KR101195112B1 - The Method for isolating and cultivating Tumor endothelial cell - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 조직으로부터 암 특이적 혈관내피세포를 분리하여 배양하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 VEGF 및 bFGF를 포함하는 마트리겔 (matrigel)을 이용하여, 경제적이면서도 간편하고 효율적으로 암혈관내피세포를 분리하여 대량 배양하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for separating and culturing cancer-specific vascular endothelial cells from cancer tissue, and more specifically, by using a Matrigel (matrigel) containing VEGF and bFGF, cancer vascular endothelial cells economically and simply and efficiently It relates to a method of separating and culturing mass.
Description
본 발명은 암조직으로부터 암혈관내피세포를 간단하면서 경제적이고 효율적인 방법으로 분리하여 대량 배양하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for separating large-scale culture of cancer vascular endothelial cells from cancer tissue in a simple, economical and efficient manner.
정상조직의 혈관구조는 외막 (tunica externa; connective tissue), 중막 (tunica intima; connective muscle cells), 그리고 내피세포로 이루어진 내막 (tunica intima; endothelial cells)으로 되어있으며 모세혈관은 내피세포와 기저막 (basement membrane)으로 되어 있는데, 이중에서 내피세포로 이루어져있는 내막이 항암제와 방사선에 대한 민감도가 가장 크다고 보고되어있다. The vascular structure of normal tissue consists of the outer membrane (tunica externa; connective tissue), the media (tunica intima; connective muscle cells), and the endothelial cells (tunica intima; endothelial cells), and the capillaries are endothelial and basement membrane (basement). It is reported that the inner membrane consisting of endothelial cells has the highest sensitivity to anticancer drugs and radiation.
반면, 암 조직의 혈관구조는 외막과 중막이 없으며 오로지 혈관내피세포로만 구성되어 있어 구조적으로 매우 불안전할 뿐만 아니라 혈관이 불규칙적으로 확장되어 있고 급한 굴곡이 존재하기 때문에 혈류 자체가 불안정하다. 이러한 암 조직의 혈관은 불규칙한 구조를 통해 정상조직의 동맥으로 연결하여 암 조직에 영양분과 산소를 공급하게 된다. On the other hand, the vascular structure of cancer tissue is not composed of outer membrane and mesial membrane and consists only of vascular endothelial cells, which is not only structurally unstable, but also unevenly expanded blood vessels and unstable blood vessels. The blood vessels of the cancer tissues are connected to arteries of normal tissues through irregular structures to supply nutrients and oxygen to the cancer tissues.
암이 성장함에 따라서 암 조직 속의 혈관의 수와 길이 역시 증가하게 된다. 그 결과 동일한 동맥으로부터 공급받는 혈액의 양에 한계가 있기 때문에 암 조직 속의 혈압은 저하되어 혈류의 속도가 늦어지거나 심할 때는 혈류가 정지하든지 또는 혈류의 방향이 변하는 현상이 발생하며, 또한 암세포의 증식으로 인해 암 조직속의 압력 (interstitial fluid pressure)이 증가하여 혈관이 터지는 현상이 암 조직 내에서 종종 발생하게 된다. As cancer grows, the number and length of blood vessels in cancer tissues also increase. As a result, there is a limit to the amount of blood supplied from the same artery, so blood pressure in cancer tissues is lowered, and when the blood flow slows or worsens, the blood flow stops or the direction of the blood flow changes. As a result, the interstitial fluid pressure increases, causing blood vessels to burst.
이와 같은 불균형 및 원활하지 못한 혈류 때문에 암조직 내의 환경은 저산소 상태로 되는데 이러한 산소결핍은 항암제 및 방사선에 대한 저항성의 큰 원인이 되며, 이러한 산소결핍증은 암세포에 원활한 영양분 공급을 위해 과도한 혈관신생과정을 촉진시킨다.Due to this imbalance and poor blood flow, the environment in cancer tissues becomes hypoxic. This oxygen deficiency is a major cause of resistance to anticancer drugs and radiation, and this oxygen deficiency causes excessive angiogenesis to provide nutrients to cancer cells. Promote
이와 같이 암 혈관내피세포는 구조적 및 환경적으로 정상 혈관내피세포와 많은 차이점이 있을 뿐만 아니라 특히 유전적으로도 다르다는 것이 분자생물학적으로 증명되어 있다. As such, cancer vascular endothelial cells are structurally and environmentally different from normal vascular endothelial cells, and in particular genetically proven to be genetically different.
이러한 차이점에도 불구하고, 종래부터 암과 관련된 혈관신생과정연구는 대부분 정상 혈관내피세포주 (e. g. HUVEC, HDMEC, BAEC)를 사용하여 수행 되어왔는데, 이와 같은 정상 혈관내피세포주를 사용한 이유는, 암 조직으로부터 암혈관내피세포의 분리가 어려우며 효율성과 비용면에서 상당히 비경제적이기 때문이다. Despite these differences, conventional angiogenesis studies involving cancer have been conducted using normal vascular endothelial cell lines (eg HUVEC, HDMEC, BAEC). The reason for using such normal vascular endothelial cell lines is from cancer tissues. It is difficult to separate cancer vascular endothelial cells and it is very economical in terms of efficiency and cost.
현재까지 수행되고 있는 암 조직으로부터 암혈관내피세포의 분리는 암 세포주를 이식한 마우스로부터 적출한 종양조직을 이용하거나 암환자들로부터 적출된 많은 암조직들을 잘게 분쇄하여 혈관내피세포 특이적 단백질에 대한 항체를 이용한 방법을 통해서 이루어지고 있다. Separation of cancer vascular endothelial cells from cancer tissues to date has been performed by using tumor tissues extracted from mice transplanted with cancer cell lines or by pulverizing many cancer tissues extracted from cancer patients for vascular endothelial specific proteins. It is done through the method using an antibody.
종래의 암특이적 혈관내피세포의 분리방법의 일례로, 혈관내피세포를 특이적으로 인지하는 단백질 (CD105, CD31, CD34, CD146)에 대한 항체와 자석 비드(magnetic bead)를 이용한 것이 있다. 이와 같은 기존의 방법은 많은 암조직이 필요로 하며 분리과정에 많은 항체와 자석 비드를 사용하는 복잡한 과정을 거쳐야 되기 때문에 효율 측면에서 상당히 비경제적이다. As an example of a conventional method for isolating cancer-specific vascular endothelial cells, there is a method using magnetic beads and antibodies to proteins (CD105, CD31, CD34, CD146) that specifically recognize vascular endothelial cells. This conventional method requires a lot of cancer tissue and is very uneconomical in terms of efficiency because it requires a complex process using many antibodies and magnetic beads in the separation process.
게다가, 이와 같은 분리방법은 복잡한 과정과 기술상의 문제들로 인해 암혈관내피세포가 유실되는 경우가 많으며, 최종적으로 분리된 혈관내피세포 역시 그 수가 극히 한정되어 있어 특성 연구 수행에 어려움이 많기 때문에 이와 같이 혈관내피세포의 분리방법은 효율성과 비용 면에서 상당히 비경제적이다.
In addition, such separation methods often cause cancerous vascular endothelial cells to be lost due to complex processes and technical problems, and finally, the number of finally isolated vascular endothelial cells is extremely limited. Likewise, the method of separating vascular endothelial cells is quite uneconomical in terms of efficiency and cost.
이에 본 발명에서는 암 조직으로부터 암혈관내피세포의 분리를 위해, 기존의 항체 및 자석 비드와 같은 복잡하면서도 비용이 요구되는 과정을 배제하면서, 보다 간편하고 싼 비용으로 암혈관내피세포를 대량생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
Therefore, in the present invention, for the separation of cancer vascular endothelial cells from cancer tissue, while excluding complex and expensive processes such as conventional antibodies and magnetic beads, mass production of cancer vascular endothelial cells at a simpler and lower cost To provide a method.
본 발명은 간편하고 경제적이면서도 효율적으로, 암 조직으로부터 암혈관내피세포를 분리하여 대량배양할 수 있는 방법을 제공하고자 한다. 본 발명은 상기의 방법에 의해 유방암, 대장암 등 여러 종류의 암조직에서 혈관내피세포를 분리하여 각 암종에 따른 암혈관내피세포의 기능 연구의 수행에 도움을 주고자 한다.
The present invention is to provide a method that can be easily and economically and efficiently, can be isolated and mass culture of cancer vascular endothelial cells from cancer tissue. The present invention is to help vascular endothelial cells in various types of cancer tissues, such as breast cancer, colorectal cancer, by the method described above to help carry out a functional study of cancer vascular endothelial cells according to each carcinoma.
본 발명은 암 조직의 배양에 있어서 마트리겔 (matrigel)을 이용하는 것을 특징으로 하는 암혈관내피세포의 분리방법을 제공한다.
The present invention provides a method for separating cancer vascular endothelial cells, characterized in that the use of Matrigel (matrigel) in the culture of cancer tissue.
상기 마트리겔을 이용하는 것은Using the Matrigel
(가) 암 조직에 마트리겔을 도포하는 단계;(A) applying Matrigel to cancerous tissue;
(나) 마트리겔이 도포된 조직을 혈관내피세포 배양액에서 배양하는 단계; 및(B) culturing the Matrigel-coated tissue in vascular endothelial cell culture; And
(다) 상기 (나)단계에서 얻어진 혈관 내피세포 군에서 단일세포로 분리하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법이 적절할 수 있다.
(C) separating into a single cell from the vascular endothelial cell group obtained in the step (b); Separation method characterized in that it comprises a may be appropriate.
상기 마트리겔은 VEGF 및/또는 bFGF이 포함될 수 있다.The Matrigel may comprise VEGF and / or bFGF.
상기 (나) 단계에서의 배양액은 ECM 배지를 사용할 수 있다.Culture medium in the step (b) may be used ECM medium.
상기 (다) 단계에서 혈관 내피세포에 트립신 및 EDTA를 첨가하여 단일세포로 분리할 수 있다.
In the step (c), trypsin and EDTA may be added to vascular endothelial cells to separate them into single cells.
본 발명은 상기와 같이 분리된 암혈관내피세포를 ECM 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 암혈관내피세포의 배양방법을 제공한다.
The present invention provides a method for culturing cancer vascular endothelial cells comprising culturing the isolated cancer vascular endothelial cells in ECM medium.
본 발명에 따르면 암 조직으로부터 암 특이적 혈관내피세포의 간편하면서도 싼 가격으로 효율적으로 분리하여 배양할 수 있다.According to the present invention, cancer-specific vascular endothelial cells can be efficiently isolated and cultured from cancer tissue at a simple and inexpensive price.
따라서, 본 발명에 의해 분리된 암 특이적 혈관내피세포는 암의 미세환경 (microenvironment)등 암 생물학을 연구하는데 이용될 수 있으며 무엇보다 암혈관내피세포에 의해 발생하는 혈관신생과정을 연구함으로써 암혈관계를 공략할 수 있는 혈관신생억제제 개발에 활용될 수 있다.
Therefore, the cancer-specific vascular endothelial cells isolated by the present invention can be used to study cancer biology such as the microenvironment of cancer, and above all, the cancer vascular system by studying the angiogenesis process caused by cancer vascular endothelial cells. Can be used to develop angiogenesis inhibitors that can target.
도 1a은 마트리겔 (matrigel)을 이용한 암조직으로부터 암혈관내피세포 분리 모식도를 나타낸 것이며, 도 1b는 시간 의존적으로 조직으로부터 혈관내피세포가 뻗어나오는 것을 확인한 것이다.
도 2a는 혈관내피세포들을 단일세포로 만들어 배양한 것이며, 도 2b는 양성대조군인 HDMEC와 암혈관내피세포를 immunostaining의 과정을 통하여 FACS 분석을 수행한 것이다.
도 3a는 양성대조군인 HDMEC과 암혈관내피세포의 세포이동을 wound healing assay으로 관찰한 것이며, 도 3b는 양성대조군인 HDMEC과 암혈관내피세포의 세포이동을 분석한 것이다.
도 4a는 양성대조군인 HDMEC과 암혈관내피세포의 혈관형성을 확인한 것이고, 도 4b는 양성대조군인 HDMEC과 암혈관내피세포의 혈관형성을 분석한 것이다.
도 5는 24시간 간격으로 72시간까지 분리된 암혈관내피세포의 세포수를 counting하여 세포성장 곡선과 세포분열 시간 (Doubling time)을 분석한 것으로, 도 5a는 본 발명의 암혈관내피세포를, 도 5b는 양성대조군을 나타낸 것이다.Figure 1a shows a schematic diagram of the separation of cancer vascular endothelial cells from cancer tissue using a Matrigel, Figure 1b confirms that the vascular endothelial cells extend from the tissue in a time-dependent manner.
Figure 2a is a culture of vascular endothelial cells made of a single cell, Figure 2b is a FACS analysis was performed through the process of immunostaining positive control HDMEC and cancer vascular endothelial cells.
FIG. 3a shows the cell migration of HDMEC and cancer vascular endothelial cells in the positive control group, and FIG. 3b shows the cell migration of HDMEC and cancer vascular endothelial cells in the positive control group.
Figure 4a is confirmed the angiogenesis of the positive control HDMEC and cancer vascular endothelial cells, Figure 4b is an analysis of the angiogenesis of the positive control HDMEC and cancer vascular endothelial cells.
5 is a cell growth curve and cell division time (Doubling time) analysis by counting the number of cells of cancer vascular endothelial cells separated by 72 hours at intervals of 24 hours, Figure 5a shows the cancer vascular endothelial cells of the present invention, Figure 5b shows a positive control group.
본 발명은 암 조직의 배양에 있어서 마트리겔 (matrigel)을 이용하는 것을 특징으로 하는 암혈관내피세포의 분리방법을 제공한다.The present invention provides a method for separating cancer vascular endothelial cells, characterized in that the use of Matrigel (matrigel) in the culture of cancer tissue.
다른 한편으로, 본 발명은 상기와 같이 분리된 암혈관내피세포를 ECM 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 암혈관내피세포의 배양방법을 제공한다.
On the other hand, the present invention provides a method for culturing cancer vascular endothelial cells comprising culturing the isolated cancer vascular endothelial cells in ECM medium.
본 발명자들은 종래의 방법에 따른 암 특이적 혈관내피세포의 분리는 다량의 조직과 시약이 필요로 하며 순수하게 분리된 혈관내피세포의 수가 적기 때문에 실험을 수행하는데 어려움이 많은 단점이 있음을 발견하고, 보다 간편하면서도 저렴한 비용으로 암 조직으로부터 암혈관내피세포를 분리하여 배양하는 방법을 고심하던 중, 마트리겔을 이용할 경우 암조직으로부터 암혈관내피세포를 경제적이면서도 간편하고 효율적으로 분리하여 대량배양할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
The present inventors found that the isolation of cancer-specific vascular endothelial cells according to the conventional method requires a large amount of tissues and reagents and has a disadvantage in that the experiments are difficult because the number of purely isolated vascular endothelial cells is small. While trying to isolate and culture cancer vascular endothelial cells from cancer tissues more easily and at a lower cost, Matrigel can be used to economically and easily and efficiently separate cancer vascular endothelial cells from cancer tissues. It was confirmed that the present invention was completed.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 암 조직의 배양에 있어서 마트리겔 (matrigel)을 이용하는 것을 특징으로 하는 암혈관내피세포의 분리방법을 제공한다.The present invention provides a method for separating cancer vascular endothelial cells, characterized in that the use of Matrigel (matrigel) in the culture of cancer tissue.
종래에 보고된 암 혈관내피세포 분리 방법은 다량의 암 조직을 파쇄하여 혈관내피세포 특이적 단백질에 대한 항체를 이용한 것으로, 이와 같은 분리방법은 인위적인 파쇄과정을 통하여 복잡한 과정을 거치는 방법이기 때문에 최종적으로 분리되는 암혈관내피세포의 수량이 극히 한정적이었고, 분리된 암혈관내피세포의 수율을 높이기 위해서는 다량의 조직 및 많은 양의 항체가 필요로 하기 때문에 복잡하면서도 상당히 비경제적인 방법이다. Conventionally reported cancer vascular endothelial cell separation method using an antibody to the vascular endothelial cell-specific protein by breaking down a large amount of cancer tissue, such separation method is a method that finally undergoes a complex process through an artificial crushing process The amount of isolated cancerous endothelial cells was extremely limited, and it is a complicated and considerably economical method because a large amount of tissue and a large amount of antibodies are required to increase the yield of isolated cancerous endothelial cells.
그러나 본 발명의 마트리겔을 이용하면 간편하면서도 적은 비용으로 소량의 암조직에서 암 특이적 혈관내피세포를 대량생산할 수 있다.
However, using the Matrigel of the present invention, it is possible to mass-produce cancer-specific vascular endothelial cells in a small amount of cancer tissue at a simple and low cost.
상기 마트리겔을 이용하는 것은 특별히 한정되는 것은 아니나, 하기 단계를 포함하는 것이 적절할 수 있다. Using the Matrigel is not particularly limited, but may include the following steps.
(가) 암 조직에 마트리겔을 도포하는 단계;(A) applying Matrigel to cancerous tissue;
(나) 마트리겔이 도포된 조직을 혈관내피세포 배양액에서 배양하는 단계; 및(B) culturing the Matrigel-coated tissue in vascular endothelial cell culture; And
(다) 상기 (나)단계에서 얻어진 혈관 내피세포 군에서 단일세포로 분리하는 단계.
(C) separating into a single cell from the vascular endothelial cell group obtained in step (b).
본 발명에서 사용하는 암조직은 분리하길 원하는 암혈관내피세포의 종류에 따라 결정되는 것으로, 유방암조직, 폐암조직, 결장암조직, 대장암조직 등 그 종류에 있어서 한정되지 않는다.The cancer tissue used in the present invention is determined according to the type of cancer vascular endothelial cells to be separated, and is not limited to those types such as breast cancer tissue, lung cancer tissue, colon cancer tissue, and colon cancer tissue.
본 발명의 마트리겔 내에는 암 조직밖으로 자연스럽게 암혈관내피세포가 뻗어 나오도록 유도함과 동시에 암혈관내피세포를 성장시킬 수 있는 환경인자들이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 VEGF 및 bFGF로 구성된 군에서 선택된 것이 포함될 수 있다.The Matrigel of the present invention may include environmental factors capable of inducing cancer blood endothelial cells to naturally extend out of cancer tissues and at the same time growing cancer blood endothelial cells, preferably selected from the group consisting of VEGF and bFGF. May be included.
본 발명에서 사용되는 마트리겔의 일례로, 라민 (laminin), 타입IV 콜라겐 (typeIV collagen), 엔탁틴/ 니도젠 (entactin/nidogen), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (heparan sulfate proteoglycans), VEGF, bFGF 그리고 성장인자 (growth factor)들이 함유된 마트리겔을 사용할 수 있다.
Examples of matrigel used in the present invention include laminin, typeIV collagen, enactin / nidogen, heparan sulfate proteoglycans, VEGF, bFGF and growth Matrigel containing growth factors can be used.
상기 (가)단계에서, 암 조직에 마트리겔을 도포하는 단계는 특별히 한정되는 것은 아니며, 암 조직에 마트리겔, 바람직하게는 VEGF 및/또는 bFGF가 포함된 마트리겔을 도포하는 것이 적절할 수 있다.In the step (a), the step of applying the Matrigel to the cancer tissue is not particularly limited, it may be appropriate to apply the Matrigel to the cancer tissue, preferably Matrigel containing VEGF and / or bFGF.
본 발명의 일례로, 유방암 조직을 VEGF 및/또는 bFGF가 포함된 마트리겔로 도포한 다음 실온에서 1분 내지 60분, 바람직하게는 5분 내지 20분간 배양시켜 마트리겔을 굳게 할 수 있다. 액체상태의 마트리겔을 완전히 안 굳히고 배지를 첨가할 경우 도포된 암조직이 마트리겔로부터 떨어져 나가는 경우가 생기기 때문에 최종적으로 혈관내피세포 분리에 어려움이 생길 수 있다. 따라서 상기 시간은 액체상태의 마트리겔을 완전하게 굳히는 데 필요한 적절한 시간일 수 있다.
In one example of the present invention, breast cancer tissue may be applied with Matrigel containing VEGF and / or bFGF and then incubated for 1 to 60 minutes, preferably 5 to 20 minutes at room temperature to harden the Matrigel. Completely solidifying the liquid Matrigel and adding the medium may cause difficulty in separating vascular endothelial cells because the applied cancer tissue may be separated from the Matrigel. Thus, this time may be an appropriate time required to completely solidify the liquid Matrigel.
상기 (나) 단계에서의 마트리겔이 도포된 암 조직을 배양하는 배지의 종류는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 ECM 배지 (endothelial cell medium)를 사용하여 배양할 수 있다. 상기 ECM 배지에는 VEGF 및/또는 bFGF가 포함될 수 있다. 본 발명의 일례로,태아소혈청 (Fetal bovine serum), 항체 (antibiotics), bFGF 및/또는 VEGF를 포함된 ECM 배지를 사용할 수 있다.The type of the medium for culturing the cancer tissue to which the Matrigel is applied in step (b) is not particularly limited, but may be preferably cultured using ECM medium (endothelial cell medium). The ECM medium may include VEGF and / or bFGF. As an example of the present invention, ECM medium containing fetal bovine serum, antibodies (antibiotics), bFGF and / or VEGF can be used.
상기 배양시간은 특별히 한정된 것은 아니나, 7일 내지 30일, 바람직하게는 10일 내지 20일간 배양할 수 있다. 상기 배양시간이 7일보다 적을 때는 혈관내피세포에서 sprouting이 일어나지 않거나 너무 미약할 수 있으며, 30일 이상에서는 sprouting되는 혈관내피세포가 아주 많아질 수 있기 때문에 혈관내피세포의 변형이 발생하여 건강하지 못한 혈관내피세포가 분리될 가능성이 있다. 따라서 상기 암조직으로부터 sprouting되는 건강한 혈관내피세포의 수를 얻기 위해 상기 배양일은 적절할 수 있다. 또한, 이때 1 내지 5일, 바람직하게는 2일 내지 3일 간격으로 배지를 교환해 주는 것이 적절할 수 있다. 이는 조직으로부터 sprouting되는 혈관내피세포가 증가할수록 배지 내에 존재하는 세포성장에 필요한 영양분이 쉽게 고갈되기 때문에 충분한 영양분을 혈관내피세포에 제공하기 위해서 상기 간격으로의 배지의 교환이 필요할 수 있기 때문이다.
The incubation time is not particularly limited, but may be incubated for 7 days to 30 days, preferably 10 days to 20 days. When the incubation time is less than 7 days, sprouting may not occur or may be too weak in vascular endothelial cells, and since 30 days or more sprouting vascular endothelial cells may increase so much that vascular endothelial cells may be deformed and unhealthy. There is a possibility of vascular endothelial cells being isolated. Thus, the culture day may be appropriate to obtain the number of healthy vascular endothelial cells sprouting from the cancer tissue. Also, At this time, it may be appropriate to change the medium at intervals of 1 to 5 days, preferably 2 to 3 days. This is because as the vascular endothelial cells sprouted from the tissues are easily depleted of nutrients necessary for cell growth present in the medium, the medium may need to be exchanged at such intervals to provide sufficient nutrients to the vascular endothelial cells.
상기 (다) 단계에서 단일세포로 분리하는 방법은 특별히 한정된 것은 아니나, 혈관 내피세포에 트립신 (Trypsin) 및 EDTA를 첨가하여 단일세포로 분리할 수 있다.The method for separating into single cells in step (c) is not particularly limited, but may be separated into single cells by adding trypsin and EDTA to vascular endothelial cells.
본 발명의 트립신은 그 종류에 있어 특별히 한정된 것은 아니며, 트립신은 포유동물 유래의 트립신 (예를 들어, 돼지 유래의 트립신(porcine trypsin)) 또는 재조합 방법에 의해 제조된 트립신을 모두 사용할 수 있다. The trypsin of the present invention is not particularly limited in its kind, and the trypsin may be either a mammal-derived trypsin (eg, porcine trypsin) or a trypsin produced by a recombinant method.
또한, 본 발명의 분리방법에 사용되는 상기 EDTA는 그 종류에 있어 특별히 한정된 것은 아니며, 에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산의 2 나트륨염 (ethylenediaminetetraacetate disodium), 또는 에틸렌디아민테트라아세트산의 2 나트륨염 2 수화물 (ethylenediaminetetraacetate disodium dihydrate) 형태를 포함할 수 있다.In addition, the said EDTA used for the separation method of this invention is not specifically limited in the kind, The disodium salt of ethylenediaminetetraacetate disodium, or
상기 트립신 및 EDTA는 멸균 생리식염수에 용해시켜 처리할 수 있으며, 염화나트륨 수용액에 용해시켜 처리할 수도 있다. 또한, 상업적으로 유용한 트립신-EDTA 용액을 희석하여 처리할 수도 있다
The trypsin and EDTA can be treated by dissolving in sterile physiological saline, and can also be treated by dissolving in aqueous sodium chloride solution. Alternatively, commercially available trypsin-EDTA solutions can be diluted for treatment.
본 발명은 상기에 따라 분리된 암혈관내피세포를 ECM 배지 (endothelial cell medium)에서 배양하는 것을 포함하는, 암혈관내피세포의 배양방법을 제공한다. 이때, 상기 ECM 배지는 VEGF 및/또는 bFGF를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.The present invention provides a method for culturing cancer vascular endothelial cells comprising culturing the cancer vascular endothelial cells isolated according to the above in ECM medium (endothelial cell medium). In this case, the ECM medium may preferably include VEGF and / or bFGF.
본 발명의 일례로, 상기 ECM배지는 태아소혈청 (Fetal bovine serum), 항체 (antibiotics), bFGF 및/또는 VEGF를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the ECM medium may include fetal bovine serum, antibodies (antibiotics), bFGF and / or VEGF.
본 발명에서 분리되어 배양된 암혈관내피세포는 양성대조군인 HDMEC 만큼 활발한 세포이동과 혈관형성 (tube formation)을 시키며 유사한 세포성장 및 세포분열을 나타낸다.Cancer vascular endothelial cells isolated and cultured in the present invention is as active as the positive control HDMEC cell migration and angiogenesis (tube formation) and shows similar cell growth and cell division.
상기 방법에 의해 분리하여 배양된 암혈관내피세포는, 인위적인 파쇄과정 등을 거치지 않아 유실되는 수가 적고, 소량의 암 조직으로도 분리가 가능하여 효율적이면서도 경제적일 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 마트리겔을 이용하면 간편하면서도 적은 비용으로 소량의 암 조직에서 암 특이적 혈관내피세포를 대량배양할 수 있으므로, 암 생물학 연구 및 혈관신생억제제 개발에 사용되어 암 치료제 개발에 발판이 될 것으로 사료된다.
Cancer vascular endothelial cells separated and cultured by the above method are less likely to be lost due to an artificial crushing process, and can be separated into a small amount of cancer tissue, thereby being efficient and economical. As such, the Matrigel of the present invention can be used to cultivate large amounts of cancer-specific vascular endothelial cells in a small amount of cancer tissue at a simple and low cost. Thus, it is used for cancer biology research and development of angiogenesis inhibitors to develop cancer therapeutics. This is believed to be.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예 및 실험예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예, 및 실험예에 의해 제한되지 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples. Since these Examples and Experimental Examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not limited by these Examples and Experimental Examples.
<< 실시예Example >>
실시예Example 1. 재료 및 시약 1. Materials and reagents
본 발명에 사용한 Matrigel은 BD Biosciences (Bedford, MA, USA)에서 구입하였고, VEGF 및 bFGF는 Sigma-Aldrich Corp (St. Louis, Mo, USA), 그리고 10% 태아소혈청 (Fetal bovine serum), 항체 (antibiotics) 및 bFGF가 첨가된 ECM (endothelial cell medium) 배지는 ScienCell Reseach Laboratories (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 또한, FITC-Anti-CD105 antibody는 BioLegend에서 구입하였으며, Anti-SMA (smooth muscle actin) antibody는 Santa-Cruz (Santa-Cruz, CA, USA)에서 구입하였고 Texas-Red-labeled-anti-rabbit anibody는 Molecular Prove (Eugene, Or, USA)에서 구입하였다.
Matrigel used in the present invention was purchased from BD Biosciences (Bedford, MA, USA), VEGF and bFGF were obtained from Sigma-Aldrich Corp (St. Louis, Mo, USA), and 10% Fetal bovine serum, antibody. (endothelial cell medium) with antibiotics and bFGF was purchased from ScienCell Reseach Laboratories (San Diego, CA, USA). FITC-Anti-CD105 antibody was purchased from BioLegend, Anti-SMA (smooth muscle actin) antibody was purchased from Santa-Cruz (Santa-Cruz, CA, USA), and Texas-Red-labeled-anti-rabbit anibody was It was purchased from Molecular Prove (Eugene, Or, USA).
실시예Example 2. 2. 암혈관Cancer vessel 내피세포의 분리. Isolation of Endothelial Cells.
0.3cm3 크기의 사람 유방암 조직을 60mm dish에 놓은 후, 사람 유방암 조직을 50ng/ml의 VEGF 혹은 bFGF가 포함된 matrigel (50㎕)로 도포한 다음 실온에서 약 10분간 incubation시켜 matrigel이 굳게 만들었다. ECM 배지를 약 5ml을 첨가하여 3주간 37℃, 5% CO2 incubator안에서 배양하면서, 배양 중에 3일 간격으로 배지 교환을 해 주었다. 2주 후에 matrigel 안에 sprouting된 혈관내피세포를 확인한 다음, 사람 유방암조직이 포함된 matrigel을 1.5ml tube에 옮기고, matrigel을 녹이기 위해서 1.5ml tube을 얼음속에 약 10분간 incubation시켰다. matrigel이 녹은 것을 확인한 다음, 조직을 제거하고 1.5ml tube안에 있는 혈관내피세포에 Trypsin-EDTA, 100㎕을 첨가하여 파이펫팅으로 single 세포로 만들고, single 세포로 된 암 특이적 혈관내피세포를 60mm dish에 옮긴 뒤 ECM 배지를 첨가하여 assay를 수행할만한 계체수가 될 때까지 37℃, 5% CO2 incubator안에서 배양하였다.
0.3cm 3 After placing human breast cancer tissues of size in a 60 mm dish, human breast cancer tissues were applied with matrigel (50 μl) containing 50 ng / ml of VEGF or bFGF and incubated at room temperature for about 10 minutes to harden the matrigel. About 5 ml of ECM medium was added and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 3 weeks, and medium exchange was performed every 3 days during the culture. After two weeks, the vascular endothelial cells sprouted in the matrigel were confirmed. Then, the matrigel containing human breast cancer tissue was transferred to a 1.5 ml tube, and the 1.5 ml tube was incubated for about 10 minutes on ice to dissolve the matrigel. After confirming that the matrigel was dissolved, the tissue was removed, and 100 μl of Trypsin-EDTA was added to the vascular endothelial cells in the 1.5 ml tube to pipette into single cells, and 60 mm dish of cancer-specific vascular endothelial cells consisting of single cells. After incubation with ECM medium was incubated in 37 ℃, 5% CO 2 incubator until the number of body water to perform the assay.
실시예Example 3. 3. IdentificationIdentification ofof endothelialendothelial cellscells
약 2 X 105 개의 암 특이적 혈관내피세포를 collagen이 coating된 60mm dish에 심은 후에 37℃, 5% CO2 incubator안에서 overnight 배양한 후, 24시간 후에 혈관내피세포들을 Trypsin-EDTA를 이용하여 harvest를 한 후 3.7% paraformaldehyde에 약 5분간 고정하였다. 고정된 혈관내피세포들을 washing buffer (2% FBS + 0.1% Sodium Azid in PBS)에 한번 washing한 후에 1st Antibody (anti-SMA)를 1:100 비율로 얼음위에서 1시간동안 반응시킨 다음, 혈관내피세포들을 washing buffer로 2번 washing하고, 2nd Antibody (Texa-Red-labeled-anti-rabbit antibody)를 1:200 비율로 얼음위에서 1시간동안 반응시켰다. 상기와 같이 2nd Antibody를 반응시킬 때 FITC-Anti-CD105 antiboy를 1:200비율로 첨가하여 같이 반응시켰고, 반응이 끝난 후, washing buffer로 2번 washing한 후에 혈관내피세포들을 Facs tube로 옮긴 다음, FACStar flow cytometry를 통하여 CD105와 SMA (smooth muscle actin)의 발현 정도를 분석하였다.
About 2
실시예Example 4. 4. MigrationMigration assayassay
암 특이적 혈관내피세포를 약 90% 이상의 confluence의 정도로 collagen이 coating된 60mm dish에 심은 후에 37℃, 5% CO2 incubator안에서 overnight 배양한 후, 배지를 제거한 다음 60mm dish의 바닥에 marker pen으로 한 줄로 표시하였다. 표시된 줄을 기준으로 세포들이 있는 면을 200㎕ 파이펫 팁을 이용하여 직각방향으로 세 개의 스크래치를 내어 세포들을 제거한 후, PBS로 한번 washing한 후 배지를 첨가하였다. 6, 12, 24시간의 간격으로 현미경하에서 image를 캡쳐하여 혈관내피세포의 migration되는 정도를 정량화하였다.
Cancer-specific vascular endothelial cells were planted in a collagen-coated 60mm dish with a degree of confluence of about 90% or more, incubated overnight in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C, and then the medium was removed. In line. Based on the indicated lines, cells were removed by three scratches at right angles using a 200 μl pipette tip, and then washed once with PBS, followed by adding medium. Images were captured under the microscope at intervals of 6, 12 and 24 hours to quantify the migration of vascular endothelial cells.
실시예Example 5. 5. TubeTube formationformation assayassay
30mm dish의 바닥을 200㎕의 Matrigel로 coating한 후 37℃에서 30분 동안 matrigel을 굳힌 후, 30mm dish에 약 2 X 105 개의 암 특이적 혈관내피세포를 심었다. 4시간에서 18시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator안에서 overnight 배양과 동시에 tube formation을 관찰하였는데, 각 관찰 시간마다 현미경하에서 image를 캡쳐하거나 staining Buffer를 이용해서 혈관내피세포를 염색하여 현미경하에서 tube의 길이 및 면적을 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
After coating the bottom of a 30 mm dish with 200 μl of Matrigel, the matrigel was hardened at 37 ° C. for 30 minutes, and about 2 X 10 5 cancer specific vascular endothelial cells were planted in the 30 mm dish. Tube formation was observed simultaneously with overnight incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 4 to 18 hours.Each time was captured by capturing an image under a microscope or staining vascular endothelial cells using a staining buffer. Length and area were analyzed using software.
실시예Example 6. 6. CellCell growthgrowth countingcounting
약 2 X 105 개의 암 특이적 혈관내피세포를 collagen이 coating된 60mm dish에 심은 후에 37℃, 5% CO2 incubator안에서 overnight 배양하였다. 24, 48, 72시간 간격으로 혈관내피세포들을 Trypsin-EDTA를 이용하여 harvest를 한 후 세포가 포함된 배지와 Trypan Blue를 1:1 비율로 썩은 다음, hemacytometer위에 loading한 다음 현미경하에서 세포수를 counting한다. counting 값을 분석하여 혈관내피세포의 doubling time을 계산하였다.
About 2
<< 실험예Experimental Example 및 결과> And results>
실험예 1. 사Experimental Example 1 람유방암 조직으로부터 From ram breast cancer tissue 암혈관내피세포Cancer vascular endothelial cells 분리 detach
유방암 환자의 암 조직을 약 0.3 cm3의 크기로 절단하여 60mm dish에 놓은 후에 50ng/ml의 recombinant VEGF 혹은 bFGF가 들어간 약 50 ㎕의 matrigel로 조직을 도포하였다. matrigel로 도포된 조직은 혈관내피세포 배양액을 첨가한 후에 약 2주 동안 배양한 후 관찰한 결과를 도1a에 나타내었다. The cancerous tissue of the breast cancer patient was cut into a size of about 0.3 cm 3 , placed in a 60 mm dish, and the tissue was applied with 50 ng of matrigel containing 50 ng / ml of recombinant VEGF or bFGF. The tissue coated with matrigel was incubated for about two weeks after the addition of the vascular endothelial cell culture medium, and the results of the observation were shown in FIG. 1A.
약 2주의 기간에 걸쳐 배양하는 동안 정상조직과 암조직으로부터 혈관내피세포의 줄기가 뻗어 나오는 것을 4일 간격으로 관찰한 결과 시간의존적으로 조직으로부터 matrigel로 뻗어 나오는 혈관내피세포가 증가함을 확인할 수 있었다 (도 2b).
After culturing for about two weeks, the stems of vascular endothelial cells emerged from normal tissues and cancerous tissues at four-day intervals. The vascular endothelial cells extending from the tissues to the matrigel increased in time. (FIG. 2B).
실험예 2. 분Experimental Example 2. Min 리된 Lee 암혈과내피세포의Of cancer and endothelial cells 확인 Confirm
약 2주 후에 암조직을 제거한 다음에 조직으로부터 뻗어 나온 혈관내피세포들은 Tripsin-EDTA를 사용하여 단일 세포로 만들어서 혈관내피세포 배양액 (ECM, Sceincell)으로 배양을 하였다 (도 2a). 배양된 혈관내피세포들을 사람 특이적 혈관내피세포의 biomarker인 CD105 항체 (antibody)로 immunostaining의 과정을 통하여 FACS 분석을 수행한 결과 분리된 세포들이 혈관내피세포인지를 분석하였다 (도 2b). 양성대조군 (Positive control)으로 상용화된 사람피부혈관내피세포주인 HDMEC (Human dermal endothelial cell)를 사용하였으며 조직내에 평활근세포 (smooth muscle cell)의 오염이 존재하는지를 평활근세포내의 특이적 actin 단백질인 SMA (Smooth muscle cell actin)를 인지하는 항체를 이용해서 확인하였다.
After about 2 weeks, the vascular endothelial cells extending from the tissues after removal of the cancerous tissues were made into single cells using Tripsin-EDTA and cultured with vascular endothelial cell culture (ECM, Sceincell) (FIG. 2A). FACS analysis was performed by immunostaining the cultured vascular endothelial cells with CD105 antibody, a biomarker of human specific vascular endothelial cells, and analyzed whether the isolated cells were vascular endothelial cells (FIG. 2B). Human dermal endothelial cell (HDMEC), a commercially available human skin vascular endothelial cell line, was used as a positive control group. SMA (Smooth), a specific actin protein in smooth muscle cells, was used to determine whether contamination of smooth muscle cells was present in tissues. Muscle cell actin) was confirmed using an antibody that recognizes.
하기 도 2에서 나타난 바와 같이, HDMEC보다는 낮지만 분리된 암혈관내피세포에서 CD105 항체를 처리하지 않는 군 (Ig G control)과 대조했을 때 CD105 항체를 처리한 군에서 CD105의 발현이 증가함을 관찰하였다. 또한, 평활근세포의 오염도를 SMA 항체로 조사하였을 때 오염도는 극히 낮음을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 2, the expression of CD105 was increased in the CD105 antibody treated group compared to the group treated with CD105 antibody (Ig G control), which was lower than HDMEC but was isolated from cancer vascular endothelial cells. It was. In addition, when the contamination of smooth muscle cells was examined with SMA antibody, the contamination was found to be extremely low.
실험예 3. 분리Experimental Example 3. Separation 된 Done 암혈관내피세포의Of cancerous endothelial cells 이동 move
혈관내피세포의 특징중 하나인 세포이동을 wound healing assay로 24시간후에 관찰하였다.
Cell migration, one of the characteristics of vascular endothelial cells, was observed 24 hours later by a wound healing assay.
하기 도 3에서 나타난 바와 같이, 양성대조군인 HDMEC 만큼 분리된 암혈관내피세포도 활발한 세포의 이동을 가진다는 것을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 3, it was found that cancer vascular endothelial cells separated by HDMEC, which is a positive control group, also had active cell migration.
실험예 4. 분Experimental Example 4. Min 리된 Lee 암혈관내피세포의Of cancerous endothelial cells 혈관형성 ( Angiogenesis ( TubeTube formationformation ) )
암혈관내피세포가 혈관을 형성하는지를 matrigel-based in vitro tube formation assay를 통해 확인하였다.
Whether the cancer endothelial cells form a vascular matrigel-based in It was confirmed by in vitro tube formation assay.
하기 도 4에서 나타난 바와 같이, 양성대조군인 HDMEC보다 암혈관내피세포가 tube formation network를 가장 잘 형성시키는 것을 알 수 있었다.
As shown in Figure 4, it was found that cancer vascular endothelial cells form the tube formation network best than the positive control HDMEC.
실험예 5. 분Experimental Example 5. Min 리된 Lee 암혈관내피세포의Of cancerous endothelial cells 세포 성장 곡선 ( Cell growth curve ( GrowthGrowth CurveCurve ))
24시간 간격으로 72시간까지 분리된 암혈관내피세포의 세포수를 counting하여 세포성장 곡선과 세포분열 시간 (Doubling time)을 분석하였다.
Cell growth curves and doubling time were analyzed by counting the number of cells of cancer vascular endothelial cells separated by 72 hours at 24 hour intervals.
하기 도 5에서 나타난 바와 같이, 양성대조군과 대비하여 암혈관내피세포 역시 정상적인 세포성장을 보이고 있으며 세포분열 시간은 약 23.8시간이며 24시간의 세포분열 시간을 보였던 양성대조군과 비교했을 때 비슷한 세포분열을 보임을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 5, cancer vascular endothelial cells also showed normal cell growth as compared to the positive control group, and the cell division time was about 23.8 hours, and similar cell division was observed when compared to the positive control group which showed the cell division time of 24 hours. I could see it.
Claims (6)
(가) 암 조직에 마트리겔을 도포하는 단계;
(나) 마트리겔이 도포된 조직을 혈관내피세포 배양액에서 배양하는 단계; 및
(다) 상기 (나)단계에서 얻어진 혈관 내피세포 군에서 단일세포로 분리하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.The method of claim 1,
(A) applying Matrigel to cancerous tissue;
(B) culturing the Matrigel-coated tissue in vascular endothelial cell culture; And
(C) separating into a single cell from the vascular endothelial cell group obtained in the step (b);
Separation method comprising a.
상기 마트리겔은 VEGF 및 bFGF로 구성된 군에서 선택된 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.The method of claim 1,
The Matrigel separation method comprising the one selected from the group consisting of VEGF and bFGF.
상기 (나) 단계에서의 배양액은 ECM (Endothelial Cell Medium) 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 분리방법.The method of claim 2,
The culture method in the step (b) is characterized in that the use of ECM (Endothelial Cell Medium) medium.
상기 (다) 단계에서 혈관 내피세포에 트립신 및 EDTA를 첨가하여 단일세포로 분리하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
The method of claim 2,
Separation method of the step (c) is characterized in that to separate into a single cell by adding trypsin and EDTA to the vascular endothelial cells.
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