KR101188979B1 - Conjugate of biocompatible polymer and photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof - Google Patents

Conjugate of biocompatible polymer and photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof Download PDF

Info

Publication number
KR101188979B1
KR101188979B1 KR1020100020279A KR20100020279A KR101188979B1 KR 101188979 B1 KR101188979 B1 KR 101188979B1 KR 1020100020279 A KR1020100020279 A KR 1020100020279A KR 20100020279 A KR20100020279 A KR 20100020279A KR 101188979 B1 KR101188979 B1 KR 101188979B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
present
cancer
biocompatible polymer
conjugate
photosensitizer
Prior art date
Application number
KR1020100020279A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20110101338A (en
Inventor
나건
배병찬
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to KR1020100020279A priority Critical patent/KR101188979B1/en
Publication of KR20110101338A publication Critical patent/KR20110101338A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101188979B1 publication Critical patent/KR101188979B1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A61K31/719—Pullulans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy

Abstract

본 발명은 광역학 진단 또는 치료를 위한 생체 적합성 고분자와 광감작제의 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 생체 적합성 고분자와 광감작제가 에스터 본드(ester bond)로 결합하고 있고, 상기 생체 적합성 고분자는 암세포 표적물질과 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체, 이의 제조방법 및 상기 결합체를 유효성분으로 포함하는 광역학적 암 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 암세포만을 특이적으로 표적할 수 있는 암세포 표적물질을 포함하고 있어 암세포에 대한 선택성과 축적성이 우수하고, 근적외선 조사시 암세포를 사멸하는 효과가 우수할 뿐만 아니라 암세포 이외의 세포에 대해서는 근적외선 조사시에도 세포독성을 나타내지 않아 체내 안정성이 우수한 효과가 있으므로 광역학을 이용한 질병의 진단 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.The present invention relates to a combination of a biocompatible polymer and a light sensitizer and a method for manufacturing the same, and more specifically, the biocompatible polymer and the light sensitizer are bonded by an ester bond. The biocompatible polymer relates to a photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate formed by binding to a cancer cell target material, a preparation method thereof, and a photodynamic cancer therapeutic composition comprising the conjugate as an active ingredient. The photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate according to the present invention includes a cancer cell target material capable of specifically targeting only cancer cells, and thus has excellent selectivity and accumulation for cancer cells, and excellent effect of killing cancer cells during near-infrared irradiation. In addition, cells other than cancer cells do not show cytotoxicity even when irradiated with near infrared rays, and thus have excellent effects on stability in the body, and thus may be useful for diagnosing or treating diseases using photodynamics.

Description

광역학 진단 또는 치료를 위한 생체 적합성 고분자와 광감작제의 결합체 및 이의 제조방법{Conjugate of biocompatible polymer and photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof}Conjugate of biocompatible polymer and photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation

본 발명은 광역학 진단 또는 치료를 위한 생체 적합성 고분자와 광감작제의 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 암세포에 대한 축적률과 표적률이 우수하고 암세포 이외의 세포에 대해서는 안정성이 우수하도록 생체 적합성 고분자에 광감작제와 암세포 표적물질이 결합된 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a combination of a biocompatible polymer and a photosensitizer for photodynamic diagnosis or treatment, and a method of preparing the same. More specifically, the present invention provides excellent accumulation rate and target rate for cancer cells and stability for cells other than cancer cells. The present invention relates to a conjugate in which a photosensitizer and a cancer cell target material are combined with a biocompatible polymer, and a method of preparing the same.

광역학 치료법(photo dynamic therapy: PDT)은 광민감성 물질(photo-sensitizer)을 이용하여 수술 없이 암 등의 난치병을 치료하거나 여드름 등의 병을 치료하는 기술이다. 이러한 광역학 치료법(PDT)은 20세기 초부터 활발한 연구가 진행되어 현재에 이르러는 암의 진단과 치료, 자가골수이식, 항생제, AIDS 치료, 피부이식 수술이나 관절염 등의 치료에 면역성을 높이기 위해 사용되고 있어 그 응용 범위는 점차 확대되고 있다. Photodynamic therapy (PDT) is a technique for treating incurable diseases such as cancer or acne and the like without surgery using photo-sensitizer. Such photodynamic therapy (PDT) has been actively studied since the beginning of the 20th century and is used to increase immunity in the diagnosis and treatment of cancer, autologous bone marrow transplantation, antibiotics, AIDS treatment, skin transplantation or arthritis. The application area is gradually expanding.

특히, 암의 치료에 사용되는 PDT는 빛에 예민한 반응을 보이는 물질인 광민감성 물질(photosensitizer)을 체내에 투여하면 외부에서 빛을 조사하였을 경우, 체내의 풍부한 산소와 외부 빛에 의한 화학반응으로 단일항산소(singlet oxygen) 또는 자유 라디칼(free radical)이 생성되고, 이런 단일항산소 또는 자유 라디칼이 각종 병변 부위나 암세포의 세포사멸을 유도하여 파괴하는 원리를 이용한 치료법이다.In particular, PDT, which is used for the treatment of cancer, is treated with a photosensitive material (photosensitizer) that is sensitive to light. Single oxygen or free radicals are produced, and this single anti-oxygen or free radical is a therapeutic method using the principle of inducing and destroying apoptosis of various lesion sites or cancer cells.

현재 PDT 요법에 사용되고 있는 광민감성 물질로는 포르피린(porphyrin) 유도체, 크로린(chlorin), 박테리오크로린 (bacteriochlorin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 5-아미노레불린 산(5-aminolevulinic acid) 유도체 등이 알려져 있으며, 광민감성 물질로서 사이클릭 테트라피롤 유도체는 암세포에 선택적으로 축적될 뿐만 아니라 화합물의 특징상 형광이나 인광을 나타내므로 종양의 조기진단 시약으로도 활용될 수는 특징이 있다. 또한, 사이클릭 테트라피롤 내부에 금속이 결합되어 있는 메탈로포르피린(metalloporphyrin)의 경우에는 결합된 금속의 종류에 따라 여러 가지 특성을 나타내기 때문에 메탈로포르피린을 MRI(magnetic resonance imaging) 조영제(contrasting agent)로 하는 진단기술을 이용하여 암세포와 같은 종양세포의 조기 진단에 응용되기도 하며, 가장 널리 알려진 광민감성 물질인 5-아미노레불린산 유도체는 사용 방법이 단순하고 분자량이 작아 비교적 피부 침투가 용이하며, 부작용이 적어 안전하다는 장점이 있다. Photosensitive materials currently used in PDT therapy include porphyrin derivatives, chlorin, bacteriochlorin, phthalocyanine, and 5-aminolevulinic acid derivatives. It is known that cyclic tetrapyrrole derivatives as photosensitive substances can be used as early diagnostic reagents of tumors because they not only selectively accumulate in cancer cells but also exhibit fluorescence or phosphorescence due to the characteristics of the compounds. In addition, in the case of metalloporphyrin, in which a metal is bonded to the cyclic tetrapyrrole, metalloporphyrin is used as a magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent because it exhibits various properties depending on the type of metal bound. It is also applied to the early diagnosis of tumor cells such as cancer cells using the diagnostic technology of). 5-aminolevulinic acid derivative, the most widely known photosensitive substance, is simple to use and relatively easy to penetrate the skin due to its small molecular weight. This has the advantage of being safe with fewer side effects.

또한, 광역학 치료는 정상 세포는 그대로 보존하면서 암세포만 선택적으로 제거할 수 있는 장점이 있고, 대부분 전신 마취의 위험성을 배제할 수 있으며, 간단한 국소 마취 만으로도 수술할 수 있는 등 시술이 용이한 장점도 있다.In addition, photodynamic therapy has the advantage of being able to selectively remove only cancer cells while preserving normal cells, and most of them can eliminate the risk of general anesthesia, and can be easily operated by simple local anesthesia. have.

한편, 광역학 치료는 빛의 투과 제한으로 부피가 큰 종양에는 사용되고 있지 못하며 특히, 광감작제의 인체 내 대사가 느려 광독성의 부작용이 발견되고 있고, 종양 내의 광감작제의 농도가 낮아 효율적인 치료 효과를 보이지 못한다는 문제점이 있다. 또한, 치료 이외의 장기간 동안 치료 화합물이 체내에 누적되어 있기 때문에 이로 인한 각종 체내의 부작용을 유발하기도 한다. 뿐만 아니라 광역학 치료용으로 사용되고 있는 광민감성 물질들의 경우, 대부분이 친수성 제품으로서 피부 침투가 어렵기 때문에 장기간에 걸쳐 여러 차례 치료해야 하므로 치료를 위해 많은 시간이 소요된다는 문제점이 있다. Photodynamic therapy, on the other hand, is not used for bulky tumors due to the restriction of light transmission. In particular, side effects of phototoxicity are found due to the slow metabolism of photosensitizers in the human body. There is a problem that does not show. In addition, due to the accumulation of therapeutic compounds in the body for a long period of time other than treatment, it may cause various side effects in the body. In addition, in the case of photosensitive materials used for photodynamic therapy, since most of them are hydrophilic products, it is difficult to penetrate the skin, and thus many times need to be treated over a long period of time.

따라서 암세포 특이적으로 축적률이 높고, 부작용이 없으며, 치료 효과가 우수한 새로운 광역학 치료제의 개발이 요구되고 있다.
Therefore, there is a need for development of a new photodynamic therapeutic agent having a high accumulation rate, no side effects, and an excellent therapeutic effect specifically for cancer cells.

따라서 본 발명의 목적은 광감작제의 종양세포로의 축적을 높임과 동시에 암세포에서만 특이적으로 세포독성을 나타내는 효과가 있는 광역학 치료제로서, 생체 적합성 고분자와 광감작제가 에스터 본드(ester bond)로 결합하고 있고, 상기 생체 적합성 고분자는 암세포 표적물질이 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is a photodynamic therapeutic agent having an effect of increasing the accumulation of photosensitive agents into tumor cells and at the same time exhibiting specific cytotoxicity only in cancer cells, wherein the biocompatible polymer and the photosensitizer are used as ester bonds. In the binding, the biocompatible polymer provides a photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate in which a cancer cell target material is bound.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing a photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate according to the present invention.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 유효성분으로 함유하는 광역학적 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a photodynamic cancer treatment composition containing the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate according to the present invention as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체 적합성 고분자와 광감작제가 에스터 본드(ester bond)로 결합하고 있고, 상기 생체 적합성 고분자는 암세포 표적물질과 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate in which a biocompatible polymer and a photosensitizer are combined with an ester bond, and the biocompatible polymer is combined with a cancer cell target material. .

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 친수성의 플루란(pullulan) 또는 히알루론산(hyaluronic acid) 유도체일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the biocompatible polymer may be a hydrophilic pullulan (pullulan) or hyaluronic acid derivative.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암세포 표적물질은 엽산, 또는 CD133, CD44, CD34 및 Bcl-2로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 단백질에 대한 단클론 항체일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the cancer cell target material may be a monoclonal antibody against folic acid or any one protein selected from the group consisting of CD133, CD44, CD34, and Bcl-2.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감작제는 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the photosensitizer may be selected from the group consisting of porphyrins (phophyrins), chlorins (chlorins), bacteriochlorins (bacteriochlorins) and porphycenes (porphycenes).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감작제는 근적외선에서 형광을 띄며, 소수성이고, COOH기를 갖는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the photosensitizer may be fluorescent in the near infrared, hydrophobic, having a COOH group.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감작제는 페어포비드 a(pheophorbide a)일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the photosensitizer may be a pair of pheophorbide a.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 결합체는 혈액순환시 또는 정상조직에서는 세포독성을 나타내지 않고, 암조직 또는 암세포에만 선택적으로 표적, 축적 및 분해되어, 근적외선 파장의 빛을 조사하면 단일항산소 또는 자유라디칼을 생성하여 세포독성을 나타낼 수 있다. In one embodiment of the present invention, the conjugate does not exhibit cytotoxicity in blood circulation or normal tissues, and is selectively targeted, accumulated and degraded only to cancer tissues or cancer cells, so as to irradiate light of near-infrared wavelengths with a single oxygen or Free radicals can be produced to show cytotoxicity.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 결합체가 암조직 또는 암세포에서 표적 및 축적되면 생체내 효소에 의해 에스터 본드와 고분자 연결부분이 절단되고 형광간섭이 풀려 형광을 띄는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, when the conjugate targets and accumulates in cancer tissues or cancer cells, the ester bond and the polymer connection portion may be cleaved by enzymes in vivo and fluorescence interference may be released to fluoresce.

또한, 본 발명은, Further, according to the present invention,

생체 적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계;Dissolving the biocompatible polymer in an organic solvent;

상기 용해된 용액에 암세포 표적물질과 촉매를 첨가하여 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 에스터 본드(ester bond)로 결합시키는 단계;Adding a cancer cell target material and a catalyst to the dissolved solution to bind the biocompatible polymer and the cancer cell target material with an ester bond;

상기 에스터 본드(ester bond)로 결합된 물질에 유기용매에 용해된 광감작제와 촉매를 첨가하여 상기 광감작제를 생체 적합성 고분자에 에스터 본드로 결합시키는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조하는 방법을 제공한다. The photodynamics according to the present invention includes the step of coupling the photosensitizer to the biocompatible polymer with an ester bond by adding a photosensitizer and a catalyst dissolved in an organic solvent to the material bonded by the ester bond. Provided are methods for preparing the diagnostic or therapeutic conjugates.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 친수성의 플루란 (pullulan) 또는 히알루론산(hyaluronic acid) 유도체일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the biocompatible polymer may be a hydrophilic pullulan or hyaluronic acid derivative.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감작제는 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the photosensitizer may be selected from the group consisting of porphyrins (phophyrins), chlorins (chlorins), bacteriochlorins (bacteriochlorins) and porphycenes (porphycenes).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 촉매는 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 또는 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide ;DCC)일 수 있다. In one embodiment of the invention, the catalyst is 4-hydroxymethyl benzoic acid (4-hydroxymethylbezoic acid (DMAP) or 1,3-dicyclo hexyl carbodiimide (1,3-dicyclohexyl carbodiimide; DCC) yl Can be.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암세포 표적물질은 엽산, 또는 CD133, CD44, CD34 및 Bcl-2으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 단백질에 대한 단클론 항체일 수 있다.
In one embodiment of the present invention, the cancer cell target material may be a monoclonal antibody against folic acid or any one protein selected from the group consisting of CD133, CD44, CD34, and Bcl-2.

본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 암세포만을 표적할 수 있는 암세포 표적물질을 포함하고 있어 암세포에 대한 선택성과 축적성이 우수하고, 근적외선 조사시 암세포를 사멸하는 효과가 우수할 뿐만 아니라 암세포 이외의 세포에 대해서는 근적외선 조사시에도 세포독성을 나타내지 않아 체내 안정성이 우수한 효과가 있으므로 광역학을 이용한 질병의 진단 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있는 특징이 있다.
The photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate according to the present invention includes a cancer cell target material capable of targeting only cancer cells, and thus has excellent selectivity and accumulation to cancer cells, as well as an effect of killing cancer cells during near-infrared irradiation. Cells other than cancer cells do not show cytotoxicity even when irradiated with near infrared rays, and thus have excellent stability in the body. Therefore, they are useful for diagnosing or treating diseases using photodynamics.

도 1은 본 발명에 따라 제조된 광역학 진단 또는 치료용 결합체(나노미립구)를 1H NMR을 이용하여 화학적 결합을 분석한 것을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 플루란-엽산 결합물을 광산란장치 및 전자현미경을 이용하여 크기와 분포 형태를 관찰한 것을 나타낸 것이고, 도 5b는 플루란-엽산 결합물에 광감작제를 첨가하여 제조한 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체(나노미립구)를 광산란장치 및 전자현미경을 이용하여 크기와 분포 형태를 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구에 대해 형광간섭 효과가 나타날때와 나타나지 않을 때의 형광그래프를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구에 대해 피렌(pyrene)을 이용하여 자가형광 간섭농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구에 대해 레이저 조사에 따른 단일항산소 생성능을 나타낸 그래프로서, ●: 개질화하지 않은 pheo-A의 DMF상에서의 산소생성을 나타낸 것이고, ○: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP1)의 DMF상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ▼: 본 발명에 따른 나노 미립구(PFP2)의 DMF상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, △: 본 발명에 따른 나노 미립구(PFP3)의 DMF상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ■: 개질화하지 않은 pheo-A의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, □: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP1)의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ◆: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP2)의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ◇: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP3)의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이다(참고로, 본 발명의 일실시예에서 나노미립구의 제조과정 중, 광감작제의 양을 0.50mg, 1.25mg 및 2.5mg로 사용하여 제조한 나노미립구를 순차적으로 각각 PFP1, PFP2 및 PFP3으로 명명하였다).
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구 및 대조군으로 사용한 개질화되지 않은 pheo-A를 각각 세포에 흡수시키고, 레이저 조사한 다음, XTT시약을 통하여 세포사멸을 관찰한 것을 비교하여 나타낸 결과로서, ●: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP2)를 세포와 배양한 다음, 레이저를 조사하지 않은 경우를 나타낸 것이고, ○: 개질화하지 않은 pheo-A을 세포와 배양한 다음, 레이저를 조사하지 않은 경우를 나타낸 것이며, : 본 발명에 따른 나노미립구(PFP2)를 세포와 배양한 후, 레이저를 조사한 경우를 나타낸 것이고, : 개질화하지 않은 pheo-A를 세포와 함께 배양 후, 레이저를 조사한 경우를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구를 암세포 및 암세포가 없는 배양액에 각각 처리하고 암세포의 효소작용에 의해 분해되어 발색하는 형광의 정도를 이미지로 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 나노미립구와 개질화되지 않은 pheo-A를 각각 투여한 누드마우스를 시간에 따라 KODAK 이미지 스테이션을 통하여 생체 내에서 나타나는 형광값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 나노미립구와 개질화되지 않은 pheo-A를 암세포에 처리한 다음, 시간에 따른 세포내의 위치를 공초점현미경을 통해 관찰한 것을 나타낸 것이다. Figure 1 is a graph showing the analysis of chemical binding using a photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate (nanomicrospheres) prepared according to the invention using 1 H NMR.
Figure 2a shows the size and distribution of the fluorane-folate conjugate prepared according to an embodiment of the present invention using a light scattering device and an electron microscope, Figure 5b is a light on the flulan-folate conjugate The optical dynamics diagnostic or therapeutic conjugate (nanomicrospheres) according to the present invention prepared by adding a sensitizer is observed by observing the size and distribution form using a light scattering device and an electron microscope.
Figure 3 shows a comparison of the fluorescence graph when the fluorescence interference effect appeared and when it does not appear for the nanoparticles of the present invention prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 shows the result of measuring the autofluorescence interference concentration using pyrene (pyrene) for the nanoparticles of the present invention prepared according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing the ability of mono-antioxidant to be generated by laser irradiation for nanoparticles of the present invention prepared according to an embodiment of the present invention. ○: shows the oxygen production performance on the DMF of the nanoparticles (PFP1) according to the present invention, ▼: shows the oxygen production performance on the DMF of the nanoparticles (PFP2) according to the present invention, △: according to the present invention Oxygen production on DMF of nanoparticles (PFP3), ■: shows oxygen production on PBS of unmodified pheo-A, □: Oxygen on PBS of nanoparticles (PFP1) according to the present invention Shows the production capacity, ◆: shows the oxygen production capacity on the PBS of the nanoparticles (PFP2) according to the present invention, ◇: shows the oxygen production performance on the PBS of the nanoparticles (PFP3) according to the present invention (For reference, in one embodiment of the present invention, the nanoparticles prepared using the amount of photosensitizer 0.50mg, 1.25mg and 2.5mg during the preparation of the nanoparticles were sequentially converted into PFP1, PFP2 and PFP3, respectively. Named).
Figure 6 is a nanoparticles of the present invention prepared in accordance with an embodiment of the present invention and the unmodified pheo-A used as a control group to absorb the cells, and then irradiated with laser, and observed the cell death through XTT reagent As a result of the comparison, it was shown that: ●: the case of culturing the nanoparticles (PFP2) according to the present invention with the cells, and not irradiated with a laser, ○: culturing unmodified pheo-A with the cells, The case of not irradiating a laser is shown, and: After culturing the nanoparticles (PFP2) according to the present invention with a cell, and the case of irradiating a laser,: After culturing unmodified pheo-A with the cells, The case of laser irradiation is shown.
Figure 7 is a result of showing the degree of fluorescence decomposed by the treatment of the nanoparticles of the present invention prepared in accordance with one embodiment of the present invention in a culture medium without cancer cells and cancer cells and the color development by the enzymatic action of cancer cells.
Figure 8 shows the results of measuring the fluorescence value in vivo through the KODAK imaging station nude mice administered with nanoparticles and unmodified pheo-A of the present invention over time.
Figure 9 shows that after treating the nanoparticles and unmodified pheo-A of the present invention to cancer cells, the position of the cells over time was observed through confocal microscopy.

본 발명은 암조직 또는 암세포로의 축적률과 표적률을 높이고 암조직 또는 암세포 이외에서는 형광간섭으로 인한 광독성을 현저히 줄여줄 수 있는 새로운 광역학 치료방법으로서, 생체 적합성 고분자와 광감작제가 에스터 본드(ester bond)로 결합하고 있고, 상기 생체 적합성 고분자는 암세포 표적물질과 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제공함에 그 특징이 있다. The present invention is a novel photodynamic therapy method that can increase the accumulation rate and target rate to cancer tissues or cancer cells and significantly reduce phototoxicity due to fluorescence interference other than cancer tissues or cancer cells. ester bond), and the biocompatible polymer is characterized in that it provides a photodynamic diagnosis or treatment conjugate formed by binding to a cancer cell target material.

통상적으로 광역학 치료에 있어서, 광감작제를 고분자 물질에 결합시킬 경우, 대부분 아미노기와 카르복실기가 결합하여 형성되는 아마이드 본드(amide bond), 즉, -CO-NH-결합으로 연결되는데, 본 발명에서는 광감작제를 고분자 물질에 결합시킬 경우, 아마이드 본드(amide bond)가 아닌 에스터 본드(ester bond) 결합으로 결합시킨 특징이 있다.Typically, in photodynamic therapy, when the photosensitiser is bound to a polymer material, most of the photosensitive agent is linked by an amide bond, ie, -CO-NH-bond, formed by binding an amino group to a carboxyl group. When the photosensitizer is bonded to the polymer material, it is characterized by bonding with an ester bond rather than an amide bond.

이러한 에스터 본드 결합은 아마이드 결합에 비해 체내에서 분해효율이 높아 적은양의 광감작제만으로도 높은 치료효과를 가질 수 있는 유용함이 있다.Such ester bond bonds have a higher degradation efficiency in the body than amide bonds, and thus have a useful therapeutic effect having only a small amount of photosensitizer.

또한, 본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 친수성인 생체 적합성 고분자 유도체와 소수성인 광감작제의 균형을 통해 수계에서 안정하게 나노크기의 자기조립체(self-assembly)인 나노겔 또는 나노미립구의 형태일 수 있다. In addition, the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate according to the present invention is a nano-sized self-assembly nanogel or nano-stable in water through a balance between a hydrophilic biocompatible polymer derivative and a hydrophobic photosensitizer It may be in the form of microspheres.

이하에서는 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조방법을 단계별로 보다 상세히 기술한다.
Hereinafter will be described in more detail step by step a method for producing a photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate according to the present invention.

제1단계: 생체 적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계First step: dissolving the biocompatible polymer in an organic solvent

본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조를 위해 먼저 생체 적합성 고분자를 유기용매에 용해시킨다.Biocompatible polymers are first dissolved in an organic solvent for the preparation of the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugates of the present invention.

상기 고분자는 생체 내에서 생체적합성 및 생분해성이 우수해야 하며, 생체 내에서 안정성이 우수할 뿐만 아니라 암 조직에 효과적으로 축적되는 특성이 필요하다.The polymer should be excellent in biocompatibility and biodegradability in vivo, as well as excellent stability in vivo and needs to be effectively accumulated in cancer tissues.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 고분자로는 생체 내에서 생체적합성을 갖는 고분자 또는 고분자 유도체라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 친수성을 띄는 플루란(pullulan) 또는 히알루론산(hyaluronic acid) 유도체를 사용할 수 있다.As the polymer that can be used in the present invention, any polymer or polymer derivative having biocompatibility in vivo can be used, and preferably, pullulan or hyaluronic acid derivatives exhibiting hydrophilicity can be used. .

본 발명의 일실시예에서는 하기 구조식의 플루란을 사용하였는데, 상기 '플루란’ 은 흑효모(Aureobasidium pullulans (DE BARY) ARN.)로부터 생산한 다당류를 분리 정제하여 얻어지는 물질로서 주성분은 중성다당류이다. 플루란은 물에 잘 녹는 반면, 알코올류와 유류에는 녹지 않는 특성이 있고, 다른 검류에 비해 점도는 낮은 편에 속하나, 산, 알칼리, 열 등에 안정하다. 특히, 피막성 외에 강력한 점착력을 가지고 있고, 평균 분자량은 200,000과 100,000의 2종류가 있으며, 점도는 1-2cps이다. 본 발명의 일실시예에서는 분자량이 100,000인 것을 사용하였다.
In one embodiment of the present invention, the flulan of the following structural formula was used, and the 'flurane' is a substance obtained by separating and purifying a polysaccharide produced from Aureobasidium pullulans (DE BARY) ARN. . While flulan is well soluble in water, it is insoluble in alcohols and oils, and has a lower viscosity than other gums, but is stable to acids, alkalis and heat. In particular, it has a strong adhesive force in addition to the coating property, and has an average molecular weight of two types of 200,000 and 100,000, the viscosity is 1-2cps. In one embodiment of the present invention, a molecular weight of 100,000 was used.

Figure 112010014506078-pat00001
Figure 112010014506078-pat00001

<플루란의 구조식>                  <Fluran structural formula>

또한, 상기 고분자는 시중에서 판매하고 있는 것을 구입하여 사용하거나, 천연으로부터 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 고분자 물질에 존재하는 불순물을 제거하고 순도도 높이기 위해 깨끗이 정제하여 사용할 수 있다.In addition, the polymer may be purchased and used in the market, or may be used by separating and purifying by natural methods known in the art, and preferably, in order to remove impurities present in the polymer material and to increase purity. It can be used by purification.

상기 고분자를 유기용매에 용해시키는 과정은 고분자가 유기용매 하에서 충분히 용해될 수 있도록 적당량의 유기용매를 사용하는 것이 바람직하며, 이때 유기용매의 사용량이 너무 적을 경우, 고분자가 서로 엉겨붙는 현상이 일어날 수 있다.In the process of dissolving the polymer in an organic solvent, it is preferable to use an appropriate amount of an organic solvent so that the polymer can be sufficiently dissolved in the organic solvent. If the amount of the organic solvent is too small, the polymers may be entangled with each other. have.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 유기용매로는 DMSO, 포름아마이드(formamide) 및 DMF 일 수 있으며, 바람직하게는 DMSO일 수 있다.The organic solvent that can be used in the present invention may be DMSO, formamide (formamide) and DMF, preferably DMSO.

제2단계: 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 에스터 본드로 결합시키는 단계Step 2: combining the biocompatible polymer and the cancer cell target with an ester bond

제1단계에서 생체 적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 과정이 완료되면, 상기 고분자가 용해된 용액에 암세포 표적물질과 촉매를 첨가하여 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 에스터 본드로 결합시킨다.When the process of dissolving the biocompatible polymer in the organic solvent is completed in the first step, a cancer cell target material and a catalyst are added to the solution in which the polymer is dissolved to combine the biocompatible polymer and the cancer cell target material with an ester bond.

본 발명에서는 광역학 진단 또는 치료용 결합체가 보다 효과적으로 암세포 또는 암조직만을 표적화 할 수 있도록 암세포 표적물질을 사용하였는데, 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 암세포 표적물질로는 이에 제한되지는 않으나, 엽산, 또는 CD133, CD44, CD34 및 Bcl-2으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 단백질에 대한 단클론 항체일 수 있다. 즉, 상기 암세포 표적물질은 정상세포에 비해 암세포에서만 특이적으로 발현되고 있어 암세포만을 표적화하는데 매우 유용하다. In the present invention, the cancer cell target material was used so that the conjugate for photodynamic diagnosis or treatment more effectively targets only cancer cells or cancer tissues. However, the cancer cell target material that can be used in the present invention is not limited thereto, but folic acid, or It may be a monoclonal antibody to any one protein selected from the group consisting of CD133, CD44, CD34 and Bcl-2. That is, the cancer cell target material is specifically expressed only in cancer cells compared to normal cells, which is very useful for targeting only cancer cells.

본 발명의 일실시예에서는 상기 암세포 표적물질로 엽산을 사용하였는데, 이는 암세포 표면에는 엽산을 인지하는 수용체가 많이 분포되어 있어 엽산을 사용할 경우, 정상적인 세포를 제외한 암세포에만 선택적으로 침투하게 됨으로써 암세포만을 표적화할 수 있기 때문이다.In one embodiment of the present invention, folic acid was used as a target material for cancer cells, which has a large number of receptors for recognizing folic acid on the surface of cancer cells, and thus folic acid selectively targets only cancer cells by selectively penetrating only cancer cells except normal cells. Because you can.

본 발명에서 사용한 상기 엽산은 비타민 B 복합체의 하나로 하기 구조식을 가지며, 자연계에서는 트라이 또는 헵타글루타밀펩티드의 형태로 존재한다.The folic acid used in the present invention has the following structural formula as one of the vitamin B complex, and exists in the form of tri or heptaglutamyl peptide in nature.

Figure 112010014506078-pat00002
Figure 112010014506078-pat00002

<엽산의 구조식>
<Structural formula of folic acid>

본 발명의 일실시예에서는 상기 엽산을 생체 적합성 고분자와 에스터 본드로 결합시키기 위해 엽산의 -COOH기를 활성화 시키는 촉매를 첨가하여 반응시킬 수 있다. In one embodiment of the present invention, in order to bind the folic acid to the biocompatible polymer and the ester bond, a catalyst for activating the -COOH group of folic acid may be added and reacted.

이때 상기 촉매로는 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 또는 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide:DCC)를 사용할 수 있다.In this case, 4-hydroxymethylbezoic acid (DMAP) or 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (1,3-dicyclohexyl carbodiimide: DCC) may be used as the catalyst.

또한, 본 발명에서 상기 암세포 표적물질과 고분자와의 에스터 결합 반응은 유기용매에 상기 암세포 표적물질과 촉매를 용해시키고, 상기 제1단계에서 고분자가 용해된 용액에 한 방울씩 떨어뜨리면서 상온에서 20~28시간 반응시킬 수 있다. 이때, 상기 암세포 표적물질과 촉매를 용해시킬 수 있는 유기용매는 상기 고분자를 용해시킨 유기용매와 동일한 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DMSO를 사용할 수 있다.
In addition, in the present invention, the ester binding reaction between the cancer cell target material and the polymer may be performed by dissolving the cancer cell target material and the catalyst in an organic solvent and dropping one drop into the solution in which the polymer is dissolved in the first step. It can react for 28 hours. In this case, the organic solvent capable of dissolving the cancer cell target material and the catalyst may use the same solvent as the organic solvent in which the polymer is dissolved, preferably DMSO.

제3단계: Step 3: 광감작제를Photosensitizer 생체 적합성 고분자와 에스터 본드로 결합시키는 단계 Combining biocompatible polymers with ester bonds

제2단계를 통해 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질이 에스터 본드로 결합된 결합물의 제조과정이 완료되면, 상기 결합물에 광감작제를 첨가하여 암세포 표적물질이 결합된 고분자에 광감작제를 에스터 본드로 결합시킨다.When the preparation of the conjugate in which the biocompatible polymer and the cancer cell target material are combined with the ester bond is completed through the second step, a photosensitizer is added to the binder to ester bond the photosensitizer to the polymer to which the cancer cell target material is bound. Combine with

이때, 상기 결합물에 광감작제를 첨가하기 전에, 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 결합시키는 과정에서 사용한 유기용매를 제거하는 단계를 추가할 수 있는데, 유기용매의 제거는 당업계에서 통상적으로 사용하는 여과 또는 투석의 방법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 투석막을 이용하여 유기용매를 제거할 수 있다. In this case, before adding the photosensitizer to the binder, a step of removing the organic solvent used in the process of combining the biocompatible polymer and the cancer cell target material may be added, and the removal of the organic solvent is commonly used in the art. The filtration or dialysis method may be used, and the organic solvent may be preferably removed using a dialysis membrane.

또한, 투석막을 통해 유기용매를 제거할 경우에는, 투석막이 열에 약한 특성이 있으므로 투석 과정 시 주변의 온도가 너무 높지 않도록 상온을 유지할 수 있도록 고려해야 한다. In addition, when the organic solvent is removed through the dialysis membrane, the dialysis membrane has a weak characteristic of heat, and thus, the dialysis process should be considered so that the ambient temperature is not too high during the dialysis process.

또한, 투석 과정을 거친 반응 용액은 동결 건조하는 단계를 추가할 수 있는데, 동결 건조를 통해 생체 적합성 고분자에 엽산이 결합된 물질을 용이하게 회수할 수 있다. 상기 동결건조는 당업계에 공지된 방법이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 액체 질소를 사용하여 동결건조시킬 수 있는데, 액체 질소 상에서 10분 동안 반응 용액을 완전히 얼려준 다음, 진공 건조기를 이용하여 수분을 완전히 승화시켜 고분자에 엽산이 결합된 물질을 회수할 수 있다.In addition, the reaction solution subjected to the dialysis process may further include a step of freeze-drying. The freeze-drying may easily recover a material in which folic acid is bound to the biocompatible polymer. The lyophilization can be used as long as it is known in the art, and preferably lyophilized using liquid nitrogen, and the reaction solution is completely frozen in liquid nitrogen for 10 minutes, and then dried using a vacuum dryer. By fully subliming it can recover the material in which folic acid is bound to the polymer.

이후, 동결건조를 통해 얻어진 물질은 광감작제 및 촉매와 함께 유기용매 상에서 생체 적합성 고분자와 광감작제가 에스터 본드에 의해 결합시킬 수 있다.Subsequently, the material obtained through lyophilization may be combined with the photosensitizer and the catalyst by the ester bond between the biocompatible polymer and the photosensitizer on the organic solvent.

즉, 유기용매 하에서 에스터 본드로 결합된 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질의 결합물에 광감작제와 촉매를 첨가하여 상기 생체 적합성 고분자와 광감작제를 에스터 본드로 결합시킬 수 있다.That is, the biocompatible polymer and the photosensitizer may be combined with the ester bond by adding a photosensitizer and a catalyst to a combination of the biocompatible polymer and the cancer cell target material bound with the ester bond in the organic solvent.

본 발명에서 상기 광감작제는 근적외선에서 형광을 띄며, 소수성이고, COOH기를 갖는 것을 사용할 수 있으며, 그 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 사용할 수 있고, 본 발명의 일실시예에서는 하기 구조식으로 표시되는 페어포비드 a(pheophorbide a)를 사용하였다.In the present invention, the photosensitizer fluorescing in the near infrared, hydrophobic, and can be used to have a COOH group, but is not limited to the kind thereof, phophyrins (chlorphyrins), chlorins (chlorins), bacteriochlorins (bacteriochlorins) and porphycenes (porphycenes) selected from the group consisting of can be used, in one embodiment of the present invention was used for the pair (pheophorbide a) represented by the following structural formula.

Figure 112010014506078-pat00003
Figure 112010014506078-pat00003

<페어포비드 a 구조식>
Fair for Bead a Structural Formula

본 발명의 일실시예에서 사용한 상기 페어포비드 a는 클로로필(Chlorophyll)로부터 추출한 것으로서, 기존의 광감작제에 비해 ROS 발생 효율이 높으며 근적외선 파장대를 흡수하여 형광을 띈다. 또한, 가시광선 영역에서 반응성이 좋기 때문에 실험 과정에서 빛에 영향을 받지 않도록 유의하여야 한다. The fair fovid a used in one embodiment of the present invention is extracted from chlorophyll (Chlorophyll), the ROS generation efficiency is higher than the conventional photosensitizer and absorbed near infrared wavelength band fluorescence. In addition, since the reactivity is good in the visible region, care must be taken not to be affected by the light during the experiment.

상기 촉매는 광감작제의 -COOH기를 활성화시키는 작용이 있으며, 광감작제와 함께 유기용매에 용해시켜 사용할 수 있으며, 상기 촉매로는 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 또는 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide ;DCC)를 사용할 수 있다. The catalyst has a function of activating the -COOH group of the photosensitizer, and can be used by dissolving it in an organic solvent together with the photosensitizer, and as the catalyst, 4-hydroxymethylbezoic acid (DMAP). Or 1,3-dicyclohexyl carbodiimide (DCC).

또한, 생체 적합성 고분자에 광감작제를 에스터 본드로 결합시키는 반응은 분자량이 상대적으로 큰 고분자와 분자량이 상대적으로 작은 촉매 및 광감작제를 반응시키는 것이기 때문에, 바람직하게는 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질이 결합된 결합물에 유기용매에 용해된 광감작제와 촉매의 혼합용액을 한 방울씩 떨어뜨려 주면서 반응시켜 상기 고분자와 광감작제 사이의 에스터 결합이 충분히 형성될 수 있도록 한다. 또한, 상기 반응은 합성이 잘 될 수 있도록 45~50시간 정도 수분이 없고 빛이 없는 환경에서 잘 섞어주면서 반응시킬 수 있다.In addition, since the reaction of binding the photosensitizer with the ester bond to the biocompatible polymer is to react the polymer having a relatively high molecular weight with the catalyst and the photosensitizer having a relatively low molecular weight, the biocompatible polymer and the target material for cancer cell are preferred. The mixed solution of the photosensitizer and catalyst dissolved in the organic solvent is dropped dropwise to the combined binder to sufficiently form an ester bond between the polymer and the photosensitizer. In addition, the reaction can be reacted while mixing well in a moisture-free and light-free environment for about 45 to 50 hours to be well synthesized.

이상, 기술된 방법의 반응과정을 통해 생체 적합성 고분자에 광감작제와 암세포 표적물질이 각각 에스터 본드 결합에 의해 결합되어 구성된 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조할 수 있다.As described above, the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate of the present invention may be prepared by combining the photosensitizer and the cancer cell target with the ester bond bond to the biocompatible polymer through the reaction process of the described method.

나아가 상기에서 고분자와 광감작제 사이의 에스터 결합에 의해 형성된 본 발명의 결합체는 앞서 기술한 바와 같이 여과 또는 투석을 통해 유기용매를 제거하고, 동결건조시킨 형태로 수득할 수 있다. Furthermore, the binder of the present invention formed by the ester bond between the polymer and the photosensitizer can be obtained in the form of lyophilized by removing the organic solvent through filtration or dialysis as described above.

본 발명의 일실시예에서, 생체 적합성 고분자로 플루란을 사용하고, 광감작제로 페어포비드 a(pheophorbide a)를 사용하여 제조된 결합체의 합성반응을 종합하여 나타내면 하기 반응식과 같다.In one embodiment of the present invention, the synthetic reaction of the conjugate prepared by using flulan as a biocompatible polymer, and using a pheophorbide a as a photosensitizer, as shown in the following scheme.

Figure 112010014506078-pat00004
Figure 112010014506078-pat00004

그러므로 본 발명은, Therefore,

생체 적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계;Dissolving the biocompatible polymer in an organic solvent;

상기 용해된 용액에 암세포 표적물질과 촉매를 첨가하여 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 에스터 본드(ester bond)로 결합시키는 단계; 및Adding a cancer cell target material and a catalyst to the dissolved solution to bind the biocompatible polymer and the cancer cell target material with an ester bond; And

상기 에스터 본드(ester bond)로 결합된 물질에 유기용매에 용해된 광감작제와 촉매를 첨가하여 상기 광감작제를 생체 적합성 고분자에 에스터 본드로 결합시키는 단계를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.  A photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate comprising the step of coupling the photosensitizer to the biocompatible polymer with an ester bond by adding a photosensitizer and a catalyst dissolved in an organic solvent to the material bonded by the ester bond. It can provide a method for producing.

또한, 상기 기술된 방법에 의해 제조된 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 수계에서 안정하게 나노입자, 즉, 나노겔 또는 나노미립구의 형태일 수 있으며, 평균 입자 크기는 100~200nm 일 수 있다. In addition, the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate of the present invention prepared by the above-described method may be in the form of nanoparticles, that is, nanogels or nanoparticles, stably in water, and the average particle size may be 100 to 200 nm. have.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 결합체 제조과정에서 소수성의 광감작제를 농도를 달리하여 결합체를 제조한 다음, 각 결합체의 크기 및 형태를 동적광산랑 기기 및 전자현미경을 사용하여 측정한 결과, 광감작제를 많이 사용할 수도록 소수성이 증가하여 서로 응집력이 강해져 결합체(나노 미립구)의 크기가 감소하는 것으로 나타났다(도 2a 및 2b 참조).According to one embodiment of the present invention, in the manufacturing process of the present invention, the conjugates were prepared by varying the concentration of the hydrophobic photosensitizer, and then the size and shape of each conjugate were measured using a dynamic light scattering device and an electron microscope. As a result, the hydrophobicity was increased to use a lot of photosensitizers, the cohesive force became stronger and the size of the conjugate (nano microspheres) was reduced (see FIGS. 2A and 2B).

한편, 종래에 사용되던 광역학 진단 또는 치료용 광감작제의 경우, 암세포의 축적률과 표적률이 낮으며 형광간섭을 일으키지 못하기 때문에 빛을 조사하게 되면 체내에서 일반세포, 즉 정상세포에도 세포독성을 나타내므로 치료 효과가 낮고 여러 가지 부작용을 유발하는 문제점이 있었다. On the other hand, conventional photodynamic sensitizer for photodynamic diagnosis or treatment has low accumulation rate and target rate of cancer cells and does not cause fluorescence interference. Because of its toxicity, there is a problem that the treatment effect is low and causes various side effects.

그러나 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 혈액순환시 또는 정상조직에서는 근적외선 조사시에도 세포독성을 나타내지 않는 반면, 암조직 또는 암세포에만 선택적으로 표적, 축적 및 분해되어, 근적외선 파장의 빛을 조사하면 단일항산소 또는 자유라디칼을 생성하여 세포독성을 나타내어 암조직의 세포사멸을 유도함으로써 광역학 치료의 효능을 최대화 할 수 있는 특징이 있다.However, the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate according to the present invention does not show cytotoxicity in blood circulation or in normal tissues even when irradiated with near infrared rays, while selectively targeting, accumulating and decomposing only to cancer tissues or cancer cells, thereby providing light of near infrared wavelengths. When investigated, it is characterized by maximizing the efficacy of photodynamic therapy by generating mono-oxygen or free radicals, showing cytotoxicity and inducing apoptosis of cancer tissues.

특히, 암조직 또는 암세포로의 선택적인 표적을 위해 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 엽산을 포함하고 있으며, 암세포 표면에는 엽산수용체가 다량 발현되어 있어 정상세포가 아닌 암세포에만 효과적으로 표적 및 침투될 수 있다.In particular, the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate of the present invention includes folic acid for selective targeting to cancer tissues or cancer cells, and folic acid receptors are expressed on the surface of cancer cells effectively to target and penetrate only cancer cells, not normal cells. Can be.

일반적으로 광역학 치료에서 소수성 광감작제만을 사용하는 경우, 이를 정맥주사하게 되면 혈액 내에서 단백질과 결합하고 이는 세포 표면에 위치하는 수용체를 통해서 세포 내부로 이동되는 것으로 알려져 있는데, 이러한 경우에는 광감작제의 세포선택 특이성이 단순히 광감작제의 소수성 특성에 의해서만 규정되며 또한 조직 또는 세포에서의 잔류 시간도 경우에 따라 많은 차이를 보이는 것으로 알려져 있다. 또한, 이는 광역학 치료의 효과를 감소시키며 치료 후 재발 확률을 증가시키는 요인으로 지목되어 왔다. 또한, 이러한 문제점을 극복할 수 있는 방법으로는 특정한 부위에 선택적으로 작용하는지의 여부를 단순히 다양한 종류의 광감작제를 사용한 시행착오를 거치면서 선별하는 방법에만 의존하고 있는 것이 현실이다. In general, the use of hydrophobic photosensitizers in photodynamic therapy is known to cause intravenous injection, which binds to proteins in the blood and is transported into cells through receptors located on the cell surface. It is known that the cell selection specificity of the agent is defined solely by the hydrophobic nature of the photosensitiser, and the retention time in the tissue or cell also shows a large difference in some cases. It has also been pointed out as a factor that reduces the effectiveness of photodynamic therapy and increases the probability of relapse after treatment. In addition, as a method of overcoming such a problem, the reality is that it depends only on the method of selectively selecting a specific site through trial and error using various kinds of photosensitizers.

그러나 본 발명에서는 광감작제를 효과적으로 조직 특이적으로 전달하기 위해 암세포 표적물질을 광감작제와 함께 사용하였다. However, in the present invention, the cancer cell target material was used together with the photosensitizer to effectively deliver the tissue photosensitizer.

또한, 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 레이저 조사시 세포독성을 유발시킬 수 있는 단일항산소 또는 자유라디칼 생성능을 가지고 있는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서 제조한 결합체, 즉 나노미립구는 양성대조군으로 사용한 pheo-A와 단일항산소의 생성정도가 유사한 것으로 나타났다(도 5 참조).In addition, the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate of the present invention has a single anti-oxygen or free radical generating ability that can cause cytotoxicity upon laser irradiation, according to one embodiment of the present invention, the conjugate prepared in the present invention, In other words, the nanoparticles were found to be similar in pheo-A production as the positive control group and the production of single antioxidant (see Fig. 5).

따라서 본 발명자들은 기존의 사용되던 결합 방법이 아닌 에스터 본드 결합으로 합성된 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체도 암조직을 사멸할 수 있는 암치료 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.Therefore, the present inventors were able to confirm that the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate of the present invention synthesized by ester bond binding, rather than the conventional binding method, has an excellent cancer treatment effect capable of killing cancer tissue.

본 발명에 따른 다른 일실시예에 따르면, 암세포로 축적되지 않은 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체가 세포에 독성을 나타내는지를 확인하는 실험을 수행하였는데, 즉, 체내와 유사한 조건인 수계 상에서는 상기 결합체가 나노 미립구의 형태를 구성하여 형광간섭을 일으키기 때문에 근적외선 파장의 빛을 조사하여도 전혀 반응이 없는 것으로 나타났다(도 3 참조). 반면, 암세포로 축적된 경우에는 세포독성을 나타내어 암세포의 세포사멸이 증가하는 것으로 나타났다(도 6 참조). According to another embodiment of the present invention, an experiment was performed to determine whether the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate of the present invention, which did not accumulate as cancer cells, was toxic to cells. Since the conjugates form the morphology of nanoparticles to cause fluorescence interference, no response was observed even when irradiated with light of near infrared wavelength (see FIG. 3). On the other hand, when accumulated as cancer cells, it showed cytotoxicity, and apoptosis of cancer cells was increased (see FIG. 6).

따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 통해 본 발명의 결합체는 암세포로 축적되지 못할 경우, 빛을 조사하여도 반응성을 나타내지 않으므로 세포독성을 나타내지 않기 때문에 체내에서 안정하며, 암세포 축적된 경우에만 세포독성을 나타내어 치료 효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있었다. Therefore, the present inventors have found that the conjugates of the present invention are stable in the body because they do not exhibit cytotoxicity when irradiated with light when they cannot accumulate into cancer cells, and exhibit cytotoxicity only when cancer cells accumulate. It can be seen that the effect.

또한, 본 발명의 결합체는 암세포에 선택적으로 표적 및 침투되면 암세포의 효소작용, 즉, 생체내 효소인 에스터레이즈(esterase)와 같은 효소에 의해 에스터 결합이 절단(분해)되어 형광간섭이 풀림으로써 형광을 띄는 특징이 있다(도 7 참조).In addition, when the conjugate of the present invention is selectively targeted and infiltrated into cancer cells, the enzymatic action of cancer cells, that is, the ester bond is cleaved (decomposed) by an enzyme such as esterase, which is an in vivo enzyme, causes fluorescence interference to be released. There is a distinguishing feature (see Fig. 7).

따라서 본 발명은 본 발명의 결합체가 암조직에 선택적으로 축적될 경우, 암세포의 효소작용에 의해 형광간섭이 풀리고, 레이저 조사에 의해 암세포에서만 광감작제가 형광발색을 나타낼 수 있기 때문에 이러한 형광 유무를 통해 암을 진단할 수 있다. Therefore, the present invention, when the conjugate of the present invention selectively accumulates in the cancer tissue, the fluorescence interference is released by the enzymatic action of the cancer cells, and the photosensitizer can only fluoresce the cancer cells by laser irradiation through such fluorescence Cancer can be diagnosed.

나아가 본 발명은 본 발명에 따른 상기 결합체를 유효성분으로 함유하는 광역학적 암 치료용 조성물을 제공할 수 있다.Furthermore, the present invention can provide a photodynamic cancer treatment composition containing the conjugate according to the present invention as an active ingredient.

본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.In the present invention, the term 'treatment', unless stated otherwise, reverses, alleviates, inhibits, or prevents the disease or condition to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or condition, As used herein, the term 'treatment' refers to the act of treating when 'treating' is defined as above.

본 발명에 따른 상기 광역학 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 암의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.The photodynamic therapeutic composition according to the present invention may include a pharmaceutically effective amount of the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate of the present invention alone or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents. The pharmaceutically effective amount herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate and treat the symptoms of cancer.

본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.The pharmaceutically effective amount of the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate according to the invention is 0.5-100 mg / day / kg body weight, preferably 0.5-5 mg / day / kg body weight. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the degree of disease symptoms, the age, weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment of the patient.

상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. Pharmaceutically acceptable herein refers to a composition that is physiologically acceptable and, when administered to a human, typically does not cause an allergic reaction, such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like. Examples of such carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In addition, fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다. In addition, the compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art so as to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to the mammal. The formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatine capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.

본 발명에 따른 광역학 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. The composition for treating photodynamics according to the present invention can be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, and the dosage of the active ingredient is determined by the route of administration, age, sex, weight and severity of the patient. It may be appropriately selected depending on various factors such as.

또한, 본 발명에 따른 결합체 또는 상기 결합체를 포함하는 조성물을 이용하여 질병을 치료 또는 진단할 경우, 사용할 수 있는 광원으로는 이에 제한되지는 않으나, 초음파 조사 방출기, 광방출 다이오드, 레이저 다이오드, 염료 레이저, 할로겐화 금속 램프, 플래쉬 램프, 기계적으로 필터링된 형광 광원, 기계적으로 필터링된 백열, 및 필라멘트 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 생체외 광조사를 위한 광원; 및 광역학 치료용 레이저 파이버 등의 생체내 광조사를 위한 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 상기 광감작제는 600nm 내지 700nm 범위의 근적외선 광선에서 활성을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 결합체는 친수성의 고분자와 소수성의 광감작제를 포함하고 있어 상기 결합체가 나노미립구의 형태로 존재할 수 있는데, 상기 나노미립구는 치료학적 활성을 나타내는 약물 또는 생물제제를 추가로 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 항암제를 포함할 수 있다. 이때 상기 약물 또는 생물제제는 나노미립구 내부에 봉입된 형태로 포함될 수 있다.
In addition, when treating or diagnosing a disease using a conjugate according to the present invention or a composition comprising the conjugate, a light source that can be used is not limited thereto, but is not limited thereto, an ultrasonic irradiation emitter, a light emitting diode, a laser diode, a dye laser. A light source for ex vivo light irradiation selected from the group consisting of a metal halide lamp, a flash lamp, a mechanically filtered fluorescent light source, a mechanically filtered incandescent light, and a filament light source; And one or more selected from the group consisting of a light source for in vivo light irradiation, such as a laser fiber for photodynamic therapy. In the present invention, the photosensitizer may exhibit activity in near infrared rays in the range of 600 nm to 700 nm. . In addition, the conjugate according to the present invention includes a hydrophilic polymer and a hydrophobic photosensitizer, so that the conjugate may exist in the form of nanoparticles, wherein the nanoparticles may further include drugs or biologics that exhibit therapeutic activity. It may further include, preferably, may include an anticancer agent. In this case, the drug or biologic may be included in a form encapsulated inside the nanoparticles.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments.

<< 실시예Example 1> 1>

광역학Photodynamics 진단 또는 치료용  For diagnostic or therapeutic purposes 나노미립구의Nanoparticles 제조 Produce

<1-1><1-1> 에스터 결합에 의한 By ester bonding 플루란Pluran -엽산 결합물의 제조Preparation of Folic Acid Binders

생체적합성 고분자 물질인 정제된 플루란(1g)을 10ml의 수분을 제거한 DMSO 용매에 용해시켰고, 암세포 표적물질로 사용하기 위한 엽산 50mg을 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 및 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide ;DCC)와 함께 DMSO 용매 5ml에 용해시켰다. 이후, 플루란이 용해된 DMSO 용액 10ml에 엽산이 용해된 DMSO 용액 5ml을 한 방울씩 떨어뜨려 혼합시켰다. 그런 뒤, 총 15ml의 혼합용액을 빛이 닿지 않는 조건에서 24시간 동안 잘 섞어주면서 에스터 결합 반응시켰고, 반응이 끝난 용액을 투석막을 이용하여 투석한 후, 동결건조하여 회수하였다.
Purified furan (1 g), a biocompatible polymer, was dissolved in 10 ml of dehydrated DMSO solvent, and 50 mg of folic acid for use as a cancer cell target was 4-hydroxymethylbenzoic acid (DMAP). And 1,3-dicyclohexyl carbodiimide (DCC) in 5 ml of DMSO solvent. Thereafter, 5 ml of a DMSO solution in which folic acid was dissolved was mixed dropwise into 10 ml of a DMSO solution in which furan was dissolved. Thereafter, a total of 15 ml of the mixed solution was mixed with the ester while reacting well for 24 hours under no light condition, and the reaction solution was dialyzed using a dialysis membrane, and then lyophilized and recovered.

<1-2> <1-2> 플루란Pluran -엽산 결합체와 Folic acid conjugates 광감작제를Photosensitizer 에스터 결합으로 결합 Combine with ester bond

상기 실시예 <1-1>에서 동결건조하여 회수된 플루란-엽산 결합물 45mg을 5ml의 수분을 제거한 DMSO 용매에 용해시켰다. 또한, 광감작제로서 페어포비드 a(pheophorbide a)를 각각 0.50mg, 1.25mg 및 2.50mg의 양으로 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 및 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide ;DCC)와 함께 DMSO 2ml에 충분히 녹여 -COOH기를 활성화시켰다. 이후, 플루란-엽산 결합물이 용해된 DMSO 5ml에 광감작제인 페어포비드 a가 각 농도별로 용해된 용액 2ml을 한 방울씩 각각 떨어뜨린 후, 잘 섞어주면서 48시간 동안 충분히 에스터 결합 반응시켰고, 반응이 끝난 용액은 상기 실시예 <1-1>의 방법과 동일한 과정을 통해 회수하여 냉동보관 함으로써 본 발명에 따른 광역학 치료 또는 진단용 결합체인 나노미립구를 제조하였다. 이후, 제조된 상기 나노미립구를 1H-NMR 분석을 통해 화학적 결합을 분석하였으며, 화학적 결합상태 및 1H-NMR 분석 결과를 도 1에 나타내었다.
45 mg of the pullulan-folic acid conjugate recovered by lyophilization in Example <1-1> was dissolved in 5 ml of dehydrated DMSO solvent. In addition, as the photosensitizer, 4-hydroxymethylbezoic acid (DMAP) and 1,3-dicyclo were used in amounts of 0.50 mg, 1.25 mg, and 2.50 mg, respectively, for pheophorbide a. Hexyl carbodimide (1,3-dicyclohexyl carbodiimide (DCC)) was dissolved in 2 ml of DMSO sufficiently to activate the -COOH group. Subsequently, 2 ml of a solution in which the sensitized fairfair a was dissolved at each concentration was dropped in 5 ml of DMSO in which the furan-folic acid conjugate was dissolved, and then sufficiently mixed with the ester for 48 hours while mixing well. The reaction solution was recovered and cryopreserved through the same process as in Example <1-1> to prepare nanoparticles as a photodynamic therapy or diagnostic conjugate according to the present invention. Thereafter, the prepared nanoparticles were analyzed for chemical binding through 1 H-NMR analysis, and the chemical binding state and the results of 1 H-NMR analysis are shown in FIG. 1.

<< 실험예Experimental Example 1> 1>

나노미립구의Nanoparticles 특성 분석 Characterization

상기 실시예 <1-1> 및<1-2>에서 제조한 플루란-엽산 결합물과 각 농도별 페어포비드 a가 에스터 결합으로 연결되어 형성된 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체인 나노미립구 샘플 3개를 각각 1mg/ml의 농도로 녹인 후, 동적광산란(Dynamic light scattering, DLS) 장치를 사용하여 각각의 크기를 측정하였고, 전자현미경(Field emission-scanning electromicroscopy, FE-SEM)을 이용하여 형태를 확인하였다. 이때 정확한 사이즈의 측정을 위해 0.1M의 NaCl로 희석하여 사이즈를 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.Flulan-folate conjugates prepared in Examples <1-1> and <1-2> and the pair of Ford a beads for each concentration are linked to ester bonds for the diagnosis or treatment of photodynamics according to the present invention. After dissolving three nanoparticle samples at a concentration of 1 mg / ml, each size was measured using a dynamic light scattering (DLS) apparatus, and field emission-scanning electromicroscopy (FE-SEM) was measured. To confirm the form. At this time, the size was measured by diluting with 0.1M NaCl to measure the exact size, and the results are shown in FIG.

측정 결과, 동적광산랑장치 및 전자현미경을 이용하여 에스터 결합에 의해 제조된 본 발명의 플루란-엽산 결합물의 크기 및 형태는 도 2a에 나타낸 바와 같이, 직경이 500~1000nm인 것으로 나타난 반면, 플루란-엽산 결합물에 페어포비드 a가 에스터 결합으로 결합되어 형성된 나노미립구의 크기 및 형태는 도 2b에 나타낸 바와 같이 약 100~200nm인 것으로 나타났다. 이러한 측정 결과를 통해 본 발명자들은 소수성인 광감작제를 첨가할 경우, 소수성이 증가하여 서로 응집력이 강해서 본 발명에 따른 결합체, 즉 나노미립구의 크기가 감소한다는 사실을 알 수 있었고, 사용하는 광감작제의 양이 증가할수록 소수성이 더욱 증가하여 나노미립구의 크기는 더욱 감소한다는 사실을 알 수 있었다.
As a result of the measurement, the size and shape of the pullulan-folate conjugate of the present invention prepared by ester bonding using a dynamic light scattering device and an electron microscope are shown to be 500-1000 nm in diameter, as shown in FIG. It was shown that the size and shape of the nanoparticles formed by the coupling of the fair-for-bead a with the ester bond to the lan-folate conjugate was about 100-200 nm as shown in FIG. 2B. Through the measurement results, the present inventors found that when the hydrophobic photosensitizer is added, the hydrophobicity is increased and the cohesive force is strong so that the size of the conjugate according to the present invention, that is, nanoparticles, is reduced. As the amount of the agent increased, the hydrophobicity increased further, indicating that the size of the nanoparticles decreased further.

<< 실험예Experimental Example 2> 2>

형광간섭의 유무 확인Check for fluorescence interference

상기 실시예 1에서 수득한 나노미립구 중 광감작제를 2.50mg의 양으로 첨가하여 제조한 나노미립구 1mg을 각각 DMSO 및 PBS에 용해시켰다. 이후, 형광 스펙트로포토미터(Spectrofluorephotometer)기기를 670nm의 파장으로 고정시키고, 600~900nm의 파장 범위에서 측정을 수행하였다. 이때 본 발명에서 제조된 나노미립구의 경우, 유기용매 상에서는 미립구가 형성되지 않아 형광간섭이 일어나지 않는다.
Among the nanoparticles obtained in Example 1, 1 mg of nanoparticles prepared by adding a photosensitizer in an amount of 2.50 mg was dissolved in DMSO and PBS, respectively. Then, the spectral fluorescence spectrophotometer (Spectrofluorephotometer) device was fixed at a wavelength of 670nm, the measurement was performed in the wavelength range of 600 ~ 900nm. In this case, in the case of the nanoparticles prepared in the present invention, the microspheres are not formed on the organic solvent, so that no fluorescence interference occurs.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 유기용매인 DMSO에 용해시킨 경우, 미립구가 형성되지 않아 형광간섭이 일어나지 않으나, PBS에 용해시킨 경우에는 나노미립구가 형성되어 형광간섭을 일으키기 때문에 근적외선 파장대에서도 전혀 반응하지 않는 다는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 유기용매에 용해시킨 경우, 600~700nm 파장 범위에서 형광을 띄는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 광역학 치료에서 암세포로 축적이 되지 않은 나노미립구의 경우, 세포독성을 띄지 않기 때문에 체내에서 안정하게 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 3, when dissolved in DMSO, which is an organic solvent, microspheres are not formed and fluorescence interference does not occur. When dissolved in PBS, nanoparticles are formed and cause fluorescence interference. It was confirmed that the reaction did not, and especially when dissolved in an organic solvent, appeared to fluoresce in the wavelength range of 600 ~ 700nm. From these results, the present inventors found that the nanoparticles, which did not accumulate as cancer cells in photodynamic therapy, can be used stably in the body because they do not exhibit cytotoxicity.

<< 실험예Experimental Example 3> 3>

CQCCQC (( CriticalCritical selfself -- quenchingquenching concentrationconcentration )의 측정)

CQC는 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체가 나노미립구의 형태를 이루려면 어느 정도의 농도가 필요한지를 형광간섭의 성질을 이용하여 계산할 수 있는 실험방법이다. 일반적으로 CQC는 나노미립구내에 피렌(Pyrene)이라는 형광물질을 봉입하여 그 형광물질의 형광이 급격히 사라지는 점을 이용하여 농도를 확인하는데, 본 발명에서는 본 발명의 나노미립구가 형광간섭이 일어나는 특징이 있으므로 피렌(Pyrene)이 나노미립구내에 봉입되어 있어 형광을 띄지 못하다가 미립구가 풀리면서 급격히 형광을 띄는 반대의 성질을 이용하였다. 즉, 이를 위해 상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 나노미립구가 제조된 용액에 증류수를 이용하여 상기 용액을 희석하였고, 여기에 피렌 수용액을 첨가하여 잘 섞어 주었다. 이때, 피렌은 물에 거의 녹지 않기 때문에 피렌 수용액 제조시 아세톤에 피렌을 잘 녹여 미량을 취해 과량의 증류수에 분산시키는 방법을 이용하였다. 이후, 희석된 나노미립구와 피렌수용액이 섞인 용액을 취해서 형광 스펙트로포토미터(Spectrofluorephotometer)기기를 이용하여 형광 정도를 측정하였다.
CQC is an experimental method that can be calculated using the nature of fluorescence interference to determine the concentration of the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate according to the present invention to form the nanoparticles. In general, the CQC checks the concentration using a fluorescent material called pyrene in the nanoparticles and rapidly decreases the fluorescence of the fluorescent material. In the present invention, since the nanoparticles of the present invention have a feature of fluorescence interference, Pyrene (Pyrene) is encapsulated in the nano-microspheres do not fluoresce, but when the microspheres are released, the opposite nature of the rapid fluorescence was used. That is, for this purpose, the solution was diluted with distilled water in the solution prepared in the nanoparticle sphere of the present invention prepared in Example 1, and the mixture was well mixed with pyrene solution. At this time, since pyrene is almost insoluble in water, a small amount of pyrene was dissolved in acetone when preparing an aqueous solution of pyrene, and a method of dispersing it in an excess of distilled water was used. Subsequently, the solution of the diluted nanoparticles and the aqueous solution of pyrene was taken, and the degree of fluorescence was measured using a fluorescence spectrofluorephotometer.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 나노미립구의 농도를 0.005mg/ml에서 1mg/ml까지 달리 희석하여 피렌(Pyrene)의 형광 정도를 측정하였더니, 나노미립구의 농도가 높아질수록 형광의 세기는 감소하는 것으로 나타났고, 이러한 값을 통해 나노미립구를 형성할 수 있는 최소 농도를 나타내는 그래프를 얻을 수 있었고, 상기 그래피를 통해 0.21mg/ml 정도에서 나노미립구를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 4, the concentration of nanoparticles was differently diluted from 0.005mg / ml to 1mg / ml to measure the degree of fluorescence of pyrene, and as the concentration of nanoparticles increased, the intensity of fluorescence was increased. It was found to decrease, and through these values, a graph showing the minimum concentration capable of forming nanoparticles was obtained, and it was confirmed that the nanoparticles were formed at about 0.21 mg / ml through the graph.

<< 실험예Experimental Example 4> 4>

나노미립구의Nanoparticles 단일항산소Monooxygen 생성능Generation 평가 evaluation

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체, 즉, 나노미립구(일명 ‘PFP 나노미립구’라고 함)를 광역학 진단 또는 치료용 광감작제로 사용하기 위하여, 레이저 조사에 따른 PFP 나노미립구의 단일항산소 생성능을 광감작제로 사용되고 있는 pheo-A와 비교하여 분석하였다. 즉, 각기 다른 농도의 광감작제를 첨가하여 제조된 PFP 나노미립구들과 개질화하지 않은 pheo-A를 유기용매인 DMF와 PBS 2ml에 각각 녹인 후, 단일항산소를 검출할 수 있는 소량의 9,10-디메틸안트라센(9,10-dimethylanthracene)을 첨가하여 최종 20㎍/ml의 농도가 되도록 하였다. 이후, pheo-A가 단일항산소를 생성할 수 있는 것으로 알려진 670nm 파장의 레이저를 사용하여 40초 간격으로 레이저를 조사한 후, 형광 스펙트로포토미터(Spectrofluorephotometer)를 이용하여 Ex 360nm, Em 380~550nm에서 형광을 측정하였다.
In order to use the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate of the present invention prepared in Example 1, that is, nanoparticles (also called 'PFP nanoparticles') as a photodynamic agent for photodynamic diagnosis or treatment, The monoantigen production ability of PFP nanoparticles was analyzed by comparing with pheo-A which is used as a photosensitizer. In other words, PFP nanoparticles prepared by adding different concentrations of photosensitizer and unmodified pheo-A were dissolved in 2 ml of DMF and PBS, which are organic solvents, respectively. , 10-dimethylanthracene (9,10-dimethylanthracene) was added to a final concentration of 20 μg / ml. Subsequently, the laser was irradiated at 40 second intervals using a 670 nm wavelength laser, which pheo-A is known to be capable of producing mono-oxygen, and then at Ex 360 nm and Em 380 to 550 nm using a fluorescence spectrofluorephotometer. Fluorescence was measured.

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 본 발명의 PFP 나노미립구는 광감작제로 사용되고 있는 pheo-A(개질화하지 않은)와 거의 동일한 단일항산소를 생성할 수 있다는 사실을 알 수 있었고, 본 발명의 나노미립구가 단일항산소를 생성할 수 있다는 효과를 확인함에 따라 본 발명자들은 본 발명의 나노미립구가 표적 세포(암세포)내에서 단일항산소의 생성을 통해 암세포를 사멸시킬 수 있음을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 5, it was found that the PFP nanoparticles of the present invention can produce almost the same mono-oxygen as pheo-A (unmodified) used as a photosensitizer. As a result of confirming that the nanoparticles can produce monoantioxidants, the present inventors have found that the nanoparticles of the present invention can kill cancer cells through the production of monoantigens in target cells (cancer cells).

<< 실험예Experimental Example 5> 5>

본 발명에 따른 According to the invention 나노미립구의Nanoparticles 세포 독성 평가 Cytotoxicity Assessment

상기 실시예 1에서 제조한 본 발명에 따른 나노미립구에 대해 세포독성 시험을 수행하였다. 세포 독성 시험을 위해 사용한 세포주는 암세포주이 HeLa 세포이고, 10%의 FBS와 1%의 페니실린이 포함되어 있는 RPMI1640 배양액에서 5% CO2 및 37℃의 온도조건에서 배양하였다. 세포 독성 실험은 우선 배양된 HeLa 세포를 96 well 플레이트에 1×104 세포수로 분주하여 24시간 동안 배양시킨 후, 이튿날 본 발명에 따른 나노미립구(1.25mg의 광감작제가 첨가된 나노미립구)를 농도별로 희석하여 100㎕씩 각 웰에 첨가하였다. 이후, 나노미립구가 세포에 작용할 수 있도록 12시간 더 배양기에서 배양시켜 준 다음, 근적외선 파장대의 빛(670nm)에서 1.2 J/cm2 의 양으로 조사하였다. 이후 다시 배양기에서 하루 동안 배양시켰다. 배양이 완료되면 세포에 XTT 시약(CCK-8,Dojindo)을 희석하여 100㎕씩 첨가하고 1시간 동안 다시 배양시켜 주었고, 이후 배양액의 광학밀도를 ELIZA 분석기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 분석하였다.
Cytotoxicity test was performed on the nanoparticles according to the present invention prepared in Example 1. The cell line used for the cytotoxicity test was a cancer cell line HeLa cells, and was cultured in RPMI1640 culture medium containing 10% FBS and 1% penicillin at 5% CO2 and 37 ℃ temperature conditions. In the cytotoxicity experiment, first, the cultured HeLa cells were dispensed into 96 well plates at 1 × 10 4 cells and incubated for 24 hours, and then the nanoparticles according to the present invention (nanoparticles with 1.25 mg of photosensitizer) were added. Diluted by concentration, 100 μl was added to each well. Thereafter, the cells were cultured in the incubator for 12 hours to allow the nanoparticles to act on the cells, and then irradiated with 1.2 J / cm 2 in the light of the near infrared wavelength (670 nm). Afterwards it was incubated for one day in the incubator. After the incubation was completed, 100 μl of XTT reagent (CCK-8, Dojindo) was added to the cells and incubated for 1 hour. Afterwards, the optical density of the culture was measured at 450 nm using an ELIZA analyzer. Survival was analyzed.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제조한 나노미립구 및 개질화하지 않은 pheo-A을 세포에 각각 첨가하여 배양한 후, 근적외선을 조사하지 않은 경우에는 세포사멸이 일어나지 않은 반면, 근적외선을 조사한 경우에는 세포사멸이 발생하여 세포 생존률이 감소하는 것으로 나타났다.
As a result, as shown in Figure 6, after the nano-microspheres and the unmodified pheo-A prepared in the present invention were added to the cells and cultured, when near-infrared rays were not irradiated, apoptosis did not occur, but near-infrared rays In this study, cell death occurred due to apoptosis.

<< 실험예Experimental Example 6> 6>

암세포의 효소작용에 의한 형광간섭의 Fluorescence Interference by Enzyme Action of Cancer Cells 풀림측정Loosening

상기 실험예 5와 같이 1x104의 세포수로 분주한 HeLa 세포를 96 웰 플레이트에서 배양한 후, 상기 세포들에 본 발명의 나노미립구를 각 농도별로 처리한 다음, KODAK 이미지 스테이션 기기를 이용하여 형광현상을 관찰하였다. 이때, 대조군으로는 HeLa 세포가 없는 배양액에 본 발명의 나노미립구를 처리한 것을 사용하였다.After culturing HeLa cells divided into 1 × 10 4 cells in 96 well plates as in Experimental Example 5, the cells were treated with nanoparticles of the present invention at different concentrations, and then fluoresced using a KODAK image station. The phenomenon was observed. At this time, the control was used as a nanoparticles treated the present invention in a culture without HeLa cells.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, HeLa 세포가 없는 일반 배양액의 웰에서는 형광간섭이 풀리지 않았지만 HeLa 세포가 분주되어있는 배양액의 웰에서는 배양시간이 경과할수록 형광간섭이 풀려 형광을 띄는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 본 발명의 나노미립구에 에스터레이즈(esterase)를 처리하여 에스터 결합을 가수분해 한 경우, 에스터레이즈의 처리 농도 및 배양 시간에 비례하여 형광간섭이 풀리는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 7, the fluorescence interference was not solved in the well of the culture medium without HeLa cells, but in the well of the culture solution in which the HeLa cells were dispensed, the fluorescence interference was released as the culture time elapsed. there was. In addition, when hydrolysis of the ester bonds by treating the esterase to the nanoparticles of the present invention, it was confirmed that the fluorescence interference was solved in proportion to the treatment concentration and the incubation time of the esterase.

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 본 발명에서 제조한 나노미립구의 경우, 암세포에 표적 및 축적되면 암세포의 효소작용에 의해 형광간섭이 풀리고, 이후 근적외선 파장의 빛을 조사하면 광감작제에 의해 암세포를 사멸시키는 과정을 통해 암을 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
Therefore, the inventors of the present invention through the above results, the nanoparticles prepared in the present invention, when targeted and accumulated in the cancer cells, the fluorescence interference is released by the enzymatic action of the cancer cells, and then irradiated with light of near-infrared wavelengths of the cancer cells by a photosensitizer It was found that cancer can be cured by killing.

<< 실험예Experimental Example 7> 7>

본 발명에 따른 According to the invention 나노미립구의Nanoparticles 동물 내에서의 작용 확인 Confirmation of Action in Animals

상기 실시예 1에서 수득한 본 발명의 나노미립구와 개질되지 않은 광감작제(pheo-A)가 실제 동물 내에서 어떠한 작용을 하는지 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, Balb/c 누드마우스(6주령)를 사용하여 등부분에 각각 본 발명의 나노미립구와 개질되지 않은 광감작제를 피하주사 하였고, 이때 주사제의 농도는 광감작제의 농도에 맞춰 각각 2㎍/ml씩 사용하였다. 주사 후, KODAK 이미지 스테이션으로 시간에 따른 형광간섭 정도를 확인하였다.
The following experiments were performed to find out how the nanoparticles of the present invention obtained in Example 1 and the unmodified photosensitizer (pheo-A) act in real animals. That is, Balb / c nude mice (6 weeks old) were used to subcutaneously inject the nanoparticles and the unmodified photosensitizer of the present invention into the dorsal part, respectively, wherein the concentration of the injection was 2 µg respectively in accordance with the concentration of the photosensitizer. / ml was used one by one. After the injection, the degree of fluorescence interference with time was checked with a KODAK image station.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 개질화되지 않은 pheo-A의 경우, 완벽하게 형광간섭을 일으키지 못해 형광을 나타내는 반면, 본 발명에 따른 나노미립구는 완벽한 형광간섭을 일으켜 초기에는 형광을 나타내지 않다가 시간이 지남에 따라 생체 내에서 분해되어 형광세기가 변화되는 것으로 나타났으며, 특히 한곳에서 3주 동안이나 머무르면서 서서히 분해가 이루어짐을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 8, in the case of unmodified pheo-A, fluorescence was not completely induced and fluorescence was observed, while nanoparticles according to the present invention caused perfect fluorescence interference and did not initially exhibit fluorescence. Decomposed in vivo as time went by changes in fluorescence intensity appeared to be, in particular, it was confirmed that the degradation takes place slowly in one place for three weeks.

<< 실험예Experimental Example 8> 8>

본 발명에 따른 According to the invention 나노미립구의Nanoparticles 세포내에서의Intracellularly 위치 확인 Check location

나아가 본 발명자들은 압세포 표적물질로 엽산을 이용한 본 발명의 나노미립구의 경우, 암세포의 표적화, 즉 암세포 내에서의 축적 위치 및 축적율을 관찰하기 위해, 상기 실시예 1에서 1.25㎍/ml의 pheo-A를 사용하여 제조된 나노미립구 및 대조군으로 개질화 되지않은 pheo-A를 각각 분주된 HeLa 세포(1 x 105 세포수)에 처리한 후, 시간에 따른 세포내 위치를 공초점현미경을 통해 관찰하였다.
Furthermore, the present inventors, in the case of the nanoparticles of the present invention using folic acid as a pressure cell target material, in order to observe the targeting of cancer cells, that is, the accumulation position and accumulation rate in cancer cells, the pheo of 1.25 µg / ml in Example 1 above. After treatment with nanoparticles prepared using -A and unmodified pheo-A as a control group to the HeLa cells (1 x 10 5 cells), respectively, the intracellular position was analyzed by confocal microscopy over time. Observed.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 나노미립구 및 개질화 되지않은 pheo-A는 세포내에서 각각 다른 부위에 위치하는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 암세포의 경우, 세포 표면에 엽산수용체가 과발현되어 있기 때문에 엽산수용체를 통해 세포내로 흡수되는 반면, 통상의 광감작제의 경우에는 수용체가 아닌 다른 기작을 통해 세포내로 흡수된다는 사실을 알 수 있어으며, 나아가 본 발명의 나노미립구를 사용하였을 경우, 개질화 되지않은 pheo-A을 사용한 것에 비해 암세포내로 더 많이 축적된다는 사실을 알 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 9, the nanoparticles and unmodified pheo-A according to the present invention was found to be located at different sites in the cell. Therefore, through the above results, the present inventors absorbed intracellularly through folic acid receptors because folic acid receptors are overexpressed on the surface of cancer cells, whereas conventional photosensitizers absorbed into cells through mechanisms other than receptors. In addition, it can be seen that, when using the nanoparticles of the present invention, more accumulation in cancer cells was observed compared with the use of unmodified pheo-A.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far I looked at the center of the preferred embodiment for the present invention. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims (13)

생체 적합성 고분자로 플루란(pullulan)과 광감작제로 페어포비드 a(pheophorbide a)가 에스터 본드(ester bond)로 결합하고 있고, 상기 생체 적합성 고분자는암세포 표적물질로 엽산과 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
A biodynamic polymer is composed of pullulan and a photo sensitizer, and a pair of pheophorbide a is an ester bond, and the biocompatible polymer is a target for cancer cell. Or therapeutic conjugates.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 결합체는 혈액순환시 또는 정상조직에서는 세포독성을 나타내지 않고, 암조직 또는 암세포에만 선택적으로 표적, 축적 및 분해되어, 근적외선 파장의 빛을 조사하면 단일항산소 또는 자유라디칼을 생성하여 세포독성을 나타내는 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체. The method of claim 1,
The conjugate does not exhibit cytotoxicity in blood circulation or normal tissues, but is selectively targeted, accumulated, and degraded only in cancer tissues or cancer cells, and when irradiated with light of near-infrared wavelengths, monoclonal or free radicals generate cytotoxicity. Photodynamic diagnostic or therapeutic combinations, characterized in that. 제7항에 있어서,
상기 결합체가 암조직 또는 암세포에서 표적 및 축적되면 생체내 효소에 의해 에스터 본드와 고분자 연결부분이 절단되고 형광간섭이 풀려 형광을 띄는 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체. The method of claim 7, wherein
When the conjugate targets and accumulates in cancer tissue or cancer cells, the ester bond and the polymer connection portion are cleaved by an enzyme in vivo and the fluorescent interference is released to fluoresce the photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate. 생체 적합성 고분자로 플루란(pullulan)을 유기용매에 용해시키는 단계;
상기 용해된 용액에 암세포 표적물질로 엽산과 촉매를 첨가하여 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 에스터 본드(ester bond)로 결합시키는 단계;
상기 에스터 본드(ester bond)로 결합된 물질에 유기용매에 용해된 광감작제인 페어포비드 a(pheophorbide a)와 촉매를 첨가하여 상기 광감작제를 생체 적합성 고분자에 에스터 본드로 결합시키는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조하는 방법.
Dissolving pullulan in an organic solvent with a biocompatible polymer;
Adding folic acid and a catalyst as a cancer cell target material to the dissolved solution to bind the biocompatible polymer and the cancer cell target material with an ester bond;
Coupling the photosensitizer to the biocompatible polymer with an ester bond by adding a catalyst and a photosensitive agent, pheophorbide a, dissolved in an organic solvent to the material bonded by the ester bond; To, the method for producing a photodynamic diagnostic or therapeutic conjugate according to claim 1.
삭제delete 삭제delete 제9항에 있어서,
상기 촉매는 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 또는 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide;DCC)인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조하는 방법. 10. The method of claim 9,
The catalyst is photodynamic diagnosis or treatment, characterized in that 4-hydroxymethyl benzoic acid (DMAP) or 1,3-dicyclohexyl carbodiimide (DCC) Method for preparing a binder for. 삭제delete
KR1020100020279A 2010-03-08 2010-03-08 Conjugate of biocompatible polymer and photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof KR101188979B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100020279A KR101188979B1 (en) 2010-03-08 2010-03-08 Conjugate of biocompatible polymer and photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100020279A KR101188979B1 (en) 2010-03-08 2010-03-08 Conjugate of biocompatible polymer and photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110101338A KR20110101338A (en) 2011-09-16
KR101188979B1 true KR101188979B1 (en) 2012-10-08

Family

ID=44953375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100020279A KR101188979B1 (en) 2010-03-08 2010-03-08 Conjugate of biocompatible polymer and photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101188979B1 (en)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101419124B1 (en) * 2011-09-16 2014-07-11 가톨릭대학교 산학협력단 poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide) copolymer and Photosensitizer Covalent Complex for Photodynamic Therapy
KR101374820B1 (en) * 2012-01-30 2014-03-17 광주과학기술원 Pheophorbide-α conjugates and Their Uses
KR101375349B1 (en) * 2012-05-17 2014-03-18 가톨릭대학교 산학협력단 Complex of hydrophilic photosensitizer and biocompatible polymer for useful photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof
KR101659855B1 (en) * 2014-05-08 2016-09-26 국립암센터 Photosensitizer containing folate, and a composition for photodynamic diagnosis and therapy comprising the same
WO2016052971A1 (en) * 2014-09-30 2016-04-07 가톨릭대학교 산학협력단 Herceptin-photosensitizer conjugate for breast cancer diagnosis and production method therefor
CN105085710B (en) * 2015-08-12 2017-11-21 长春理工大学 Sulfamide groups phenyl porphyrin hyaluronic acid polymer and its preparation method and application
KR102182630B1 (en) 2019-12-19 2020-11-24 김진왕 Eco-friendly smart photosensitizers and photobiomodulation of stem cell therapy agent using the same
KR102266865B1 (en) * 2020-01-10 2021-06-18 가톨릭대학교 산학협력단 Water-soluble photosensitizer composite containing a fatty acid, and process of preparation thereof
CN115818623B (en) * 2022-12-09 2024-02-23 山东大学 Folic acid-iron porphyrin carbonized polymer dot and preparation method and application thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070059316A1 (en) 2003-09-23 2007-03-15 Pallenberg Alexander J Singlet oxygen photosensitizers activated by target binding enhancing the selectivity of targeted pdt agents
KR101035269B1 (en) 2007-04-23 2011-05-26 한국과학기술연구원 Novel photosensitizer based on pholymer derivatives-photosensitizer conjugates for photodynamic therapy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070059316A1 (en) 2003-09-23 2007-03-15 Pallenberg Alexander J Singlet oxygen photosensitizers activated by target binding enhancing the selectivity of targeted pdt agents
KR101035269B1 (en) 2007-04-23 2011-05-26 한국과학기술연구원 Novel photosensitizer based on pholymer derivatives-photosensitizer conjugates for photodynamic therapy

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110101338A (en) 2011-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101188979B1 (en) Conjugate of biocompatible polymer and photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof
KR102081666B1 (en) Phamaceutical composition for treating cancer
Porcu et al. Indocyanine green delivery systems for tumour detection and treatments
KR101847187B1 (en) Conjugate for photodynamic diagnosis or therapy and method for preparing same
KR101035269B1 (en) Novel photosensitizer based on pholymer derivatives-photosensitizer conjugates for photodynamic therapy
Jeong et al. Photosensitizer-conjugated human serum albumin nanoparticles for effective photodynamic therapy
JP6230443B2 (en) Near-infrared dye-bound hyaluronic acid derivative and contrast agent for optical imaging having the same
KR101183732B1 (en) Conjugate of acetylated polysccharide and photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof
US9211283B2 (en) Nanoparticle carrier systems based on human serum albumin for photodynamic therapy
Heidari et al. Gold nanorods-bombesin conjugate as a potential targeted imaging agent for detection of breast cancer
SG189034A1 (en) A nanoprobe comprising gold colloid nanoparticles for multimodality optical imaging of cancer and targeted drug delivery for cancer
WO2005089106A2 (en) Degradable nanoparticles
Kang et al. Hybrid photoactive nanomaterial composed of gold nanoparticles, pheophorbide-A and hyaluronic acid as a targeted bimodal phototherapy
KR101452819B1 (en) Redox-responsive polymer-photosensitizer conjugate containing disulfide linker and its composition for fluorescence imaging and photodynamic therapy comprising thereof
KR101419254B1 (en) Enzyme-responsive graphene oxide/biopolymer-photosensitizer nanocomplex and composition for fluorescence image and photodynamic/photothermal treatment comprising thereof
WO2019027370A1 (en) Polymer nanoparticles for afterglow molecular imaging
Liu et al. Thiophene donor for nir-ii fluorescence imaging-guided photothermal/photodynamic/chemo combination therapy
KR102280761B1 (en) Fucoidan-based Theragnostic Composition
KR20130127232A (en) Glycol chitosan and fullerenes conjugate as photosensitizer for photodynamic therapy, method for preparing the same, and photodynamic therapy using the same
KR20200042795A (en) Rhamnolipid Nanoparticle Comprising Hydrophobic Drug and Anti-Cancer Use of the Same
KR102238174B1 (en) Fucoidan-based Theragnostic Composition
KR101375349B1 (en) Complex of hydrophilic photosensitizer and biocompatible polymer for useful photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof
WO2016143017A1 (en) Nanoparticle for photoacoustic imaging
Korolev et al. Fluorescent Nanoagents for Biomedical Applications
Siwawannapong Development of functionalized organic nanoparticles for cancer diagnosis and therapy

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160927

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170804

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180806

Year of fee payment: 7