KR101189187B1 - 글리세롤 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 이용한 １、３―프로판디올의 제조방법 - Google Patents

글리세롤 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 이용한 １、３―프로판디올의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리세롤 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 배양하여 1,3-프로판디올을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 글리세롤 대사경로에서 부산물을 생성하는 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 2단계 배양하는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 글리세롤 대사경로에서 부산물을 생성하는 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 2단계 배양하면, 정제과정에서 비용 상승을 초래하는 부산물의 생성 없이, 향상된 수율로 1, 3-프로판디올을 생산할 수 있다.
Figure R1020090021244
1, 3-프로판디올, 글리세롤 산화경로, 2단계 배양

Description

글리세롤 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 이용한 １、３―프로판디올의 제조방법{Method for Preparing 1,3-Propanediol Using Mutant Blocked in Glycerol Oxidation Pathway}
본 발명은 글리세롤 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 배양하여 1,3-프로판디올을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 글리세롤 대사경로에서 부산물을 생성하는 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 2단계 배양하는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올의 제조방법에 관한 것이다.
1,3-프로판디올은 폴리에스터(polyester), 폴리에테르(polyether), 혹은 폴리우레탄(polyurethanes) 등의 합성원료로 사용될 수 있는 물질로, 고기능성 의류,카펫, 자동차직물 등의 섬유와 플라스틱 필름 등의 다양한 용도로 쓰이고 있다. 특히 1,3-프로판디올과 테레프탈릭산(terephtalic acid)의 중합반응에 의해 생성되는 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(polytrimethylene terephtalate, PTT)는 물성이 우수하고 유점이 228℃로 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 보다 낮아 실질적인 효용 성이 높아 향후 PET를 대체할 수 있는 차세대 섬유재료로서 주목을 받고 있다. 또한, 1,3-프로판디올을 단량체로 하여 만든 플라스틱과 중합체는 부탄디올, 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)로 만든 제품보다 더 우수한 광학 안정성을 가지는 특성을 나타낸다. 또한 1,3-프로판디올은 폴리글리콜 형태(polyglycol-type)의 윤활제와 용매로 사용될 수 있어 글리세롤에 비해 그 상업적 가치를 높게 평가 받고 있다.
1,3-프로판디올은 화학적 합성 및 미생물 발효에 의하여 생산할 수 있다. 화학적 생산방법에는 에틸렌옥사이드(ethylene oxide)를 hydroformylation에 의해 1,3-프로판디올로 전환하는 방법(미국특허 제3,687,981호)과 아크롤레인(acrolein)을 hydration에 의해 1,3-프로판디올로 전환하는 방법(미국특허 제5,015,789호)이 있다. 하지만 이러한 화학공정들은 1,3-프로판디올의 생산 과정중 고온 또는 고압과정을 필요로 하기 때문에 생산 비용이 높고, 환경 오염물질을 함유한 폐유를 발생시키는 문제점이 있다.
생물학적 방법으로 통성 혐기성 균주인 시트로박터(Citrobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 엔테로박터(Enterobacter), 크렙시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus) 등의 미생물들을 이용 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 생성하는 방법(미국특허 제 5,254,467호)이 있다.
상기의 미생물을 이용하여 글리세롤의 1,3-프로판디올로 전환하는 대사과정에서 다양한 종류의 산화대사산물들이 다량 생산된다. 특히, 2,3-부탄디올(2,3-butanediol)은 글리세롤 산화대사산물로서 1,3-프로판디올과 유사한 비점을 지녀 정제 과정에서 큰 제약으로 작용한다. 본 발명자들은 대사공학적 방법에 의해 글리 세롤 대사에서 2,3-부탄디올을 비롯한 산화대사 부산물들을 생성하지 않고, 1,3-프로판디올만을 생산하는 미생물을 개발하기 위하여, 유전자 재조합 기술을 이용하여 글리세롤 대사경로에서 부산물을 생성하는 산화대사경로를 차단시키고, 1,3-프로판디올을 생성하는 환원대사경로만을 갖는 변이체를 제작하였으나(대한민국 특허출원 10-2008-0122166), 상기 변이체는 일반적인 회분식 배양에서 부산물을 생산하지 않았으나, 1,3-프로판디올의 생산성은 떨어지는 것으로 확인되었다.
이에, 본 발명자들은 글리세롤 대사경로에서 부산물을 생성하는 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주의 배양에 있어서, 1,3-프로판디올의 생산성을 개선하고자 예의 노력한 결과, 배지에 글리세롤을 첨가하지 않은 1차 배양과 글리세롤을 첨가하는 2차 배양으로 나누어 2단계 배양하는 경우, 1,3-프로판디올의 수율이 증가하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 글리세롤 대사경로에서 부산물을 생성하는 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주의 배양방법을 개선하여, 1,3-프로판디올의 생산성을 향상시킨, 1,3-프로판디올의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계; (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨가하고 2차 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 글리세롤을 탄소원으로하여 1,3-프로판디올을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서 전사 활성인자를 코딩하는 유전자 또는 디하이드록시아세톤키나아제를 코딩하는 유전자가 결실 또는 불능화되어 있는 미생물 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계; (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨가하고 2차 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체(AK 균주)에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입되어 있거나, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자가 상기 변이체(AK 균주)의 염색체에 삽입되어 있는, 글리세롤을 탄소원으로하여 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계; (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨가하고 2차 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체(AK 균주)에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자와 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입되어 있거나, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자와 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자를 코딩하는 유전자가 상기 변이체(AK 균주)의 염색체에 삽입되어 있는, 글리세롤을 탄소원으로하여 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계; (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨 가하고 2차 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체(AR 균주)에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입되어 있거나, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자가 상기 변이체(AR 균주)의 염색체에 삽입되어 있는, 글리세롤을 탄소원으로하여 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계; (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨가하고 2차 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체(AR 균주)에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자와 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입되어 있거나, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자와 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자를 코딩하는 유전자가 상기 변이체(AR 균주)의 염색체에 삽입되어 있는, 글리세롤을 탄소원으로하여 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 글리세롤 대사경로에서 부산물을 생성하는 산화대사경로를 차단시킨 재조합 균주를 2단계 배양하면, 정제과정에서 비용 상승을 초래하는 부산물의 생성 없이, 향상된 수율로 1, 3-프로판디올을 생산할 수 있다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계; (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨가하고 2차 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 글리세롤을 탄소원으로하여 1,3-프로판디올을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서 전사 활성인자를 코딩하는 유전자 또는 디하이드록시아세톤키나아제를 코딩하는 유전자가 결실 또는 불능화되어 있는 미생물 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
글리세롤 대사경로는 산화적, 환원적 두 대사경로를 통해 대사가 이루어진다 (도 1). 먼저, 산화적 대사과정에서, 글리세롤은 NAD+ 의존적 글리세롤 디히드로게나제(dehydrogenase)의 작용에 의해 디히드록시아세톤(dehydroxyacetone, DHA)으로 산화되면서 NADH가 생산되고, DHA 키나제(kinase)의 작용에 의해 디히드록시아세톤포스페이트(dehydroxyacetone phosphate, DHAP)로 전환되어진 후 해당과정을 통해 대사되면서 성장에 필요한 탄소원과 에너지원으로 이용되며, 상기 산화적 대사과정 에서, 2,3-부탄디올, 아세트산, 에탄올, 젖산, 숙신산 등의 부산물들이 생성된다.
한편, 환원적 대사과정에서, 글리세롤은 디히드라타제(dehyratase)의 작용에 의해 3-히드록시프로피온알데히드(3-hydroxypropionaldehyde)로 전환된 후 NADH 의존적 옥시도리덕타제(oxidoreductase)에 의해 1,3-프로판디올로 환원되면서 NAD+가 형성된다.
본 발명에서 1,3-프로판디올을 생성시키기 위하여 배양되는 변이체는 상기 글리세롤 대사과정 중 산화경로를 담당하는 단백질을 코딩하는 유전자를 결실 또는 불능화시켜, 2,3-부탄디올, 에탄올, 젖산, 숙신산 등의 부산물을 생성하지 않으면서, 환원경로를 통하여 1, 3-프로판디올만을 생산하는 균주이다.
상기 글리세롤의 산화, 환원 대사경로는 세포내의 NAD+-NADH 밸런스를 유지하기 위해 서로 밀접하게 연관이 되어 있으며, 상기의 네 가지 효소를 코드하는 유전자들-글리세롤 디히드라타제(glycerol dehyratase, dhaB), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제(1,3-propanediol reducatse, dhaT), 글리세롤 디히드로게나제(glycerol dehydrogenase, dhaD), 디히드록시아세톤 키나제(dehydroxyacetone kinase, dhaK)-은 통상 염색체상에서 클러스터(cluster)로 존재하고, 공존하는 전사 조절인자인 DhaR에 의해 동일한 레귤론(regulon)으로 조절된다.
본 발명에서, 상기 1,3-프로판디올을 생산하는 능력을 가지는 미생물은 시트로박터(Citrobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 엔테로박터(Enterobacter), 크렙시엘라(Klebsiella) 및 락토바실러스(Lactobacillus)로 구성된 군에서 선택되는 균주를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 크렙시엘라 뉴모니아를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 변이 미생물이 크렙시엘라 뉴모니아인 경우, 상기 전사 활성인자 유전자는 DhaR이며, 디하이드록시아세톤키나아제 유전자는 DhaK, DhaL, DhaM 및 DhaK'로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체의 글리세롤 산화경로를 담당하는 단백질은 글리세롤 디하이드로게나아제, 전사 활성인자 및 디하이드록시아세톤 키나아제인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 일 양태에서 사용되는 글리세롤 산화경로가 차단된 재조합 미생물은 크렙시엘라 뉴모니아 균주의 염색체에서 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)를 결실시켜 크렙시엘라 뉴모니아 변이체(AK 균주)를 제작하고, 상기 결실된 유전자 중 글리세롤 환원경로를 담당하는 유전자인 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)를 포함하는 재조합벡터로 형질전환시켜, 환원경로를 복구시키고, 결과적으로, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD) 및 전사 활성인자 유전자(DhaR)만을 결실시켜 제작하였다 (도 2).
따라서, 본 발명의 일양태에서 사용된 상기 변이체는 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD) 및 전사 활성인자 유전자(DhaR)가 결실 또는 불능화되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
이 과정에서 환원경로 유전자들이 더 이상 DhaR 조절 인자의 조절을 받지 않도록 유전자의 상류에 lacZ 프로모터(PlacZ)를 삽입하여 유전자의 발현을 유도인자를 이용하여 인위적으로 조절할 수 있도록 하였다.
본 발명은 다른 양태에서 사용되는 글리세롤 산화경로가 차단된 재조합 미생물은 크렙시엘라 뉴모니아 균주의 염색체에서 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실된 크렙시엘라 뉴모니아 변이체(AR 균주)를 제작하고, 상기 결실된 유전자 중 글리세롤 환원경로를 담당하는 유전자인 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)를 포함하는 재조합벡터로 형질전환시켜, 환원경로를 복구시키고, 결과적으로, 전사 활성인자 유전자(DhaR)만이 결실된 변이체를 제작하였다 (도 2).
따라서, 본 발명 다른 양태에서 사용된 상기 변이체는 전사 활성인자 유전자(DhaR)가 결실 또는 불능화되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계; (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨가하고 2차 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 글리세롤을 탄소원으로하여 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체(AK 균주)에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입되어 있거나, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자가 상기 변이체(AK 균주)의 염색체에 삽입되어 있는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 일 양태에서, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD) 및 전사 활성인자 유전자(DhaR)가 결실된 클랩시엘라 뉴모니아 균주와 전사 활성인자 유전자(DhaR)가 결실된 크렙시엘라 뉴모니아 균주는 글리세롤을 함유하는 배지에서 소량의 아세트산을 제외하고는 산화경로의 다른 부산물을 생산하지 않고, 1,3-프로판디올을 생산하지만, 1,3-프로판디올의 생성능이 야생형 모균주에 비하여 떨어지는 는 것을 확인하였으며, 이를 극복하기 위하여, 상기 재조합 균주를 글리세롤을 함유하지 않는 배지에서 1차 배양하여 균체를 증식시킨 후, 글리세롤을 함유하는 배지에서 2차 배양하면 부산물의 생성 없이 높은 수율로 1,3-프로판디올을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 모균주인 크렙시엘라 뉴모니아 Cu 균주를 2단계 배양한 경우의 글리세롤-1,3-프로판디올 전환율이 35%(mol/mol)인데 비하여, 상기 재조합 균주를 이용하여 2단계 배양한 경우, 글리세롤-1,3-프로판디올 전환율은 70%(mol/mol)로 매우 향상된 전환율을 나타내었다.
본 발명에 있어서, 상기 2단계 배양에서 글리세롤은 5~50 g/L의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 5~20 g/L로 첨가할 수 있으며, 가 장 바람직하게는 10 g/L로 첨가하는 것이 좋다.
본 발명의 일 양태에서, 배양과정에서 Aeration을 하지 않은 경우 글리세롤을 거의 소모하지 못했으며, 0.2 vvm, 0.5 vvm 및 1.0 vvm에서는 거의 비슷한 글리세롤 소모성과 1,3-프로판디올 생산성을 보였다. 또한, 본 발명의 일 양태에서, 배양액의 pH를 각각 5, 6, 7 및 8로 배양이 끝날 때까지 유지한 경우, pH 6에서 가장 높은 1,3-프로판디올 생산성을 보였다. 또한, 균주 성장 정도가 OD600 수치가 각각 0, 0.5, 1, 2 및 3일 때 글리세롤을 최종농도가 20 g/L가 되게 첨가해 준 경우, 도 12에 나타난 바와 같이, OD600 수치가 높을수록 1,3-프로판디올 생산성이 높은 것으로 확인되었다.
본 발명의 일 양태에서 사용된 변이체는 플라스미드 DNA가 큐어링된 크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 균주(이하, "Cu"라 함)를 모균주로 하여 상동성 재조합 (homologous recombination) 방법으로 dha 레귤론의 DhaB 효소 재활성화 인자, DhaT 유전자, DhaR 조절인자 및 DhaD 유전자를 apramycin 내성 유전자로 치환하여 산화, 환원 경로가 모두 결손된 기본 재조합 균주(이하, "AK" 균주라 함)를 제조하고, 글리세롤 환원 경로를 복구하기 위하여, 글리세롤 환원 경로 복구용 플라스미드를 제조하였다. 상기 플라스미드 DNA는 DhaB 재활성화 효소 유전자(orfW)-orfX DNA 단편과 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 지닌 유전자{dhaT, yqhD(E. coli 유래), 혹은 yqhD 상동성 유전자(크렙시엘라 뉴모니아 유래)}를 증폭하고, pGEM TEasy 벡터의 lacZ 프로모터 하류에 삽입하여 제작하고, 상기 글리세롤 환원 경로 복구용 플라스미드 DNA가 형질전환된 1, 3-프로판디올 생산용 재조합 균주를 제조하였다.
본 발명은 일 양태에서, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD) 및 전사 활성인자 유전자(DhaR)가 결실된 클랩시엘라 뉴모니아 균주와 전사 활성인자 유전자(DhaR)가 결실된 크렙시엘라 뉴모니아 균주는 글리세롤을 함유하는 배지에서 소량의 아세트산을 제외하고는 산화경로의 다른 부산물을 생산하지 않고, 1,3-프로판디올을 생산하는 것을 확인하였다.
본 발명의 일양태에서는 상기 변이체를 제조하기 위하여, 플라스미드 DNA가 큐어링된 크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 균주(이하, "Cu"라 함)를 모균주로 하여 상동성 재조합 (homologous recombination) 방법으로 dha 레귤론의 DhaB 효소 재활성화 인자, DhaT 유전자 및 DhaR 조절인자를 apramycin 내성 유전자로 치환한 재조합 균주를 제조하였다(AR로 명명) 치환하여 산화, 환원 경로가 모두 결손된 재조합 균주를 제조하였다(이하 "AR" 균주라 함). 상기 AR 균주의 글리세롤 환원 경로를 복구하기 위하여, 상기 본 발명의 일양태에서 제조된 글리세롤 환원 경로 복구용 플라스미드를 AR 균주에 형질전환시켜, 부산물을 생성하시 않으면서 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이체를 제조하였다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체의 배양액으로부터의 1,3-프로판디올의 회수는 통상적인 분리 기술, 예를 들어 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그라피, 용매추출, 반응추출 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 물질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 유전자의 "결실"이란 상기 유전자가 염색체상 또는 플라스미드 상에서 삭제되어 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 생산할 수 없게된 상태를 의미하고, 유전자의 "불능화"란 상기 유전자가 삽입, 전좌, 일부결실 등에 의하여, 유전자가 코딩하는 단백질을 생산하지 못하게 된 상태를 의미한다.
본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예에서는 크랩시엘라 뉴모니아 균주의 글리세롤 산화환원경로를 모두 차단한 변이체를 제조하고, 글리세롤 환원경로를 다시 복구시켜 부산물을 생성하지 않으면서, 1,3-프로판디올 생산능을 가지는 변이체를 제조하여 사용하였으나, 글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물의 글리세롤 산화경로만을 차단시킴으로, 부산물을 생성하지 않으면서, 1,3-프로판디올 생산능을 가지는 변이체를 제조하여 배양하여도 동일성 있는 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 실시예에서는 글리세롤 산화환원경로를 모두 차단한 변이체에서 글리세롤 환원경로를 다시 복구시키는 데에, 글리세롤 환원경로 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 균주를 사용하였으나, 이외에 통상적으로 사용되는 염색체 삽입방법을 이용하여 글리세롤 환원경로 유전자를 상기 변이체의 염색체에 삽입한 균주를 사용하여도 동일성 있는 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 글리세롤 산화-환원 대사경로가 차단된 재조합 균주의 제조
글리세롤 대사회로 재설계를 위하여 크렙시엘라 뉴모니아 MGH 78578(ATCC 700721)에서 글리세롤로부터 대사회로를 완전히 차단한 재조합 균주(AK 및 AR)를 제조하였다.
플라스미드 DNA가 큐어링된 크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 균주(Cu로 명명)를 모균주로 하여 상동성재조합 방법으로 dha 레귤론(도 2)의 한 DhaB 효소 재활성화 인자, DhaT 유전자, DhaR 조절인자 및 DhaD 유전자를 apramycin 내성 유전자로 치환하여 산화, 환원 경로가 모두 결손된 재조합 균주 AK를 제조하였다. 동시에 DhaB 효소 재활성화 인자, DhaT 유전자 및 DhaR 조절인자를 apramycin 내성 유전자로 치환한 재조합 균주 AR을 제조하였다. 이때 DhaB 유전자 상류의 DhaR 의존적 자체 프로모터를 인위적으로 조절이 가능한 lacZ 프로모터로 교체하였다.
크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578을 항생제를 첨가하지 않은 액상 배지에서 수 회 반복 배양한 후, 테트라사이클린이 첨가된 혹은 첨가되지 않은 배지에 접종하여, 플라스미드 DNA가 소실되어, 테트라사이클린이 첨가된 배지에서 증식하지 못하는 콜로니를 선별하여, 크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 Cu라 명명하고, 재조합 균주 제조를 위한 모균주로 이용하였다.
크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 상동성 재조합(homologous recombination) 용 플라스미드를 제조하기 위한 DNA 단편들을 하기의 프라이머 세트들을 사용하여 PCR로 증폭하였다 (도 2).
dhaBI 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 1 : 5'-TCTAGAATGAAAAGATCAAAACGATTT-3'(dhaBI XbaI-480bpF)
서열번호 2 : 5'-GGATCCGTCAGCGGCAATCTGCAC-3'(dhaBI BamHI-480bpR)
dhaK 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 3 : 5'-AAGCTTCATGCTCTCCGGCGCCTGTC-3'(dhaK HindIII-200-700 bpF)
서열번호 4 : 5'-AGATCTATTTGGTCCAGCGAGCTGAAGC-3'(dhaK BglII-200-700bpR)
dhaR 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 5 : 5'-AGATCTCCTGGGATTTCGCGACGGCA-3'(dhaR bglII-200-700bpF)
서열번호 6 : 5'-AAGCTTTCGACAATCGGTTTTAAGGTG-3'(dhaR HindIII-200-700bpR)
Apr 유전자 단편 증폭용 프라이머
서열번호 7 : 5'-GTTAACCTGACGCCGTTGGATACACC-3' Apr HpaI F
서열번호 8 : 5'-AGATCTAAAAGCTTATGAGCTCAGCCAATCGA-3' Apr HindIII-BglIIR
증폭된 DNA 단편을 pGEM TEasy 벡터를 이용하여 클로닝하여 염기서열을 확인한 후, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이 플라스미드 DNA를 제작하였다.
도 3에 나타낸 방법으로, AK 균주를 제조하기 위한 DhaB 유전자의 아미노 말단(dhaB')-LacZ promoter(PlacZ)-Apramycin 내성 유전자-DhaK 유전자의 아미노말단(dhaK')이 연결된 플라스미드 DNA를 제작하였으며, 도 4에 나타낸 방법으로, AR 균주를 제조하기 위한 DhaB 유전자의 아미노 말단(dhaB')-LacZ promoter(PlacZ)-Apramycin 내성 유전자-DhaR 유전자의 아미노말단(dhaR')이 연결된 플라스미드 DNA를 제작하였다.
상기 플라스미드를 BamHI-BglII로 처리하여 회수한 DNA 단편을 전기충격법으로 크렙시엘라 뉴모니아 Cu 균주에 도입한 후 apramycin이 첨가된 배지에서 콜로니를 형성하는 재조합 균주들을 분리하였다. 그 결과, dha 레귤론의 DhaB 효소 재활성화 인자, DhaT 유전자, DhaR 조절인자 및 DhaD 유전자가 제거되고 lacZ 프로모터와 apramycin 내성 유전자가 삽입된 재조합 균주 AK 균주를 수득하였으며, DhaB 효소 재활성화 인자, DhaT 유전자 및 DhaR 조절인자가 제거되고 lacZ 프로모터와 apramycin 내성 유전자가 삽입된 재조합 균주 AR을 수득 제작하였다.
실시예 2: 글리세롤 환원 경로 복구 균주의 제조
(1) 글리세롤 환원 경로 복구을 위한 플라스미드 DNA의 제조
하기의 프라이머 서열을 사용하여 DhaB 재활성화 효소 유전자(orfW)-orfX DNA 단편과 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 지닌 유전자{dhaT, yqhD(E. coli 유래), 혹은 yqhD 상동성 유전자(크렙시엘라 뉴모니아 유래)}를 증폭, pGEM TEasy 벡터로 클로닝하여 염기서열을 확인한 후 도 5에 나타낸 바와 같이 플라스미드 DNA를 제조하였다.
서열번호 9 : 5'-AGATCTATGAGCTATCGTATGTTTGA-3'(dhaT-BglII F)
서열번호 10 : 5'-CTCGAGAAGCTTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT-3'(dhaT-HindIII/XhoI R)
서열번호 11 : 5'-AGATCTATGAACAACTTTAATCTGCAC-3'(yqhD-BglII F)
서열번호 12 : 5'-AGATCTATGAATAATTTCGACCTGCA-3'(yqhD-HindIII/XhoI R)
서열번호 13 : 5'-AGATCTATGAATAATTTCGACCTGCA-3'(yqhD Kle BglII F)
서열번호 14 : 5'-CTCGAGAAGCTTAGCGTGCAGCCTCGTAAAT-3'(yqhD Kle HindIII, XhoI R)
도 5 및 도 6은 lacZ 프로모터 하류에 크렙시엘라 뉴모니아의 DhaT 유전자와 DhaB 재활성화 효소 유전자가 포함된 플라스미드 혹은 DhaT 유전자만이 포함된 플라스미드 DNA를 제작하는 과정을 나타낸 것이고, 도 7 및 도 8은 lacZ 프로모터 하류에 대장균 유래의 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성 YqhD(E) 유전자와 DhaB 재활성화 효소 유전자가 포함된 플라스미드 혹은 YqhD(E) 유전자만이 포함된 플라스미드 DNA를 제작하는 과정을 나타낸 것이다. 도 9 및 도 10은 lacZ 프로모터 하류에 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성 YqhD(K) 유전자와 dhaB 재활성화 효소 유전자가 포함된 플라스미드 혹은 YqhD(K) 유전자만이 포함된 플라스미드 DNA를 제작하는 과정을 내타낸 것이다.
(2) 글리세롤 환원경로가 복구된 재조합 균주의 제조
상기에서 제작된 6종류의 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA와 대조구로 pBR322 및 DhaB 재활성화효소 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 전기 충격법으로 글리세롤 혐기대사회로가 폐쇄된 AK, AR 균주로 도입하여 글리세롤 환원 경로가 복구된 재조합 균주들을 제조하였다 (표 1). 모균주인 Cu 균주에 각각의 플라스미드가 도입된 재조합 균주가 대조구로 이용되었다. 본 실시예에서 제작한 제조합 균주는 한국생명공학연구원 내 유전자원센터에 기탁하였다 (표 2).
본 발명에서 이용되거나 제작한 재조합 균주와 플라스미드 DNA
Significant Genotype
Strains
E. coli DH5a Cloning Host
K. pneumoniae Cu TetRcontained Plasmid DNA curing K. pneumoniae MGH 78578
K. pneumoniae AK (orfY-dhaT-orfW-orfX-dhaR-dhaD)::PLacZ-AprR
K. pneumoniae AR (orfY-dhaT-orfW-orfX-dhaR)::PLacZ-AprR
Plasmids
pV pBR322
pVO pBR322-PLacZ orfW-orfX
pVOT pBR322-PLacZ orfW-orfX-PLacZ dhaT
pVT pBR322-PLacZ dhaT
pVOQ pBR322-PLacZ orfW-orfX-PLacZ yqhD(E. coli)
pVQ pBR322-PLacZ yqhD(E. coli)
pVOK pBR322-PLacZ orfW-orfX-PLacZ yqhD(K. pneumoniae)
pVK pBR322-PLacZ yqhD(K. pneumoniae)
본 발명에 따른 재조합 균주의 기탁번호
균주명 기탁번호
Klebsiella pneumoniae AK KCTC11419BP
Klebsiella pneumoniae AR KCTC11420BP
Klebsiella pneumoniae AK-VOT KCTC11421BP
Klebsiella pneumoniae AK-VOK KCTC11422BP
Klebsiella pneumoniae AR-VOT KCTC11423BP
Klebsiella pneumoniae AR-VOK KCTC11424BP
실시예 3: 크렙시엘라 뉴모니아 Cu, AK-VOT, AK-VOQ 및 AK-VOK의 발효에 의한 1,3-프로판디올 생산
5L 발효조를 이용하여 크렙시엘라 뉴모니아 Cu, AK-VOT, AK-VOQ 및 AK-VOK 균주의 증식 정도를 조사하고, 동시에 배양 상등액의 글리세롤의 잔존량과 1,3-프로판디올을 비롯한 대사산물들의 생성량을 크로마토그래피법으로 분석하였다. 배지조성은 다음과 같다:
20 g/l 글리세롤, 3.4 g/l K2HPO4, 1.3 g/l KH2PO4, 0.2 g/l MgSO4, 0.002 g/l CaCl22H2O, 1 g/l 효모추출물, 1 ml 철 용액 [5 g/l FeSO47H2O, 4 ml HCl(37%,w/v)] 및 1 ml 미량원소용액 [70 mg/l ZnCl2, 100 mg/l MnCl24H2O, 60 mg/l H3BO3, 200 mg/l CoCl24H2O, 20 mg/l CuCl22H2O, 25 mg/l NiCl26H2O, 35 mg/l Na2MoO42H2O, 4 ml HCl(37%,w/v)].
5L 발효조에 유효용적을 2 L로하고, 최종농도가 IPTG 0.5 mM, 테트라사이클린 10 μg/L으로 하였으며, 접종량 1%, 배양온도 37ㅀC, 교반속도 200 rpm, 공기 주입속도는 0.5 vvm으로 하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 대조구인 Cu 균주가 타균주에 비해 다소 빠른 증식 속도를 보이기는 하였지만, 최종 OD600 값은 4 정도로 모든 균주에서 유사하게 나타났다. 잔존 글리세롤을 살펴보면 Cu의 경우 배양 12 시간째에 2% 글리세롤을 모두 소모하고, 7.63 g/L의 1,3-PD를 생산하였으며, 동시에 산화대사산물인 2,3-부탄디올 (2.35 g/L), 에탄올 (1 g/L), 젖산 (1 g/L), 아세트산 (0.4 g/L), 숙신산 (0.3 g/L)를 생산하였다. AK-VOT, AK-VOQ 및 AK-VOK 균주는 배양 30 시간 이후에도 5 g/L 이상의 글리세롤이 잔존하였으며, 6 g/L의 1,3-PD를 생산하였지만, Cu와 달리 산화대사 부산물들은 전혀 생산하지 않았다. 1,3-PD의 생산량 측면에서는 Cu 균주가 AK-VOT, AK-VOQ, AK-VOK 균주에 비해 1 g/L 이상 많았지만, 전환율 면에서는 반대로 10% 정도 낮은 것으로 나타났다.
본 발명에서 제조된 AK/pVOT 균주의 1단계 발효 결과
균주 (배양시간) Cu/pV (12 hr) AK/pVOT (24 hr)
잔존 글리세롤 (g/L) 0 5.7
1,3-PD 생산량 (g/L) 7.63 6.18
2,3-부탄디올 (g/L) 2.35 0
에탄올 (g/L) 1.0 0
젖산 (g/L) 1.0 0
숙신산 (g/L) 0.3 0
아세트산 (g/L) 0.4 1
글리세롤-1,3-PD 전환율 (%, mol/mol) 44 52
1,3-PD 생산성 (g/Lh) 0.61 0.26
실시예 4: 2단계 발효에 의한 1,3-프로판디올 생산
AK-VOT 균주의 낮은 1,3-PD 생산성을 개선하기 위하여 2단계 발효(two-step fermentation)을 수행하였다. 5L 발효조에 유효용적을 2L로하고, 최종농도가 IPTG 0.5 mM, 테트라사이클린 10 μg/L으로 하였으며, 균주접종량은 배지의 1%, 배양온도는 37ㅀC, 교반속도는 200 rpm, 공기 주입속도는 0.5 vvm으로 하였다. LB 배지에서 전배양한 균주를 2 L의 LB 배지에 접종하여(1%), 1차 발효(균주 배양 단계)를 수행한 후 12 시간째에 글리세롤을 20 g/L 농도로 첨가해주어 2차 발효(1,3-PD 생산 단계)를 실시하여 글리세롤 대사를 유도하였으며, 그 결과 1단계 발효(one-step fermentation)와 비교하여 1,3-PD 전환율은 52%에서 70%로, 생산성은 0.26 g/Lh에서 0.56 g/Lh로 두 배 이상의 향상된 결과를 얻었다 (도 12 및 표 4).
AK-VOT 균주의 2단계 발효결과
균주 (배양시간) Cu/pV (9 hr) AK/pVOT (9 hr)
잔존 글리세롤 (g/L) 0 11.4
1,3-PD 생산량 (g/L) 5.8 5
2,3-부탄디올 (g/L) 2.35 0
에탄올 (g/L) 1.0 0
젖산 (g/L) 1.0 0
숙신산 (g/L) 0.3 0
아세트산 (g/L) 0.4 0.5
글리세롤-1,3-PD 전환율 (%, mol/mol) 35 70
1,3-PD 생산성 (g/Lh) 0.64 0.56
실시예 5: 글리세롤 농도에 따른 영향
실시예 2와 동일한 조건으로 1단계 및 2단계 배양을 수행하였으며, 균주 성장 정도가 OD600 2일 때, 최종농도가 각각 5 g/L, 10 g/L, 15 g/L 및 20 g/L가 되도록 글리세롤을 첨가해 주었다. 배양 7시간 후에 1,3-PD 생산량을 비교했을 때 초기 글리세롤 농도가 10 g/L 일 때 가장 많은 4.94 g/L을 생산했으며, 전환율 역시 70%으로 가장 높은 전환율을 보였다 (도 13 및 표 5).
글리세롤 농도에 따른 발효결과
초기 글리세롤 (g/L) 5 10 15 20
잔존 글리세롤 (g/L) 0 1.9 6.6 12.1
1,3-PD 생산량 (g/L) 3.44 4.94 3.4 3.83
글리세롤-1,3-PD 전환율 (%, mol/mol) 0.49 0.70 0.49 0.55
1,3-PD 생산성 (g/Lh) 0.83 0.73 0.49 0.59
실시예 6: Aeration 정도에 따른 영향
실시예 2와 동일한 조건으로 1단계 및 2단계 배양을 수행하였으며, 균주 성장 정도가 OD600 2일 때, 글리세롤을 최종농도가 20 g/L가 되게 첨가해 주었으며, 각각의 areation 조건을 각각 0.0 vvm, 0.2 vvm, 0.5 vvm 및 1.0 vvm으로 달리하여 배양하였다. 그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, Aeration을 하지 않은 0.0 vvm의 경우 글리세롤을 거의 소모하지 못했으며, 0.2 vvm, 0.5 vvm 및 1.0 vvm에서는 거의 비슷한 글리세롤 소모성과 1,3-PD 생산성을 보였다.
실시예 7: pH에 따른 영향
실시예 2와 동일한 조건으로 1단계 및 2단계 배양을 수행하였으며, 균주 성장 정도가 OD600 2일 때, 글리세롤을 최종농도가 20 g/L가 되게 첨가해 주었으며, 배양액의 pH를 각각 5, 6, 7 및 8로 배양이 끝날 때까지 유지하였다. 그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, pH 6에서 가장 높은 1,3-PD 생산성을 나타내었다
실시예 8: 균체량에 따른 영향
실시예 2와 동일한 조건으로 1단계 및 2단계 배양을 수행하였으며, 균주 성장 정도가 OD600 수치가 각각 0, 0.5, 1, 2 및 3일 때 글리세롤을 최종농도가 20 g/L가 되게 첨가해 주었다. 그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, OD600 수치가 높을수록 1,3-PD 생산성이 높은 것을 확인하였다.
도 1은 글리세롤 대사과정에서 1,3-프로판디올을 생산하는 환원경로와 부산물을 생산하는 산화경로를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 변이체의 제조 방법을 dha 레귤론의 구조를 이용하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 AK 균주를 제조하기 위한 DhaB 유전자의 아미노 말단(dhaB')-LacZ promoter(PlacZ)-Apramycin 내성 유전자-DhaK 유전자의 아미노말단(dhaK')이 연결된 플라스미드 DNA의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 AR 균주를 제조하기 위한 DhaB 유전자의 아미노 말단(dhaB')-LacZ promoter(PlacZ)-Apramycin 내성 유전자-DhaR 유전자의 아미노말단(dhaR')이 연결된 플라스미드 DNA의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 5는 lacZ 프로모터 하류에 크렙시엘라 뉴모니아의 DhaT 유전자와 DhaB 재활성화 효소 유전자가 포함된 포함된 플라스미드 DNA의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 6은 lacZ 프로모터 하류에 크렙시엘라 뉴모니아의 DhaT 유전자만이 포함된 플라스미드 DNA의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 7은 lacZ 프로모터 하류에 대장균 유래의 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성 YqhD(E) 유전자 (E. coli)와 DhaB 재활성화 효소 유전자가 포함된 플라스미드 DNA의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 8은 lacZ 프로모터 하류에 대장균 유래의 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성 YqhD(E) 유전자 (E. coli)만이 포함된 플라스미드 DNA의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 9는 lacZ 프로모터 하류에 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성 YqhD(K) (K. pneumoniae) 유전자와 DhaB 재활성화 효소 유전자가 포함된 플라스미드 DNA의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 10은 lacZ 프로모터 하류에 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 1,3-프로판디올 옥시도리덕타제 활성 YqhD(K) (K. pneumoniae) 유전자만이 포함된 플라스미드 DNA의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에서 사용된 재조합 균주를 1단계 배양한 배양액의 성분을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에서 사용된 재조합 균주를 2단계 배양한 후의 배양액의 잔존 글리세롤 농도 및 생산된 1,3-프로판디올의 농도를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에서 사용된 재조합 균주의 글리세롤 농도에 따른 배양특성을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에서 사용된 재조합 균주의 aeration 정도에 따른 배양특성을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에서 사용된 재조합 균주의 pH에 따른 배양특성을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명에서 사용된 재조합 균주의 균체량에 따른 배양특성을 나타낸 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for Preparing 1,3-Propanediol Using Mutant Blocked in Glycerol Oxidation Pathway <130> P09-B013 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tctagaatga aaagatcaaa acgattt 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggatccgtca gcggcaatct gcac 24 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aagcttcatg ctctccggcg cctgtc 26 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agatctattt ggtccagcga gctgaagc 28 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agatctcctg ggatttcgcg acggca 26 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aagctttcga caatcggttt taaggtg 27 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gttaacctga cgccgttgga tacacc 26 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agatctaaaa gcttatgagc tcagccaatc ga 32 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agatctatga gctatcgtat gtttga 26 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ctcgagaagc ttcagaatgc ctggcggaaa at 32 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agatctatga acaactttaa tctgcac 27 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agatctatga ataatttcga cctgca 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 agatctatga ataatttcga cctgca 26 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ctcgagaagc ttagcgtgca gcctcgtaaa t 31

Claims (14)

  1. 다음 단계를 포함하는, 글리세롤을 탄소원으로하여 1,3-프로판디올을 생산하는 능력을 가지는 미생물에서 전사 활성인자를 코딩하는 유전자인 DhaR 또는 디하이드록시아세톤키나아제를 코딩하는 유전자가 결실 또는 불능화되어 있는 미생물 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법:
    (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계;
    (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨가하고 2차배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 1,3-프로판디올을 생산하는 능력을 가지는 미생물은 시트로박터(Citrobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 엔테로박터(Enterobacter), 크렙시엘라(Klebsiella) 및 락토바실러스(Lactobacillus)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 미생물 변이체는 추가적으로 글리세롤 디하이드로게나아제 를 코딩하는 유전자가 결실 또는 불능화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 1,3-프로판디올을 생산하는 능력을 가지는 미생물은 크렙시엘라 뉴모니아이고, 디하이드록시아세톤 키나아제 유전자는 DhaK, DhaL, DhaM 및 DhaK'로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 미생물 변이체는 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자인 DhaD 및 전사 활성인자 유전자인 DhaR가 결실 또는 불능화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 미생물 변이체는 전사 활성인자 유전자인 DhaR가 결실 또는 불능화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 다음 단계를 포함하는, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자인 DhaD, 전사 활성인자 유전자인 DhaR, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자인 DhaT 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자인 DhaBA2가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체인 AK 균주에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입되어 있거나, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자가 상기 변이체인 AK 균주의 염색체에 삽입되어 있는, 글리세롤을 탄소원으로하여 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법:
    (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계;
    (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨가하고 2차 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 글리세롤은 5~50 g/L의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 다음 단계를 포함하는, 글리세롤 디하이드로게나아제 유전자(DhaD), 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴 모니아 변이체(AK 균주)에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자와 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입되어 있거나, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자와 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자를 코딩하는 유전자가 상기 변이체(AK 균주)의 염색체에 삽입되어 있는, 글리세롤을 탄소원으로하여 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법:
    (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계;
    (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨가하고 2차배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 글리세롤은 5~50 g/L의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 다음 단계를 포함하는, 글리세롤을 탄소원으로하여 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈 유전자(DhaT) 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자(DhaBA2)가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이 체(AR 균주)에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입되어 있거나, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자가 상기 변이체(AR 균주)의 염색체에 삽입되어 있는, 글리세롤을 탄소원으로하여 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법:
    (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계;
    (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨가하고 2차 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 상기 글리세롤은 5~50 g/L의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 다음 단계를 포함하는, 글리세롤을 탄소원으로하여 전사 활성인자 유전자(DhaR), 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈 유전자인 DhaT 및 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자II 유전자인 DhaBA2가 결실되어 있는 크렙시엘라 뉴모니아 변이체인 AR 균주에 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자와 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입되어 있거나, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자와 글리세롤 디하이드라타아제 재활성화인자를 코딩하는 유전자가 상기 변이체인 AR 균주의 염색체에 삽입되어 있는, 글리세롤을 탄소원으로하여 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이체를 배양하여 1, 3-프로판디올을 제조하는 방법:
    (a) 글리세롤 부재 배지에서 상기 미생물 변이체를 1차 배양하여 균체를 증식시키는 단계;
    (b) 상기 균체가 증식된 배양액에 글리세롤을 첨가하고 2차 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 회수하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 글리세롤은 5~50 g/L의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020185654A1 (en) * 2019-03-08 2020-09-17 Colgate-Palmolive Company Personal care compositions

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130011343A (ko) * 2011-07-21 2013-01-30 한국생명공학연구원 글리세롤 발효 미생물 변이체를 이용하여 디올화합물을 고수율로 생산하는 방법
KR101871464B1 (ko) * 2011-09-02 2018-06-26 한국생명공학연구원 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 에탄올 고생성능을 가지는 개량된 변이 미생물 및 이를 이용한 에탄올의 제조방법
EP3438270A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-06 Metabolic Explorer Microorganism and method for improved 1,3-propanediol production by fermentation on a culture medium with high glycerine content
US20230265466A1 (en) * 2020-07-31 2023-08-24 Lg Chem, Ltd. Method for preparing 3-hydroxypropionic acid through two steps

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020059364A (ko) * 1999-08-18 2002-07-12 메리 이. 보울러 1,3-프로판디올의 생물학적 생산 방법
US6432686B1 (en) * 1998-05-12 2002-08-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms comprising genes for vitamin B12 transport
KR20080109787A (ko) * 2006-03-31 2008-12-17 라이스 유니버시티 글리세롤의 혐기성 발효

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6432686B1 (en) * 1998-05-12 2002-08-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms comprising genes for vitamin B12 transport
KR20020059364A (ko) * 1999-08-18 2002-07-12 메리 이. 보울러 1,3-프로판디올의 생물학적 생산 방법
KR20080109787A (ko) * 2006-03-31 2008-12-17 라이스 유니버시티 글리세롤의 혐기성 발효

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biotechnol Bioeng. 2003 Sep 5;83(5):525-36. *
논문1:BIOTECHNOL BIOENG. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020185654A1 (en) * 2019-03-08 2020-09-17 Colgate-Palmolive Company Personal care compositions

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