.

<2-2><2-2> 단클론Monoclonal 항체의  Antibody 아이소타입Isotype (( isotypeisotype ) 결정) decision

상기 <실시예 2-1>에서 제조된 8F5 단클론 항체의 아이소타입을 결정하기 위해 mouse immunoglobulin isotyping ELISA kit (BD Biosciences, USA)로 분석하였다. 구체적으로 isotyping은 rabbit anti-murine isotype specific antisera(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, Kappa, Lamda)를 이용하고 secondary antibody는 peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG를 사용하였다. 발색 반응은 ortho-phenylenediamine(OPD)와 hydrogen peroxide substrate를 이용해 유도하였으며 450nm의 흡광도를 측정하여 값을 확인하였다.In order to determine the isotype of the 8F5 monoclonal antibody prepared in <Example 2-1>, it was analyzed by mouse immunoglobulin isotyping ELISA kit (BD Biosciences, USA). Specifically, isotyping was performed using rabbit anti-murine isotype specific antisera (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, Kappa, Lamda) and peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG. The color reaction was induced using ortho-phenylenediamine (OPD) and hydrogen peroxide substrate and the absorbance at 450 nm was measured to confirm the value.

상기 실험결과, 8F5 단클론 항체는 mouse IgG1/kappa light chain으로 확인되었다.(결과 미기재)
As a result, 8F5 monoclonal antibody was identified as mouse IgG1 / kappa light chain. (Result not shown)

<2-3><2-3> 단클론Monoclonal 항체를 이용한  Antibody CD66cCD66c 항원의  Antigenic 겸출Cum

본 발명의 8F5 단클론 항체와 anti-CD66c AP11항체를 이용하여 A549 세포 용해물과 재조합 항원(CD66c-HuIgFc)에 대한 western blotting을 실시하였다. Western blotting of A549 cell lysate and recombinant antigen (CD66c-HuIgFc) was performed using 8F5 monoclonal antibody and anti-CD66c AP11 antibody of the present invention.

구체적으로 1x107 cells의 폐선암 세포주 A549를 lysis buffer(1% Nonidet P-40;NP-40 in 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 50mM EDTA, and 1mM phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride;PMSF) 100ul로 현탁한 후, 상온에서 15분간 용해시킨 다음 원심 분리를 통해 세포 잔존물을 제거하고 상층액을 모아 용해물을 준비하였다. 준비된 A549 용해물과 상기 <실시예 1>에서 수득한 재조합 항원(CD66c-HuIgFc)을 3분간 끓인 후 8% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 reducing과 non-reducing 조건에서 로딩하였다. 이를 니트로셀룰로오스 막에 electrophoretic transfer시킨 후 5% skim milk(sigma) 용액으로 블로킹하고 각각 8F5와 AP11 단클론 항체에 결합시킨 후, 8F5 단클론 항체를 결합시킨 것은 PBS로 세 번 세척한 후 peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG (Sigma, Saint Louis, USA)을 결합시키고, AP11 단클론 항체는 peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgM (Sigma, Saint Louis, USA)을 반응시켰다. 상기 니트로셀룰로오스 막을 PBS로 세척한 후 enhanced chemiluminescence detection system(ECL, Amersham, Sweden)로 밴드를 확인하여 그 결과를 도 10에 기재하였다. Specifically, the lung adenocarcinoma cell line A549 of 1x10 7 cells with 100ul of lysis buffer (1% Nonidet P-40; NP-40 in 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 50mM EDTA, and 1mM phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride; PMSF) After suspension, the cells were lysed at room temperature for 15 minutes, centrifuged to remove cell residues, and the supernatant was collected to prepare a lysate. The prepared A549 lysate and the recombinant antigen (CD66c-HuIgFc) obtained in Example 1 were boiled for 3 minutes and then loaded under 8% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing and non-reducing conditions. . After electrophoretic transfer to nitrocellulose membrane, blocking with 5% skim milk (sigma) solution and binding to 8F5 and AP11 monoclonal antibodies, respectively, combined with 8F5 monoclonal antibody were washed three times with PBS and then peroxidase-conjugated goat anti -mouse IgG (Sigma, Saint Louis, USA) was bound and AP11 monoclonal antibody reacted with peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgM (Sigma, Saint Louis, USA). After washing the nitrocellulose membrane with PBS, the band was confirmed with an enhanced chemiluminescence detection system (ECL, Amersham, Sweden) and the results are shown in FIG. 10.

상기 도 10에 기재한 바와 같이, non-reduced와 reduced 조건에서 두 항체 모두 대략 75kDa의 band가 확인되었고, 재조합 CD66c-HuIgFc는 두 항체 모두 non-reduced 조건에서는 약 210kDa과 reduced 조건에서는 105kDa의 band를 확인 할 수 있다. 재조합 CD66c-HuIgFc의 크기가 non-reduced와 reduced에서 차이가 나타나는 것은 HuIgFc부위에서 dimer가 형성 되었기 때문에 크기의 차이가 발생한 것이다. As shown in FIG. 10, a band of approximately 75 kDa was confirmed in both non-reduced and reduced conditions, and recombinant CD66c-HuIgFc showed a band of about 210 kDa in both non-reduced conditions and 105 kDa in reduced conditions. You can check. The difference in non-reduced and reduced size of recombinant CD66c-HuIgFc was due to the dimer formation in HuIgFc region.

결국 종래 anti-CD66c에 대한 항체인 AP11과 8F5의 western blotting 결과가 일치함을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 CD66c 항원의 검출할 수 있음을 알 수 있다.As a result, it can be seen that the Western blotting results of AP11 and 8F5, which are antibodies to the conventional anti-CD66c, are consistent. Therefore, it can be seen that the CD66c antigen can be detected using the monoclonal antibody of the present invention.

한편 CD66c 항원의 경우 혈액의 과립구(granulocytes)에서 모두 발현되고 있다고 알려져 있다. 이에 말초 혈액에 대한 8F5의 결합 정도를 확인하기 위해 PBMC(peripheral blood mononuclear cells, 적십자혈액원)에 8F5 항체를 1ug 넣고 4℃에서 30분간 반응 시킨 후 PBS 3ml을 넣고 1500rpm에서 3분간 원심분리 하여 결합하지 않은 항체를 washing하고 결합된 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat anti-Mouse Ig-FITC (Dinona)을 200배 희석하여 넣은 후 4℃에서 15분간 반응 시킨 후 PBS 3ml로 위와 동일한 방법으로 washing한 후 유세포 분석기로 측정하였고 그 결과를 도 11에 기재하였다. The CD66c antigen is known to be expressed in granulocytes of blood. In order to confirm the binding of 8F5 to peripheral blood, 1ug of 8F5 antibody was added to PBMC (peripheral blood mononuclear cells) and reacted at 4 ° C for 30 minutes, and then 3 ml of PBS was added and centrifuged at 1500 rpm for 3 minutes. After washing the non-antibodies and checking the bound antibody, 200-fold dilution of goat anti-Mouse Ig-FITC (Dinona), which is a secondary antibody, was reacted at 4 ° C for 15 minutes, and then washed with PBS 3ml in the same manner as above. Measured by flow cytometry and the results are shown in FIG.

상기 도 11에 기재한 바와 같이, 8F5 단클론 항체를 이용함으로써 CD66c 항원이 거의 모든 과립구(granulocytes)에서 98% 정도 발현하는 것을 확인하였으며, 림프구(lymphocytes)와 단핵세포(monocytes)에서는 거의 발현되지 않는 것을 알 수 있다. As shown in FIG. 11, it was confirmed that the CD66c antigen was expressed in almost all granulocytes by 98% by using 8F5 monoclonal antibody, and was hardly expressed in lymphocytes and monocytes. Able to know.

또한 anti-CD66c에 대한 단클론 항체로써 AP11 이외에 널리 알려진 9A6(SantaCrutz, USA) 클론을 이용해 8F5와 CD66c-HuIgFc에 대한 결합을 확인하기 위해 정제된 CD66c-HuIgFc를 100ng/웰을 넣어 37℃에서 1시간 반응시켜 코팅하고 blocking buffer(sigma)를 웰당 200ul씩 넣고 37℃에서 1시간 반응시켜 차단하였다. 이렇게 코팅된 플레이트에 1ug/ml 농도의 9A6, 8F5, AP11항체를 웰당 100ul씩 넣고 37℃에서 1시간 반응시키고 결합하지 않은 항체를 PBS로 수세하였다. 마지막으로 결합되어있는 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat anti-Mouse Ig-HRP(Jackson)을 2000배 희석하여 well당 100ul씩 넣은 후 37℃에서 반응시킨 후 PBS로 수세하고 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)를 웰당 50ul넣어 실온에서 10분간 반응시킨 후 2N H2SO4(sigma)로 반응을 중지시킨 후 450nm에서의 흡광도를 측정하는 방법인 ELISA로 확인하고 그 결과를 도 12에 기재하였다. In addition, a monoclonal antibody against anti-CD66c was used to confirm binding to 8F5 and CD66c-HuIgFc using a well-known 9A6 clone (SantaCrutz, USA) in addition to AP11. After the reaction was coated and put blocking buffer (sigma) 200ul per well was blocked by reacting for 1 hour at 37 ℃. 100 μl of each of the 9A6, 8F5, and AP11 antibodies at a concentration of 1 ug / ml was added to the coated plate and reacted at 37 ° C. for 1 hour, and the unbound antibody was washed with PBS. Finally, to confirm the antibody bound to the secondary antibody goat anti-Mouse Ig-HRP (Jackson) diluted 2000 times and put in 100ul per well and reacted at 37 ℃ and washed with PBS and TMB (3,3 ' 50 μl of 5,5'-Tetramethylbenzidine per well was reacted at room temperature for 10 minutes, and then the reaction was stopped with 2N H 2 SO 4 (sigma) and confirmed by ELISA, a method for measuring absorbance at 450 nm. It described in 12.

상기 도 12에 기재한 바와 같이, 세 항체 모두 CD66c-HuIgFc에 높은 값을 나타내고 있으나, 세 클론이 activity는 서로 다르게 나타남을 알 수 있다.(도 12)
As shown in FIG. 12, all three antibodies show high values for CD66c-HuIgFc, but it can be seen that the three clones have different activities (FIG. 12).

<2-4><2-4> 8F5 8F5 단클론Monoclonal 항체를 이용한  Antibody 폐선암Lung adenocarcinoma 세포주의  Cell line CD66cCD66c 항원의 발현 분석 Expression Analysis of Antigens

KCLB(Korean Cell Line Bank)와 SNU(Seoul National University)를 통해 확보한 다양한 암 세포주에서의 8F5 단클론 항체의 결합 여부를 유세포 분석기(flow cytometry)로 확인하였다.Flow cytometry confirmed the binding of 8F5 monoclonal antibodies to various cancer cell lines obtained through Korean Cell Line Bank (KCLB) and Seoul National University (SNU).

구체적으로 암세포주는 KCLB(Korean Cell Line Bank)와 SNU(Seoul National University)를 통해 얻었으며 L-132, SW-900, DU145, LNCap, MDA-MB231, MCF-7는 10% heat inactivated fetal bovine serum(FBS; GIBCO, invitrogen)가 첨가된 Dubco's MEM(GIBCO, invitrogen) 배지를, A549, NCI-H460, NCI-H417, DLD-1,HCT116, HT-29, SW-480, SW-620, PC-3 은 10% heat inactivated FBS이 첨가된 RPMI 1640(GIBCO, invitrogen) 배지를 이용해 37℃에서 5% CO2 . 상태의 배양기를 이용해 배양하였다. Specifically, cancer cell lines were obtained through Korean Cell Line Bank (KCLB) and Seoul National University (SNU), and 10% heat inactivated fetal bovine serum (L-132, SW-900, DU145, LNCap, MDA-MB231, MCF-7) FBS; GIBCO, invitrogen) added Dubco's MEM (GIBCO, invitrogen) medium, A549, NCI-H460, NCI-H417, DLD-1, HCT116, HT-29, SW-480, SW-620, PC-3 Was prepared using 5% CO 2 at 37 ° C using RPMI 1640 (GIBCO, invitrogen) medium supplemented with 10% heat inactivated FBS . The culture was carried out using a state incubator.

상기 배양된 암세포주에 본 발명의 8F5 단클론 항체를 넣어 4℃에서 30분간 배양한 후 PBS로 수세하고, FITC-conjugated goat anti-mouse Ig G(DiNona Inc, Korea)를 넣어 4℃에서 15분간 배양하였다. 다시 PBS로 수세한 후 FACScaliber(Becton Dickinson, USA)로 분석하여 그 결과를 표 3에 기재하였다.Put the 8F5 monoclonal antibody of the present invention in the cultured cancer cell line and incubated for 30 minutes at 4 ℃, washed with PBS, and incubated for 15 minutes at 4 ℃ put FITC-conjugated goat anti-mouse Ig G (DiNona Inc, Korea) It was. After washing with PBS again and analyzed by FACScaliber (Becton Dickinson, USA) the results are shown in Table 3.

Figure 112010049249610-pat00001
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상기 표 3에 기재한 바와 같이, 본 발명의 8F5 단클론 항체는 폐선암 세포주 A549에서는 높게 결합하는 반면, 정상 폐세포주인 L-132와 small cell carcinoma 세포주인 NCI-H417, HT-29를 제외한 4개의 colon cancer cell line, 3개의 prostate cell line, 2개의 breast cancer cell line에서 모두 결합하지 않는 것을 확인하였고, colon cancer cell line인 HT-29는 약하게 결합이 나타나는 것을 확인하였다.
As shown in Table 3 above, the 8F5 monoclonal antibody of the present invention binds highly in lung adenocarcinoma cell line A549, while four cells except L-132, a normal lung cell line, and NCI-H417, HT-29, a small cell carcinoma cell line. The colon cancer cell line, three prostate cell lines, and two breast cancer cell lines did not bind to each other. The colon cancer cell line HT-29 was found to be weakly bound.

<2-5><2-5> 8F5 8F5 단클론Monoclonal 항체를 이용한 폐암 조직에서  Lung Cancer Tissues Using Antibodies CD66cCD66c 항원의 발현 분석 Expression Analysis of Antigens

충북대학병원에서 수득한 정상 흉선(thymus), 림프절(lymph node), 편도(tonsil), 비장(spleen), 신장(kidney), 요도(urethra) 및 피부(skin)의 동결조직으로 8F5에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였으며, 임상에서 확보한 폐암 조직은 10% 포르말린(sigma)로 고정시킨 후 파라핀(paraffin)에 포매(embedding)시켰다.Immunity to 8F5 with frozen thymus, lymph node, tonsil, spleen, kidney, urethra and skin frozen tissue obtained from Chungbuk National University Hospital Histochemical staining was performed, and the lung cancer tissues secured in the clinic were fixed with 10% formalin (sigma) and embedded in paraffin.

구체적으로 조직염색은 8F5 단클론 항체를 블로킹 버퍼(blocking buffer, 4% skim milk, 0.1% Tween-20, PBS)에 넣어 4℃에서 밤새 반응시킨 후 biotinylated goat anti-mouse IgG와 HRP conjugated streptavidin (Dako, Denmark)를 넣어 실온에서 20분간 결합시켰다. 발색 반응은 3,3'-diaminobenzidine (Sigma, Saint Louis. USA)를 이용해 실시하고 그 결과를 표 4 및 도 13에 기재하였다.Specifically, tissue staining was performed by adding 8F5 monoclonal antibody to blocking buffer (4% skim milk, 0.1% Tween-20, PBS) at 4 ° C. overnight, followed by biotinylated goat anti-mouse IgG and HRP conjugated streptavidin (Dako, Denmark) was added and allowed to bind at room temperature for 20 minutes. Color reaction was performed using 3,3'-diaminobenzidine (Sigma, Saint Louis. USA) and the results are shown in Table 4 and FIG.

Figure 112010049249610-pat00002
Figure 112010049249610-pat00002

상기 표 4에 기재한 바와 같이, 충북대학교 병원을 통해 얻은 정상 동결조직에 대한 8F5 단클론 항체 염색 결과 모든 조직에서 음성임을 알 수 있다.As shown in Table 4, 8F5 monoclonal antibody staining for normal frozen tissue obtained through Chungbuk National University Hospital can be seen that all tissues are negative.

그러나 폐선암 조직에서는 갈색의 양성이 확인 되었으며(도 13a, b), 편평세포암(squamous cell carcinoma, 도 13c)과 소세포암(small cell carcinoma, 도 13d)조직에서는 음성으로 나타나, 본 발명의 8F5 단클론 항체를 이용하여 폐선암 조직을 검출할 수 있음을 알 수 있다.However, brown positivity was detected in lung adenocarcinoma tissues (FIGS. 13A, B), squamous cell carcinoma (squamous cell carcinoma, FIG. 13C) and small cell carcinoma (small cell carcinoma, FIG. 13D), and negative in tissues. It can be seen that the antibody can be used to detect lung adenocarcinoma tissue.

<< 실시예Example 3> 3>

본 발명의 The 단클론Monoclonal 항체의  Antibody 에피토프Epitope (( epitopeepitope ) 결정) decision

<3-1> 본 발명의 <3-1> of the present invention 단클론Monoclonal 항체의  Antibody 에피토프Epitope (( epitopeepitope ) 결정) decision

상기 <실시예 2>에서 제조된 본 발명이 단클론 항체인 8F5 항체의 에피토프를 결정하기 위하여, MOLI-TOF 방법을 이용한 단백질 펩타이드 분석법을 이용하였다. In order to determine the epitope of the 8F5 antibody of the present invention prepared in <Example 2> monoclonal antibody, protein peptide analysis using the MOLI-TOF method was used.

먼저 상기 8F5 항체 2 내지 5ug과 Protein A resin(amersham phamarcia) 20ul를 넣고 4℃에서 12시간 이상 결합시킨 후 A549 용해물을 500ul넣고 4℃에서 4시간 이상 회전시킨 다음, 항체에 결합하지 않은 단백질들을 PBS로 수세하여 제거하고 항체에 결합한 단백질만 protein A resin에 남게 하였다. 이를 SDS-PAGE 겔에 로딩하여 단백질을 분리하고 이에 트립신을 처리(trypsinization)한 뒤 MOLDI-TOF (Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Mann M. Anal Chem. 1996 Mar 1;68(5):850-8.)를 수행하여 펩타이드를 분석하였다. 상기 분석된 화면을 캡쳐하여 도 14에 기재하였다.First, 2-5 ug of the 8F5 antibody and 20ul of Protein A resin (amersham phamarcia) were added and bound at 4 ° C for at least 12 hours. Then, 500ul of A549 lysate was added and rotated at 4 ° C for at least 4 hours. After washing with PBS, only proteins bound to the antibody remained in protein A resin. This was loaded onto an SDS-PAGE gel to separate proteins and trypsinization followed by MOLDI-TOF (Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Mann M. Anal Chem Peptides were analyzed by 1996 Mar 1; 68 (5): 850-8.). The analyzed screen was captured and described in FIG. 14.

상기 도 14에 기재한 바와 같이, 본 발명의 단클론 항체의 에피토프는 서열번호 7의 아미노산 서열(RNDAGSYECEIQNPASANR)로 표시됨을 알 수 있다.
As shown in FIG. 14, the epitope of the monoclonal antibody of the present invention can be seen that the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (RNDAGSYECEIQNPASANR).

<3-2> 본 발명의 <3-2> of the present invention 단클론Monoclonal 항체의  Antibody 에피토프Epitope (( epitopeepitope ) 검증) Verification

상기 <실시예 3-1>의 프로테옴 분석으로 결정된 8F5 항체에 대한 항원이 CD66c임을 확인하였고, 이에 대한　에피토프(epitope)을 검증하기 위하여 도 15에 기재한 바와 같이 상기 <실시예 3-1>에서 결정된 에피토프 부위를 포함하거나 포함하지 않는 재조합 항원을 제작하여 8F5 항체에 대한 면역반응을 실시하였다.
It was confirmed that the antigen for the 8F5 antibody determined by the proteome analysis of <Example 3-1> was CD66c, and as shown in FIG. 15 to verify the epitope, the <Example 3-1> Recombinant antigens with or without the determined epitope region were constructed to perform an immune response against the 8F5 antibody.

<3-2-1> <3-2-1> CD66cCD66c mutantmutant 재조합 유전자 제조 Recombinant gene manufacturing

pSec-Tag-CD66cfull-hFc 재조합 유전자를 이용하여 8F5 항체의 epitope부위에 존재하는 제한효소 BamHI를 이용해 CD66c mutant 재조합 유전자를 만들었다. 구체적으로 서열번호 8로 표시되는 상기 CD66c 항원의 전체 염기서열과 hFc가 결합된 유전자를 pSec-Tag에 삽입하고 이를 8F5 항체의 epitope부위에 존재하는 제한효소 BamHI를 이용하여 절단함으로써 CD66c mutant 재조합 유전자를 확보하였다.Using the pSec-Tag-CD66cfull-hFc recombinant gene, a CD66c mutant recombinant gene was generated using the restriction enzyme BamHI present in the epitope region of the 8F5 antibody. Specifically, the CD66c mutant recombinant gene was cleaved by inserting the entire nucleotide sequence of the CD66c antigen represented by SEQ ID NO: 8 and the gene to which hFc is bound in pSec-Tag, and cleaving it using restriction enzyme BamHI present in the epitope region of the 8F5 antibody. Secured.

보다 구체적으로 8F5 항체의 에피토프가 포함되지 않은 CD66c mutant(BI /BHI)는 BamHI으로 자른 후, 상기 서열번호 8의 CD66c 유전자의 535 내지 787bp 사이의 252bp를 제거하고 나머지 단편을 다시 연결하는 방법으로 제작하였다.　상기와 같이 제조된 CD66c mutant(BI /BHI)의 서열은 서열번호 9의 염기서열로 표시된다.More specifically, the CD66c mutant (BI / BHI) not containing the epitope of the 8F5 antibody was cut by BamHI, and then produced by a method of removing 252bp between 535 and 787bp of the CD66c gene of SEQ ID NO: 8 and relinking the remaining fragments. It was. The sequence of the prepared CD66c mutant (BI / BHI) is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO.

한편 8F5 항체의 에피토프(epitope)을 포함하나 N 말단의 N domain과 A domain 일부가 결핍된 CD66c mutant(HPK/HdIII/PstI/klenow)는 Hind III와 PstI으로 자른 후 N 말단부터 479bp 단편을 제거하고 나머지 유전자 단편에 Klenow를 처리하여 HindIII와 PstI에 의한 접착 말단(sticky end)을 채워 평활말단(blunt ends)을 서로 연결하여 제조하였다. 상기와 같이 제조된 CD66c mutant(HPK/HdIII/PstI/klenow)의 서열은 서열번호 10의 염기서열로 표시된다.
The CD66c mutant (HPK / HdIII / PstI / klenow), which contains an epitope of the 8F5 antibody but lacks the N- and N-domains of the N-terminal, was cut with Hind III and PstI, and then removed a 479bp fragment from the N-terminal. Klenow was applied to the remaining gene fragments to fill the sticky ends by HindIII and PstI, and thus, the blunt ends were connected to each other. The sequence of the prepared CD66c mutant (HPK / HdIII / PstI / klenow) is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.

<3-2-2> <3-2-2> CD66cCD66c mutantmutant 재조합 유전자의 발현 Expression of Recombinant Genes

상기 CD66cfull-hFc, CD66c mutant(BI /BHI)-hFc, CD66c mutant(HPK/HdIII/PstI/klenow)-hFc가 삽입된 pSec-Tag 벡터를 Effectene(Qiagen사)을 이용하여 CHO-K1 세포에 삽입함으로써 형질전환하였다. The pSec-Tag vector inserted with the CD66cfull-hFc, CD66c mutant (BI / BHI) -hFc, and CD66c mutant (HPK / HdIII / PstI / klenow) -hFc was inserted into CHO-K1 cells using Effectene (Qiagen). By transformation.

보다 구체적으로 상기 각 유전자 및 Effectene complex을 하루 전날 플레이팅하여 새로운 배지로 갈아준 CHO 세포에 뿌리고 48시간 동안 배양하였다. 상기 형질감염한지 이틀 후 배양 상등액을 수확하여 human Fc(hFc)를 검출하는 sandwich ELISA를 이용해 발현여부를 확인하였다.(결과 미기재)
More specifically, the genes and the Effectene complexes were plated one day before, sprinkled with CHO cells, which were ground with fresh medium, and cultured for 48 hours. Two days after the transfection, the culture supernatant was harvested and the expression was confirmed using a sandwich ELISA detecting human Fc (hFc). (Result not shown)

<3-2-3> 본 발명의 <3-2-3> of the present invention 단클론Monoclonal 항체의  Antibody 에피토프Epitope (( epitopeepitope ) 검증) Verification

본 발명의 단클론 항체의 CD66c에 대한 에피토프를 검증하기 위해, 기존에 알려진 anti-CD66c 항체인　9A6(Santa cruz), AP11(다이노나)를 well당 100ng 넣어 37℃에서 한 시간 반응시켜 capture 항체로서 코팅하고, 1xblocking 용액(sigma)을 웰당 200ul 넣고 37℃에서 한 시간 반응시켜 블로킹하였다. 상기 준비된 플레이트에 상기 <실시예 3-2-2>에서 제조된 CD66c full-hFc, CD66c mutant(BI /BHI)-hFc 및 CD66c mutant(HPK/HdIII/PstI/klenow)-hFc의 배양 상층액을 웰당 100ul씩 넣은 후 37℃에서 한 시간 반응시키고 PBS로 수세하여 결합하지 않는 항체는 제거하였다. 이에 anti-human Ig-HRP(Jackson)을 희석하여 넣어주고 1시간 반응시킨 후　PBS로 수세한 뒤 TMB 용액을 웰당 50ul씩 넣어 10분간 반응시킨 후 황산 50ul를 넣어 반응을 중지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 배양 상층액에 CD66c mutant-hFc 단백질이 존재함을 확인하기 위해, 대조군으로 anti-human Ig 항체를이용하여 Capture & detect Sandwich ELISA를 수행하고 상기 실험 결과를 표 5 및 도 16에 기재하였다. In order to verify the epitope of the CD66c of the monoclonal antibody of the present invention, 100ng of known anti-CD66c antibodies, 9A6 (Santa cruz) and AP11 (Dinona), were reacted for one hour at 37 ° C and coated as a capture antibody. Then, 200 μl of 1 × blocking solution (sigma) was added per well and blocked by reaction at 37 ° C. for 1 hour. The prepared supernatant of CD66c full-hFc, CD66c mutant (BI / BHI) -hFc and CD66c mutant (HPK / HdIII / PstI / klenow) -hFc prepared in Example 3-2-2 was prepared in the prepared plate. After adding 100ul per well, the reaction was performed at 37 ° C for one hour and washed with PBS to remove the non-binding antibody. After diluting anti-human Ig-HRP (Jackson) and reacting for 1 hour, rinsed with PBS and rinsed with PBS and reacted for 10 minutes by adding 50ul of TMB solution per well, and stopping the reaction with 50ul of sulfuric acid. It was. In order to confirm the presence of the CD66c mutant-hFc protein in the culture supernatant, Capture & detect Sandwich ELISA was performed using an anti-human Ig antibody as a control and the experimental results are shown in Table 5 and FIG. 16.

　 Capture 항체Capture antibody 8F58F5 9A69A6 AP11AP11 a-huIga-huIg 상층
배양액Upper layer
Culture CD66c full-hFcCD66c full-hFc 2.8732.873 2.8382.838 2.9132.913 3.1233.123 CD66c mutant(HPK/HdIII/PstI/klenow)-hFcCD66c mutant (HPK / HdIII / PstI / klenow) -hFc 2.8042.804 0.0490.049 0.0970.097 3.1133.113 CD66c mutant(BI /BHI)-hFcCD66c mutant (BI / BHI) -hFc 0.0190.019 1.9241.924 2.6622.662 3.1493.149 negativenegative 0.0170.017 0.0270.027 0.2470.247 3.1613.161

상기 표 5 및 도 16에 기재한 바와 같이, 본 발명의 8F5 항체는 상기 <실시예 3-1>에서 결정된 에피토프를 포함하고 있는 CD66c full-hFc 또는 CD66c mutant(HPK/HdIII/PstI/klenow)-hFc에 결합하는 활성이 있으나, 상기 에피토프가 제거된 CD66c mutant(BI /BHI)-hFc에 대해서는 거의 결합하지 않음을 알 수 있다. 그러나 기존 CD66c의 항체인 9A6, AP11는 상기 에피토프가 제거된 CD66c mutant(BI /BHI)-hFc에 주로 결합하는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 8F5 항체는 종래 9A6, AP11 항체와 다른 에피토프인 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시됨을 알 수 있다.As described in Table 5 and FIG. 16, the 8F5 antibody of the present invention is a CD66c full-hFc or CD66c mutant (HPK / HdIII / PstI / klenow)-containing an epitope determined in Example 3-1. It can be seen that there is activity for binding to hFc, but little to CD66c mutant (BI / BHI) -hFc from which the epitope has been removed. However, it can be seen that the antibodies of the existing CD66c 9A6, AP11 mainly binds to the CD66c mutant (BI / BHI) -hFc from which the epitope is removed. Therefore, it can be seen that the 8F5 antibody of the present invention is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, which is a different epitope from the conventional 9A6 and AP11 antibodies.

상기와 같은 실험결과는 도 17에 기재한 바와 같이, MOLDI-TOF를 통해 밝힌 8F5 항체의 에피토프(epitope) 부위와 정확히 일치함을 알 수 있다.
As shown in FIG. 17, it can be seen that the epitope region of the 8F5 antibody revealed through MOLDI-TOF is exactly the same as the epitope region.

<< 실시예Example 4> 4>

본 발명의 The 단클론Monoclonal 항체를 이용한  Antibody 폐선암의Lung cancer 검출 detection

본 발명의 단클론 항체로 CD66c항원을 면역분석법(immunoassay)을 이용하여 검출하였다.CD66c antigen was detected by immunoassay with the monoclonal antibody of the present invention.

구체적으로 먼저 종래 CD66c에 대한 항체인 AP11를 웰당 100ng 넣고 37℃에서 한 시간 반응시켜 capture 항체로서 코팅하고, 1xblocking 용액(sigma)을 웰당 200ul 넣고 37℃에서 한 시간 반응시켜 블로킹하였다. 이렇게 준비된 플레이트에 폐선암 세포주인 A549와 소세포 폐암 세포주인 H417, 위암 세포주인 KatoIII (ATCC HB-103), 혈액암 세포주인 K562(ATCC CCL-243)의 용해물을 웰당 100ug씩 넣은 후 37℃에서 한 시간 반응시키고 PBS로 수세하여 결합하지 않는 항체는 제거하였다. 이에 8F5항체에 HRP를 conjugation시킨 항체를 희석하여 넣어주고 1시간 반응 시킨 후　PBS로 수세한 뒤 TMB 용액을 웰당 50ul씩 넣어 10분간 반응시킨 후 황산 50ul를 넣어 반응을 중지시키고 450nm에서의 값을 확인하였다. 이때 CD66c full-hFc 단백질을 standard로 하여 나온 값(detection Ag)을 정량적으로 계산하였으며, 그 결과를 도 18에 기재하였다.Specifically, AP11, which is an antibody against the conventional CD66c, was put in 100ng per well and reacted at 37 ° C. for one hour to coat as a capture antibody, and 200 × of 1 × blocking solution (sigma) was added per well for 1 hour at 37 ° C. for blocking. Into the plate prepared as described above, lysate of pulmonary adenocarcinoma cell line A549, small cell lung cancer cell line H417, gastric cancer cell line KatoIII (ATCC HB-103), and blood cancer cell line K562 (ATCC CCL-243) was put in 100 ugs per well, at 37 ° C. The reaction was removed for 1 hour, washed with PBS, and the antibody was not bound. After diluting the HRP-conjugated antibody into the 8F5 antibody and reacting for 1 hour, washing with PBS and rinsing with PBS for 50 minutes per well for 10 minutes, stopping the reaction by adding 50ul of sulfuric acid and checking the value at 450nm. It was. At this time, a value (detection Ag) derived from CD66c full-hFc protein as a standard was quantitatively calculated, and the results are shown in FIG. 18.

상기 도 18에 기재한 바와 같이, 본 발명의 8F5 항체를 통하여 폐선암을 효과적으로 검출할 수 있어 폐선암 특이적 바이오 마커로 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.
As shown in FIG. 18, it can be seen that lung cancer can be effectively detected through the 8F5 antibody of the present invention and thus can be effectively used as a lung cancer-specific biomarker.

<< 실시예Example 5> 5>

본 발명의 The 단클론Monoclonal 항체의 항암 활성 Anticancer Activity of Antibodies

마우스는 6주령(18g)된 수컷 Nude-mouse(중앙실험동물)을 사용하였으며, 폐선암 세포주인 A549를 1xtrypsin-EDTA(GIBCO)로 부유시키고, Hanks balanced salt solution(HBSS)에 두 번 수세하여 1x107cell을 한 마리의 누드 마우스에 100ul 부피로 마우스 앞다리 뒷부분에 주사하여 종양주를 획득하였다. 종양의 중심괴사(central necrosis)가 일어나기 전에 충분한 혈액공급으로 급속히 자라는 단계의 종양 절편을 만들었으며, 피부 위를 만져 종양편의 위치를 확인하고 1주일에 2회 이상 성장을 관찰한 다음 이식 후 부피가 100mm3에 도달한 마우스를 본 실험에 사용하였다.Mice were 6 weeks old (18 g) male Nude-mouse (Central Experimental Animal). The lung adenocarcinoma cell line A549 was suspended with 1xtrypsin-EDTA (GIBCO), washed twice with Hanks balanced salt solution (HBSS) and 1x10. Tumor lines were obtained by injecting 7 cells into one nude mouse in the back of the mouse forelimb in a volume of 100ul. Tumor sections of rapidly growing stage were made with sufficient blood supply before the central necrosis of the tumor occurred.They were placed on the skin to confirm the location of the tumor and observed growth at least twice a week. Mice that reached 100 mm 3 were used in this experiment.

통계적 유의성을 획득하기 위해, 부피가 100mm3가 된 마우스를 선별하고 각 그룹당 10마리의 마우스를 배정하였으며 본 발명의 단클론 항체는 개체당 100ug/100ul의 1xPBS에 희석하여 마우스 꼬리 정맥에 주사하였고, 주사 간격은 0, 3, 7, 14, 21, 28, 35일로 총 7회 투여하였다.To obtain statistical significance, mice with a volume of 100 mm 3 were selected and 10 mice were assigned to each group, and monoclonal antibodies of the present invention were injected into mouse tail vein diluted in 100 ug / 100 ul of 1 × PBS per subject and injected. Intervals were administered seven times at 0, 3, 7, 14, 21, 28, and 35 days.

종양 부피 측정은 본 발명의 단클론 항체 투여일을 기준으로 1주일에 2회씩 캘리퍼스(calipers)로 종양의 장, 단축을 측정하였고 1주일 단위로 4 내지 5주간 측정하여 시험물질의 효과를 판별하였으며, 그 결과를 도 19에 기재하였다.Tumor volume was measured by calipers twice a week on the basis of the monoclonal antibody administration date of the present invention, and the length and shortening of the tumor were measured for 4 to 5 weeks on a weekly basis to determine the effect of the test substance. The result is shown in FIG.

상기 도 19에 기재한 바와 같이, 본 발명의 8F5 항체가 A549 세포에서 발현되는 항원이 없는 항체로써 8F5 와 같은 isotype을 가진 항체인 isotype control 항체 (Dinona)에 비하여 약 30% 이상의 종양억제 효능이 있음을 알 수 있다.As shown in FIG. 19, the 8F5 antibody of the present invention is an antigen-free antibody expressed in A549 cells, and has an tumor suppression effect of about 30% or more compared to an isotype control antibody (Dinona), an antibody having an isotype such as 8F5. It can be seen.

한국세포주연구재단Korea Cell Line Research Foundation KCLRFBP00230KCLRFBP00230 2010022220100222

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims (10)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00230)에 의해 생산되며, 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CD66c(Cluster of Differentiation 66c)의 에피토프(epitope)인 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 단클론 항체 또는 이의 절편.Monoclonal that is specifically produced by hybridoma cells (Accession No .: KCLRF-BP-00230) and specifically recognizes a polypeptide that is an epitope of CD66c (Cluster of Differentiation 66c) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 Antibodies or fragments thereof. 삭제delete 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CD66c(Cluster of Differentiation 66c)의 에피토프(epitope)인 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00230).A hybridoma cell (Accession No .: KCLRF-BP-00230) that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes a polypeptide that is an epitope of CD66c (Cluster of Differentiation 66c) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. 제5항의 단클론 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 함유하는 폐선암 진단용 조성물.Lung adenocarcinoma diagnostic composition comprising the monoclonal antibody or a fragment thereof as an active ingredient. 제5항의 단클론 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 함유하는 폐선암 진단 키트.Lung adenocarcinoma diagnostic kit containing the monoclonal antibody or a fragment thereof as an active ingredient. 제5항의 단클론 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 함유하는 폐선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating lung cancer, comprising the monoclonal antibody of claim 5 or a fragment thereof as an active ingredient.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101783907B1 (en) 2016-03-15 2017-10-10 다이노나(주) composition for preventing or treating lung cancer comprising antibody against CD66c and chemical drug
KR102373502B1 (en) * 2018-05-14 2022-03-11 주식회사 금호에이치티 Use of prevention and treatment of disease related to myeloid-derived suppressor cell and use thereof
WO2019221574A1 (en) * 2018-05-14 2019-11-21 다이노나(주) Use for preventing and treating myeloid-derived suppressor cell-related diseases

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0098162A2 (en) 1982-06-30 1984-01-11 Yuji Matsuoka Monoclonal antibodies specific to carcinoembryonic antigen
US5225541A (en) 1987-03-05 1993-07-06 Peralta Cancer Research Institute Composition containing CEA/NCA-specific monoclonal antibody XMMBR-B14 conjugated to a detectable moiety and a kit containing the antibody
US20060088521A1 (en) 2004-03-27 2006-04-27 University Of Arizona Composition and method for cancer treatment

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0098162A2 (en) 1982-06-30 1984-01-11 Yuji Matsuoka Monoclonal antibodies specific to carcinoembryonic antigen
US5225541A (en) 1987-03-05 1993-07-06 Peralta Cancer Research Institute Composition containing CEA/NCA-specific monoclonal antibody XMMBR-B14 conjugated to a detectable moiety and a kit containing the antibody
US20060088521A1 (en) 2004-03-27 2006-04-27 University Of Arizona Composition and method for cancer treatment

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018088877A2 (en) 2016-11-14 2018-05-17 다이노나(주) Antibody binding specifically to cd66c and use thereof

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