KR101189839B1 - Ptger gene family polymorphisms marker for diagnosing aspirin intolerant asthma - Google Patents

Abstract

본 발명은 PTGER 유전자 패밀리 다형성을 이용하는 아스피린 과민성 천식 진단용 마커, 아스피린 과민성 천식 진단 키트 및 아스피린 과민성 천식을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 아스피린 과민성 천식의 발생 위험을 예측할 수 있으며, 천식의 치료 분야에 유용하게 이용될 수 있다. The present invention relates to aspirin-sensitive asthma diagnostic markers, aspirin-sensitive asthma diagnostic kits, and methods of providing information for diagnosing aspirin-sensitive asthma using the PTGER gene family polymorphism. According to the present invention, it is possible to predict the risk of developing aspirin-sensitive asthma and may be usefully used in the field of treatment of asthma.

Description

아스피린 과민성 천식 진단용 ＰＴＧＥＲ 유전자 패밀리 다형성 마커{PTGER GENE FAMILY POLYMORPHISMS MARKER FOR DIAGNOSING ASPIRIN INTOLERANT ASTHMA}PTGENE FAMILY POLYMORPHISMS MARKER FOR DIAGNOSING ASPIRIN INTOLERANT ASTHMA}

본 발명은 아스피린 과민성 천식 진단용 마커, 진단 키트 및 이를 이용한 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to aspirin-sensitive asthma diagnostic markers, diagnostic kits and methods for providing information necessary for diagnosis using the same.

아스피린-과민성 천식(Aspirin-intolerant asthma :AIA)이란 아스피린 또는 다른 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAIDs)의 섭취 후에 천식환자들에게서 기관지수축이 발생하는 것이다. 이러한 증후군은 ‘아스피린 삼징후’, 즉 아스피린 과민성, 기관지 천식, 및 비강 용종증(nasal polyposis)를 동반하는 만성 과형성성 호산성의 부비동염(sinusitis)를 특징으로 한다. AIA의 병인은 프로스타글란딘(PGs), 루코트리엔(LTs) 및 트롬복산(TBX)와 같은 아라키돈산 대사에 의한 것이다. Aspirin-intolerant asthma (AIA) is the development of bronchial contraction in asthma patients after ingestion of aspirin or other non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). These syndromes are characterized by 'aspirin swallowing', ie chronic hyperplastic eosinophilic sinusitis accompanied by aspirin hypersensitivity, bronchial asthma, and nasal polyposis. The pathogenesis of AIA is due to arachidonic acid metabolism such as prostaglandins (PGs), leukotrienes (LTs) and thromboxane (TBX).

아라키돈산 대사물인 프로스타글란딘 E2(PGE2)는 염증으로 유발된 비정상적인 통증 감각의 생성에 있어서 중요한 인자이다. PGE2는 다양한 세포 타입에 의해 합성되고 분비되고, Th1/Th2 면역반응 밸런싱에 있어 중요한 역할을 한다. PGE2는 PTGER1 (MIM# 176802), PTGER2 (MIM# 176804), PTGER3 (MIM# 176806) 및 PTGER4 (MIM# 601586)을 포함하는 4개의 유전자로 암호화되는 4개의 다른 G 프로테인 결합 수용체에 바인딩하여 생물학적 역할을 한다. AIA의 병인에 있어 이 PGE2의 역할은, 특히 아스피린으로 유발된 사이클로옥시제나제 억제 때문에 PGE2 방출이 감소하는 것에 중점을 두어 연구되어 왔다. Arachidonic acid metabolite, prostaglandin E2 (PGE2), is an important factor in the production of abnormal pain sensations caused by inflammation. PGE2 is synthesized and secreted by various cell types and plays an important role in Th1 / Th2 immune response balancing. PGE2 binds to four other G protein binding receptors encoded by four genes, including PTGER1 (MIM # 176802), PTGER2 (MIM # 176804), PTGER3 (MIM # 176806), and PTGER4 (MIM # 601586). Do it. The role of PGE2 in the pathogenesis of AIA has been studied, with particular emphasis on reducing PGE2 release, particularly due to aspirin-induced cyclooxygenase inhibition.

본 발명자들은 PGE2 수용체인 PTGER 유전자 패밀리의 유전적 다형성을 조사하고, 천식환자들에서 아스피린 과민성에 대한 잠재적인 후보자들로서 이 좌위를 평가하였다. SNPs를 한국인 군집에서 분석하였고, 통계학적 분석을 수행하여 천식 및 아스피린 과민성에 대한 유전적 효과를 조사하였다.
We investigated the genetic polymorphism of the PTGER gene family, a PGE2 receptor, and evaluated this locus as a potential candidate for aspirin hypersensitivity in asthmatic patients. SNPs were analyzed in Korean population and statistical analysis was performed to investigate the genetic effect on asthma and aspirin hypersensitivity.

본 발명의 목적은 아스피린 과민성 천식 진단용 PTGER 유전자 패밀리 다형성 마커, 진단 키트 및 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a PTGER gene family polymorphism marker for diagnosing aspirin-sensitive asthma, a diagnostic kit, and a method for providing information necessary for diagnosis.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 481의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되며, 상기 서열에서 4911번째 염기가 C 또는 G이고, 상기 4911번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드인 아스피린 과민성 천식(Aspirin Intolerant Asthma : AIA) 진단용 프로스타글란딘 E 리셉터(Prostaglandin E receptor : 이하 PTGER) 유전자 패밀리 다형성 마커 및 상기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브나 이를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is selected from a polynucleotide consisting of the DNA sequence of SEQ ID NO: 481, wherein the 4911 base is C or G in the sequence, 20-100 consecutive DNA containing the 4911 base Prostaglandin E receptor (PTGER) gene family polymorphism marker and any probe capable of detecting the polymorphic marker. Provided is an aspirin-sensitive asthma diagnostic kit comprising a primer pair capable of amplifying it.

또한, 본 발명은 서열번호 483의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되며, 상기 서열에서 175519번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 175519번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드인 아스피린 과민성 천식 진단용 PTGER 유전자 패밀리 다형성 마커 및 상기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브나 이를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트를 제공한다.In addition, the present invention is selected from a polynucleotide consisting of the DNA sequence of SEQ ID NO: 483, the polynucleotide consisting of 20-100 consecutive DNA sequences comprising the 175519th base is G or T, the 175519th base in the sequence Provided is an aspirin-sensitive asthma diagnosis kit comprising a polymorphic marker for aspirin-sensitive asthma diagnosis, which is a polynucleotide selected from among a polymorphic marker, and a probe for detecting the polymorphic marker or a primer pair for amplifying the polymorphic marker.

또한, 본 발명은 서열번호 483의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되며, 상기 서열에서 197231번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 197231번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드인 아스피린 과민성 천식 진단용 PTGER 유전자 패밀리 다형성 마커 및 상기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브나 이를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트를 제공한다.In addition, the present invention is selected from a polynucleotide consisting of the DNA sequence of SEQ ID NO: 483, the polynucleotide consisting of 20-100 consecutive DNA sequence comprising the 197231 base is A or G, the 197231 base in the sequence Provided is an aspirin-sensitive asthma diagnosis kit comprising a polymorphic marker for aspirin-sensitive asthma diagnosis, which is a polynucleotide selected from among a polymorphic marker, and a probe for detecting the polymorphic marker or a primer pair for amplifying the polymorphic marker.

또한, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 및 3) 단계 2)의 검출 결과와 정상인의 다형성 부위 검출결과를 비교하는 단계;를 포함하는 아스피린 과민성 천식을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention comprises the steps of 1) extracting genomic DNA from blood samples isolated from the subject; 2) detecting the polynucleotide of any one of claims 1 to 3 present on the genomic DNA of step 1); And 3) comparing the detection result of step 2) with the detection result of the polymorphic site of the normal person. The method provides information for diagnosing aspirin-sensitive asthma.

PTGER 유전자 패밀리 중의 PTGER1의 +1869C>G, PTGER3의 +173288G>T 및 +195000A>G 다형성 마커는 천식환자들에게 있어서 아스피린 과민성과 밀접한 관련이 있으므로, 이를 측정함으로써 아스피린 과민성 천식의 발생 위험을 예측할 수 있으며, 아스피린 과민성 천식의 예방 및 치료 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
The polymorphic markers of PTGER1 + 1869C> G, PTGER3 + 173288G> T, and + 195000A> G in the PTGER gene family are closely related to aspirin hypersensitivity in asthma patients, and thus measuring the risk of developing aspirin-sensitive asthma It can be usefully used in the field of prevention and treatment of aspirin-sensitive asthma.

도 1은 PTGER 유전자 패밀리인 PTGER1~4 유전자의 다형성의 연관성을 나타낸 것이다. Y 축은 -log[p]를 나타내고, 다이아몬드, 사각형 및 삼각형은 각각 공동우성, 우성, 및 열성 모델을 나타낸 것이다.
도 2는 PTGER1~4 유전자 다형성 사이의 연관 불평형 계수(LDs)를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the correlation between the polymorphism of PTGER1 ~ 4 genes of the PTGER gene family. The Y axis represents -log [p] and the diamond, square and triangle represent the co-dominant, dominant and recessive models, respectively.
Figure 2 shows the association unbalance coefficients (LDs) between PTGER1-4 polymorphisms.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 아스피린 과민성 천식 진단용 PTGER 유전자 패밀리 다형성 마커를 제공한다. PTGER 유전자 패밀리의 다형성 마커가 될 수 있는 SNPs는 PTGER1 상의 2개의 SNPs(-1937G>T , +1869C>G), PTGER2 상의 12개의 SNPs(-1934T>C , -1722G>A, -814G>A , +75A>T, +6772G>C, +7206C>A, +9081C>G, +9269C>T, +11719C>T, +12968C>T, +13115A>G, +13834C>T), PTGER3 상의 103개의 SNPs(+10156A>C, +23119C>T, +25449T>C, +25770C>T, +26559A>G, +27059C>A, +27428C>T, +27962A>G, +28202C>T, +32463T>C, +32667A>G, +35946A>T, +43442A>G, +44768T>G, +49993T>C, +54403T>A　+54913T>C　+55099A>G　+57791G>A　+58294C>T　+59709T>C, +62498G>C, +64131G>A, +64363A>G, +65742A>T, +65816C>A, +67358C>G, +67871T>A, +68627G>A, +68906T>A, +69112C>T, +69862A>G, +70578G>A, +71055A>G, +72168G>C, +73044A>G, +73603C>G, +73671C>T, +73733G>T, +77005G>A, +80277C>T, +82793A>C, +93762A>G, +96088C>G, +99821T>C, +99937G>A, +106570C>T, +113387T>C, +113847G>A, +128581G>A, +133210C>T, +135611A>G, +137489G>T, +137898C>T, +137986G>A, +138925A>T, +139154C>G, +139523A>G, +143817G>C, +143999G>A, +144897T>C, +144980T>C, +146068C>T, +147767C>G, +148243G>A, +148471G>C, +149156T>C, +149305A>G, +149380G>A, +150025A>C, +150283C>T, +150674C>A, +150789C>T, +152793G>A, +153111C>T, +155071G>A, +155574G>C, +155824C>A, +156424G>A, +158060C>T, +160157A>G, +162284C>A, +165085C>T, +165844A>G, +172311G>A, +173288G>T, +175731G>A, +176068A>G, +181041G>A, +181250T>C, +181831C>T, +182041C>T, +182322G>C, +183805T>C, +185027C>T, +185798T>C, +185899T>C, +186169C>T, +187471A>T, +187962G>A, +188217G>A, +191521G>A, +195000A>G) 및 PTGER4 상의 3개의 SNPs(+6936A>G, +7457A>G, +11845G>A)이다. The present invention provides a PTGER gene family polymorphism marker for diagnosing aspirin hypersensitivity asthma. SNPs that may be polymorphic markers of the PTGER gene family include two SNPs on PTGER1 (-1937G> T, + 1869C> G), 12 SNPs on PTGER2 (-1934T> C, -1722G> A, -814G> A, + 75A> T, + 6772G> C, + 7206C> A, + 9081C> G, + 9269C> T, + 11719C> T, + 12968C> T, + 13115A> G, + 13834C> T), 103 on PTGER3 SNPs (+ 10156A> C, + 23119C> T, + 25449T> C, + 25770C> T, + 26559A> G, + 27059C> A, + 27428C> T, + 27962A> G, + 28202C> T, + 32463T> C, + 32667A> G, + 35946A> T, + 43442A> G, + 44768T> G, + 49993T> C, + 54403T> A + 54913T> C + 55099A> G + 57791G> A + 58294C> T + 59709T> C, + 62498G> C, + 64131G> A, + 64363A> G, + 65742A> T, + 65816C> A, + 67358C> G, + 67871T> A, + 68627G> A, + 68906T> A, + 69112C> T, + 69862A> G, + 70578G> A, + 71055A> G, + 72168G> C, + 73044A> G, + 73603C> G, + 73671C> T, + 73733G> T, + 77005G> A, + 80277C> T, + 82793A> C, + 93762A> G, + 96088C> G, + 99821T> C, + 99937G> A, + 106570C> T, + 113387T> C, + 113847G> A, + 128581G> A, + 133210C> T, + 135611A> G, + 137489G> T, + 137898C> T, + 137986G> A, + 138925A> T, + 139154C> G, + 139523A> G, + 143817G> C, + 143999G> A, + 144897T> C, +14 4980T> C, + 146068C> T, + 147767C> G, + 148243G> A, + 148471G> C, + 149156T> C, + 149305A> G, + 149380G> A, + 150025A> C, + 150283C> T, + 150674C> A, + 150789C> T, + 152793G> A, + 153111C> T, + 155071G> A, + 155574G> C, + 155824C> A, + 156424G> A, + 158060C> T, + 160157A> G, + 162284C> A, + 165085C> T, + 165844A> G, + 172311G> A, + 173288G> T, + 175731G> A, + 176068A> G, + 181041G> A, + 181250T> C, + 181831C> T, + 182041C> T, + 182322G> C, + 183805T> C, + 185027C> T, + 185798T> C, + 185899T> C, + 186169C> T, + 187471A> T, + 187962G> A, + 188217G> A, + 191521G> A, + 195000A> G) and three SNPs (+ 6936A> G, + 7457A> G, + 11845G> A) on PTGER4.

상기와 같이 동정된 PTGER 유전자 패밀리의 120개의 SNPs와 천식환자들 중에 아스피린 과민성과의 연관성을 비교 분석한 결과 PTGER1 +1869C>G (서열번호 481의 4911번째 염기가 C 또는 G), PTGER3 +173288G>T(서열번호 483의 175519번째 염기가 G 또는 T), PTGER3 +195000A>G(서열번호 483의 197231번째 염기가 A 또는 G)가 밀접한 연관성을 보였다.Comparative analysis of the association between 120 SNPs of the PTGER gene family identified above and aspirin hypersensitivity among asthma patients showed PTGER1 + 1869C> G (SEQ ID No. 481 is C or G), PTGER3 + 173288G> T (SEQ ID NO: 483 of the 175519 base G or T) and PTGER3 + 195000A> G (SEQ ID NO: 483 197231 base A or G) showed close correlation.

또한, 본 발명은 상기 다형성 마커 중 어느 하나 이상을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for diagnosing aspirin hypersensitivity asthma comprising any one or more of the above polymorphic markers.

또한, 본 발명은 PTGER1 +1869C>G (서열번호 481의 4911번째 염기가 C 또는 G), PTGER3 +173288G>T(서열번호 483의 175519번째 염기가 G 또는 T), PTGER3 +195000A>G(서열번호 483의 197231번째 염기가 A 또는 G)다형성 부위 중 어느 하나 이상을 검출할 수 있는 프로브 또는 상기 다형성 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트를 제공한다.In addition, the present invention is PTGER1 + 1869C> G (the 4911 base of SEQ ID NO: 481 is C or G), PTGER3 + 173288G> T (the 175519th base of SEQ ID NO: 483 is G or T), PTGER3 + 195000A> G (SEQ ID NO: 4) An aspirin-sensitive asthma diagnosis kit comprising a probe capable of detecting any one or more of A or G) polymorphic sites or a pair of primers capable of amplifying the polymorphic sites is provided.

상기 프로브 또는 프라이머쌍은 특별히 제한되지 않는다.The probe or primer pair is not particularly limited.

또한, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 및 3) 단계 2)의 검출 결과와 정상인의 다형성 부위 검출결과를 비교하는 단계를 포함하는 아스피린 과민성 천식을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of 1) extracting genomic DNA from blood samples isolated from the subject; 2) detecting the polynucleotide of any one of claims 1 to 3 present on the genomic DNA of step 1); And 3) comparing the detection result of step 2) with the detection result of the polymorphic site of a normal person. The method provides information for diagnosing aspirin-sensitive asthma.

단계 2에 있어서, 다형성 부위를 검출하는 방법은, 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화 분석, 대립 유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR) 분석, 다이나믹 대립유전자 혼성화(dynamic allele-specific hybridization, HASH) 분석, PCR 연장 분석 및 TaqMan 프로브 PCR 분석방법 중 어느 하나를 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In step 2, the method for detecting the polymorphic site includes sequencing analysis, hybridization analysis by microarray, allele specific PCR analysis, dynamic allele-specific hybridization, HASH ), PCR prolongation analysis, and TaqMan probe PCR analysis method can be performed using, but not limited to.

상기 방법들은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. The methods can use conventional methods for sequencing and can be performed using an automated genetic analyzer.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

<실시예 1> 피검자 선정 Example 1 Selection of Subjects

본 발명에서 피검자는 한국에 있는 9개 대학 병원으로 이루어진 천식 유전체 연구 센터로부터 모집하였고, 모든 피검자는 한국인이었다. 모든 환자는 의사에게 진단받은 환자였고, 세계천식기구(GINA) 가이드라인에 설정된 천식의 기준을 충족시켰다. 모든 환자는 지난 12개월 동안 호흡곤란과 헐떡임의 병력이 있었고, 15% 이상의 1초간 노력성 호기량(FEV1) 또는 단기-활성의 기관지확장제를 200ml 더 흡입하여 12% 이상 증가하거나; 10 mg/ml 미만의 PC20 메타콜린; 또는 스테로이드와 장기-활성 기관지확장제를 흡입을 2주 동안 처리했을 때 20% 이상의 FEV1 증가를 더 가졌다. 24가지 일반 흡입 알러젠(예를 들면, 먼지, 고양이털, 개털, 바퀴벌레, 풀, 나무, 두드러기 쑥 꽃가루와 같은)(Bencard Co. Ltd., Brentford, UK)에 대해 피부 테스트를 수행하였다. 총 IgE는 CAP시스템(Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)에 의해 측정되었다. 아토피는 피부 테스트로부터 하나 이상의 양성 반응 (>3mm 직경)으로 정의하였다. 천식 환자들은 경구 아스피린 유발(OAC)를 진행한 6 주 이내에 질병의 발작 및 호흡기 감염을 경험하지 못했다. 경구 유발 검사는 종래의 방법을 약간 변형한 방법을 사용하여 아스피린의 함량을 증가(10-450mg Astrix; 호주, 멜버른, 메인 약품사(Mayne Pharma Ltd.))시키면서 수행하였다.In the present invention, the subjects were recruited from an asthma genome research center consisting of nine university hospitals in Korea, and all the subjects were Korean. All patients were diagnosed by a physician and met the criteria for asthma set in the World Asthma Organization (GINA) guidelines. All patients had a history of shortness of breath and gasping for the last 12 months and increased by more than 12% by inhaling 200 ml more of ESR or short-active bronchial dilator for at least 15%; PC20 methacholine less than 10 mg / ml; Or had an increase in FEV1 of 20% or more when inhaled for two weeks with steroids and long-acting bronchodilators. Skin tests were performed on 24 general inhalation allergens (such as dust, cat hair, dog hair, cockroaches, grass, trees, hives wormwood pollen) (Bencard Co. Ltd., Brentford, UK). Total IgE was measured by the CAP system (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden). Atopy was defined as one or more positive responses (> 3 mm diameter) from skin tests. Asthma patients did not experience seizures and respiratory infections of the disease within six weeks of oral aspirin induction (OAC). Oral provocation testing was performed using a slightly modified method of the conventional method with increasing aspirin content (10-450 mg Astrix; Melbourne, Australia, Maine Pharma Ltd.).

FEV1 변화가 아스피린을 최종 투여한 후 5시간 동안 지속되었다. 아스피린으로 유도된 기관지경련(bronchospasms)은 [투여 전 FEV1]-[투여 후 FEV1]/[투여 전 FEV1]으로 계산하였다. OAC 반응에 의해 3 그룹으로 분류하였는데, 눈코사이(naso-ocular)나 피부의 반응이 일어나면서 FEV1에서 20% 이상 증가하거나 FEV1에서 15% 에서 19% 감소하면 아스피린 과민성 천식(AIA)이고, FEV1에서 15% 에서 19% 감소하거나 눈코사이(naso-ocular)나 피부의 반응만 일어나면 중간적(intermediate) 아스피린 과민성 천식(AIA-I)이고, 눈코사이(naso-ocular)나 피부의 반응 없이 FEV1에서 15% 미만의 감소를 보이면 아스피린 내성 천식(ATA)으로 분류하였다. The FEV1 change lasted for 5 hours after the last dose of aspirin. Aspirin-induced bronchospasms were calculated as [FEV1 before administration]-[FEV1 after administration] / [FEV1 before administration]. They were classified into three groups by the OAC response, which was aspirin-sensitive asthma (AIA) when increased by more than 20% in FEV1 or by 15% in FEV1 by a naso-ocular or skin reaction. 15% to 19% reduction, or naso-ocular or skin reactions, which are intermediates of aspirin-sensitive asthma (AIA-I), 15 to FEV1 without naso-ocular or skin reactions. A reduction of less than% was classified as aspirin resistant asthma (ATA).

기관지 경련이 있을 때나 아스피린 유발 2시간 후에 말초 정맥혈을 모아서, 혈장을 분리하였다. 말초혈액 유래 단핵 세포(PBMC)를 히스토파크(Histopaque)-1077 용액(1.077 g/ml, Sigma, St. Louis, MO)에서 분리하였다. Plasma was isolated by collecting peripheral venous blood during bronchospasm or 2 hours after aspirin induction. Peripheral blood-derived mononuclear cells (PBMCs) were isolated from Histoqueque-1077 solution (1.077 g / ml, Sigma, St. Louis, Mo.).

제 1 실험군과 제 2실험군을 포함하여 1162명의 천식 환자들이 포함되었다. 피검자들의 임상학적 특징들을 표 1에 요약하였다. ATA 와 AIA 그룹 사이에는 평균 연령, 성별 분포, 흡연 유발 및 BMI에서 현저한 차이가 있었다. 제 2 실험군에서만 ATA 와 AIA 그룹 사이에 DVC, FEV1, 및 log[PC20]이 큰 차이가 있었다. 제 2 실험군의 AIA 피검자들에 AIA-중간적 피검자가 포함되었기 때문에 아스피린 유발에 의한 FEV1 감소는 제 1 실험군보다 제 2 실험군에서 더 낮았다. 아스피린 유발에 의한 FEV1 감소는 -15% 에서 82%가 관찰되었다. 1162 asthma patients were included, including the first and second experimental groups. The clinical characteristics of the subjects are summarized in Table 1. There were significant differences in mean age, sex distribution, smoking incidence, and BMI between the ATA and AIA groups. There was a significant difference in DVC, FEV1, and log [PC20] between the ATA and AIA groups only in the second experimental group. The AEV-induced FEV1 reduction was lower in the second experimental group than the first experimental group because the AIA subjects in the second experimental group included the AIA-intermediate subject. Aspirin-induced FEV1 reduction was observed from -15% to 82%.

<실시예 2> PTGER 유전자의 SNP 동정 및 유전자형 분석Example 2 SNP Identification and Genotyping of PTGER Gene

본 발명자들은 한국인 피검자들 DNA 샘플에서 SNPs(single nucleotide polymorphism)를 발견하기 위해 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)에서 GenBank 서열(NT_011295.11)에 기초하여 PTGER1 유전자를 서열분석하였다. 또한, GenBank 서열(NT_026437.12)에 기초한 PTGER2 유전자, GenBank 서열(NT_032977.9)에 기초한 PTGER3 유전자, GenBank 서열(NT_006576.16)에 기초한 PTGER4 유전자를 서열분석하였다. We sequenced the PTGER1 gene based on the GenBank sequence (NT_011295.11) at the National Center for Biotechnology Information to find single nucleotide polymorphism (SNPs) in DNA samples from Korean subjects. In addition, PTGER2 gene based on GenBank sequence (NT_026437.12), PTGER3 gene based on GenBank sequence (NT_032977.9), and PTGER4 gene based on GenBank sequence (NT_006576.16) were sequenced.

본 발명자들은 제 1 실험군에서의 후보자 다형성 SNP를 선택하였고 137명의 AIA 피검자와 268명의 ATA 피검자들에서 유전자형을 분석하였다. 제 2 실험군에서, 추가적인 실험자(106명의 AIA 와 651명의 ATA)를 이용하였고, PTGER1의 한개의 SNP 와 PTGER3의 4개의 SNP를 제 1 실험군에서 선택하여 유전자형 분석하였다. 제 1 실험군에서의 유전자형분석은 일루미나 골든 게이트 서열분석 시스템(Illumina Golden Gate genotyping system)을 사용하여 멀티플렉스 수준에서 수행하였고 데이터의 퀄리티는 복제 DNA(n=10)에 의해 평가되었다. 데이터에서 서열분석 퀄리티 점수는 0.25에 설정하였다. 하기 기준을 충족시킬 수 없는 SNPs는 배제하였다: (ⅰ)90%의 최소 콜 레이트(call rate); (ⅱ) 복제 에러가 없을 것; (ⅲ)P>0.001 이상의 하디-바인베르크 평형. PTGER1 상의 2개의 SNPs, PTGER2 상의 12개의 SNPs, PTGER3 상의 103개의 SNPs 및 PTGER4 상의 3개의 SNP 가 성공적으로 유전자형 분석되었다. 사용한 프로브 정보는 표 2에 나타내었다.We selected candidate polymorphic SNPs in the first experimental group and analyzed genotypes in 137 AIA subjects and 268 ATA subjects. In the second experimental group, additional subjects (106 AIA and 651 ATA) were used, and one SNP of PTGER1 and four SNPs of PTGER3 were selected from the first experimental group for genotyping. Genotyping in the first experimental group was performed at the multiplex level using the Illumina Golden Gate genotyping system and the quality of the data was evaluated by replica DNA (n = 10). The sequencing quality score in the data was set at 0.25. SNPs that did not meet the following criteria were excluded: (iii) a minimum call rate of 90%; (Ii) there is no replication error; (Iii) Hardy-Weinberg equilibrium of P> 0.001 or greater. Two SNPs on PTGER1, 12 SNPs on PTGER2, 103 SNPs on PTGER3 and three SNPs on PTGER4 were successfully genotyped. Probe information used is shown in Table 2.

제 2 실험군에서는 선택한 SNPs를 TaqMan® assay를 사용하여 유전자형을 분석하였다. PCR 프라이머와 MGB TaqMan 프로브를 디자인하기 위해 프라이머 익스프레스(Primer Express; Applied Biosystem)을 사용하였다. 한 개의 대립형질 프로브는 FAM 으로 표지하였고 나머지 하나는 형광 VIC으로 표지하였다. 사용한 프로브 정보는 표 3에 나타내었다.
In the second experimental group, the selected SNPs were genotyped using TaqMan® assay. Primer Express (Applied Biosystem) was used to design PCR primers and MGB TaqMan probes. One allele probe was labeled with FAM and the other with fluorescent VIC. Probe information used is shown in Table 3.

유전자gene #rs#rs assay IDassay ID PTGER1PTGER1 rs2241363rs2241363 C___2884017_20 C___2884017_20 PTGER3PTGER3 rs6424414rs6424414 C___2503603_10 C___2503603_10 rs516647rs516647 C___2240960_10 C___2240960_10 rs7543182rs7543182 C__30422646_10 C__30422646_10 　 rs959rs959 C___8906614_10C___8906614_10

<실시예 3> 통계적 분석Example 3 Statistical Analysis

본 발명자들은 이대립유전자 좌위, 르원틴 D(Lewontin's D')(|D'|) 및 r²의 모든 쌍 사이에 연관 불평형에 대해 폭넓게 사용된 측정법을 이용하였다. 개체들의 일배체형을 스테판(Stephens)에 의해 개발된 PHASE 알고리즘(ver.2.0)을 사용하여 추론하였다. 유전자형 및 일배체형 분포를 연령(연속값), 성별(남성=0, 여성=1), 아토피 상태(비-아토피=0, 아토피=1), 및 흡연 상태(비흡연자=0, 금연자=1, 흡연자=2) 및 신체 비만지수(BMI)을 공변량으로 하여 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 분석하였다. 유전자형 및 일배체형 사이에서 아스피린 투여에 따른 FEV1 감소율 변화는 선형 회귀 모델을 사용해 검사하였다. 이 데이터를 SAS 버전 9.1(SAS Inc., Cary, NC) 를 사용하여 관리, 분석하였다.
We used a widely used measure of association disequilibrium between allelic loci, Lewontin's D '(| D' |) and all pairs of r ² . Haplotypes of the individuals were inferred using the PHASE algorithm (ver. 2.0) developed by Stephens. Genotype and haplotype distributions include age (continuous value), gender (male = 0, female = 1), atopy state (non-atopy = 0, atopy = 1), and smoking state (non-smoker = 0, non-smoker = 1, Smokers = 2) and body obesity index (BMI) as covariates were analyzed using logistic regression model. The change in FEV1 reduction with aspirin between genotype and haplotype was examined using a linear regression model. This data was managed and analyzed using SAS version 9.1 (SAS Inc., Cary, NC).

<실시예 4> 유전자 다형성 빈도 분석 Example 4 Gene Polymorphism Analysis

본 발명의 제 1 실험군에서, NCBI dbSNP의 데이타베이스로부터 4개의 PTGER 유전자의 유전적인 변이를 조사하였고, PTGER1 상의 2개의 SNPs, PTGER2 상의 12개의 SNPs, PTGER3 상의 103개의 SNPs 및 PTGER4 상의 3개의 SNP 를 포함한 120개의 변이를 유전자형 분석하였다. 모든 SNP의 전체 콜 레이트(call rate)는 99.80%였다. 이 120개의 SNP의 열성 대립형질 빈도(MAFs)는 표 4 에 나타내었다. s11209710 과 re7543182(각각 P=0.005와 0.007)만 제외하고, 모든 좌위의 분포가 하디-바인베르크 평형(P>0.01)에 있었다. 4개의 PTGER 수용체 유전자의 일배체형이 조립되었고, PTGER3은 각각의 블록이 강한 LD 값을 가지는 3개의 일배체형 블록으로 나누어졌다. PTGER1에는 3개의 일배체형, PTGER2에는 6개의 일배체형, PTGER3의 블록 1에는 5개, 블록 2에는 3개, 블록 3에는 5개, PTGER4에는 3개의 일배체형을 조립하였다.In the first experimental group of the present invention, genetic variation of four PTGER genes was examined from the database of NCBI dbSNP, and two SNPs on PTGER1, 12 SNPs on PTGER2, 103 SNPs on PTGER3 and 3 SNPs on PTGER4 were examined. One hundred and twenty variants were genotyped. The overall call rate of all SNPs was 99.80%. The recessive allele frequencies (MAFs) of these 120 SNPs are shown in Table 4. s11209710 and Except for re7543182 (P = 0.005 and 0.007, respectively), all loci distributions were in the Hardy-Weinberg equilibrium (P> 0.01). Haplotypes of the four PTGER receptor genes were assembled, and PTGER3 was The block was divided into three haplotype blocks with strong LD values. Three haplotypes were assembled in PTGER1, six haplotypes in PTGER2, five in Block 1 of PTGER3, three in Block 2, five in Block 3, and three haplotypes in PTGER4.

<실시예 5> 아스피린 내성 천식(ATA)과 아스피린 과민성 천식(AIA) 사이의 아스피린의 유도에 대한 PTGER 유전자 다형성의 연관성 회귀 분석Example 5 Regression Analysis of Association of PTGER Gene Polymorphism to Induction of Aspirin Between Aspirin-Resistant Asthma (ATA) and Aspirin Sensitive Asthma (AIA)

다중 로지스틱 회귀 모델을 사용하였을 때, 두개의 SNP와 PTGER1의 두개의 일배체형, PTGER3의 10개의 SNP가 아스피린 과민성의 위험이 감소하는 것과 연관성이 있었고, 반면 PTGER3의 6개, PTGER2의 1개의 일배체형이 위험의 증가와 연관성이 있었다.(표 5) Using multiple logistic regression models, two haplotypes of two SNPs and PTGER1, ten SNPs of PTGER3 were associated with a reduced risk of aspirin hypersensitivity, whereas six haplotypes of PTGER3 and one haplotype of PTGER2 This risk was associated with an increase in risk (Table 5).

양성적으로 연관된 SNP 중에서 PTGER1의 한개(rs2241363)과 PTGER3의 4개(rs6424414, rs516657, rs7543182 및 rs959)를 106명의 AIA와 651명의 ATA를 포함하여 제 2 복제 실험군으로 선택하였다. 이 5개의 SNPs 중에서, PTGER1 rs2241363 과 PTGER3 rs7541363과 PTGER3 rs959가 제 2 실험군에서 같은 효과의 방향성을 보였다; PTGER1 rs2241363은 보호적인 효과를 보였고, PTGER3 rs7541363과 PTGER3 rs959은 통계적인 중요성은 잃었지만, 아스피린 과민성에 민감한 효과를 보였다.(표 6) PTGER1 과 PTGER3 에 있는 3개의 SNP는 전체 집단에서 역시 그들의 효과와 통계적인 중요성을 유지하였다.(표 6) 그러나, PTGER3 rs6424414과 rs516647은 제 2 실험군과 전체 집단 모두에서 효과의 방향성과 통계적인 중요함을 보여주지 못하였다.Of the positively related SNPs, one of PTGER1 (rs2241363) and four of PTGER3 (rs6424414, rs516657, rs7543182 and rs959) were selected as the second replication experiment group, including 106 AIA and 651 ATA. Of these five SNPs, PTGER1 rs2241363 and PTGER3 rs7541363 and PTGER3 rs959 showed the same directionality in the second experimental group; PTGER1 rs2241363 showed a protective effect, while PTGER3 rs7541363 and PTGER3 rs959 lost statistical significance, but showed a sensitive effect on aspirin hypersensitivity (Table 6). The three SNPs in PTGER1 and PTGER3 also had their effects on the overall population. However, PTGER3 rs6424414 and rs516647 did not show statistical significance of the effect in both the second experimental group and the entire population.

본 발명에서는 PTGER1 rs2241363이 아스피린 과민성의 위험을 감소시키는 것과 관련이 있음을 보여주었다. 또한, PTGER3 의 연관성이 있는 두 개의 다형성 중에서 3'UTR 지역의 rs959는 공동우성과 우성 모델(각각 p=0.005 및 0.002)에서 아스피린 과민성 천식의 위험을 증가시키는 것과 큰 연관성이 있었다. 3'UTR에서의 선택적인 유전자형의 아스피린 과민성 천식에서 관련된 매카니즘이 완전히 밝혀지지는 않았지만 게놈의 비암호화 부분의 중요한 역할 때문에 몇몇의 설명이 가능하다. mRNA UTR이 여러 전사 후 조절 경로에서 mRNA의 위치결정(localisation), 안정화 및 전사 효율성을 조절하고, 단백질 합성의 개시에 5'UTR 과 3'UTR 모두에 있는 서열 요소가 영향을 줄 수 있다고 알려져 있다. The present invention has shown that PTGER1 rs2241363 is associated with reducing the risk of aspirin hypersensitivity. In addition, among the two polymorphisms associated with PTGER3, rs959 in the 3'UTR region was associated with increased risk of aspirin-sensitive asthma in the co-dominant and dominant models (p = 0.005 and 0.002, respectively). Although the mechanism involved in selective genotype aspirin-sensitized asthma at 3'UTR is not fully understood, several explanations are possible because of the important role of the non-coding portion of the genome. It is known that mRNA UTR regulates localization, stabilization and transcriptional efficiency of mRNA in several post-transcriptional regulatory pathways, and that sequence elements in both 5'UTR and 3'UTR can influence the initiation of protein synthesis. .

본 발명자들은 한국인 천식환자(n=1162) 중에서 아스피린 과민성과 PTGER1, PTGER2, PTGER3 및 PTGER4를 포함하는 4개의 PGE2 수용체의 유전적 연관성을 연구하였다. 본 연구는 PTGER1 과 PTGER3에서의 다형성이 한국인 천식환자의 아스피린 과민성을 조절하는데에 중요한 유전적인 인자가 될 수 있음을 밝혀냈다. We studied the genetic association of aspirin hypersensitivity with four PGE2 receptors including PTGER1, PTGER2, PTGER3 and PTGER4 in Korean asthma patients (n = 1162). This study revealed that polymorphisms in PTGER1 and PTGER3 could be important genetic factors in controlling aspirin hypersensitivity in Korean asthma patients.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

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Claims (5)

아스피린 과민성 천식(Aspirin Intolerant Asthma : AIA) 진단용 다형성 마커 조성물로서,
상기 마커는
프로스타글란딘 E 리셉터 1(Prostaglandin E receptor 1: 이하 PTGER1) 유전자 패밀리 다형성 마커로서, 서열번호 481의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되고;
상기 마커 조성물은
상기 서열에서 4911번째 염기가 C 또는 G이며; 및
상기 4911번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아스피린 과민성 천식(Aspirin Intolerant Asthma : AIA) 진단용 다형성 마커 조성물.
Aspirin Intolerant Asthma (AIA) diagnostic polymorphic marker composition,
The marker is
A prostaglandin E receptor 1: PTGER1 gene family polymorphic marker, selected from a polynucleotide consisting of the DNA sequence of SEQ ID NO: 481;
The marker composition is
The 4911 base in the sequence is C or G; And
Aspirin Intolerant Asthma (AIA) diagnostic polymorphic marker composition comprising any one of polynucleotides selected from polynucleotides consisting of 20-100 consecutive DNA sequences including the 4911 th base.
삭제delete 삭제delete 제 1 항의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 키트.
Claim 1 polynucleotide or aspirin hypersensitivity asthma diagnostic kit comprising a primer pair capable of amplifying the same.
1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 제1항의 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 및
3) 단계 2)의 검출 결과와 정상인의 다형성 부위 검출결과를 비교하는 단계;를 포함하는 아스피린 과민성 천식을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.1) extracting genomic DNA from blood samples isolated from the subject;
2) detecting the polynucleotide of claim 1 present on the genomic DNA of step 1); And
3) comparing the detection result of step 2) with the detection result of the polymorphic site of a normal person; providing information for diagnosing aspirin-sensitive asthma.

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