KR101190269B1 - Pantoea ananatis B1-9 that promotes crop yield - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물생장촉진 근권세균(PGPR)으로서 작물의 생장 및 작물의 수확량을 획기적으로 증가시키는 미생물 균주 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) B1-9에 관한 것이다. 판토에아 아나나티스 B1-9를 처리하면 작물의 생장이 증진되고, 고추의 수확량은 다른 식물생장촉진 근권세균(PGPR)균에 비해 2배 이상, 무처리구에 비해 3배 정도 증가될 수 있다. 또한, 판토에아 아나나티스 B1-9은 내생균으로서 식물체의 뿌리 내외부 조직에 효과적으로 정착하여 자라며, 배양이 용이하고 식물에 대한 병원성이 없어 환경 및 인축에 안전하다. 따라서, 친환경 미생물제제로서의 개발 가치와 효용성이 매우 높다.The invention Ana ah microorganism strain panto to dramatically increase the yield of growth of crops and crops as Rhizobacteria (PGPR) Plant growth promotion or the teeth (Pantoea ananatis ) on B1-9. Pantoea Ananatis Treatment of B1-9 enhances crop growth, and the yield of red pepper can be more than doubled compared to other PGPR and tripled compared to untreated plants. Also, Pantoea Ananatis B1-9 is an endogenous bacterium that grows and settles effectively inside and outside the roots of plants. It is easy to cultivate and safe for the environment and human beings because it is not pathogenic to plants. Therefore, the development value and utility as an eco-friendly microbial agent are very high.
식물생장촉진 근권세균(PGPR), 판토에아 아나나티스, 생장, 수확량, 비병원성 PGPR, Pantoea ananatis, growth, yield, non-pathogenicity
Description
본 발명은 식물생장촉진 근권세균(PGPR)으로서 작물의 수확량을 획기적으로 증가시키는 미생물 균주 판토에아 아나나티스 B1-9에 관한 것이다. The present invention relates to a microbial strain Pantoea ananatis B1-9, which dramatically increases the yield of crops as plant growth promoting root bacteria (PGPR).
농약과 화학물질을 전혀 사용하지 않는 친환경 유기농업 실천농가들의 가장 큰 애로사항은 병해충 방제 및 수량 감소이다. 이들 농가들은 작물생장 및 병해충 방제목적으로 다양한 친환경 유기농 자재를 구입 활용하고 있으나 효과가 불확실하고 경영비 상승의 요인이 되고 있다.The biggest challenge for farmers working in eco-friendly organic farming that does not use pesticides and chemicals at all is pest control and reduced yields. These farmers purchase and use various eco-friendly organic materials for crop growth and pest control, but the effect is uncertain and it is a factor of increase in operating cost.
이러한 상황에서 식물생장촉진 근권세균(PGPR)(Plant Growth Promoting Rizobacteria) 등 유용미생물을 이용한 생물적 방제 및 미생물비료 분야에 대한 연구가 국내외에서 활발히 진행되고 있다. 미생물 농약을 포함하는 생물농약의 경우 국외에는 260여 종, 국내에는 총 31종이 등록되어 있으며, 미생물비료는 230여 제품이 생산되고 있다. 최근에는 친환경농업 육성정책에 따라 화학비료 및 농약절감 녹색기술 소재로 미생물 관련 기술이 부각되고 있으며 축산사료 효율증진과 분뇨처리 및 환경개선제로도 미생물의 활용이 증대되고 있다. Under these circumstances, researches on biological control and microbial fertilizers using useful microorganisms such as plant growth promoting roots (PGPR) have been actively conducted at home and abroad. In the case of biopesticides containing microbial pesticides, about 260 species are registered overseas and 31 species are registered in Korea, and about 230 microbial fertilizers are produced. In recent years, microorganism-related technologies have emerged as green materials for reducing chemical fertilizers and pesticides in accordance with the policy of promoting eco-friendly agriculture, and the utilization of microorganisms has also increased as animal feed efficiency improvement, manure treatment and environmental improvement agents.
농업분야에 있어서 식물생장촉진 근권세균(PGPR)을 포함하는 미생물 비료에 있어서 요구되는 실질적인 기능은 작물의 수확량의 증대이다. 상기 언급한 바와 같이 다양한 종류의 미생물농약 또는 비료와 연구결과가 제공되고 있지만, 수확량 증대에 있어서 우수하고 확실한 효능을 나타내면서도 기타 작물에 병원성이 없어 생태적이며 친환경적인 균주의 개발사례는 많지 않으며, 이에 대한 개발이 무엇보다 필요한 시점이다.In the agricultural sector, the practical function required for microbial fertilizers, including PGPR, is to increase crop yields. As mentioned above, various kinds of microbial pesticides or fertilizers and research results have been provided, but there are not many cases of development of ecologically and environmentally friendly strains because they show excellent and sure efficacy in increasing yields but are not pathogenic to other crops. This is the point where development is needed.
이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 상기에 언급한 바와 같은 균주의 개발을 위하여 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Under such technical background, the present inventors have completed the present invention as a result of intensive efforts for the development of the strain as mentioned above.
결국, 본 발명의 목적은 작물의 수확량 증대에 있어서 우수하고 확실한 효능을 나타내면서도 기타 작물에 병원성이 없어 생태적이며 친환경적인 균주를 제공하는 데 있다.After all, it is an object of the present invention to provide an ecological and environmentally friendly strain having excellent and sure efficacy in increasing the yield of crops, but not pathogenic to other crops.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 하기의 미생물 균주 및 이의 처리 방법이 제공된다.In order to achieve the above object, the present invention provides the following microbial strains and treatment methods thereof.
본 발명의 일 측면에 따르면, 작물의 수확량을 증가시키는 활성을 갖는 판토에아 아나나티스 B1-9 (Pantoea ananatis B1-9) 균주(기탁번호: KACC 91518P)가 제공될 수 있다.According to one aspect of the invention, Pantoea ananatis B1-9 ( Pantoea having activity to increase the yield of crops ananatis B1-9) strain (Accession No. KACC 91518P) may be provided.
일 실시예에 따르면, 상기 작물은 고추일 수 있다.According to one embodiment, the crop may be pepper.
일 실시예에 따르면, 상기 균주는 미국 국립생물정보센터(NCBI) 액세스 번호 EF690403으로 기재되는 16S rRNA염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.According to one embodiment, the strain may be characterized by having a 16S rRNA base sequence as described by the US National Biological Information Center (NCBI) access number EF690403.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 신규의 판토에아 아나나티스 B1-9 균주(기탁번호: KACC 91518P) 또는 그 배양여액을 함유하는 작물의 수확량 증진용 미생물 제제가 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a novel pantoea ananatis B1-9 strain (Accession Number: KACC 91518P) or a microbial agent for improving yield of a crop containing the culture filtrate may be provided.
일 실시예에 따르면, 상기 균주를 107~108cfu/ml 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제가 제공될 수 있다.According to one embodiment, a microbial agent may be provided that contains the strain at a concentration of 10 7 to 10 8 cfu / ml.
일 실시예에 따르면, 상기 균주에 대하여 제제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제가 제공될 수 있다.According to one embodiment, a microbial agent may be provided further comprising a pharmaceutically acceptable carrier for the strain.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 균주를 식물에 관주(물주기)하는 것을 특징으로 하는 재배 방법이 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, there may be provided a cultivation method characterized in that the strain irrigation (water cycle) to the plant.
판토에아 아나나티스 B1-9을 처리한 결과 작물의 생장이 증진되고, 고추의 수확량은 다른 식물생장촉진 근권세균(PGPR)균에 비해 2배 이상, 무처리구에 비해 3배 정도 증가되는 것으로 나타났다. 판토에아 아나나티스 B1-9은 내생균으로서 식물체의 뿌리 내외부 조직에 효과적으로 정착하여 자라며 배양이 용이하고 식물에 대한 병원성이 없어 환경 및 인축에 안전하다. 따라서, 친환경 미생물제제로서의 개발 가치와 효용성이 매우 높은 것으로 나타났다.Pantoea Ananatis The treatment of B1-9 increased crop growth, and the yield of red pepper was more than doubled compared to other plant growth promoting PGPR and about three times higher than untreated. Pantoea Ananatis B1-9 is an endogenous bacterium that is effectively settled and grows inside and outside the roots of plants, and is easy to cultivate and is safe for the environment and human beings because it is not pathogenic to plants. Therefore, development value and utility as an eco-friendly microbial agent were found to be very high.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 측면에 따르면, 작물의 수확량을 증가시키는 활성을 갖는 판토에아 아나나티스 B1-9 (Pantoea ananatis B1-9) 균주(기탁번호: KACC 91518P)가 제공될 수 있다.According to an aspect of the present invention, Pantoea ananatis B1-9 strain (Accession Number: KACC 91518P) having an activity of increasing the yield of crops may be provided.
일 실시예에 따르면, 상기 작물은 고추일 수 있다.According to one embodiment, the crop may be pepper.
일 실시예에 따르면, 상기 균주는 미국 국립생물정보센터(NCBI) 액세스 번호 EF690403으로 기재되는 16S rRNA염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.According to one embodiment, the strain may be characterized by having a 16S rRNA base sequence as described by the US National Biological Information Center (NCBI) access number EF690403.
도 1a는 판토에아 아나나티스 B1-9의 콜로니 및 전자현미경적인 형태를 나타낸다. 판토에아 아나나티스 B1-9는 TSA 배지에 도말하여 배양해 본 결과 황색의 콜로니를 나타내었으며, 전자현미경을 통해 관찰해 본 결과 긴 편모를 갖는 막대형태로 관찰되었다. 1A shows colonies and electron microscopic forms of Pantoea ananatis B1-9. Pantoea ananatis B1-9 showed yellow colonies as a result of culturing on TSA medium and observed as an electron microscope and showed a rod with long flagella.
도 1b는 염기서열 분석을 통한 판토에아 아나나티스 B1-9의 계통분류학적인 위치를 나타낸다. 미국 국립생물정보센터(NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank 데이터 베이스를 활용하면 16S rRNA의 염기서열 분석을 통해 근연종들을 규명할 수 있는데, 본 발명의 동정된 균주가 판토에아 아나나티스와 동종인 것으로 나타나고 있다.Figure 1b shows the phylogenetic location of Pantoea ananatis B1-9 through sequencing. Using the GenBank database of the National Institute of Biological Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov), it is possible to identify related species through sequencing of the 16S rRNA. It is shown to be homologous to Anaanatis.
상기 도 1a에서 관찰된 콜로니의 형태 및 색깔, 전자현미경 관찰 결과와 도 1b에 나타나 있는 계통분류학적인 결과를 종합하여 판단할 때, 상기 분리된 균주는 판토에아 아나나티스인 것으로 동정할 수 있었으며, 이를 판토에아 아나나티스 B1-9로 명명하고 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다. 기탁번호는 KACC 91518P이다.Judging from the combination and shape of the colonies observed in Figure 1a, electron microscopy results and phylogenetic results shown in Figure 1b, the isolated strain could be identified as Pantoea ananatis. It was named Pantoea ananatis B1-9 and deposited in the National Institute of Agricultural Science. The accession number is KACC 91518P.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 신규의 판토에아 아나나티스 B1-9 균주(기탁번호: KACC 91518P) 또는 그 배양여액을 함유하는 작물의 수확량 증진용 미생물 제제가 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a novel pantoea ananatis B1-9 strain (Accession Number: KACC 91518P) or a microbial agent for improving yield of a crop containing the culture filtrate may be provided.
도 2는 판토에아 아나나티스 B1-9의 인 가용화 능력(A), 황산화 능력(B) 및 인돌아세트산(IAA) 생성 능력(C)을 나타낸다. 인돌아세트산은 식물 호르몬인 옥신의 일종으로서 식물의 생장에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 하기에서 나타나는 판토에아 아나나티스 B1-9의 식물에 대한 생장효과 및 수확량 증진에 대한 분자생물학적인 기전을 뒷받침하는 데이터로 볼 수 있다. 2 shows the phosphorus solubilizing ability (A), sulfated ability (B) and indole acetic acid (IAA) generating ability (C) of Pantoea ananatis B1-9. Indole acetic acid is a kind of plant hormone auxin and is known to be involved in plant growth. Therefore, it can be seen as data supporting the molecular biological mechanisms for the growth effect and yield increase for plants of Pantoea ananatis B1-9 shown below.
도 3은 판토에아 아나나티스 B1-9에 대한 식물 병원성 검정 결과를 나타낸다. 도 3 우측의 판토에아 아나나티스 균주(미국 국립생물정보센터 액세스 번호 AF364847, Pantoea ananatis strain LMG 20103)는 배추, 당근 및 양파에 무름병을 일으켰으나, 판토에아 아나나티스 B1-9은 식물에 대해 비병원성인 것으로 나타났다.3 shows the plant pathogenicity assay results for Pantoea ananatis B1-9. Pantoea ananatis strain (US National Biological Information Center Access No. AF364847, Pantoea ananatis strain LMG 20103) on the right of FIG. 3 caused the cabbage, carrot, and onions to be infested with the pantoea ananatis B1-9. It has been shown to be nonpathogenic for.
도 4는 판토에아 아나나티스 B1-9의 고추에 대한 근권정착 및 내생(endophyte)능력을 나타내는 공초점 현미경 사진이다. A 및 B는 고추뿌리 표면에 넓게 분포하는 판토에아 아나나티스 B1-9의 양상을 나타내고 있으며(붉은 점으로 나타남), C 및 D는 고추 내부의 피질세포(Cortex cell)에서 자라는 판토에아 아나나티스 B1-9(노란색 화살표), E 및 F는 고추줄기 표면에서 자라는 판토에아 아나나티스 B1-9, G 및 H는 고추잎의 공변세포(guard cell)에 분포하는 판토에아 아나나티스 B1-9를 나타내고 있다. 이 때 각 사진 우측하단의 표시막대의 길이는 10 마이크로 미터를 나타낸다. 도 4에 나타난 관찰결과, 판토에아 아나나티스 B1-9는 근권에 정착하는 능력이 우수한 내생균인 것으로 나타났다.FIG. 4 is a confocal micrograph showing pantoea ananatis B1-9 capillary fixation and endophyte ability to red pepper. A and B show Pantoea ananatis B1-9 widely distributed on the surface of red pepper roots (shown as red dots), and C and D are pantoeas that grow in the cortex cells inside the pepper. Ananas B1-9 (yellow arrow), E and F are pantoeas that grow on the surface of the red pepper stem Ananas B1-9, G and H are pantoea anas distributed in the guard cells of the pepper leaf. Natis B1-9 is shown. At this time, the length of the display bar at the bottom right of each picture represents 10 micrometers. As a result of the observation shown in FIG. 4, Pantoea ananatis B1-9 was found to be an endogenous bacteria having excellent ability to settle in the rhizosphere.
도 5a는 판토에아 아나나티스 B1-9의 고추, 오이, 토마토의 유묘생장 촉진효과를 나타낸 사진이며, 도 5b는 판토에아 아나나티스 B1-9의 고추, 오이, 토마토의 유묘생장 촉진효과를 그래프로 나타낸 것이다. 도 1의 무처리에 비해 판토에아 아나나티스 B1-9를 처리한 경우, 고추에서는 초장, 엽수 및 지상부 생체중이 모두 증가하는 경향을 나타내고 있으며, 오이 및 토마토에서도 초장 및 지상부 생체중이 증가하는 경향을 나타내고 있다. Figure 5a is a photograph showing the effect of promoting the seedling growth of pepper, cucumber, tomato of Pantoea ananatis B1-9, Figure 5b is the seedling growth of pepper, cucumber, tomato of Pantoea ananatis B1-9 The effect is graphed. When treated with Pantoea ananatis B1-9 compared to no treatment of Figure 1, The pepper show a tendency to increase both the plant height, leaf number and shoot fresh weight, and cucumber In addition, tomatoes have a tendency to increase the height and ground live weight.
도 6은 판토에아 아나나티스 B1-9의 고추 수확량 증대에 대한 결과를 나타낸다. 아래의 그래프에 나타나 있는 바와 같이, 판토에아 아나나티스 B1-9를 처리한 고추의 경우 무처리군 및 대장균에 비해 3배 이상의 고추수확량을 나타내는 것으로 관찰되었다.6 shows the results for increasing pepper yield of Pantoea ananatis B1-9. As shown in the graph below, red peppers treated with Pantoea ananatis B1-9 showed more than three times the yield of red pepper compared to the untreated group and E. coli.
도 2 내지 6에서 나타난 바와 같이, 판토에아 아나나티스 B1-9은 비병원성으로서 작물의 생장 촉진 효과를 나타내고 있으며, 특히 고추의 경우에는 현저한 수확량의 증가를 나타내고 있음을 알 수 있다. 또한 상기 균주는 대량 배양이 용이하고, 하기 실시예에 기술된 바와 같이 국내를 산지로 하는 파의 근권으로부터 동정 된 것이므로, 국내의 재배환경에도 별다른 생태적인 교란 없이 바로 적용될 수 있는 장점이 있다.As shown in Figures 2 to 6, Pantoea ananatis B1-9 is non-pathogenic, showing the effect of promoting the growth of crops, particularly in the case of red pepper it can be seen that the marked increase in yield. In addition, the strain is easy to mass cultivation, and as described in the root region of the wave originating in Korea as described in the following examples, there is an advantage that can be applied directly to domestic cultivation environment without any ecological disturbance.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 균주에 대하여 제제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제가 제공될 수 있다. According to one embodiment of the present invention, a microbial agent may be provided further comprising a pharmaceutically acceptable carrier for the strain.
상기 담체는 판토에아 아나나티스 B1-9의 활성을 유지시켜 줄 수 있는 것이면 무엇이든 가능하다. 이에 국한되지는 않으나, 이러한 담체의 종류로는 수지류, 실리카 등과 같은 광물류 및 기타의 다공성 매질, 고분자 소재 등 통상적인 토양뿐만 아니라 온도가 낮거나 높은 토양, 토양이 아닌 매질 등 통상의 재배 환경이 아닌 상황에 있어서도 상기 균주의 활성을 유지시킬 수 있는 것이면 무엇이든 적용될 수 있다. The carrier may be anything that can maintain the activity of Pantoea ananatis B1-9. Such carriers include, but are not limited to, conventional soils such as minerals such as resins, silica, and other porous media, polymer materials, as well as low or high temperature soils, and mediums other than soils. Anything that can maintain the activity of the strain even if the situation can be applied.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 판토에아 아나나티스 B1-9 균주 또는 그 배양여액을 식물에 관주(물주기)하는 것을 특징으로 하는 재배 방법이 제공될 수 있다. 여기서, 관주의 방법은 제한되어 있지 않으며, 식물의 근권에 상기 판토에아 아나나티스 B1-9 균주가 증식하여 식물의 수확량에 영향을 미칠 수 있는 정도이면 어떠한 방법이든 적용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 균주를 0.1M MgSO4로 수확하고 107~108cfu/ml로 희석하여 작물의 근권에 관주하는 방법을 사용하고 있으나, 스프레이 형식의 도포, 담체 또는 용기를 이용한 서방형 도포 등 어떠 한 방법도 가능하다. According to another aspect of the present invention, a cultivation method characterized in that the pantoea ananatis B1-9 strain or its culture filtrate irrigation (watering) to the plant. Here, the method of irrigation is not limited, and any method may be applied as long as the pantoea ananatis B1-9 strain is propagated in the root zone of the plant to affect the yield of the plant. In the embodiment of the present invention, the strain is harvested with 0.1M MgSO 4 and diluted to 10 7 to 10 8 cfu / ml, and the method of irrigation in the root zone of the crop is used, but the sustained release using a spray-type coating, a carrier or a container Any method such as application is possible.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It should be understood, however, that these examples are for illustrative purposes only and are not to be construed as limiting the scope of the present invention.
실시예Example 1: One: 판토에아Pantoea 아나나티스Ananatis B1-9의 동정 Identification of B1-9
판토에아 아나나티스 B1-9는 경남 명지의 파 재배포장에서 파의 근권으로부터 분리된 균주들을 통상적인 근권 세균의 분리 방법(Kim et al. Korean J. Soil. & Fert. vol.35(1):59~67, 2002, Materials and method)을 통해 분리하였다. Pantoea ananatis B1-9 is a method for the isolation of conventional root-strain bacteria (Kim et al. Korean J. Soil. & Fert. Vol. 35 (1)). ): 59-67, 2002, Materials and method).
분리된 토착 미생물 중 식물체의 근권(뿌리)에 정착하여 자라면서 작물의 생장을 촉진하거나 병 저항성을 높이는 유용미생물(식물생장촉진 근권세균(PGPR), Plant Growth Promoting Rhizobacteria)을 선발하기 위하여 고추, 오이, 토마토의 유묘검정을 거친 결과, 판토에아 아나나티스 B1-9이 선발되었다. 유묘검정은 환경조절실에다 종자를 심고 발아후 어린 묘에 나타나는 병의 징후를 관찰하여 병에 걸린 것인지 아닌지를 가리는 방법을 말하며, 본 실험에서는 고추, 오이, 토마토의 종자 각 20개 씩을 25℃로 유지되는 환경조절실에 파종하고, 각 파종된 유묘의 근권에 상기 분리된 균주들을 관주(물주기)하여 병의 징후 및 생장율을 관찰하였다.Pepper, cucumber to select useful microorganisms (PGPR, Plant Growth Promoting Rhizobacteria) that settles in the root zone (root) of the isolated native microorganism and promotes crop growth or increases disease resistance. As a result of the seedling assay of the tomato, Pantoea ananatis B1-9 was selected. Seedling test refers to a method of screening seeds or seeds after germination in the environment control room and screening for signs of disease in young seedlings.In this experiment, 20 seeds of red pepper, cucumber and tomato should be kept at 25 ℃. The isolated strains were seeded in the maintained environmental control room, and the isolated strains were irrigated (watered) in the root zone of each seeded seedling to observe signs and growth rate of the disease.
유묘검정을 통해 작물의 생장과 병 저항성을 높이는 유용미생물로서 최종적으로 하나의 균주가 선발되었으며, 이에 대해서는 16S rRNA의 염기서열 분석을 통 해 종간의 근연관계를 조사하였다. 이 때, 염기서열 분석을 위해 준비된 프라이머(서열목록 1의 27F 및 서열목록 2의 1492R)로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석한 다음, 미국 국립생물정보센터(NCBI) 데이터 베이스를 통해 가장 근접한 종들을 분석하고 그 계통도를 작성하였다 (도 1b 참조). Finally, one strain was selected as a useful microorganism to increase the growth and disease resistance of crops through seedling assay, and the relationship between species was examined through sequencing of 16S rRNA. At this time, the nucleotide sequence of the PCR product amplified with the primers prepared for sequencing (27F of SEQ ID NO: 1 and 1492R of SEQ ID NO: 2) was analyzed, and then the closest to the National Bioinformatics Center (NCBI) database. Species were analyzed and their schematics drawn (see FIG. 1B).
또한, 상기 균주를 TSA(Tryptic Soy Agar) 배지에 도말한 다음, 25℃에서 배양하여 콜로니의 외형 및 전자현미경을 통해 미세구조를 관찰한 결과, 막대모양 외형과 긴 편모가 관찰되었으며, 이는 판토에아 아나나티스의 형태학적 특징과 일치하는 것을 확인하였다(도 1a 참조). 이와 같은 분석을 통해 상기 분리된 균주가 판토에아 아나나티스와 동종인 것으로 확인하고, 이를 판토에아 아나나티스 B1-9로 명명하고 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다. 기탁번호는 KACC 91518P (16S rRNA의 염기서열은 미국 국립생물정보센터(NCBI) accession No. EF 690403로 등재함)이다.In addition, the strain was plated on TSA (Tryptic Soy Agar) medium, and then cultured at 25 ° C. to observe the microstructure through the appearance and the electron microscope of the colony, and the rod-like appearance and the long flagella were observed on the panto It was confirmed that it is consistent with the morphological characteristics of Anaanatis (see FIG. 1A). Through this analysis, the isolated strain was confirmed to be the same as Pantoea ananatis, named as Pantoea ananatis B1-9 and deposited in the Agricultural Genetic Resource Center of the National Academy of Agricultural Science. The accession number is KACC 91518P (nucleotide sequence of 16S rRNA is listed as US National Biological Information Center (NCBI) accession No. EF 690403).
실시예Example 2: 2: 판토에아Pantoea 아나나티스Ananatis B1-9의 배양 및 Incubation of B1-9 and 관주(물주기)처리를Cross-border treatment 통한 식물 병원성 검사 Plant pathogenicity test
상기 실시예 1에서 동정된 판토에아 아나나티스 B1-9은 TSA(Tryptic Soy Agar)에 도말한 다음 25℃에서 2일간 배양한 후 0.1M MgSO4로 수확하였다. 대량 액체배양은 TSB(Tryptic Soy Broth)에 판토에아 아나나티스 B1-9을 접종한 후 25℃에서 120rpm/min 속도로 5일간 교반하여 배양한 후 0.1M MgSO4로 수확하고 108 cfu/ml 농도로 희석하였다. Pantoea ananatis B1-9 identified in Example 1 was plated in TSA (Tryptic Soy Agar) and then incubated at 25 ° C. for 2 days and then harvested with 0.1M MgSO 4 . Bulk liquid culture was then incubated 5 days stirring at 120rpm / min rate at 25 ℃ were inoculated ah analog or tooth B1-9 in panto in TSB (Tryptic Soy Broth) harvested in 0.1M MgSO 4 and 10 8 cfu / Dilute to ml concentration.
그런 다음, 작물을 포장 정식(아주 심기, 온상에서 기른 모종을 밭에 제대로 심음)한 후에 주당 100ml씩 근권에 관주(물주기)하였다. 이러한 방법으로 양파, 당근 및 배추에 균주를 처리한 결과, 양파 속썩음병을 일으키는 것으로 알려져 있는 기존의 판토에아 아나나티스 LMG 20103과는 달리 본 발명의 판토에아 아나나티스 B1-9은 양파와 당근 및 배추를 이용한 식물병원성 검정에서 병원성이 전혀 없는 것으로 나타났다(도 3 참조). The crops were then packaged (planted very well, seedlings grown in hotbeds in the field) and then irrigated (watered) in the root zone at 100 ml per week. As a result of treating the onion, carrot and cabbage strain in this way, unlike the existing
실시예Example 3: 3: 판토에아Pantoea 아나나티스Ananatis B1-9의 식물 생장 촉진 활성 측정 Measurement of plant growth promoting activity of B1-9
본 발명의 균주 판토에아 아나나티스 B1-9는 식물생장 호르몬인 인돌아세트산(IAA) 생성능, 인산가용화(Phosphate solubilizing)능 및 황산화능을 보유하고 있는 것으로 나타났다(도 2 참조).Strain Pantoea ananatis B1-9 of the present invention has been shown to have the ability to produce plant growth hormone indole acetic acid (IAA), phosphate solubilizing and sulfated ability (see FIG. 2).
인산가용화능에 대한 검정을 위해 NBRIP(national botanical research institute's phosphate growth) 한천 배지 (glucose 10 g, Ca3(PO4)2 5 g, MgCl2 ㆍH2O 5 g, MgSO4 ㆍH2O 0.25 g, KCl 0.2 g, (NH4)2SO4 0.1 g, agar 15 g, pH 7.0)에 실시예 1을 통해 선발된 세균을 접종하여 28℃에서 2일간 배양한 후 관찰하였다. 판토에아 아나나티스 B1-9는 NBRIP 배지에 첨가되어 있는 삼인산 칼슘(Tricalcium phosphate, Ca3(PO4)2)을 포스파타아제(phosphatase)를 분비하여 분해함으로써 접종부위에 뚜렷한 클린존(clean zone)을 나타내는 것을 관찰할 수 있었다(도 2의 A). NBRIP (national botanical research institute's phosphate growth) agar medium (glucose 10 g, Ca 3 (PO 4 ) 2 5 g, MgCl 2 ㆍ H 2 O 5 g, MgSO 4 ㆍ H 2 O 0.25 g , KCl 0.2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 0.1 g, agar 15 g, pH 7.0) was inoculated with the bacteria selected in Example 1 and incubated for 2 days at 28 ℃ was observed. Pantoea ananatis B1-9 produces distinct clean zones at the site of inoculation by secreting and decomposing tricalcium phosphate (Ca 3 (PO 4 ) 2 ) added to NBRIP medium by phosphatase. zone) can be observed (A in FIG. 2).
황산화 검정을 위해서는 미네랄염(mineral salts) 배양기(Na2S2O3 5.0g, K2HPO4 0.2g, MgCl2ㆍH2O 2.5g, NH4Cl 1.0g, bromocresol purple 0.002g, pH 7.5, 150mM methanol)에 상기와 동일한 균주를 접종하여 28℃에서 2일간 배양한 결과, 도 2의 B와 같이 접종부위에 황산(sulfuric acid)의 생산에 의해 노란색의 홀로존(holo zone)이 생성되는 것을 관찰할 수 있었다. The mineral salts incubator (Na 2 S 2 O 3) 5.0 g, 0.2 g of K 2 HPO 4 , 2.5 g of MgCl 2 · H 2 O, 1.0 g of NH 4 Cl, 0.002 g of bromocresol purple, pH 7.5, 150 mM methanol) and inoculated with the same strain as above and incubated at 28 ° C. for 2 days. As a result, as shown in B of Figure 2 it was observed that the production of yellow holo (holo zone) by the production of sulfuric acid (sulfuric acid) in the inoculation site.
인돌아세트산(IAA) 생산능은 균주를 L-트립토판(L-Tryptophan)을 0.1% 첨가한 King' B(Proteose peptone No. 3 2g, K2HPO4 0.15g, MgSO4 ㆍH2O 0.15g, glycerol 1.5%, pH 7.2) 배지에 접종하고 28℃에서 2일간 배양한 후 8,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 회수한 배양상등액 1 ml에 Salkowski시약(35% HClO4 50 ml에 0.5M FeCl3ㆍH2O 1ml를 용해) 2 ml를 첨가하고 30분간 반응시킨 후 색의 변화를 관찰하였다. 도 2의 C와 같이 L-트립토판(L-tryptophan)을 전구물질로 사용한 비색실험에서 대조군(control)에 비해 우측 사진 B1-9에서 적색의 변화가 관찰 되는 것을 통해 판토에아 아나나티스 B1-9가 인돌아세트산(IAA)을 생산하는 것을 알 수 있었다.Indoleacetic acid (IAA) is the producing ability of the strain L- tryptophan (L-Tryptophan) 0.1% addition of the King 'B (Proteose peptone No. 3 2g,
실시예Example 4: 4: 판토에아Pantoea 아나나티스Ananatis B1-9의 서식조건 관찰 Observation of habitat conditions of B1-9
실시예 2와 같은 방법으로 고추의 뿌리에 판토에아 아나나티스 B1-9를 관주(물주기)하고 7일간 재배한 후, DRAQ5 형광염료(fluorescence dye)로 염색하여 공초점(confocal) 현미경으로 조사한 결과 판토에아 아나나티스 B1-9은 고추뿌리의 외부뿐만 아니라 내부조직에서 자라는 내생균(endophyte)인 것으로 밝혀졌다(도 4 참조). 판토에아 아나나티스 B1-9은 근권 정착 능력이 높아 작물 생육 초기에 단 1회 관주(물주기) 처리로 수확기까지 효과를 나타내었다. Pantoea ananatis in the root of pepper in the same manner as in Example 2 After fertilizing (watering) B1-9 and cultivating for 7 days, staining with DRAQ5 fluorescence dye and confocal microscopy showed pantoea ananatis. B1-9 was found to be an endophyte that grows in internal tissues as well as outside of red pepper roots (see Figure 4). Pantoea Ananatis B1-9 had a high rooting capacity and showed effective effects until harvest by only one irrigation treatment at the beginning of crop growth.
실시예Example 5: 5: 판토에아Pantoea 아나나티스Ananatis B1-9의 고추 수확량 증대 효과 관찰 Observation of B1-9 Pepper Yield
고추를 정식(아주 심기)한 다음, 실시예 2와 같은 방법으로 판토에아 아나나티스 B1-9을 한 그루당 100ml씩 고추의 근권에 관주(물주기)하였다. 마찬가지로, 기타 식물생장촉진 근권세균(PGPR)으로 알려져 있는 균주들로서 기존에 오이에서 생장촉진효과가 검정된 Serratia grimesii N10-1, Bacillus baekryungensis Y39-4, Pedobacter steynii U46-1, Bacillus weihenstephanensis K10-3를 상기 실시예 1에서 동정된 판토에아 아나나티스 B1-9와 함께 고추포장에 처리하였다. 각 처리구당 25그루의 고추로부터 수확된 전체 생산량을 도 6 우측 하단의 그래프에 나타내었다. 그 결과, 판토에아 아나나티스 B1-9를 처리한 결과, 수확량이 18.6kg 에 달하며, 그래프 하단에 도시되어 있는 다른 식물생장촉진 근권세균(PGPR)균들에 비해 2배 이상, 무처리구에 비해 3배 정도 많은 수확량을 나타내는 것으로 관찰되었다. After the red pepper is planted (very planted), Pantoea ananatis is prepared in the same manner as in Example 2. 100 ml of B1-9 was irrigated into the root of pepper. Similarly, Serratia, another strain known as PGPR, has been tested for growth promoting effects in cucumbers. grimesii N10-1, Bacillus baekryungensis Y39-4, Pedobacter steynii U46-1, Bacillus weihenstephanensis K10-3 was treated in pepper packaging with Pantoea ananatis B1-9 identified in Example 1 above. The total yield harvested from 25 peppers per treatment was shown in the graph at the bottom right of FIG. 6. As a result, Pantoea Ananatis As a result of B1-9 treatment, the yield was 18.6kg, which was more than doubled compared to other PGPRs shown at the bottom of the graph, and three times more than the untreated group. .
이러한 수확량 증대의 결과는 상기 실시예 2에서 공초점 현미경 등의 관찰결과를 통해 나타난 바와 같이, 판토에아 아나나티스 B1-9가 내생균으로서 식물체의 뿌리 내외부 조직에 효과적으로 정착할 수 있으며, 식물생장 호르몬인 인돌아세트산(IAA) 생성능, 인산가용화(Phosphate solubilizing)능 및 황산화능을 보유하고 있는 것으로 나타난 실시예 3의 결과로 뒷받침될 수 있다.As a result of the increase in yield is shown through observation results such as confocal microscope in Example 2, Pantoea ananatis B1-9 is an endogenous bacterium that can effectively settle in and outside the roots of plants, and has the ability to produce plant growth hormone indoleacetic acid (IAA), phosphate solubilizing and sulfate The results can be supported.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
도 1a는 판토에아 아나나티스 B1-9의 콜로니 및 전자현미경적인 형태를 나타낸다.1A shows colonies and electron microscopic forms of Pantoea ananatis B1-9.
도 1b는 염기서열 분석을 통한 판토에아 아나나티스 B1-9의 계통분류학적인 위치를 나타낸다.Figure 1b shows the phylogenetic location of Pantoea ananatis B1-9 through sequencing.
도 2는 판토에아 아나나티스 B1-9의 인 가용화 능력(A), 황산화 능력(B) 및 IAA 생성 능력(C)을 나타낸다.2 shows the phosphorus solubilizing ability (A), sulfated ability (B) and IAA producing ability (C) of Pantoea ananatis B1-9.
도 3은 판토에아 아나나티스 B1-9에 대한 식물 병원성 검정 결과를 나타낸다. 3 shows the plant pathogenicity assay results for Pantoea ananatis B1-9.
도 4는 판토에아 아나나티스 B1-9의 고추에 대한 근권정착 및 내생(endophyte)능력을 나타내는 공초점 현미경 사진이다. A 및 B는 고추뿌리 표면에 넓게 분포하는 판토에아 아나나티스 B1-9의 양상을 나타내고 있으며(붉은 점으로 나타남), C 및 D는 고추 내부의 피질세포(Cortex cell)에서 자라는 판토에아 아나나티스 B1-9(노란색 화살표), E 및 F는 고추줄기 표면에서 자라는 판토에아 아나나티스 B1-9, G 및 H는 고추잎의 공변세포(guard cell)에 분포하는 판토에아 아나나티스 B1-9를 나타내고 있다. 이 때 각 사진 우측하단의 표시막대의 길이는 10 마이크로 미터를 나타낸다. FIG. 4 is a confocal micrograph showing pantoea ananatis B1-9 capillary fixation and endophyte ability to red pepper. A and B show Pantoea ananatis B1-9 widely distributed on the surface of red pepper roots (shown as red dots), and C and D are pantoeas that grow in the cortex cells inside the pepper. Ananas B1-9 (yellow arrow), E and F are pantoeas that grow on the surface of the red pepper stem Ananas B1-9, G and H are pantoea anas distributed in the guard cells of the pepper leaf. Natis B1-9 is shown. At this time, the length of the display bar at the bottom right of each picture represents 10 micrometers.
도 5a는 판토에아 아나나티스 B1-9의 고추, 오이, 토마토의 유묘생장 촉진효과를 나타낸 사진이다. Figure 5a is a photograph showing the effect of promoting seedling growth of pepper, cucumber, tomato of Pantoea ananatis B1-9.
도 5b는 판토에아 아나나티스 B1-9의 고추, 오이, 토마토의 유묘생장 촉진효 과를 그래프로 나타낸 것이다. Figure 5b is a graph showing the effect of promoting seedling growth of pepper, cucumber, tomato of Pantoea ananatis B1-9.
도 6은 판토에아 아나나티스 B1-9의 고추 수확량 증대에 대한 결과를 나타낸다. 6 shows the results for increasing pepper yield of Pantoea ananatis B1-9.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Pantoea ananatis B1-9 that promotes crop yield <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. ananatis B1-9 16S rRNA forward primer 27F <400> 1 ttctcgggtg ac 12 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. ananatis B1-9 16S rRNA reverse primer 1492R <400> 2 ttaagctacc ta 12 <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Pantoea ananatis B1-9 that promotes crop yield <160> 2 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P. ananatis B1-9 16S rRNA forward primer 27F <400> 1 ttctcgggtg ac 12 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 ananatis B1-9 16S rRNA reverse primer 1492R <400> 2 ttaagctacc ta 12
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