KR101191649B1

KR101191649B1 - 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법 및 용도

Info

Publication number: KR101191649B1
Application number: KR1020100022521A
Authority: KR
Inventors: 유정수; 달판판댜
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2010-03-12
Publication date: 2012-10-17
Also published as: KR20110023707A

Abstract

본 발명은 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 위치선택적 합성공정을 이용하여 시스 이중치환 결과물을 생성하지 않으면서도 마일드한 반응조건에서 매우 우수한 수율로 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물을 제조할 수 있는 제조방법 및 상기 제조방법을 통해 제조된 신규한 이작용성 테트라아자 거대고리 화합물에 관한 것이다.

Description

이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법 및 용도{Manufacturing method of bifunctional tetraaza Macrocyclic Compounds and use thereof}

본 발명은 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 위치선택적 합성공정을 이용하여 시스 이중치환 결과물을 생성하지 않으면서도 마일드한 반응조건에서 매우 우수한 수율로 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물을 제조할 수 있는 제조방법 및 상기 제조방법을 통해 제조된 신규한 이작용성 테트라아자 거대고리 화합물 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.

N-기능기화 폴리아자마크로사이클(N-functionalized polyazamacrocycles)의 다양한 타입에 기초한 금속 복합체의 합성, 구조 및 특성에 대한 관심이 지난 수십 년 동안 크게 증가하고 있는데, 그 이유는 상기 물질들의 의학영상과 치료 분야(예컨대, 핵자기공명영상 조영제, 진단학적 방사능의약품 및 방사면역치료제)에 대한 잠재적인 응용성 때문이다¹ ^-3. 또한, 폴리아자마크로사이클의 알카리토금속 및 전이금속 복합체들은 NMR 초미세 이동제⁴, 분자발광 프로브⁵, DNA/RNA 절단제⁶, 분자 인식 및 촉매⁷로서 널리 이용된다. 특히, N-아세트산 팬던트 암(pendant arm)을 포함하는 사이클렌(Cyclen) 및 사이클람(Cyclam) 화합물, 예를 들면, DOTA⁸, DO2A⁹, TETA¹⁰, crossed bridged-DO2A (CB-DO2A)¹¹, crossed bridge-TE2A(CB-TE2A)^10,12및 이의 유도체들은 영상화 및 치료를 위한 이중기능기 킬레이트(bifunctional chelates: BFC)로 폭 넓게 연구되고 있다.

이들 BFCs의 금속 복합체들을 in vivo에서 이용하였을 때, 이 복합체들이 리간드 구조에 따라 다른 수준의 화학적 불활성화 및 열역학적 안정성을 나타내었다^13-16. 배위결합 되는 아세테이트 펜던트 암(pendent arm) 및 금속 이온들의 산화 상태에 따라 주로 결정이 되는 상기 금속 복합체들의 전체 전하는, 비-타겟팅 기관에서의 복합체의 제거 패턴 및 활성 흡수에 큰 영향을 나타내었다¹⁷. 이 복합체들이 구조와 in vivo에서의 물리적/생물학적 특성 간의 관련성은 사이클렌-계열의 BFCs 사례에서 잘 나타나 있다. 그러나 사이클렌 및 사이클람과의 구조적 유사성에도 불구하고, 사이클람을 기초로 하는 연구는 미미한 상태이다. 놀랍게도, TE2A가 1989년 최초로 합성되었는데도 불구하고, 단지 몇몇 TE2A의 금속 복합체만이 1990년대 초반에 추가적으로 보고되었을 뿐이다. 지금까지 가능성 있는 BFC로서 TE2A의 이용에 대한 체계적인 연구는 진행되지 못했다. ⁶⁴Cu-DO2A 복합체가 ⁶⁴Cu-DOTA¹⁵보다 빠르게 체외로 빠져나가고, TE2A 유도체인 CB-TE2A가 매우 안정한 Cu(Ⅱ) 복합체를 형성한다¹¹는 것을 고려할 때, TE2A에 대한 BFC로서의 연구가 진행되지 않았다는 것은 놀라운 사실이다.

우리가 알고 있는 한, Parker 등에 의하여 기술된 논문에서의 TE2A의 합성이 유일한 합성에 관련된 논문이다¹⁸. 이 합성 과정은 다른 치환된 사이클람 부산물과 함께 위치이성질체(cis 및 trans)의 동시 형성, 지루한 컬럼 정제 및 가혹한 반응조건에 의한 매우 낮은 수득율(16%)과 같은 많은 어려움으로 인하여 실제로 활용하는 데 많은 어려움이 있다. TE2A가 처음 보고된 지 20 여년이 경과하였지만, 원하지 않는 다른 위치이성질체 치환 생성물 없이 1,8-N,N-이중기능기화 사이클람(예를 들면, TE2A)의 위치선택적 합성을 하는 것은 화학자들에게 있어 아직까지 커다란 도전적 과제이다.

본 연구자들은 본 명세서에서 새로운 BFC들의 개발에 대한 일환으로서 효과적이고 간단한 TE2A의 합성 프로토콜을 제시하고 ⁶⁴Cu의 효과적인 킬레이트로서의 유용성을 기술한다¹⁷ ^,19.

최근 논문에서 in vivo에서 TETA 유사체들의 불안정성에 대하여 언급하고는 있지만, 생체 분자에 대한 구리 방사성핵종 표지를 하는데 있어서 가장 일반적으로 사용되고 있는 것 중의 하나가 TETA 유도체이다¹³.

또한, 최근에 Anderson 등은 영상 및 타겟 방사성치료를 위하여 생체분자에 구리 방사성핵종이 표지된 우수한 이중기능기 킬레이터 CB-TE2A의 합성에 대하여 보고 하였다.⁹ 그러나 다단계 반응 공정과 높은 온도(95℃)에서만 가능한 Cu-64의 방사성 동의원소 표지 조건은 열에 민감한 항체 및 생체거대분자를 표지하는데 걸림돌로 작용한다. 지난 몇 년 동안 킬레이터의 화학적 불활성화 및 열역학적 안정성 향상에도 불구하고, 여전히 널리 활용되지 못하고 있으며, 이로 인하여 in vivo에서 안정성이 보다 향상된 BFC들의 연구가 진행되고 있는 실정이다.

한편, 하기 반응식 1은 종래의 TE2A를 제조하는 방법을 나타내는 반응식이다. 반응식 1에서 확인할 수 있듯이, 사이클람을 출발물질로 하고 1, 8번 질소에 Ts를 결합시킨 후 나머지 질소부분에 CH₂CO₂Et를 결합시키고 여기에 산을 가하여 TE2A를 제조하였다. 그런데, 상술한 종래의 방법으로 TE2A를 제조하는 경우 최종수율이 16%에 불과하므로 제조비용 및 제조시간이 비약적으로 상승하는 문제가 있었다. 즉 TE2A는 원래 위치선택적 합성을 위한 핵심 중간체로 1,8-다이토실-사이클람을 통하여 합성하였다. 그러나 토실 클로라이드(tosyl chloride)를 사용한 사이클람의 트랜스 보호기는 매우 복잡한데, 이는 토실 클로라이드를 사용한 사이클람의 반응은 모든 가능한 이성질체를 형성하고 원하는 산물은 컬럼 정제법을 실시해야만 하는 문제가 발생하는 것이다. 따라서 사이클람에서부터 TE2A까지 보고된 전체 수율은 16%이나, 실제 실험결과는 보고된 것보다 훨씬 낮고 게다가 순수한 산물을 분리할 수가 없는 단점이 있었다.

[반응식 1]

나아가, 실제 테트라아자 거대고리 화합물을 핵의학 조영제 등으로 사용하기 위해서는 방사성 금속원소와 착물형성이 이루어져야 하는데 이 경우 방사성 금속원소의 반감기로 인해 사용가능기간이 매우 짧아지게 되므로, 실제 제품에는 테트라아자 거대고리 화합물에 생물활성물질을 부착한 형태로 생산된다(생물활성물질이 부착되지 않은 형태로 제품이 출시될 경우 병원등에서 생물활성물질을 직접 붙여야 하지만 이는 병원 등의 여건상 특수한 경우를 제외하고는 거의 불가능한 일이므로 실제 제품은 모두 테트라아자 거대고리 화합물에 생물활성물질을 부착한 형태로만 출시된다). 상기 생물활성물질을 부착된 테트라아자 거대고리 화합물을 병원 등에서 구입하여 방사성 금속원소와 착물을 형성시킨 뒤 조영제 및 방사성 치료제 등으로 사용하게 되는 것이다. 따라서 금속이온과의 착물형성온도가 높은 경우 결합된 생물활성물질(예 : 단백질)이 변성될 수 있으므로, 낮은온도에서 방사성 원소 표지 및 금속이온과의 착물형성을 할 수 있으면서, 동시에 조영제의 가장 중요한 요건인 체내 안전성을 갖는 것은 너무나도 중요한 문제이다. 그러나, 종래의 TE2A 제조방법에서는 TE2A와 금속이온을 배위결합하는 구성만 기재되어 있을 뿐 방사성 동위원소를 TE2A에 표지하고 그 안전성을 평가한 구성은 개시되지 않았다.

한편, Cross-bridged TE2A(CB-TE2A)는 DOTA와 TETA 같은 이전 킬레이트에 비해 매우 높은 역학적 안정성을 보여준다. 그러나 CB-TE2A는 구리 2가에 대한 좋은 킬레이트로서 한 가지 중요한 단점을 가지고 있다. 표지 조건이 좋지 않고 높은 온도(95 ℃)에서만 좋은 표지 수율을 보여주었다. 그러므로, 이작용기 킬레이트로서 CB-TE2A의 사용은 작은 분자의 표지로 제한되고, 항체와 같은 열에 민감한 생체물질은 CB-TE2A를 사용하여 방사성 구리 2가 이온을 표지할 수는 없다. CB-TE2A의 또 다른 단점은 리간드에 대한 접근용이성이다. 합성 절차가 다소 길고 (사이클람으로부터 6 과정) 전체 합성 시간은 적어도 한달이나 걸리는 치명적인 단점이 있어 이를 상용화하는데 큰 어려움이 있었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

1. V. Alexander, Chem. Rev. (Washington, D. C.), 1995, 95, 273-342. 2 .S. Liu, Adv. Drug Delivery Rev., 2008, 60, 1347-1370. 3. T. K. Nayak and M. W. Brechbiel, Bioconjugate Chem., 2009, 20, 825-841. 4. N. Bansal, M. J. Germann, V. Seshan, G. T. Shires, III, C. R. Malloy and A. D. Sherry, Biochemistry, 1993, 32, 5638-5643. 5. C. Li and W.-T. Wong, Chem. Commun. (Cambridge, U. K.), 2002, 2034-2035. 6. C. Wang, S. Choudhary, C. B. Vink, E. A. Secord and J. R. Morrow, Chem. Commun. (Cambridge), 2000, 2509-2510. 7. R. Reichenbach-Klinke and B. Koenig, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 2002, 121-130. 8. L. M. De Leon-Rodriguez and Z. Kovacs, Bioconjugate Chem., 2008, 19, 391-402. 9. J. Huskens, D. A. Torres, Z. Kovacs, J. P. Andre, C. F. G. C. Geraldes and A. D. Sherry, Inorg. Chem., 1997, 36, 1495-1503. 10. T. J. Wadas and C. J. Anderson, Nat. Protoc., 2006, 1, 3062-3068. 11. C. A. Boswell, X. Sun, W. Niu, G. R. Weisman, E. H. Wong, A. L. Rheingold and C. J. Anderson, J. Med. Chem., 2004, 47, 1465-1474. 12. E. H. Wong, G. R. Weisman, D. C. Hill, D. P. Reed, M. E. Rogers, J. S. Condon, M. A. Fagan, J. C. Calabrese, K.-C. Lam, I. A. Guzei and A. L. Rheingold, J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 10561-10572. 13. B. E. Rogers, C. J. Anderson, J. M. Connett, L. W. Guo, W. B. Edwards, E. L. C. Sherman, K. R. Zinn and M. J. Welch, Bioconjugate Chem., 1996, 7, 511-522. 14. R. Delgado, V. Felix, L. M. P. Lima and D. W. Price, Dalton Trans., 2007, 2734-2745. 15. T. M. Jones-Wilson, K. A. Deal, C. J. Anderson, D. W. McCarthy, Z. Kovacs, R. J. Motekaitis, A. D. Sherry, A. E. Martell and M. J. Welch, Nucl. Med. Biol., 1998, 25, 523-530. 16. A. Bianchi, L. Calabi, C. Giorgi, P. Losi, P. Mariani, D. Palano, P. Paoli, P. Rossi and B. Valtancoli, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 2001, 917-922. 17. J. Yoo, D. E. Reichert and M. J. Welch, J. Med. Chem., 2004, 47, 6625-6637. 18. I. M. Helps, D. Parker, J. R. Morphy and J. Chapman, Tetrahedron, 1989, 45, 219-226. 19. J. Yoo, D. E. Reichert and M. J. Welch, Chemical Communications (Cambridge, United Kingdom), 2003, 766-767. 20. R. Tripier, J.-M. Lagrange, E. Espinosa, F. Denat and R. Guilard, Chem. Commun. (Cambridge, U. K.), 2001, 2728-2729. 21. G. Royal, V. Dihaoui-Gindrey, S. Dahaoui, A. Tabard, R. Guilard, P. Pullumbi and C. Lecomte, Eur. J. Org. Chem., 1998, 1971-1975. 22. T. J. Wadas, E. H. Wong, G. R. Weisman and C. J. Anderson, Curr. Pharm. Des., 2007, 13, 3-16. 23. I. M. Helps, D. Parker, J. Chapman and G. Ferguson, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1988, 1094-1095. 24. J. Chapman, G. Ferguson, J. F. Gallagher, M. C. Jennings and D. Parker, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1992, 345-353. 25. J. D. Silversides, C. C. Allan and S. J. Archibald, Dalton Trans., 2007, 971-978. 26. L. A. Bass, M. Wang, M. J. Welch and C. J. Anderson, Bioconjugate Chem., 2000, 11, 527-532.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 비스-아미날(bis-aminal) 화합물의 1 및 8 위치에 존재하는 질소원소를 위치선택적으로 알킬화시켜 수율을 현저하게 향상시킬 수 있는 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 본 발명의 제조방법을 통해 제조되는 다양한 형태의 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 세번째 해결하려는 과제는 본 발명의 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물과 금속원소가 배위결합한 배위결합 화합물 및 그 용도를 제공하는 것이다.

상술한 첫번째 과제를 달성하기 위하여, (1) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 산화시켜 하기 화학식 2로 표시되는 비스아미날 화합물을 제조하는 단계, (2) 상기 비스아미날 화합물을 알킬화시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 보호기가 부착된 트랜스 화합물을 제조하는 단계 및 (3) 상기 보호기가 부착된 트랜스 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식에서 R은 각각 독립적으로 H 또는 C₁ _~5의 알킬기;

X₁ _, X₂는 각각 독립적으로 -C(R¹)m-COO-, CH₂PO₃H- 또는 -C(R¹)m-PO₃H-이고;

Y는 알킬기;

R¹은 각각 독립적으로 H; 또는 H, 이미드, 알데하이드. 카르복시기, 케톤, 니트로, 아미노, 숙신이미드, 말레이미드, 아미노옥실, 에스테르, N₃, 알킨, 및 NCS로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 성분(moiety)을 포함하는 C₀ _~7의 알킬, C₀ _~7의 알케닐, C₀ _~7의 알키닐, C₀ _~7의 아릴, C₀ _~7의 아실, C₀ _~7의 헤테로아릴 또는 C₀ _~7의 헤테로알킬; 및

n, m은 각각 독립적으로 R또는R¹부분이 공유결합하고 있는 탄소원자의 원자가를 충족시키는 0 내지 2 중 어느 하나의 정수이다.

본 발명의 두번째 과제를 달성하기 위하여, 하기 화학식 5로 표시되는 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물을 제공한다.

[화학식 5]

상기 화학식에서 R은 각각 독립적으로 H, 또는 C₁ _~5 알킬기, R¹은 각각 독립적으로 NH₂; 또는 H, 이미드, 알데하이드. 카르복시기, 케톤, 니트로, 아미노, 숙신이미드, 말레이미드, 아미노옥실, 에스테르, N₃, 알킨 및 NCS로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 성분을 포함하는 C₁ _~5의 알킬, C_1~5의 알케닐, C₁ _~5의 알키닐, C₁ _~5의 아릴, C₁ _~5의 아실, C₁ _~5의 헤테로아릴 또는 C₁ _~5의 헤테로알킬 및

본 발명의 세번째 과제를 달성하기 위하여, 상기 화학식 5로 표시되는 테트라아자 거대고리 화합물 및 상기 테트라아자 거대고리 화합물과 배위결합된 금속원소를 포함하는 배위결합 화합물 및 이를 조영제 등으로 활용하는 용도를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.

용어 "방향족(aromatic)"은 공유 파이 전자계를 가지고 있는 적어도 하나의 링을 가지고 있고 카르보시클릭 아릴(예를 들어, 페닐)과 헤테로시클릭 아릴기(예를 들어, 피리딘, 퓨란, 인돌, 퓨린)를 포함하는 방향족 그룹을 의미한다. 이 용어는 모노시클릭 또는 융합 링 폴리시클릭(즉, 탄소원자들의 인접한 쌍들을 나눠 가지는 링들) 그룹들을 포함한다.

용어 "헤테로원자"는 탄소 및 수소 이외의 원자를 의미한다.

용어 "헤테로알킬"은 알킬그룹의 탄소원자 중 하나 이상이 다른 헤테로원자로 치환된 형태를 의미한다.

용어 "헤테로 방향족(heteroaromatic)"은 적어도 하나의 헤테로시클릭 링을 포함하고 있는 방향족 그룹을 의미하는 것으로, 보다 상세하게는 각각의 고리에 5개 또는 6개의 원자)를 갖는 임의로 치환된 방향족 기를 나타낸다. 헤테로방향족 기는 바람직하게는 고리에 1 또는 2개의 산소 원자, 1 또는 2개의 황 원자 및/또는 1 내지 4개의 질소 원자를 갖고, 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 결합될 수 있다. 헤테로방향족의 예로는 푸릴, 티에닐, 피리딜, 옥사졸릴, 피롤릴, 인돌릴, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 등이 있다. 치환기의 예는 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌, 케톤, 히드록시, 보호된 히드록시, 아실, 아실옥시, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아릴옥시, 할로겐, 아미도, 아미노, 니트로, 시아노, 티올, 케탈, 아세탈, 에스테르 및 에테르 중 하나 이상을 포함한다.

용어 "헤테로시클로" 또는 "헤테로시클릭"은 하나 이상의 고리에 하나 이상의 헤테로원자 (바람직하게는, 각각의 고리에 5 또는 6개의 원자)를 갖는 임의로 치환되고, 완전히 포화되거나 불포화된 모노시클릭 또는 바이시클릭 방향족 또는 비방향족 기를 나타낸다. 헤테로시클로기는 바람직하게는 고리에 1 또는 2개의 산소 원자, 1 또는 2개의 황 원자 및/또는 1 내지 4개의 질소 원자를 갖고, 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 결합될 수 있다. 헤테로시클로의 예로는 헤테로방향족, 예컨대 푸릴, 티에닐, 피리딜, 옥사졸릴, 피롤릴, 인돌릴, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 등이 있다. 치환기의 예는 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌, 케톤, 히드록시, 보호된 히드록시, 아실, 아실옥시, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아릴옥시, 할로겐, 아미도, 아미노, 니트로, 시아노, 티올, 케탈, 아세탈, 에스테르 및 에테르 중 하나 이상을 포함한다.

용어 "알킬(alkyl)"은 지방족 탄화수소 그룹을 의미한다. 알킬 부위는 어떠한 알켄이나 알킨 부위를 포함하고 있지 않음을 의미하는 "포화 알킬(saturated alkyl)" 그룹일 수 있다. 알킬 부위는 적어도 하나의 알켄 또는 알킨 부위를 포함하고 있는있음을 의미하는 "불포화 알킬(unsaturated alkyl)" 부위일 수도 있다. "알켄(alkene)" 부위는 적어도 두 개의 탄소원자가 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합으로 이루어진 그룹을 의미하며, "알킨(alkyne)" 부위는 적어도 두 개의 탄소원자가 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합으로 이루어진 그룹을 의미한다. 포화이든 불포화이든 간에 알킬 부위는 분지형, 직쇄형 또는 환형일 수 있으며 바람직하게는 C₁ _~ ₂₀이고 보다 바람직하게는 C₁ _~10이다.

용어 "아실"은 유기 카르복실산의 -COOH 기로부터 히드록실기를 제거하여 형성된 잔기를 나타내며, 예를 들면 RC(O)-이고, 여기서 R은 R¹, R¹O-, R¹R²N- 또는 R¹S-이고, R¹은 히드로카르빌, 헤테로치환된 히드로카르빌 또는 헤테로시클로이고, R²는 수소, 히드로카르빌 또는 치환된 히드로카르빌이다.

용어 "아릴" 또는 "아르"는 임의로 치환된 호모시클릭 방향족기, 바람직하게는 고리 부분에 6 내지 12개의 탄소를 함유하는 모노시클릭 또는 바이시클릭 기, 예컨대 페닐, 바이페닐, 나프틸, 치환된 페닐, 치환된 바이페닐 또는 치환된 나프틸을 나타낸다. 페닐 및 치환된 페닐이 보다 바람직한 아릴이다.

용어 "아미도"는 치환된 아미도 잔기를 포함하고, 여기서 치환기는 하나 이상의 아릴 및 C₁ _-20 알킬 등을 포함하고, 이들은 각각 하나 이상의 아릴, 카르브알데히드, 케톤, 카르복실, 시아노, 할로, 니트로, C₁ _-20 알킬, 술페이토, 술피토, 포스페이토, 포스피토, 히드록실, 옥시, 머캅토 및 티오 치환기에 의해 치환 또는 비치환될 수 있다.

용어 "아미노"는 치환된 아미노 잔기를 포함하고, 여기서 치환기는 하나 이상의 아릴 및 C₁ _-20 알킬 등을 포함하고, 이들은 각각 하나 이상의 아릴, 카르브알데히드, 케톤, 카르복실, 시아노, 할로, 니트로, C₁ _-20 알킬, 술페이토, 술피토, 포스페이토, 포스피토, 히드록실, 옥시, 머캅토 및 티오 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다.

용어“방사성 동위원소”는 핵이 불안정하여 알파(α)?베타(β^+/-)?감마(γ)선을 자발적으로 방출하면서 과량의 에너지를 방산시키는 질량이 다른 화학원소를 의미한다.

용어 “약제학적으로 허용되는 염”은, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다.

용어 "컨쥬게이트"는 본 발명의 테트라아자 거대고리 화합물이 금속원소과 배위결합을 통한 착물을 형성하는지 또는 형성하지 않는지 여부와 관계없이 생물활성분자 또는 화학활성분자와 결합된 것을 나타낸다.

용어 “사이클람(cyclam: 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecane)"은 4개의 질소 원자가 포함된 테트라아자사이클로알칸(tetraazacycloalkane) 화합물의 유도체이다.

기타 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.

본 발명의 이중기능기 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법은 종래의 제조방법에 비하여 비교적 마일드한 조건에서 반응을 수행하면서도 수율을 현저하게 향상시킬 수 있으며 합성과정에서 별도의 컬럼정제를 하지 않고도 높은 수율로 원하는 테트라아자 거대고리 화합물을 수득할 수 있다.

나아가, 본 발명의 이증기능기 테트라아자 거대고리 화합물을 ⁶⁴Cu로 표지하는 경우 종래의 TETA에 ⁶⁴Cu로 표지한 것에 비하여 생체안정성이 현저하게 증대된다.

도 1은 본 발명의 제조방법에 의하여 생성된 이중기능기 TE2A의 제조 공정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 제조방법에 의하여 생성된 TE2A로부터 구리-64 착물을 제조하는 공정을 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 제조 공정 과정에서 생성된 화합물 3(C24H46N4O4)의 ¹H 핵자기공명(NMR) 스펙트럼 결과이다(DMSO-d₆, 500 MHz).
도 4는 본 발명의 제조 공정 과정에서 생성된 화합물 3의 ¹³C 핵자기공명 스펙트럼 결과이다(DMSO-d₆, 125 MHz).
도 5는 본 발명의 제조 공정 과정에서 생성된 화합물 3의 고분해능 질량분석기 (high-resolution mass spectrometry: HRMS)의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 제조방법에 의하여 생성된 TE2A의 2D-NMR 결과이다(500 MHz, D₂O).
도 7은 본 발명의 제조방법에 의하여 생성된 TE2A의 ¹H 핵자기공명 스펙트럼 결과이다(500 MHz, D₂O).
도 8은 본 발명의 제조방법에 의하여 생성된 TE2A의 ¹³C 핵자기공명 스펙트럼 결과이다(125 MHz, D₂O).
도 9는 본 발명의 제조방법에 의하여 생성된 TE2A를 고분해능 질량분석기를 사용하여 분자량을 측정한 결과이다.
도 10은 Cu-TE2A의 HRMS의 스펙트럼 결과이다.
도 11은 Cu-TETA의 HRMS의 스펙트럼 결과이다.
도 12는 자연로그와 시간에 따른 (a) Cu-TE2A, (b) Cu-TETA
at 50℃ in 5M HCl, (c) Cu-TE2A, (d) Cu-TETA at 90℃ 5M HCl , (e) Cu-TE2A, 및 (f) Cu-TETA at 90℃ 12M HCl 를 나타낸 그래프이다.
도 13은 90℃, 5M HCl에서 산 탈착물 실험동안 시간에 따른 Cu-TE2A (a)와 Cu-TETA(b)의 HPLC 크로마토그램이고, Cu-TE2A (c)와 Cu-TETA(d)의 cyclic voltammograms (스캔속도 100 mV/s, 0.1 M NaOAc, pH 7)이다.
도 14a는 ⁶⁴Cu-TE2A의 Radio-TLC 이고, 14b는 HPLC 크로마토그래프이다.
도 15a는 ⁶⁴Cu-TETA의 Radio-TLC 이고, 15b는 HPLC 크로마토그래프이다.
도 16은 정상 암컷 5마리의 스프래그-다우리 랫트(Sprague-Dawley rats)에 ⁶⁴Cu로 표지된 TE2A와 TETA를 주입한 후 24시간째에서의 기관 및 조직(혈액, 심장, 폐, 근육, 지방, 골, 이자, 신장 및 간)의 생체분포 결과를 나타낸 것이다. %ID/g은 기관 및 조직 그램당 투입된 방사성 착물의 양(dose)을 백분율로 나타낸 것이다.
도 17은 ⁶⁴Cu-TE2A를 balb/c 마우스에 주사 후 1시간 30분 지난 뒤 획득한 microPET 영상 결과이다. 도면에서, "Transverse"는 신체의 장축에 대해 직각으로 위치한 면을 보여주는 영상이고, “Coronal”은 신체를 정면에서 바라보았을 때 보이는 단면 영상이며, "Sagittal"은 신체의 정중면과 평행한 단면으로 신체를 옆에서 보았을 때 보이는 단면 영상이다. 윗줄에 있는 3개의 영상은 간 위치에 촛점을 맞춘 영상이고 아래 줄은 신장에 촛점을 맞춘 영상이다. 대부분의 액티버티가 간과 신장에 있는 것을 알 수 있으며 신장을 통해 배출된 ⁶⁴Cu-TE2A가 방광에 다량 모여 있는 것을 알 수 있다.
도 18은 ⁶⁴Cu-TE2A를 balb/c 마우스에 주사 후 6시간 20분 지난 뒤 획득한 microPET 영상 결과이다. ⁶⁴Cu-TE2A 주사 후 1시간 30분 뒤의 영상인 도 17에 5시간 이상 시간이 지났으므로 많은 방사능물질이 체외로 배출되어 몸 안에 남아 있는 방사능량이 도 17에 비해 현저히 낮은 것을 알 수 있다. 특히 방광에 모여있는 액티버티는 상당히 줄어들었음을 알 수 있다.
도 19는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 TE2A-c(RGDyK) 콘쥬게이트를 정제하기 위한 시간, 용매 및 컬럼의 조건을 나타낸 것이다. 214 ㎚ 파장(Wavelength)에서 실시하였다.
도 20은 c(RGDyK)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 결과이다.
도 21은 TE2A-c(RGDyK)의 HPCL 크로마토그램을 나타낸 결과이다.
도 22는 c(RGDyK)의 FAB(Fast atom bombardment) 질량분석을 나타낸 결과이다.
도 23a는 TE2A-c(RGDyK)의 FAB(Fast atom bombardment) 질량분석을 나타낸 결과이고, 도 23b는 글리세롤 매트릭스의 FAB(Fast atom bombardment) 질량분석을 나타낸 결과이다.
도 24는 ⁶⁴CuCl₂를 모니터링 한 방사 박층크로마토그래피의 결과이다.
도 25는 ⁶⁴Cu-TE2A-c(RGDyK)를 모니터링 한 방사 박층크로마토그래피의 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래의 이중기능기를 갖는 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법은 상기 반응식 1에 따라 제조하게 되는데, 이 경우 각 단계의 반응수율 및 최종 반응수율이 현저하게 낮아 부산물로부터 중간체를 분리하기 매우 어려울 뿐 아니라 실제 수율이 10 ~ 20%에 불과한 문제가 있었다(비교예 1 참조). 나아가, 종래의 방법을 통해 제조하는 경우 중간체의 수율이 낮아 각 단계의 부산물로부터 중간체들을 각각 분리하여야 하므로 이를 통해 다양한 작용기를 부착한 이중기능기를 갖는 테트라아자 거대고리 화합물을 제조하는데 한계가 있었다.

이에 본 발명에서는 테트라아자 거대고리 화합물을 산화시켜 비스아미날 화합물을 제조하고, 보호기가 부착된 알킬기를 도입한 후 가수분해하는 단계를 통해 비교적 마일드한 반응조건에서 제조수율을 현저하게 향상시킬 수 있게 되었다(실시예 1 참조).

구체적으로 본 발명의 한 측면에 따른 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법은, (1) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 산화시켜 하기 화학식 2로 표시되는 비스아미날 화합물을 제조하는 단계, (2) 상기 비스아미날 화합물을 알킬화시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 보호기가 부착된 트랜스 화합물을 제조하는 단계, 및 (3) 상기 보호기가 부착된 트랜스 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하여 제조된다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

Y는 알킬기;

먼저, 상기 (1) 단계를 설명한다. 구체적으로 본 발명의 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법은 화학식 1로 표시되는 화합물을 산화시켜 하기 화학식 2로 표시되는 비스아미날 화합물을 제조한다. 상기 산화는 비스아미날 화합물을 제조하기 위하여 수행하는 것으로서, 화학식 2로 표시되는 비스아미날 화합물을 제조할 수 있다면, 산화의 조건 등에 제한이 없으나, 바람직하게는 상기 포름알데히드, 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 소듐 하이드로젠 카보네이트, 포타슘 하이드로젠 카보네이트, 칼슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 소듐 실리케이트 및 다이-, 트리- 또는 폴리포스포르산의 알칼리 금속염으로 구성된 군으로부터 선택되는 양성자 수용체(proton acceptor)를 이용하여 산화공정이 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 극성용매의 존재 하에서 포름알데히드를 양성자 수용체로 이용하여 화합물 2의 비스아미날 화합물을 수득할 수 있으며 이 때 사용가능한 극성용매는 물, 알콜일 수 있다. 이러한 공정 단계로 생산된 화학식 2의 화합물은 트랜스-이중치환 거대고리 화합물의 위치선택적 합성에 있어서 매우 유리한 전구체(precursor)로 이용된다.

한편, (1)단계에서 출발물질로 사용되는 상기 화학식 1의 화합물은 R이 각각 독립적으로 H 또는 C₁ _~5의 알킬기인 화합물일 수 있으나, 가장 바람직하게는 R이 모두 H인 사이클람일 수 있다.

다음, (2) 단계에서 상기 (1)단계를 거쳐 제조된 상기 화학식 2의 비스아미날 화합물을 알킬화시켜 상기 화학식 3으로 표시되는 보호기가 부착된 트랜스 화합물을 제조한다. 구체적으로, 알킬화는 위치선택적으로 알킬화되는 것을 의미하며, 보다 구체적으로 화학식 2로 표시되는 화합물의 trans-위치에 존재하는 질소를 보호기(예를 들면, 알킬 또는 아릴)와 카르복실기로 알킬화 시키는 것을 의미한다.

이 때 상기 (2) 단계의 알킬화는 바람직하게는 알킬 할로카르복실레이트를 이용하여 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는, 알킬 할로C₁ _-3카르복실레이트를 이용하고, 더욱 바람직하게는 부틸 할로아세테이트를 이용하며, 가장 바람직하게는, t-부틸 브로모아세테이트를 이용하여 알킬화를 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (2)단계에서 알킬화는 극성 비양자성 용매(polar aprotic solvent)의 존재 하에서 실시되며, 보다 바람직하게는 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 디메톡시 에탄, 2-메톡시에틸 에테르, 메틸렌 클로라이드, t-부틸 메틸에테르, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 에틸아세트 및 이소프로필 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택된 1이상의 용매의 존재 하에서 수행될 수 있고, 보다 더 바람직하게는 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란 및 메틸아세트아미드로 구성된 군으로부터 선택된 1이상의 용매의 존재 하에서 실시되며, 가장 바람직하게는 아세토니트릴의 존재 하에서 수행될 수 있다.

한편, (3)단계를 거쳐 제조된 상기 화학식 3의 화합물에서 X₁ _, X₂는 바람직하게는 각각 독립적으로 -C(R¹)m-COO-, CH₂PO₃H- 또는 -C(R¹)m-PO₃H-이고, 상기 R¹은 각각 독립적으로 H; 또는 H, 이미드, 알데하이드. 카르복시기, 케톤, 니트로, 아미노, 숙신이미드, 말레이미드, 아미노옥실, 에스테르, N₃, 알킨, 및 NCS로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 성분(moiety)을 포함하는 C₀ _~7의 알킬, C_0~7의 알케닐, C₀ _~7의 알키닐, C₀ _~7의 아릴, C₀ _~7의 아실, C₀ _~7의 헤테로아릴 또는 C₀ _~7의 헤테로알킬일 수 있으나, 보다 바람직하게는 상기 X₁ _, X₂는 각각 독립적으로 H, NH₂, 말레이미드, 벤질아미노,

,

,

,

또는

를 포함하는 C₁ _{~ 5}의 알킬기 또는 -CH₂CO₂ 일 수 있다.

상기 Y는 알킬기이며, 보다 바람직하게는 C₁ _~7의 알킬기일 수 있다.

다음, (3)단계로서 기 보호기가 부착된 트랜스 화합물을 가수분해하여 상기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (3)단계는 알코올 수용액의 존재 하에서 알칼리 용액을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 에탄올 수용액의 존재 하에서 NaOH, KOH, MgOH 또는 CaOH 용액을 이용하여 실시되고, 보다 더 바람직하게는 에탄올 수용액의 존재 하에서 NaOH 또는 KOH 용액을 이용하여 실시되며, 가장 바람직하게는 상기 (3)단계는 에탄올 수용액의 존재 하에서 KOH 용액을 이용하여 실시될 수 있다. 한편, 바람직하게는 도 1과 같은 반응식을 통해 본 발명의 테트라아자 거대고리 화합물이 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상술한 본 발명의 단계들을 순차적으로 거치는 것이면 다양한 반응조건하에서 합성공정을 수행할 수 있다.

결국, TE2A는 원래 입체선택적 합성을 위한 핵심 중간체로서 종래에는 상기 반응식 1과 같이 1,8-다이토실-사이클람을 통하여 합성하였다. 그러나 토실 클로라이드(tosyl chloride)를 사용한 사이클람의 트랜스 보호기는 매우 복잡한데, 이는 토실 클로라이드를 사용한 사이클람의 반응은 모든 가능한 이성질체를 형성하고 원하는 산물은 컬럼 정제법을 실시해야만 하는 문제가 발생하는 것이다. 따라서 사이클람에서부터 TE2A까지 보고된 전체 수율은 16%이나, 실제 실험결과는 보고된 것보다 훨씬 낮고 게다가 순수한 산물을 분리할 수가 없는 단점이 있었다.

이와는 대조적으로 본 발명의 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법은 핵심 중간체로 비스아미날를 사용하였을 때, 다른 부산물 없이 단지 1,8 위치에 t-부틸 브로모아세테이트(butyl bromoacetate)를 입체 선택적으로 도입할 수 있었으며 합성 과정에서 종래의 제조방법과는 달리 칼럼 정제가 필요치 않다. 이러한 새로운 합성 경로를 사용하여 우리는 전체 수율 86%로 많은 양의 순수한 TE2A를 얻을 수 있었다.

그러므로, 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물은 상술한 종래의 제조방법(반응식 1)에 비하여 제조공정이 단순하면서도 현저하게 수율이 향상하게 된다. 한편, 도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 TE2A의 제조방법을 나타낸 반응식이지만 이는 예시로서 실제로는 상술한 화학식 1로 표시되는 화합물이라면 종류를 불문하고 본 발명의 제조공정을 통해 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물을 제조할 수 있게 된다.

또한, Cross-bridged TE2A(CB-TE2A)는 DOTA와 TETA 같은 이전 킬레이트에 비해 매우 높은 역학적 안정성을 보여준다. 그러나 CB-TE2A는 구리 2가에 대한 좋은 킬레이트로서 한 가지 중요한 단점을 가지고 있다. 표지 조건이 용이하지 않고 높은 온도(95 ℃)에서만 좋은 표지 수율을 보여주었다. 그러므로, 이작용기 킬레이트로서 CB-TE2A의 사용은 작은 분자의 표지로 제한되고, 항체와 같은 열에 민감한 생체물질은 CB-TE2A를 사용하여 방사성 구리 2가 이온을 표지할 수는 없다. CB-TE2A의 또 다른 단점은 리간드에 대한 접근용이성이다. 합성 절차가 다소 길고 (사이클람으로부터 6 과정) 전체 합성 시간은 적어도 한달이나 걸리는 치명적인 단점이 있어 이를 상용화하는데 큰 어려움이 있었다. 그러나, 대조적으로 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 TE2A는 3일 안에 3 과정으로 쉽게 준비할 수 있고 방사성 구리 2가를 사용한 표지조건도 TETA만큼 온화하거나 보다 쉽다. 또한 Cu-TE2A 착물은 TETA 유도체에 비해 생리학적 조건에서 높은 역학적 안정성을 보여준다. TETA가 ⁶⁴Cu를 사용한 펩타이드와 항체 같은 생체 분자의 표지에 있어서 여전히 가장 널리 사용되는 이중기능기 킬레이트 중 하나라는 것을 고려해 볼 때, TE2A가 구리 2가 이온에 대한 새로운 킬레이터로 사용될 수 있을 것이고 다양한 새로운 이중기능기 킬레이터가 이로부터 유도될 수 있을 것이다.

한편, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 하기 화학식 5로 표시되는 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물을 제공한다.

[화학식 5]

상기 화학식에서 R은 각각 독립적으로 H, 또는 C₁ _~5의 알킬기;

R¹은 각각 독립적으로 NH₂; 또는 H, 이미드, 알데하이드. 카르복시기, 케톤, 니트로, 아미노, 숙신이미드, 말레이미드, 아미노옥실, 에스테르, N₃, 알킨 및 NCS로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 성분을 포함하는 C₁ _~5의 알킬, C_1~5의 알케닐, C₁ _~5의 알키닐, C₁ _~5의 아릴, C₁ _~5의 아실, C₁ _~5의 헤테로아릴 또는 C₁ _~5의 헤테로알킬; 및

이 때, 바람직하게는 상기 R은 각각 독립적으로 H 또는 메틸기일 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 R¹은 각각 독립적으로 H, 말레이미드, 벤질아미노,

,

,

,

또는

를 포함하는 C₁ _{~ 5}의 알킬 또는 NH₂ 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명에 따른 상기 화학식 1 또는 5로 표시되는 테트라아자 거대고리 화합물 및 상기 테트라아자 거대고리 화합물과 배위결합된 금속원소를 포함하는 배위결합 화합물을 제공하며, 보다 바람직하게는 하기 반응식 2 및 도 2에 따라 금속원소가 결합된 배위결합 화합물을 제조할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 종류의 금속원소를 배위결합할 수 있다.

[반응식 2]

본 발명의 일 실시예에 의하면, 바람직하게는 상기 금속원소는 비방사성 금속원소 또는 방사성 금속원소일 수 있으며, 상기 금속원소는 바람직하게는 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 및 (+1) 내지 (+7) 전하를 보유하는 전이 금속으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 금속원소는 바람직하게는 Mn(II),Mn(III),Mn(IV),Mn(V),Fe(II),Fe(III),Fe(IV),Co(I),Co(II),Co(III), Ni(I),Ni(II),Ni(III),Cu(I),Cu(II),Cu(III),Cr(II),Cr(III),Cr(IV),Cr(V),Cr(VI),V(III),V(IV),V(V),Mo(IV),Mo(V),Mo(VI),W(IV),W(V),W(VI),Pd(II),Ru(II),Ru(III) 및 Ru(IV)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 금속원소는 바람직하게는

1족 금속 원소 (Li 또는 Na), 2족 금속 원소 (Be, Ca, Mg, Sr, Ba 또는 Ra), 13족 원소 (Ga 또는 In), 14족 원소 (Si 또는 Ge), 15족 원소 (As, Sb 또는 Bi), 16족 원소 (S, Se 또는 Te), 전이 금속 (Sr, Ti, V, Cu, Y, Zr, Nb, Mo, Tc, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au 또는 Hg), 란탄족 및 악티늄족 원소 (La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm 또는 Yb)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 원소 및 방사성 동위원소로서 ⁴³Sc, ⁴⁴Sc, ⁴⁵Ti, ⁵¹Mn, ⁵¹Cr, ⁵²Mn, ⁵²Fe, ⁵³Fe, ⁵⁵Co, ⁵⁶Co, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶²Zn, ⁶³Zn, ⁶⁴Cu, ⁶⁵Zn, ⁶⁶Ga, ⁶⁶Ge, ⁶⁷Ge, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁶⁹Ge, ⁶⁹As, ⁷⁰As, ⁷⁰Se, ⁷¹Se, ⁷¹As, ⁷²As, ⁷³Se, ⁷⁴Kr, ⁷⁴Br, ⁷⁵Se, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ⁷⁷Kr, ⁷⁸Br, ⁷⁸Rb, ⁷⁹Rb, ⁷⁹Kr ,⁸¹Rb, ⁸²Rb, ⁸³Sr, ⁸⁴Rb, ⁸⁴Zr, ⁸⁵Y, ⁸⁶Y, ⁸⁷Y, ⁸⁷Zr, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ⁸⁹Zr, ⁹²Tc, ⁹³Tc, ⁹⁴Tc, ⁹⁵Tc, ⁹⁵Ru, ⁹⁵Rh, ⁹⁶Rh, ⁹⁷Rh, ⁹⁷Ru, ⁹⁸Rh, ⁹⁹Rh, ⁹⁴ ^mTc, ⁹⁹ ^mTc, ¹⁰⁰Rh, ¹⁰¹Ag, ¹⁰²Ag, ¹⁰²Rh, ¹⁰³Ag, ¹⁰³Ru, ¹⁰⁴Ag, ¹⁰⁵Ag, ¹⁰⁵Ru, ¹⁰⁶Ag, ¹⁰⁸In, ¹⁰⁹In, ¹¹⁰In, ¹¹¹In, ¹¹⁵Sb, ¹¹⁶Sb, ¹¹⁷Sb, ¹¹⁵Te, ¹¹⁶Te, ¹¹⁷Te, ¹¹⁷I, ¹¹⁸I, ¹¹⁸Xe, ¹¹⁹Xe, ¹¹⁹I, ¹¹⁹Te, ¹²⁰I, ¹²⁰Xe, ¹²¹Xe, ¹²¹I, ¹²²I, ¹²³Xe, ¹²⁴I, ¹²⁶I, ¹²⁸I, ¹²⁹La, ¹³⁰La, ¹³¹La, ¹³²La, ¹³³La, ¹³⁵La, ¹³⁶La, ¹⁴⁰Sm, ¹⁴¹Sm, ¹⁴²Sm, ¹⁴⁴Gd, ¹⁴⁵Gd, ¹⁴⁵Eu, ¹⁴⁶Gd, ¹⁴⁶Eu, ¹⁴⁷Eu, ¹⁴⁷Gd, ¹⁴⁸Eu, ¹⁴⁹Pr, ¹⁵⁰Eu, ¹⁵³Sm, ¹⁵⁹Gd, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁰Au, ¹⁹¹Au, ¹⁹²Au, ¹⁹³Au, ¹⁹³Tl, ¹⁹⁴Tl, ¹⁹⁴Au, ¹⁹⁵Tl, ¹⁹⁶Tl, ¹⁹⁷Tl, ¹⁹⁸Tl, ²⁰⁰Tl, ²⁰⁰Bi, ²⁰¹Tl, ²⁰²Bi, ²⁰³Bi, ²⁰⁵Bi 또는 ²⁰⁶Bi, ²¹¹As, ²¹²Bi, ²²⁵Ac로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

보다 바람직하게는, 상기 금속 원소는 Ba, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Hg, Nb, Mo, Zr, Te, W, Pd, Ag, Pt, 및 Au로 구성된 군으로부터 선택되는 전이 금속 원소, Ga, In, Sn, Pb, Bi로 구성된 군으로부터 선택되는 13족~15족 원소, 또는 Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Sm 및 Nd로 구성된 군으로부터 선택되는 란탄족 또는 악티늄족 금속 원소; 및 방사성 동위원소로부터 선택되는 원소이다. 가장 바람직하게는, 상기 금속 원소는 Cu, Mn, Fe, Ga 또는 Gd; 방사성 동위원소(바람직하게는, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga,⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁹⁹ ^mTc, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵¹Cr, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁶⁹Yb, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu 및 ⁶⁷Cu)로부터 선택되는 원소이다.

한편, 보다 바람직하게는 화학식 4 또는 5의 X¹, X², R¹ 또는 카르복시기에 생물활성물질 또는 화학활성물질이 부착된 형태일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 화학식 4 또는 5로 표시되는 테트라아자 거대고리 화합물 또는 배위결합 화합물; 및 상기 배위결합 화합물과 연결된 생물활성물질 또는 화학활성물질을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 구체적으로 본 발명의 컨쥬게이트는 컨쥬게이트를 표적화된 조직, 기관, 수용체 또는 다른 생물학적으로 발현된 조성물로 지시하는 하나 이상의 생물활성물질 또는 화학활성물질 (생물학적 분자로도 알려져 있음)를 포함한다. 이상적으로, 각각의 생물활성물질 또는 화학활성물질는 표적화된 기관 또는 조직 부위에 대해 선택적이거나 또는 특이적이다. 구체적으로 상기 생물활성물질은 생체유래의 타겟물질로서 항체, 단백질, 항원, 펩타이드, 핵산, 효소, 세포, 탄수화물, 비타민, 압타머 및 호르몬으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 화학활성물질은 비생체유래이나 화학적으로 생산이 가능한 것으로서 나노입자, 무기지지체, 고분자, 단분자 및 약물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

통상적인 생물활성물질 또는 화학활성물질로는 호르몬, 아미노산, 펩티드, 펩티도유사체(peptidomimetic), 단백질, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 핵산, 효소, 탄수화물, 글리코유사체(glycomimetic), 지질, 알부민, 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 수용체, 시클로덱스트린과 같은 봉입 화합물 및 수용체 결합 분자가 있다. 생물활성물질 또는 화학활성물질의 구체적 예로는 유방 및 전립선 병소의 치료를 위한 스테로이드 호르몬; 신경내분비 종양의 치료를 위한 소마토스타틴, 봄베신, CCK 및 뉴로텐신 수용체 결합 분자; 폐암 치료를 위한 CCK 수용체 결합 분자; 결장직장 암 치료를 위한 ST수용체 및 암배 항원 (CEA) 결합 분자; 흑색종 치료를 위한 디히드록시인돌카르복실산 및 다른 멜라닌 생성 생합성 중간체; 혈관 질환 치료를 위한 인테그린 수용체 및 아테롬성 동맥경화증 플라크 결합 분자; 및 뇌 병소 치료를 위한 아밀로이드 플라크 결합 분자가 있다. 생물활성물질 또는 화학활성물질의 예로는 또한 합성 중합체, 예컨대 폴리아미노산, 폴리올, 폴리아민, 폴리산, 올리고뉴클레오티드, 아보롤, 덴드리머 및 압타머가 있다.

본 발명의 일 실시예로서, 생물활성물질 또는 화학활성물질은 나노입자, 항체 (예를 들면, 뉴트로스펙트(NeutroSpect;등록상표), 제발린(Zevalin; 등록상표) 및 헤르셉틴(Herceptin; 등록상표)), 단백질 (예를 들면, TCII, HSA, 아넥신 및 Hb), 펩티드 (예를 들면, 옥트레오티드, 봄베신, 뉴로텐신 및 안지오텐신), 질소-함유 단순 또는 복합 탄수화물 (예를 들면, 글루코사민 및 글루코스), 질소-함유 비타민 (예를 들면, 비타민 A, B1, B2, B12, C,D2, D3, E, H 및 K), 질소-함유 호르몬 (예를 들면, 에스트라디올, 프로게스테론 및 테스토스테론), 질소-함유활성 제약 (예를 들면, 셀레콕시브 또는 다른 질소-함유 NSAIDS, AMD3100, CXCR4 및 CCR5 길항제) 및 질소-함유 스테로이드 중에서 선택될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 여러 실시예에서는 다수의 생물활성물질 또는 화학활성물질을 갖는 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 예를 들면, 특정 표적 조직, 기관 수용체 또는 다른 생물학적으로 발현된 조성물에 대한 특이성을 증가시키기 위해, 다수의 생물활성물질 또는 화학활성물질이 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 생물활성물질 또는 화학활성물질은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들면, 단일 컨쥬게이트는 목적하는 항원 또는 합텐에 대해 지시된 다수의 항체 또는 항체 단편을 보유할 수 있다. 통상적으로, 컨쥬게이트에 사용되는 항체는 목적하는 항원 또는 합텐에 대해 지시된 모노클로날 항체 또는 항체 단편이다. 따라서, 예를 들면, 컨쥬게이트는 목적하는 에피토프에 대한 특이성을 가져 목적하는 부위에서 컨쥬게이트의 농도를 증가시키는 둘 이상의 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. 이와 유사하게 독립적으로, 컨쥬게이트는 각각 동일한 표적 조직 또는 기관 상의 다른 부위에 대해 표적화된 둘 이상의 상이한 생물활성물질 등을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로 다수의 생물활성물질 또는 화학활성물질을 사용하면 컨쥬게이트는 유리하게는 표적 조직 또는 기관의 여러 영역에 집중되며, 이는 잠재적으로 치료 처치의 효과를 증가시킨다. 또한, 컨쥬게이트는 비-표적 침착을 최소화시키면서 목적하는 치료 및/또는 진단 결과를 가장 잘 달성하는 표적 조직 또는 기관에 컨쥬게이트가 집중되도록 설계된 소정 비율의 생물활성물질 또는 화학활성물질을 가질 수 있으나 나노입자 등의 경우 특정한 펩타이드나 항체를 결합시키지 않는한 조직 특이적 성질을 가지지 않을 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 1) 상술한 본 발명의 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물을 제조하는 단계, 2) 제조된 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물에 생물활성물질 또는 화학활성물질을 결합시키는 단계, 및 3) 상기 테트라아자 거대고리 화합물에 금속원소를 배위결합시켜 착물을 형성하는 단계를 포함하여 컨쥬게이트를 제조하거나, 상기 2), 3)단계를 바꾸어 컨쥬게이트를 제조할 수 있으나 가장 바람직하게는 상기 1), 2), 3)단계가 순차적으로 수행된다. 이 경우 종래의 CB-TE2A의 착물형성온도가 고온인데 비하여, 본원발명의 화학식 4 또는 5로 표시되는 화합물의 착물형성단계를 고온이 아닌 20 ~ 50℃에서 수행할 수 있으므로 생물활성물질 또는 화학활성물질의 변성을 막을 수 있어 후술하는 치료제, 진단제 및 조영제로서 다양하게 활용될 수 있다.

한편, 하기 반응식 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조되는 TE2A-c(RGDyK) 콘쥬게이트에 ⁶⁴Cu로 레이블링하는 과정을 도시한 일실시예이나 이에 제한되지 않는다.

[반응식 3]

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 컨쥬게이트 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체에 분사된, 금속과 착물을 형성한 컨쥬게이트를 포함한다. 제약상 허용되는 담체 (또한, 당업계에 부형제, 비히클, 보조제, 아주반트 또는 희석제로 알려져 있음)는 통상적으로 제약상 비활성인 물질이고, 조성물에 적합한 경도 또는 형태를 부여하고, 컨쥬게이트의 치료 또는 진단효능을 감소시키지 않는다. 담체는 일반적으로 포유동물, 특히 인간에게 투여되었을 때 허용되지 않는 역반응, 알레르기성 반응 또는 다른 적절하지 못한 반응을 생성하지 않는다면 "제약상 또는 약리학상 허용되는" 것으로 간주된다.

본 발명의 제약 조성물의 투여에 사용되는 투여량 및 처방은 질환의 진단 또는 치료에 있어 숙련된 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 컨쥬게이트의 투여량은 수혜자의 연령, 성별, 건강 및 체중, 수반되는 치료의 종류, 만약 있다면 치료 횟수, 및 목적하는 효과의 특성에 따라 달라질 것으로 이해된다. 임의의 투여 방식에 있어, 전달되는 컨쥬게이트의 실제량 뿐만 아니라 본원에 기재된 유리한 효과를 달성하는데 필요한 투여 계획은 또한 부분적으로는 컨쥬게이트의 생체이용가능성, 치료 또는 진단되는 장애, 목적하는 치료 또는 진단 투여량, 및 당업자에게 명백할 것인 다른 요인과 같은 요인에 따라 달라질 것이다. 본 발명에 있어서 동물, 특히 인간에게 투여되는 투여량은 동물에서 적당한 기간에 걸쳐 목적하는 치료 또는 진단 반응을 나타내기에 충분해야 하며 바람직하게는 1일 1 ~ 3회 복용에 0.01 mL 내지 약 10 mL이 경구 또는 주사의 형태로 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명에 의한 약학적 배합물은, 상기 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 종양, 마이코플라스마, 병원체표면항원, 독소, 효소, 알레르기원, 약물, 생물학적 활성분자, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 기생충, 자가면역, 치매, 심장 및/또는 신경계와 관련된 질환을 진단 및/또는 치료하는데 사용된다. 본 발명의 인간을 제외한 포유 동물의 질환을 진단 및/또는 치료하는 방법은, 효과량의 상기 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물을 인간을 제외한 포유 동물에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 킬레이트제 또는 킬레이트가 컨쥬게이션하는 항체는 단일클론 또는 다클론 항체, 키메릭 항체 또는 이종항체, 또는 예를 들어, 아넥신, 항-CEA, 토시투모맙(Tositumomab), 트라스투주맙(trastuzumab), HUA33, 에프라투주맙(Epratuzumab), cG250, 이브리투모맙 튜세탄(Ibritumomab Tiuxetan) 등의 유도체를 포함하는 단백질을 포함하는, 항체가 될 수 있다. 본 발명에 따른 킬레이트제 또는 킬레이트에 결합될 수 있는 항체 또는 항체 단편은 당 분야에서 잘 알려진 기술로 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 킬레이트제 또는 킬레이트가 컨쥬게이션하는 단백질로 예를 들면, TCII, HSA, 아넥신 및 Hb 등이 있고; 펩티드로 예를 들면, RGD-함유 펩티드, 멜라닌세포-자극 호르몬 (MSH) 펩티드, 네우로텐신, 칼시토닌, 트레오티드, 봄베신, 뉴로텐신, 우로텐신 II 및 안지오텐신; 질소-함유 비타민으로 예를 들면, 비타민 A, B1, B2, B12, C,D2, D3, E, H 및 K; 질소-함유 호르몬으로 예를 들면, 에스트라디올, 프로게스테론 및 테스토스테론 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 조영제를 제공한다. 본 발명에 의한 조영제는, 상기 화학식 4 또는 5로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 구체적으로, 상기 화학식 4 또는 5로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 킬레이트제로 이용하여 상자성을 띠는 금속 이온 Mn, Fe, Gd, Cu 등과 킬레이팅시키고, 질병특이적 생체물질과 컨쥬게이션시킴으로서, 예를 들어 초음파 조영제, 컴퓨터단층촬영(computed tomography: CT) 조영제, 자기공명영상(magnetic resonance imaging: MRI) 조영제로 사용하거나, ⁶⁴Cu와 같은 방사성 동위원소를 표지하는 것을 통해 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (Single Photon Emission Computed Tomography: SPECT) 또는 양전자방출단층영상촬영(positron emission tomography: PET)과 같은 진단/검사시의 조영제로 사용할 수 있다.

보다 구체적으로 진단 방사성 착물 형성에 있어, 일반적으로는 약 0.01 밀리퀴리 (mCi)/mL 내지 100 mCi/mL 농도의 방사성을 함유하는 용액에서 방사성 착물을 형성하는 것인 바람직하다. 일반적으로, 투여되는 단위 투여량은 약 0.01 mCi 내지 약 100 mCi, 바람직하게는 약 1 mCi 내지 약 30 mCi의 방사성을 갖는다. 단위 투여량으로 주입되는 용액은 약 0.01 mL 내지 약 10 mL이다. 투여에 적절한 방사성 동위원소 표지된 컨쥬게이트의 양은 빠르게 제거되는 컨쥬게이트가 덜 빠르게 제거되는 것 보다 높은 투여량이 투여될 필요가 있을 수 있다는 점에서 선택된 컨쥬게이트의 분배 프로파일에 따라 달라진다. 생체내 분배 및 국지화는 투여 후의 적절한 시점, 비-표적 조직에서의 제거 속도에 대한 표적 부위에서의 축적 속도에 따라 통상적으로는 30 분과 180 분 사이에 표준 신티그램촬영 기술에 따라 추적할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 하기 실시예의 내용으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> TE2A의 제조

(1) 재료 및 실험 방법

사이클람은 프랑스 CheMatech사로부터 구입하였으며, 본 실험에 사용된 모든 시약 및 용매 용액은 미국 시그마-알드리치사로부터 구입하였다. 구리-64는 ⁶⁴Ni(p,n)⁶⁴Cu 핵반응을 통하여 한국원자력의학원(KIRAMS)에서 제조되었다. 모든 ¹H NMR 및 ¹³C NMR 스펙트라는 바리안 유니티 이노바(Varian Unity Inova 500 MHz; Varian, 미국)로 측정하였다. 고-분해능 질량분석기(HRMS)는 JEOL JMS700(JEOL, Tokyo, 일본) 또는 Quattro Premier XE (Waters, 미국) 질량 분석계를 이용하여 측정하였다. UV-Vis 스펙트라는 Shimadzu UV-Vis 분광 광도계(UV-1650PC)로 얻었다. 분석 HPLC는 등용매 용리법 (30 mM citric acid, 1 mL/min 유속도)으로 Waters 600 시리즈 HPLC 시스템과 Waters Xbridge C18 칼럼 (4.6 X 150 mm, 5 ㎛)을 사용하여 얻었다. 성분 분석은 한국과학기술원(KAIST)과 경북국립대학교에서 실시하였다

(2) 1,4,8,11- Tetraazatricyclo [9.3.1.1 ^4,8 ]- hexadecane 합성 제1공정

반응식 4

비스아미날 화합물 2를 상기 반응식 4에 따라 제조하였다. 즉, 물에 37%로 희석된 2 당량의 포름알데히드 15.1 ㎖를 0-5℃에서 사이클람(화합물 1) 수용액(20.3 g, 0.10 mol in 200 ㎖)에 한 번에 첨가하였다. 그 다음 반응 혼합물을 실온까지 가열하고 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 다시 0-5℃로 냉각한 후, 형성된 흰색 침전물을 여과하였고 냉각수(2 x 10 ㎖)로 세척하였다. 생성된 흰색 고체를 200 ㎖ CHCl₃에 녹였으며 MgSO₄으로 건조시켰다. 감압 하에서 CHCl₃를 증발시키면 흰색 고체 화합물 2가 20.95 g 생성된다(92% 생산율). 화합물 2의 분광 데이터는 공지된 보고서의 것과 정확하게 일치하였다.

(3) 1,4,8,11- Tetraazatricyclo [9.3.1.1 ^4,8 ]hexadecane 합성 제2공정

반응식 5

상기 반응식 5에 따라 20 ㎖ MeCN (acetonitrile; Aldrich사)에 화합물 2(0.49g, 2.2 mmol)가 혼합된 용액의 한 부분에 t-부틸브로모아세테이트(t-Butylbromoacetate; 1.70 g, 8.74 m㏖, Aldrich사) 4 당량(equivalent)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한 후 형성된 노란색을 띤 흰색 침전물을 여과하였고, 2 x 10 ㎖ MeCN으로 세척하였으며 진공에서 건조시켰다. 바로 얻은 생성물(crude product)을 재결정시켜 1.27 g 흰색 고체 화합물 3을 95% 생산율로 생산하였다(도 3 ~ 5).

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆): 1.48(s, 18H), 1.76-1.78(d, 2H, J = 8.5 Hz), 2.35-2.45(m, 4H), 2.70-2.73(d, 2H, J = 15Hz), 3.08-3.09(d, 2H, J = 5Hz), 3.24-3.38(m, 4H), 3.53-3.58(m, 2H), 3.64-3.66(d, 2H, J = 10Hz), 3.79-3.81(d, 2H, J = 11.5Hz), 4.33-4.38(t, 2H, J = 14H), 4.43-4.46(d, 2H, J = 16.5 Hz), 4.59-4.62(d, 2H, J = 16.5 Hz), 5.23-5.25(d, 2H, J = 9.5 Hz); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆): 163.5, 84.2, 76.5, 59.8, 57.2, 50.6, 47.7, 46.3, 27.5, 19.2 HRMS (ESI) calculated for C₂₄H₄₇N₄O₄, 455.3591 [(M+H)⁺], found: 455.3594 [(M+H)⁺]; Anal. Calcd. For C₂₄H₄₆Br₂N₄O₄.: C 46.91, H 7.55, N 9.12; Found C 46.63, H 7.74, N 9.21.

(4) 1,4,8,11- Tetraazatricyclo [9.3.1.1 ^4,8 ]hexadecane ( TE2A ) 합성 제3공정

반응식 6

상기 반응식 6에 따라 20 ㎖ 에탄올/물(1:1) 혼합액에 화합물 3(1.2 g, 1.95 mmol)이 혼합된 용액에 9.76 mmol KOH 0.55 g을 첨가하였다. 80℃에서 8시간 동안 저어주면서 반응시켰다. 모든 용매를 증발시킨 후, 생성된 노란색을 띄는 흰색 고체를 최소의 물에 용해시켰다. 그 다음 상기 고체가 용해된 용액을 DOEWX 1X8 (OH형성) anion 교환 수지에 놓고 1차 세척한 후, 0.5 M 염산으로 생산물을 용출(elution) 시켰다. 산 용출액으로부터 수분을 제거하면 흰색 고체 0.89 g TE2A 염화수소산염이 98%의 생산율로 생성된다(도 6 ~ 도 9).

¹H NMR (500 MHz, D₂O): 3.48(brs, 2H), 3.01-3.19(m, 10H), 2.80(brs, 6H), 2.67(brs, 2H), 1.84(brs, 4H); ¹³C NMR (125 MHz, D₂O): 179.0, 56.3, 55.7, 48.9, 45.4, 22.8 HRMS (FAB): Calculated for C₂₄H₂₈N₄O₄, 317.2189[(M+H)⁺] Found: 317.2185 [(M+H)⁺]; Anal Calcd For C₂₄H₂₈N₄O₄.3.7HCl.H₂O: C 35.83, H, 7.24, N 11.94, Found: C 35.81, H 7.42, N 12.06.

결국, 본 발명에서는 2개의 6원 고리를 포함하는 트리사이클릭 화합물 2를 생성하기 위하여 포름알테히드를 사용하여 사이클람을 보호하였다. 상기 비스-아미날(bis-aminal) 화합물은 트랜스-이치환된 사이클람의 위치선택적 합성에 있어서 사용하기 편리한 전구체이다. 사이클릭 사이클람 2를 t-부틸 브로모아세테이트로 알킬화시키는 경우 임의의 시스-이중치환된 생산물의 형성 없이 사이클릭 사이클람 2의 1,8-위치상에 선택적인 이중알킬화를 시킨다. 2개의 인접하지 않은 4개 질소 원자를 가지는 생성물 3은 CH₃CN에서 비용해성을 나타내며 간단한 여과를 통하여 분리된다.

생성물 3에서의 2개의 아미날(aminal) 결합 절단 및 에스테르 가수분해는 8시간 동안 80℃ 에탄올-물 혼합물(1:1)에 5 M KOH을 첨가하여 한 단계로 실시할 수 있으며, 그 다음 매우 뛰어난 수득율로 TE2A의 염화수소산 염을 수득하기 위하여 다우엑스 이온-교환 수지(Dowex ion-exchange resin)에 통과시켰다. 이러한 TE2A 합성 방법은 직접적이고 매우 다루기 쉽다. 또한 지루한 컬럼 정제를 필요로 하지 아니하며 사이클람으로부터 TE2A를 86%의 수득률로 생성할 수 있으며, 종래 보고된 합성 방법에 달성된 16%의 수득율보다 매우 높은 수치이다¹⁸.

< 비교예 1>

[반응식 1]

종래의 방법으로서 반응식 1에 따라 TE2A를 제조하였다. 상술한 방법을 통해 수득된 TE2A의 수율은 16%에 불과하였다. 이를 통해 본 발명의 제조공정이 종래의 제조공정에 비하여 TE2A 및 그 유도체에 대한 수율을 현저하게 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

< 실시예 2> Cu - TE2A 의 합성

실시예 1에서 제조된 20 mL 메탄올에 녹아 있는 TE2A (4) (227 mg, 0.48 mmol) 와 Cu(ClO₄)₂ ^.6H₂O (178 mg, 0.48 mmol ) 용액에 1M NaOH (2.88 mmol) 수용액을 첨가하였다. 이렇게 하여 얻은 투명한 파란색 용액을 2시간동안 환류시킨 후, 냉각시켰고 celite bed를 통과시켜 필터하였다. 여과액은 다이에틸 에테르에 분산시켰다. 이렇게 형성된 파란색의 결정은 수집한 후 건조시켰다. (223 mg, 89% 수율). HRMS (FAB): Calculated for C₁₄H₂₇CuN₄O₄, 378.1328 [(M+H)⁺] Found: 378.1332 [(M+H)⁺](도 10); Anal Calcd For C₁₄H₂₆CuN₄O₄ ^.NaClO₄ ^.H₂O: C 32.44, H, 5.44, N 10.81, Found: C 32.74, H 5.48, N 10.26. Visible electronic spectrum: l_max (H₂O)/568 nm (e = 71 M^-1cm^-1); l_max (5 M HCl)/549 nm (e = 80 M^-1cm^-1).

< 비교예 2> Cu - TETA 의 합성

18 mL 메탄올에 있는 TETA (235 mg, 0.54 mmol)와 Cu(ClO₄)₂ ^.6H₂O (201 mg, 0.54 mmol ) 용액에 1M NaOH (3.24 mmol) 수용액을 첨가하였다. 이렇게 형성된 투명한 파란색 용액은 2시간동안 환류시킨 후, 냉각시켰고 celite bed를 통과시켜 필터하였다. 여과액은 다이에틸 에테르에 분산시켰다. 이렇게 형성된 파란색의 결정은 수집한 후 건조시켰다. (344 mg, 90% 수율). HRMS (FAB): Calculated for C₁₈H₃₀CuN₄O₈, 493.1360[(M)⁺] Found: 493.1356 [(M)⁺](도 11); Anal Calcd For C₁₈H₃₀CuN₄O₈ ^.1.45NaClO₄ ^.1.8H₂O: C 30.71, H, 4.81, N 7.96, Found: C 30.73, H 4.93, N 7.73. . Visible electronic spectrum: l_max (H₂O)/640 nm (e = 102 M^-1cm^-1); l_max (5 M HCl)/615nm (e = 97 M^-1cm^-1).

< 실험예 1> Cu - TE2A 와 Cu - TETA 의 평가

상기 실시예 2 및 비교예 2에서 합성한 Cu-TE2A와 Cu-TETA에 대하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로 채내 안정성을 평가하는데에는 열역학적 안정성 보다 중요하다고 알려진 역학적 안정성을 평가하기 위해, 산 탈착물 실험 (acidic decomplexation), cyclic voltammetry 실험 등을 수행하였다.

(1) 분광 광도계를 사용한 산 탈착물 ( acidic decomplexation ) 연구

산 탈착물 연구는 50℃ 또는 90℃에서 2.2 mmol의 5 M 또는 12 M HCl 농도를 사용하여 pseudo first-order 조건 하에서 수행하였다. 시간에 따른 흡광도 변화는 Shimadzu UV-Vis 분광 광도계 (UV-1650PC)를 사용하여 모니터링하였다. 각 스펙트럼의 λ_max(Cu-TE2A 549 nm, Cu-TETA 615 nm)에서 감소하는 흡광도는 decomplexation 반응의 진행을 모니터하는데 사용하였다. 반감기는 ln(흡광도) 대 time의 직선그래프에서 기울기로부터 계산하였다. 각 실험은 2 내지 3번 반복하였고, 반감기의 평균값을 보고하였다. 각 경우에 대한 시간에 따른 전형적인 흡광도 그래프를 도 12a ~ 12f에 나타내었다.

(2) HPLC 을 사용한 산 탈착물 ( acidic decomplexation )연구

구리 착물 (Cu-TE2A와 Cu-TETA)의 샘플 농도는 5 M HCl에서 2.2 mmol이었다. 90℃, 5 M HCl에서 각 착물의 HPLC 스펙트럼은 등용매 용리법 (30 mM citric acid, 1 mL/min 유속도)으로 Xbridge C18 칼럼 (4.6 X 150 mm, 5 ㎛)상에 일부 용액 (20 ㎕)을 주사한 후 특정시간에 값을 기록하였다. 각 HPLC 스펙트럼의 λ_max(Cu-TE2A 549 nm, Cu-TETA 615 nm)에서 감소하는 흡광도는 decomplexation 반응의 진행을 모니터하는데 사용하였다.

[표 1] 구리 2가 착물들의 환원력과 산 탈착물 실험^a (acid decomplexation)에 대한 반감기 측정

높은 HCl 농도에서 pseudo first-order 조건하에 Cu-TE2A와 Cu-TETA의 산 탈착물 실험 (acidic decomplexation)에 대한 반감기는 상기 표 1에 요약하였다. 구체적으로 Cu-TE2A와 Cu-TETA에서 2 리간드의 구조적 유사함에도 불구하고, 산 탈착물 실험 (acidic decomplexation)에 대해 매우 다른 역학적 안정성을 보여주었다. 5M HCl에서 Cu-TE2A의 역학적 안정성은 Cu-TETA에 비해 적어도 10배 이상 높았다. 12M HCl (90℃)에서 Cu-TE2A의 반감기는 단지 2.6분이지만, Cu-TETA의 1.1분에 비해 여전히 2배 정도 높은 값이다. 90℃, 5M HCl 하에서 산 탈착물 실험 (acidic decomplexation)의 진행과정은 또한 HPLC 시스템에 반응 분액을 반복적으로 주사함으로서 모니터링 할 수 있다(도 13a, 13b). 온전한 구리 2가 착물의 피크 값이 감소할 때, 구리 2가 이온의 피크 값은 꾸준하게 증가하였다. Cu-TE2A의 3%는 6시간 이후에도 온전히 남아있는 반면, 모든 Cu-TETA 착물들은 40분 내에 분해되었다.

(3) 전기화학적 연구

Cyclic voltammetry는 3-전극 배열을 가지는 Biologic model SP-150을 사용하여 수행하였다. 실험 전극은 유리탄소 (지름=3 mm)이고, Ag/AgCl (sat. KCl) 대조 전극 그리고 Pt 선 계수 전극이 있다. 샘플은 스캔 속도 100 mV/s에서 빙초산으로 pH 7.0 로 맞춘 0.1 M 아세트산에서 실험하였다. 용액은 측정하는 동안 아르곤 (Ar) 대기 상태에서 유지하고 실험하기 위해 앞서 아르곤으로 30분 동안 산소를 제거하여 그 결과를 도 13c, 13d에 나타내었다. 그 결과 Cu-TE2A의 환원력은 -1.21 V (vs. Ag/AgCl)인 반면, Cu-TETA는 단지 -1.00 V였다. 이는 Cu-TE2A가 구리 1가 착물로 환원되는 것은 Cu-TETA의 경우보다 약 200 mV만큼 더 어렵다는 것을 의미하는 것으로, Cu-TE2A가 생리적인 조건하에서 구리 1가 이온으로의 환원과 뒤이은 탈금속에 대해 역학적으로 안정할 것이다.

결국, 2개의 구리 2가 착물의 산 탈착물 실험 (acidic decomplexation)에 대한 역학적 안정성에 있어서 이런 큰 차이는 그들의 다른 배위 형태에 기인하는 것으로 보인다. Cu-TE2A 착물의 X-선 결정 구조는 구리 2가 이온이 4개의 질소원자와 강하게 배위결합하고 있고 2개의 carboxylate 산소 원자가 8면체 형태로 2개의 axial 위치를 차지하고 있음을 보여주었다(반응식 7 참조). 이 경우에 강한 N ₄ in-plane ligand field가 착물에게 높은 역학적 그리고 열역학적 안정성을 주었다고 볼 수 있다. 대조적으로, Cu-TETA 착물의 중심부 배위 구 형태는 equatorial plane에 있는 N₂O₂ 배위와 axial 위치에 있는 2개의 고리 N₂ 원자와 관련 있으며, 이것이 역학적 불안정성을 증가시켜주는 요소일 것이다.

< 실시예 3> TE2A의 Cu-64 방사성 동위원소 레이블링

반응식 7

상기 반응식 7에 따라 0.1 M 아세트산 암모늄(ammonium acetate; pH 6.8)에 포함된 5 mM 리간드 TE2A에 0.1 N HCl에 포함된 캐리어-부재 ⁶⁴CuCl₂(한국원자력의학원)를첨가하여 TE2A와 ⁶⁴Cu의 착화합물을 생성시킨 후, 30℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 실리카 플레이스트 상에서 이동상(mobile phase; 1:1 메탄올: 10% 아세트산 암모늄)을 이용하는 방사박층크로마토그래피(radio TLC)를 사용하여 착물 형성을 최종 확인하였다. ⁶⁴Cu-TE2A의 Radio-HPLC분석은 등용매 용리법 (30 mM citric acid, 1 mL/min 유속도)으로 Xbridge C18 칼럼 (4.6 X 150 mm, 5 ㎛)을 사용하였다(도 14a, 14b).

< 비교예 3> TETA 의 Cu -64 방사성 동위원소 레이블링

⁶⁴Cu와 TETA의 착물은 0.1M ammonium acetate (pH = 6.8)에 있는 리간드 TETA의 5 mM 용액에 0.01 N HCl에 있는 ⁶⁴CuCl₂를 첨가하고 30℃에서 30분간 반응하여 형성하였다. 착물의 형성은 실리카판에 Methanol: 10% ammonium acetate = 1:1을 이동상으로 하여 radio TLC로 확인하였다. ⁶⁴Cu-TETA의 Radio-HPLC분석은 등용매 용리법 (30 mM citric acid, 1 mL/min 유속도)으로 Xbridge C18 칼럼 (4.6 X 150 mm, 5 ㎛)을 사용하였다(도 15a, 15b).

< 실험예 2> ⁶⁴ Cu - TE2A 와 ⁶⁴ Cu - TETA 의 평가

상기 실시예 3 및 비교예 3에서 합성한 ⁶⁴Cu-TE2A와 ⁶⁴Cu-TETA에 대하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

(1) 체외 혈청 안정성

⁶⁴Cu-TE2A와 ⁶⁴Cu-TETA의 체외 혈청 안정성은 500 ㎕ FBS (Fetal Bovine Serum)에 ⁶⁴Cu-TE2A와 ⁶⁴Cu-TETA (2 mM, 50μCi ) 50 ㎕ 를 넣어 수행하였다. 용액은 37℃에서 반응하였고 샘플은 FBS을 넣은 후 10, 30, 60 분 그리고 2, 4, 10, 24 시간에 radio-TLC로 분석하였다.

도 14a 및 도 15a는 ⁶⁴Cu-TE2A와 ⁶⁴Cu-TETA의 표지후 radio-TLC 측정 결과를 보여주는데 두 화합물 모두 100%로 표지되었음을 보여주고 있다. 또한 14b 및 도 15b는 표지한 ⁶⁴Cu-TE2A와 ⁶⁴Cu-TETA를 HPLC로 분석한 결과를 보여주는데 비방사성을 띠는 구리 착물 피크와 구리-64로 표지한 착물의 피크가 정확히 일치하는 것으로 보아 우리가 표지한 착물이 ⁶⁴Cu-TE2A와 ⁶⁴Cu-TETA가 각각 맞음을 확인할 수 있다.

(2) ⁶⁴ Cu - TE2A 및 ⁶⁴ Cu - TETA 의 생체분포 비교

성숙 암컷 스프래그-다우리 래트(180-190 g) 5마리(효창사이언스, 한국)를 꼬리정맥을 통하여 마리당 약 20 μCi의 ⁶⁴Cu-TE2A 및 ⁶⁴Cu-TETA가 희석된 200 ㎕ 를 주입하였다. 주입 후 24시간째에 래트를 희생시켰다. 원하는 기관 및 조직(혈액, 심장, 폐, 근육, 지방, 골, 이자, 신장 및 간)을 제거한 후 무게를 측정하고, 감마선-측정기를 이용하여 측정하였다. 래트 무게를 기준으로 비교하여 그램(gram)당 %ID (%ID/g)를 계산하였다.

⁶⁴Cu-TE2A의 배출과 체내 안정성을 평가하기 위해 ⁶⁴Cu 표지된 TE2A와 TETA를 사용하여 생체내 분포 연구를 하나씩 비교하며 수행하였다. 현재적으로 TETA는 표지된 착물의 우수한 체내 안정성과 용이한 방사성 표지로 인해, ⁶⁴Cu의 방사성 표지 연구에 대한 가장 흔하게 사용되고 있는 리간드 중 하나이다. 최근 ⁶⁴Cu 표지된 CB-TE2A가 TETA에 비해 탈금속이 적고 우수한 체내 안정성을 보여주는 논문이 발표되었지만, 항체와 같은 열에 민감한 생체 물질의 방사성 표지에 있어서 BFC로서의 CB-TE2A의 이용성은 높은 온도(95℃)에서 진행되는 가혹한 표지 조건에 의해 제약을 받는다.¹⁰ 구체적으로 도 16은 주사 후 24시간에 ⁶⁴Cu 표지된 TE2A와 TETA의 생체내 분포도 (시간시점당 5마리 스프라구-돌리 랫)를 도시한 그래프이다. 생체내 분포도 데이터는 ⁶⁴Cu-TE2A 착물이 TETA 카운터파트에 비해 생체 밖으로의 배출이 빠름을 명확하게 보여주었다; 주사 후 24시간에 모든 장기에서 ⁶⁴Cu-TETA에 비해⁶⁴Cu-TE2A의 방사능 섭취가 낮으며, 이는 ⁶⁴Cu-TE2A가 ⁶⁴Cu-TETA에 비해 생리학적 조건하에서 보다 안정하고 ⁶⁴Cu-TE2A 착물로부터 이탈된 자유 구리 이온의 트랜스킬레이션이 최소화되었음을 의미한다.¹⁷ ⁶⁴Cu-TE2A의 높은 안정성과 빠른 배출 패턴은 구리착물의 총 전하와 중심부 배위결합의 기하학적 구조에 기인한 것으로 보인다. ⁶⁴Cu-TE2A의 전체 전하는 중성인 반면, ⁶⁴Cu-TETA는 2개의 배위하지 않은 카르복실레이트 그룹 때문에 생리학적인 조건에서 -2이다.

(3) ⁶⁴Cu-TE2A를 이용한 microPET 영상 연구

동물 실험은 경북대학교 의과대학 동물실험실에서 사육된 balb/c 마우스 (7주령, 수컷, 22 g)를 이용하여 진행되었다. 181 μCi의 Cu-64로 표지된 ⁶⁴Cu-TE2A를 마우스의 꼬리정맥을 통하여 주입하였고 주입 후 1시간 30분, 6시간 20분이 지난 시점에 가스 마취 하에서 microPET (MicroPET R4 Rodent Model Scanner, Concorde Microsystems Inc., Knoxville, Tennessee) 영상 연구를 실시하였다. 이미징은 정해진 시간동안만 얻었고, 획득한 파일은 OSEM2D 재구성 방법을 거쳐 이미지화 하였다.

구체적으로 도 17은 ⁶⁴Cu-TE2A를 balb/c 마우스에 주사 후 1시간 30분 지난 뒤 획득한 microPET 영상 결과이다. 도면에서, "Transverse"는 신체의 장축에 대해 직각으로 위치한 면을 보여주는 영상이고, “Coronal”은 신체를 정면에서 바라보았을 때 보이는 단면 영상이며, "Sagittal"은 신체의 정중면과 평행한 단면으로 신체를 옆에서 보았을 때 보이는 단면 영상이다. 위 줄에 있는 3개의 영상은 간 위치에 촛점을 맞춘 영상이고 아래 줄의 신장에 촛점을 맞춘 영상이다. 대부분의 액티버티가 간과 신장에 있는 것을 알 수 있으며 신장을 통해 배출된 ⁶⁴Cu-TE2A가 방광에 다량 모여 있는 것을 알 수 있다.

구체적으로 도 18은 ⁶⁴Cu-TE2A를 balb/c 마우스에 주사 후 6시간 20분 지난 뒤 획득한 microPET 영상 결과이다. ⁶⁴Cu-TE2A 주사 후 1시간 30분 뒤의 영상인 도 17에 비해 5시간 이상 시간이 지났으므로 많은 방사능물질이 체외로 배출되어 몸 안에 남아 있는 방사능량이 도 17에 비해 현저히 낮은 것을 알 수 있다. 특히 방광에 모여있는 액티버티는 상당히 줄어들었음을 알 수 있다.

결국, MicroPET 영상연구에서 꼬리 정맥으로 주입한 ⁶⁴Cu-TE2A는 매우 빠르게 체내에서 빠져나감을 알 수 있다(참조: 도 17 및 도 18). 간과 신장 등 배출 기관을 제외한 다른 장기에 대한 섭취가 거의 보이지 않는다. 이 상의 결과는 24시간 뒤에 실시한 체내분포 실험 결과와도 일치하는 결과로써 체내에 주입된 ⁶⁴Cu-TE2A가 Cu-64의 분리 없이 매우 빠르게 체외로 배출됨을 확인시켜 주었다.

이상의 결과, 본 연구자들은 보호/위치선택적 알킬레이션을 이용하여 사이클람으로부터 TE2A를 보다 용이하게 제조할 수 있는 신규한 대안적 TE2A 합성 경로를 개발하였다. TE2A를 낮은 온도에서 정량적으로 방사성 동위원소 ⁶⁴Cu로 표지하였으며 표지된 ⁶⁴Cu-TE2A는 가장 많이 사용되는 킬레이트 TETA보다 in vivo에서 더 빠르게 체외로 배출되었다. MicroPET 영상연구에서도 체내 주입된 ⁶⁴Cu-TE2A가 매우 빠르게 간과 신장을 통해 체외로 배출됨을 실시간으로 확인할 수 있었다. 또한 질병특이적 펩타이드와 컨쥬게이션된 TE2A는 효과적으로 비교적 낮은 온도에서 Cu-64와 높은 수율로 표지할 수 있었다. 이러한 특징은 ⁶⁴Cu과 같은 방사성금속으로 질병특이적 펩타이드 및 항체를 표지하기 위한 새로운 BFC로서의 용도에 대한 매우 큰 잠재성을 암시한다. TE2A의 용이성은 다양한 금속 착물의 추가적인 구조적 변형을 하여 시각 영상 프로브, MRI 시약 및 촉매작용뿐 만 아니라 의학 영상 및 방사선치료와 같은 다양한 연구 분야의 응용을 가능케 한다.

<실시예 4> TE2A-사이클로(RGDyK) 콘쥬케이트(conjugate)에 대한 ⁶⁴Cu로의 표지화

[반응식 3]

상술한 반응식 3에 따라 pH 5.5, 4℃에서 30분 동안 TE2A:EDC(1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)-propyl] carbodiimide):SNHS(N-hydroxysulfonosuccinimide) = 1:0.5:0.6의 몰비(molar ratio)에서 EDC로 TE2A를 활성화시켰다. 물 500 ㎕에 TE2A (5 ㎎, 15.7 μ㏖), EDC (1.5 ㎎, 7.8 μ㏖) 및 SNHS (2 ㎎, 9.4 μ㏖)을 용해시키고, 4℃에서 pH 5.5를 적정하기 위하여 0.1 N 수산화나트륨(200 ㎕)를 가하였다. 4℃에서 30분 동안 저어주면서 반응시켰다. 사이클릭 RGDyK 펩타이드(c(RGDyK); 0.8 mg, 94 μ㏖)를 물 100 ㎕에 용해시키고 반응 혼합물을 첨가하였으며, 0.1 N 수산화나트륨(200 ㎕)을 가하여 pH 8.5로 적정한 후 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. TE2A-RGD 콘쥬게이트를 반-분취형(semi-preparative) HPLC로 정제하였다[Zorbax Agilent Prep-C¹⁸ 21.2 x 100 ㎜; 이동상은 95% A 용매(0.1% TFA (trifluoroacetic acid)가 포함된 수용액)와 5% B 용매(0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴)(0-2분)로부터 35% A 용매와 65% B 용매(32분)까지 3 ㎖/분의 유속으로 흘려주었다, 도 19). c(RGDyK) 콘쥬게이트를 포함하는 피크를 모아 38% 수율로 0.33 mg을 동결 건조하였다.

0.1 N NaOAC (pH 8) 완충액에 ⁶⁴Cu 1-2 mCi(1 mCi 당 2-5 ㎍ TE2A-c(RGDyK))을 첨가하여 TE2A-c(RGDyK)을 ⁶⁴Cu으로 레이블링 한 후 50℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 고정상으로 실리카 플레이트 및 1:1 MeOH:10% NH₄OAc의 용매를 사용하는 방사(Radio)-TLC로 방사화학적 수율을 결정하였다.

합성된 TE2A를 αvβ3 인테그린에 선택적 결합을 보이는 사이클릭 RGDyK와 컨쥬게이션 시켜 손쉽게 TE2A가 이중기능기 거대고리 화합물로 사용될 수 있음을 확인하였다. 컨쥬게이션 후 HPLC를 이용해 38%의 수율로 분리 정체하였다. 컨쥬게이션 된 TE2A-c(RGDyK) 화합물은 질량분석계를 이용해 분자량을 측정한 결과 예상치와 정확히 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이렇게 분리 정제된 TE2A-c(RGDyK)를 이용해 Cu-64로 표지하였을 경우 95%의 높은 수율로 표지할 수 있음을 확인하였다(도 19 ~ 25).

결국, TE2A의 용이한 합성, Cu-TETA에 비해 Cu-TE2A 착물의 우수한 역학적 안정성 그리고 낮은 온도에서 ⁶⁴Cu의 높은 표지율, 그리고 추가적인 구조적 변경없이 가능한 펩타이드와의 컨쥬게이트 형성 및 컨쥬게이트의 높은 방사성 표지율은 다양한 구리 2가 핵종을 위한 새로운 킬레이터로서 TE2A의 광범위한 사용으로 이끌 것으로 기대된다. 게다가 많은 새로운 이중기 킬레이터들이 TE2A을 기반으로 하여 유도될 수 있고 질병 특이적인 펩타이드와 항체를 표지하는데 사용될 수 있다. TE2A의 쉬운 접근성은 다양한 금속 착물들의 구조적 수정을 가능하게 하고 의학 영상과 방사성 치료뿐만 아니라, 형광 영상제, MRI 조영제 그리고 촉매와 같은 다양한 연구 분야로의 적용이 가능하게 한다.

본 발명의 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법은 위치선택적 합성공정을 이용하여 시스 이중치환 결과물을 생성하지 않으면서도 마일드한 반응조건에서 매우 우수한 수율로 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물을 제조할 수 있으므로, 진단영상분야에서 대단히 유용한 발명이며 의료용 방사성 핵종과 착물이 형성된 킬레이트를 질병특이적 항체와 컨쥬게이션시 치료용 방사성 의약품으로 사용될 수 있다.

Claims

(1) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 산화시켜 하기 화학식 2로 표시되는 비스아미날 화합물을 제조하는 단계;
(2) 상기 비스아미날 화합물을 알킬화시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 보호기가 부착된 트랜스 화합물을 제조하는 단계; 및
(3) 상기 보호기가 부착된 트랜스 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;를 포함하는 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식에서 R은 각각 독립적으로 H 또는 C_1~5의 알킬기;
X_1, X₂는 각각 독립적으로 C_{1 ~ 7}의 알킬렌기; NH₂, 말레이미드, 벤질아미노,
,
,
,
또는
로 치환된 C_{1 ~ 7}의 알킬렌기; 또는 -CH₂CO₂-이고;
Y는 C_{1 ~ 20}의 알킬기; 및
n, m은 각각 독립적으로 R또는R¹부분이 공유결합하고 있는 탄소원자의 원자가를 충족시키는 0 내지 2 중 어느 하나의 정수이다.
삭제
제1항에 있어서,
상기 (1)단계는 포름알데히드를 포함하는 극성용매에서 수행되는 것을 특징으로 하는 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (2) 단계는 C₁ _-3의 알킬 할로카르복실레이트 또는 C₁ _-3의 알킬 할로포스페이트를 상기 화학식 2의 화합물과 반응시키는 것을 특징으로 하는 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (3)단계는 알칼리를 포함하는 알콜 수용액을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 (3) 단계는 KOH 를 포함하는 에탄올 수용액에서 수행되는 것을 특징으로 하는 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물은 사이클람인 것을 특징으로 하는 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 화학식 3의 Y는 C₁ _~7의 알킬기인 것을 특징으로 하는 이작용기성 테트라아자 거대고리 화합물의 제조방법.
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