KR101183553B1

KR101183553B1 - Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a cancer comprising a quinoxaline derivative or a salt thereof as an active ingredient

Info

Publication number: KR101183553B1
Application number: KR1020100117988A
Authority: KR
Inventors: 김광록; 정희정; 안진희; 강승규; 최상운
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2010-11-25
Filing date: 2010-11-25
Publication date: 2012-09-20
Also published as: KR20120056447A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 퀴녹살린 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 암을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
<화학식 1>

The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which comprises a quinoxaline derivative represented by Formula 1 or a salt thereof as an active ingredient, and the composition may be usefully used for preventing or treating cancer.
&Lt; Formula 1 >

Description

퀴녹살린 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a cancer comprising a quinoxaline derivative or a salt thereof as an active ingredient}Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a cancer comprising a quinoxaline derivative or a salt especially as an active ingredient}

본 발명은 퀴녹살린 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a quinoxaline derivative or a salt thereof as an active ingredient.

과거에 사용된 항암제의 대부분은 화학요법제로서 암의 증상과 증후를 일시적으로 제어하여 수명을 연장시켜 주는 기능을 해 왔다. 이에 반해, 최근 항암제는 특정 암세포에 존재하는 단백질 또는 유전자를 표적으로 하여 정상세포에 대한 항암제의 부작용을 최소화시키기 위한 방향으로 개발되고 있다. 그럼에도 불구하고 다양한 유형의 암발생 메커니즘으로 인하여 효율적인 항암제가 부족하고, 항암제에 대한 내성 역시 해결되지 못하고 있는 실정이다. 이에 상기 문제를 해결하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다.
Most of the anticancer drugs used in the past have been used as chemotherapy agents to extend the life span by temporarily controlling the symptoms and symptoms of cancer. In contrast, recently, anticancer drugs have been developed to minimize the side effects of anticancer drugs against normal cells by targeting proteins or genes present in specific cancer cells. Nevertheless, due to various types of cancer development mechanisms, there is a lack of effective anticancer drugs, and the resistance to anticancer drugs is not solved. Many studies have been made to solve the above problems.

모성 배아 류신 지퍼 키나아제(maternal embryonic leucine zipper kinase, MELK)는 아데노신 모노포스페이트에 의해 활성화되는 세린/트레오닌 키나아제의 일종으로 다양한 암에서 중요한 역할을 한다. MELK는 아프리카 발톱개구리(Xenopus)의 수정란에서 처음 발견되었으며 세포 주기의 유사분열 단계에서 그 양이나 활성화가 최대화되는 것으로 알려져 있다. 이러한 현상은 척추동물세포에서도 확인되었다(Blot J. et al., Dev. Biol. 2002, 241(2):327-338; Davezac N. et al., Oncogene, 2002, 21:7630-7641). MELK에 의해 인산화되는 단백질로는 세포 주기에 관여하는 CDC25가 알려져 있으며(Dmitry V. et al., Nat. Cell Biol., 2003, 5:545-551), 상기 단백질은 전사 단백질인 ZPR9을 인산화시켜 세포 주기를 조절하는 것으로 알려져 있다(Hyun-A Seoung et al., J. Biol. Chem., 2003, 278:9655-9662). 최근 유방암 환자나 교아세포암 환자의 조직에서 MELK의 발현이 증가하는 것으로 확인되었으며 MELK의 발현을 억제하는 것 자체만으로도 암세포의 성장이 저해되는 것으로 밝혀졌다(Ichiro Nakano et al., J. Neurosci. Res., 2008, 86:48-60; Haiyoung Jung et al., J. Biol. Chem., 2008, 283:34541-34553).
Maternal embryonic leucine zipper kinase (MELK) is a type of serine / threonine kinase that is activated by adenosine monophosphate and plays an important role in various cancers. MELK was first discovered in fertilized eggs of African Xenopus and is known to maximize its amount or activation during the mitotic phase of the cell cycle. This phenomenon has also been confirmed in vertebrate cells (Blot J. et al., Dev. Biol. 2002, 241 (2): 327-338; Davezac N. et al., Oncogene , 2002, 21: 7630-7641). One of the proteins phosphorylated by MELK is known as CDC25 involved in the cell cycle (Dmitry V. et al., Nat. Cell Biol., 2003, 5: 545-551), which phosphorylates the transcription protein ZPR9. It is known to regulate the cell cycle (Hyun-A Seoung et al., J. Biol. Chem., 2003, 278: 9655-9662). Recently, the expression of MELK is increased in the tissues of breast cancer patients and glioblastoma cancer patients, and inhibiting the expression of MELK alone has been shown to inhibit the growth of cancer cells (Ichiro Nakano et al., J. Neurosci. Res). , 2008, 86: 48-60; Haiyoung Jung et al., J. Biol. Chem., 2008, 283: 34541-34553).

이에 본 발명자들은 암에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타내는 화합물을 연구하던 중, 특정 퀴녹살린 유도체가 암세포에서 MELK의 발현을 효율적으로 감소시킬 뿐만 아니라 암세포의 성장을 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
The inventors of the present invention, while studying a compound that exhibits a prophylactic or therapeutic effect on cancer, confirmed that the present invention was confirmed that certain quinoxaline derivatives not only effectively reduce the expression of MELK in cancer cells but also inhibit the growth of cancer cells. Completed.

따라서, 본 발명의 목적은 암의 예방 또는 치료에 유용한 화합물을 제공하는 것이다.
Accordingly, it is an object of the present invention to provide compounds useful for the prevention or treatment of cancer.

상기 목적에 따라, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 퀴녹살린 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:In accordance with the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a quinoxaline derivative represented by Formula 1 below or a salt thereof as an active ingredient:

본 발명에 따른 퀴녹살린 유도체 또는 이의 염은 암세포의 성장 및 MELK 단백질의 발현을 효율적으로 억제하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 신경암, 유방암, 위암, 대장암 등의 다양한 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Since the quinoxaline derivative or salt thereof according to the present invention efficiently inhibits the growth of cancer cells and the expression of MELK protein, the pharmaceutical composition comprising the same as an active ingredient prevents or treats various cancers such as nerve cancer, breast cancer, gastric cancer, and colon cancer. It can be usefully used.

도 1은 본 발명의 실시예 1의 화합물에 의한 암세포(SNB19 및 XF498)의 성장억제를 미토콘드리아 활성 측정을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1의 화합물에 의한 암세포(SNB19 및 XF498)의 세포 주기변화를 세포주기분석기를 이용하여 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1의 화합물에 의한 암세포의 MELK 발현량을 실시간 PCR을 통해 확인한 결과이다. 1 is a result of confirming the growth inhibition of cancer cells (SNB19 and XF498) by the compound of Example 1 of the present invention through measurement of mitochondrial activity.
2 is a result of analyzing the cell cycle of the cancer cells (SNB19 and XF498) by the compound of Example 1 of the present invention using a cell cycle analyzer.
Figure 3 is the result of confirming the MELK expression amount of cancer cells by the compound of Example 1 of the present invention by real-time PCR.

본 명세서에서 사용되는 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.The terms, techniques, and the like used in the present specification are used as meanings generally used in the technical field to which the present invention belongs unless there is a specific limitation. In addition, all the documents mentioned in this specification are included in this specification as the documents for demonstrating this invention.

본 명세서에서 사용되는 용어 "암세포"는 중추신경암세포, 교아종세포, 간암세포, 피부암세포, 췌장암세포, 위암세포, 대장암세포, 폐암세포, 상피암세포, 혈액암세포 등을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "예방 또는 치료"는 1) 암세포를 보유하고 있는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 질병 또는 장애가 발생되는 것을 예방하는 것, 2) 암세포의 생성을 억제, 즉 발전을 억제하는 것, 및 3) 암세포를 경감시키는 것을 의미한다.As used herein, the term "cancer cell" includes central neuron cells, glioblastoma cells, liver cancer cells, skin cancer cells, pancreatic cancer cells, gastric cancer cells, colon cancer cells, lung cancer cells, epithelial cancer cells, hematological cancer cells, and the like. In addition, the term "prophylaxis or treatment" as used herein refers to 1) preventing the occurrence of a disease or disorder in an animal, preferably a mammal, more preferably a human, having cancer cells, 2) production of cancer cells Inhibiting, ie, inhibiting development, and 3) alleviating cancer cells.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 퀴녹살린 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a quinoxaline derivative represented by Formula 1 below or a salt thereof as an active ingredient:

<화학식 1>&Lt; Formula 1 >

.

상기 화합물은 N-히드록시-2-옥소-3-(3-페닐프로필)-1,2-디히드로퀴녹살린-6-카복스아미드로 표현될 수 있으며, 본 발명에서 사용된 "화학식 1로 표시되는 퀴녹살린 유도체"와 상호교환적으로 사용된다.
The compound may be represented by N-hydroxy-2-oxo-3- (3-phenylpropyl) -1,2-dihydroquinoxalin-6-carboxamide, as used in the present invention. Quinoxaline derivatives represented ".

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 퀴녹살린 유도체는 하기 반응식 1로 표시되는 합성경로에 따라 제조할 수 있다.The quinoxaline derivative of Chemical Formula 1 according to the present invention may be prepared according to the synthetic route represented by Scheme 1 below.

[반응식 1][Reaction Scheme 1]

구체적으로, 에틸 2-옥소-5-페닐펜타노에이트(2) 등과 같은 알파-케토 에스터 화합물과, 3,4-디아미노 벤조산 알킬 에스터(예를 들어, 3,4-디아미노 벤조산 메틸 에스터(3) 또는 3,4-디아미노 벤조산 에틸 에스터)를 에탄올 용매 중에서 반응시킨 후, 레지오이성질체(regioisomer)를 재결정으로 분리하여 화학식 (4)의 화합물을 제조한다(단계 1). Specifically, alpha-keto ester compounds such as ethyl 2-oxo-5-phenylpentanoate (2), and 3,4-diamino benzoic acid alkyl esters (for example, 3,4-diamino benzoic acid methyl ester ( 3) or 3,4-diamino benzoic acid ethyl ester) is reacted in ethanol solvent, and then the regioisomer is separated by recrystallization to prepare a compound of formula (4) (step 1).

상기 단계 1에서 제조된 화합물(4)을 용매(예를 들어, 테트라히드로퓨란(THF), 메탄올, 또는 이들의 혼합용매 등)에 용해시킨 후, 염기(예를 들어, 수산화리튬 등)를 물에 용해시켜 제조한 용액을 첨가하여 가수분해함으로써 카르복실산 화합물(5)을 제조한다(단계 2).Compound (4) prepared in step 1 is dissolved in a solvent (for example, tetrahydrofuran (THF), methanol, or a mixed solvent thereof), and then a base (for example, lithium hydroxide or the like) is dissolved in water. The carboxylic acid compound (5) was manufactured by adding and hydrolyzing the solution prepared by dissolving in (step 2).

상기 단계 2에서 제조된 화합물(5)을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산염(EDCI) 및 1-히드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBT)의 존재하에 O-(테트라히드로-2H-피란-2-일)하이드록실아민(NH₂OTHP)(6) 및 디이소프로필에틸아민(DiPEA)과 반응시켜 화합물(7)을 제조한다(단계 3).Compound (5) prepared in Step 2 was prepared with O- (tetra) in the presence of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDCI) and 1-hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT). Compound (7) is prepared by reaction with hydro-2H-pyran-2-yl) hydroxylamine (NH ₂ OTHP) (6) and diisopropylethylamine (DiPEA) (step 3).

이어서 상기 단계 3에서 제조된 화합물(7)을 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올 등)과 염화 메틸렌의 혼합용매에 용해시킨 후, 산(예를 들면, 트리플루오로아세트산 등)의 존재 하에 탈보호 반응시킴으로써 본 발명에 따른 화학식 1의 퀴녹살린 유도체를 제조할 수 있다(단계 4). 이때 반응은 실온 내지 60℃의 온도범위에서 실시되는 것이 바람직하다.
Subsequently, compound (7) prepared in step 3 is dissolved in a mixed solvent of alcohol (for example, methanol, ethanol, etc.) and methylene chloride, and then desorbed in the presence of an acid (for example, trifluoroacetic acid, etc.). The quinoxaline derivative of formula 1 according to the present invention can be prepared by a protective reaction (step 4). At this time, the reaction is preferably carried out in a temperature range of room temperature to 60 ℃.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 퀴녹살린 유도체는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 염의 예로는 리튬, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속과의 반응에 의한 알칼리 금속염; 칼슘 또는 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속과의 반응에 의한 알칼리 토금속염; 또는 4가 암모늄염과 같은 적절한 유기 리간드로 이루어진 암모늄염 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. The quinoxaline derivative of Chemical Formula 1 according to the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt. Examples of preferred salts include alkali metal salts by reaction with alkali metals such as lithium, sodium and potassium; Alkaline earth metal salts by reaction with alkaline earth metals such as calcium or magnesium salts; Or ammonium salts consisting of suitable organic ligands, such as tetravalent ammonium salts, and the like.

또한 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 퀴녹살린 유도체의 염은 본 기술분야에 알려진 통상의 방법들을 사용하여 화학식 1의 화합물로부터 제조할 수 있다. 구체적으로는 화학식 1의 퀴녹살린 유도체를 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 용해시킨 후, 과량의 유기산을 가하거나 또는 무기산의 산 수용액을 가하여 침전 또는 결정화시킴으로써 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시킴으로써 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과하여 제조할 수 있다.
In addition, salts of the quinoxaline derivatives represented by Formula 1 according to the present invention may be prepared from compounds of Formula 1 using conventional methods known in the art. Specifically, the quinoxaline derivative of Formula 1 is dissolved in a water-miscible organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or acetonitrile, and then prepared by precipitation or crystallization by adding an excess of an organic acid or an acidic aqueous solution of an inorganic acid. can do. Subsequently, the solvent or excess acid may be evaporated and dried in this mixture to obtain an addition salt, or the precipitated salt may be prepared by suction filtration.

본 발명에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 화학식 1로 표시되는 퀴녹살린 유도체 또는 이의 염을 0.1 내지 100 μM, 바람직하게는 10 내지 20 μM의 양으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
The pharmaceutical composition for preventing or treating cancer according to the present invention may include, but is not limited to, a quinoxaline derivative represented by Formula 1 or a salt thereof in an amount of 0.1 to 100 μM, preferably 10 to 20 μM.

본 발명의 조성물에 함유되는 퀴녹살린 유도체 또는 이의 염은 암세포의 성장을 억제하며, MELK(maternal embryonic leucine zipper kinase)의 발현을 억제함으로써, 포유동물, 바람직하게는 인간에 대한 암 예방 또는 치료 용도를 갖는다(도 1 및 3 참조).The quinoxaline derivative or salt thereof contained in the composition of the present invention inhibits the growth of cancer cells and inhibits the expression of the internal embryonic leucine zipper kinase (MELK), thereby preventing or treating cancer in mammals, preferably humans. (See FIGS. 1 and 3).

상기 암은 바람직하게는 뇌암, 위암, 유방암, 대장암, 췌장암 및 간암으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
The cancer may be preferably selected from the group consisting of brain cancer, stomach cancer, breast cancer, colon cancer, pancreatic cancer and liver cancer, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive in addition to the active ingredient.

본 발명의 약학 조성물은 약학 분야에서의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 주사용 제제; 또는 연고제 등의 국소 투여용 제제 등이 바람직하다. 이때, 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 함께 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in a unit dosage form suitable for administration in the body of a patient according to conventional methods in the pharmaceutical art. Formulations suitable for this purpose include, but are not limited to, injectable preparations, such as injectable solutions or suspensions as parenteral preparations, or ready-to-use injectable dry powders which can be prepared and used as injectable distilled water at the time of injection; Or preparations for topical administration, such as an ointment, are preferable. In this case, generally used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants can be used together.

상기 화학식 1의 퀴녹살린 유도체 또는 그의 염의 1일 투여량은 1 내지 1000 mg/kg 체중, 바람직하게는 100 mg/kg 체중이며, 바람직하게는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 암세포의 양, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등 여러 관련 인자를 고려하여 결정할 수 있으며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 형태로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
The daily dosage of the quinoxaline derivative of Formula 1 or a salt thereof is 1 to 1000 mg / kg body weight, preferably 100 mg / kg body weight, and preferably may be administered once or divided into several times. However, the actual dosage of the active ingredient may be determined in consideration of various related factors such as the amount of cancer cells, the route of administration, the weight of the patient, the age and sex of the patient, and thus the dosage may limit the scope of the present invention in any form. It is not.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예 1: N-히드록시-2-옥소-3-(3-페닐프로필)-1,2-디히드로퀴녹살린-6-카복스아미드(화학식 1)의 제조Example 1: Preparation of N-hydroxy-2-oxo-3- (3-phenylpropyl) -1,2-dihydroquinoxaline-6-carboxamide (Formula 1)

<단계 1> 메틸 2-옥소-3-(3-페닐프로필)-1,2-디히드로퀴녹살린-6-카복실레이트의 제조Step 1 Preparation of Methyl 2-oxo-3- (3-phenylpropyl) -1,2-dihydroquinoxaline-6-carboxylate

[반응식 2]Scheme 2

에탄올(30 mL)에 3,4-디아미노 벤조산 메틸 에스터(649 mg, 3.9 mmol)를 가하여 용해시킨 후, 에틸 2-옥소-5-페닐펜타노에이트(860 mg, 3.9 mmol)를 가하여 처음에 약간 가열한 다음 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 여과하여 생성된 백색 고체를 분리한 후, 소량의 용매(에탄올/n-헥산, 1/1(v/v))로 세척하고 건조하여 표제 화합물(880 mg, 수율: 70 %)을 수득하였다.3,4-diamino benzoic acid methyl ester (649 mg, 3.9 mmol) was dissolved in ethanol (30 mL), and ethyl 2-oxo-5-phenylpentanoate (860 mg, 3.9 mmol) was added first. It was heated slightly and stirred at room temperature for 20 hours. The reaction mixture was filtered to separate the resulting white solid, which was then washed with a small amount of solvent (ethanol / n-hexane, 1/1 (v / v)) and dried to give the title compound (880 mg, yield: 70%). Obtained.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 12.57 (s, 1H), 8.23 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.02 (dd, J = 8.5, 1.9 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.32 - 7.15 (m, 5H), 3.87 (s, 3H), 2.81 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.71 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.08 - 1.98 (m, 2H) ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 12.57 (s, 1H), 8.23 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.02 (dd, J = 8.5, 1.9 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.32-7.15 (m, 5H), 3.87 (s, 3H), 2.81 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.71 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.08- 1.98 (m, 2 H)

¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 165.4, 162.7, 154.5, 141.8, 135.4, 130.8, 129.5, 129.3, 128.3, 128.2, 125.6, 124.0, 115.5, 52.1, 34.7, 32.0, 27.3
¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 165.4, 162.7, 154.5, 141.8, 135.4, 130.8, 129.5, 129.3, 128.3, 128.2, 125.6, 124.0, 115.5, 52.1, 34.7, 32.0, 27.3

<단계 2> 2-옥소-3-(3-페닐프로필)-1,2-디히드로퀴녹살린-6-카복실산의 제조<Step 2> Preparation of 2-oxo-3- (3-phenylpropyl) -1,2-dihydroquinoxaline-6-carboxylic acid

[반응식 3]Scheme 3

상기 단계 1에서 수득한 화합물(554 mg, 1.71 mmol)을 테트라히드로퓨란(THF, 10 mL)과 메탄올(10 mL)의 혼합용매에 용해시킨 후, LiOH(366 mg, 8.6 mmol)를 H₂O(10 mL)에 용해시켜 제조한 용액을 가하고, 50 ℃에서 10시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응이 종결되면 감압 농축한 후 물에 용해시키고, 2N-HCl로 pH를 2로 조정하였다. 상기 용액을 에틸 아세테이트로 추출한 후, Na₂SO₄로건조시키고, 여과 및 감압 농축하여 표제 화합물(백색 고체, 503 mg, 수율: 95 %)을 수득하였다.The compound (554 mg, 1.71 mmol) obtained in step 1 was dissolved in a mixed solvent of tetrahydrofuran (THF, 10 mL) and methanol (10 mL), and LiOH (366 mg, 8.6 mmol) was dissolved in H ₂ O. A solution prepared by dissolving in (10 mL) was added and reacted with stirring at 50 ° C. for 10 hours. After the reaction was completed, the mixture was concentrated under reduced pressure, dissolved in water, and the pH was adjusted to 2 with 2N-HCl. The solution was extracted with ethyl acetate and then Na ₂ SO ₄ Drying, filtration and concentration under reduced pressure gave the title compound (white solid, 503 mg, yield: 95%).

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.04 (brs, 1H), 12.59 (s, 1H), 8.27 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.06 (dd, J = 8.5, 1.9 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.36 - 7.20 (m, 5H), 2.87 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.13 - 2.03 (m, 2H)
¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.04 (brs, 1H), 12.59 (s, 1H), 8.27 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.06 (dd, J = 8.5, 1.9 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.36-7.20 (m, 5H), 2.87 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.13- 2.03 (m, 2H)

<단계 3> 테트라히드로-2H-피란-2-일 2-옥소-3-(3-페닐프로필)-1,2-디히드로퀴녹살린-6-카복실레이트의 제조<Step 3> Preparation of tetrahydro-2H-pyran-2-yl 2-oxo-3- (3-phenylpropyl) -1,2-dihydroquinoxalin-6-carboxylate

[반응식 4]Scheme 4

상기 단계 2에서 수득한 화합물(154 mg, 0.5 mmol)을 디메틸포름아마이드(DMF, 1 mL)에 용해시킨 후, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산염(EDCI, 115 mg, 0.6 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBT, 68 mg, 0.5 mmol)의 존재하에 O-(테트라히드로-2H-피란-2-일)하이드록실아민(NH₂OTHP, 117 mg, 1 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(DiPEA, 258 mg, 2 mmol)과 실온에서 3시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응이 종결되면 포화 NH₄Cl을 넣고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 분리된 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과, 감압 및 농축한 후, 잔여물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 표제 화합물(백색 고체, 129 mg, 수율: 63 %)을 얻었다.The compound obtained in step 2 (154 mg, 0.5 mmol) was dissolved in dimethylformamide (DMF, 1 mL), and then 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDCI, 115 mg, 0.6 mmol) and O- (tetrahydro-2H-pyran-2-yl) hydroxylamine (NH ₂ OTHP, 117 mg in the presence of 1-hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT, 68 mg, 0.5 mmol) , 1 mmol) and diisopropylethylamine (DiPEA, 258 mg, 2 mmol) were reacted with stirring for 3 hours at room temperature. Upon completion of the reaction, saturated NH ₄ Cl was added and extracted with ethyl acetate. The separated organic layer was dried over Na ₂ SO ₄ , filtered, reduced pressure and concentrated, and then the residue was separated by column chromatography to give the title compound (white solid, 129 mg, yield: 63%).

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 12.48 (brs, 1H), 11.71 (brs, 1H), 8.16 (d, J=1.4 Hz, 1H), 7.87 (dd, J=8.5, 1.7 Hz, 1H), 7.31-7.13 (m, 6H), 4.99 (s, 1H), 4.11-3.96 (m, 1H), 3.56-3.46 (m, 1H), 2.76 (t, J=7.5 Hz, 2H), 2.68 (t, J=7.7 Hz, 2H), 2.06-1.95 (m, 2H), 1.73-1.48 (m, 6H).
¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 12.48 (brs, 1H), 11.71 (brs, 1H), 8.16 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.87 (dd, J = 8.5, 1.7 Hz, 1H), 7.31-7.13 (m, 6H), 4.99 (s, 1H), 4.11-3.96 (m, 1H), 3.56-3.46 (m, 1H), 2.76 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.68 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.06-1.95 (m, 2H), 1.73-1.48 (m, 6H).

<단계 4> N-히드록시-2-옥소-3-(3-페닐프로필)-1,2-디히드로퀴녹살린-6-카복사미드의 제조Step 4 Preparation of N-hydroxy-2-oxo-3- (3-phenylpropyl) -1,2-dihydroquinoxalin-6-carboxamide

[반응식 5]Scheme 5

상기 단계 3에서 수득한 화합물(86 mg, 0.21 mmol)을 메탄올(MeOH, 5 mL) 및 CH₂Cl₂(5 mL)의 혼합용매에 용해시킨 후, 실온에서 트리플루오로아세트산(TFA, 490 mg, 4.3 mmol)을 가하고 35℃에서 10시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면 농축하고, 잔여물에 소량의 에틸 아세테이트를 가하여 30분 동안 교반한 후 여과하여 표제 화합물(백색 고체, 56 mg, 수율: 83 %)을 수득하였다. Compound (86 mg, 0.21 mmol) obtained in step 3 was dissolved in a mixed solvent of methanol (MeOH, 5 mL) and CH ₂ Cl ₂ (5 mL), and then trifluoroacetic acid (TFA, 490 mg) at room temperature. , 4.3 mmol) was added and stirred at 35 ° C. for 10 hours. Concentrate at the end of the reaction, add a small amount of ethyl acetate to the residue, stir for 30 minutes and filter to afford the title compound (white solid, 56 mg, yield: 83%).

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 12.48 (s, 1H), 11.30 (s, 1H), 9.07 (s, 1H), 8.13 (d, J=1.7 Hz, 1H), 7.88 (dd, J=8.5, 1.8 Hz, 1H), 7.32 - 7.14 (m, 6H), 2.80 (t, J=7.3 Hz, 2H), 2.70 (t, J=7.4 Hz, 2H), 2.07 - 1.97 (m, 2H). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 12.48 (s, 1H), 11.30 (s, 1H), 9.07 (s, 1H), 8.13 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.88 (dd, J = 8.5, 1.8 Hz, 1H), 7.32-7.14 (m, 6H), 2.80 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.07-1.97 (m, 2H ).

¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 163.3, 162.4, 154.6, 141.8, 133.8, 130.8, 128.3, 128.2, 127.9, 127.2, 126.5, 125.6, 115.2, 34.7, 32.0, 27.5
¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 163.3, 162.4, 154.6, 141.8, 133.8, 130.8, 128.3, 128.2, 127.9, 127.2, 126.5, 125.6, 115.2, 34.7, 32.0, 27.5

실험예 1: 암세포 성장 저해 효과 측정Experimental Example 1 Measurement of Cancer Cell Growth Inhibition Effect

본 발명에 따른 화학식 1의 퀴녹살린 유도체의 암세포 성장 저해 능력을 확인하기 위해, 상기 화합물을 교종암 세포(SNB19)에 처리한 후, 세포성장 지표인자인 미토콘드리아 활성도를 CCK-8 키트(Dojindo Molecular Technologies, Inc.)를 이용하여 측정하였다. In order to confirm the cancer cell growth inhibition ability of the quinoxaline derivative of Formula 1 according to the present invention, after treating the compound with glioma cancer cells (SNB19), mitochondrial activity, which is a cell growth indicator, was added to the CCK-8 kit (Dojindo Molecular Technologies). , Inc.).

구체적으로, 사람의 교아종세포인 SNB19 세포(ATCC Cat. No. CRL-2219)와 인간중추신경계 암세포인 XF498 세포를 96-웰 플레이트(Corning)에 웰 당 2,000개의 농도로 넣은 다음, 10% 우태아혈청(FBS)이 첨가된 RPMI 배지(Gibco)에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 화학식 1의 화합물을 10 μM 및 20 μM의 농도로 각각 처리한 다음, 1일, 2일, 3일 및 4일째에 CCK-8 키트를 이용하여 각 세포의 미토콘드리아 활성을 측정하였다. 구체적으로 활성은, 상기 날짜에 각 웰에 CCK-8 용액 10 μL를 처리하여 2시간 동안 섭씨 37도에서 반응시킨 다음, 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 460 nm에서 측정하였다. 이때 DMSO로 처리한 군을 100%로 기준을 잡았다.
Specifically, human glioblastoma SNB19 cells (ATCC Cat. No. CRL-2219) and human central nervous system cancer cells XF498 cells were put in a concentration of 2,000 per well in a 96-well plate (Corning), and then 10% right Incubation for 24 hours in RPMI medium (Gibco) to which fetal serum (FBS) was added. After 24 hours, the compounds of Formula 1 were treated at concentrations of 10 μM and 20 μM, respectively, and then the mitochondrial activity of each cell was measured using CCK-8 kits on day 1, day 2, day 3 and day 4. Specifically, activity was measured at 460 nm using a microplate reader (Molecular Devices) and then reacted at 37 ° C. for 2 hours by treating 10 μL of CCK-8 solution in each well on the day. At this time, the group treated with DMSO was set to 100%.

실험 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이, 교아종세포(SNB19)의 경우, DMSO로 처리한 군은 배양 시간이 길어질수록 세포수가 증가하여 5일째에는 거의 4배 이상까지 증가하였다. 이에 반해, 화학식 1의 화합물을 처리한 군의 경우, 세포 성장이 억제되어 5일째에는 세포수가 2배 정도밖에 되지 않았다. 인간중추신경계 암세포(XF498)를 대상으로 한 실험에서도 유사한 결과가 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 암세포의 성장을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.
The experimental results are shown in FIG. 1. As shown in FIG. 1, in the case of glioblastoma cells (SNB19), the group treated with DMSO increased the number of cells with longer incubation time and increased to almost four times or more at 5 days. In contrast, in the group treated with the compound of Formula 1, cell growth was inhibited, resulting in only about twice the number of cells on day 5. Similar results were observed in human central nervous system cancer cells (XF498). Therefore, it was found that the compound of formula 1 according to the present invention effectively inhibits the growth of cancer cells.

실험예 2: 암세포 세포주기 분석 Experimental Example 2: Cancer Cell Cell Cycle Analysis

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물이 암세포의 세포주기에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, FACS 유세포 분석기를 이용하여 세포를 분석하였다. In order to examine the effect of the compound of formula 1 according to the present invention on the cell cycle of cancer cells, cells were analyzed using a FACS flow cytometer.

구체적으로, SNB19 세포를 10% FBS가 포함된 RPMI 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 계대배양 하였다. 계대배양한 세포를 60Φ 디쉬에 분주한 후(1 × 10⁵ 세포/웰, n=2), 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 각 디쉬에 화학식 1의 화합물을 처리하고, 48시간 후 세포를 인산완충식염수(PBS, Gibco invitrogen corporation, USA)를 사용하여 세척하고, PBS에 희석한 1 X Typsin-EDTA(Gibco invitrogen corporation, USA)를 800 μL씩 처리하여 회수하였다. 3,000rpm으로 2분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 70% 에탄올로 세포를 고정하였다. 그 후, 3,000rpm으로 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 PBS로 세척한 후 PI 염색용액(RNase A 10㎎/㎖, 1X PBS, Propidium iodide 0.4㎎/㎖)을 400 μL씩 넣어 FACS용 튜브에 옮겨 유세포 분석기로 분석하였다.Specifically, SNB19 cells were passaged at 37 ° C., 5% CO ₂ using RPMI medium containing 10% FBS. Subcultured cells were dispensed into 60Φ dish (1 × 10 ⁵ cells / well, n = 2) and incubated for 24 hours in RPMI medium containing 10% FBS. Thereafter, each dish was treated with the compound of formula 1, and after 48 hours, cells were washed with phosphate buffered saline (PBS, Gibco invitrogen corporation, USA) and diluted in PBS with 1 X Typsin-EDTA (Gibco invitrogen corporation). , USA) was recovered by 800 μL treatment. After removing the supernatant by centrifugation at 3,000 rpm for 2 minutes, the cells were fixed with 70% ethanol. Thereafter, the supernatant was removed by centrifugation at 3,000 rpm for 5 minutes, washed with PBS, and 400 μL of PI staining solution (RNase A 10 mg / ml, 1X PBS, Propidium iodide 0.4 mg / ml) was added to the FACS tube. Transfer was analyzed by flow cytometry.

실험결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 M1은 세포주기의 DNA 합성전기(G1)에 해당하고, M2는 합성기(S)에 해당하며, M3은 합성후기(G2) 및 유사분열기(M)에 해당하는 세포의 수를 나타낸다. M4로 표시되는 영역은 정상적인 세포줏기의 DNA양에 미치지 못하는 DNA를 가진 세포들로서 자연사로 인하여 손상을 받은 세포들이 해당된다. 도 2에서 보는 바와 같이, DMSO로 처리된 군에 비해 화학식 1의 화합물로 처리된 군의 경우 M1 영역, 즉 DNA 합성전기(G1)에 해당하는 세포가 줄어들었으며, 이는 본 발명의 화합물이 암세포의 DNA 합성전기(G1)에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 또한, 화학식 1의 화합물로 처리된 군에서 M4로 표시되는 영역이 증가하였는데, 이는 본 발명의 화합물에 따른 암세포의 사멸이 증가하였음을 보여준다. 상기 결과로부터 본 발명의 화합물이 암세포를 사멸시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
The experimental results are shown in FIG. 2. In FIG. 2, M1 corresponds to the DNA synthesis electric cell (G1) of the cell cycle, M2 corresponds to the synthesizer (S), and M3 represents the number of cells corresponding to the late synthesis (G2) and mitosis (M). The region labeled M4 is a cell with DNA that is less than the normal DNA level of the cell, and the cells are damaged by natural death. As shown in Figure 2, compared to the group treated with DMSO in the group treated with the compound of formula 1 cells corresponding to the M1 region, DNA synthesis electric (G1) was reduced, which means that the compound of the present invention DNA synthesis electricity (G1) is shown. In addition, the region labeled M4 in the group treated with the compound of Formula 1 increased, indicating that the death of cancer cells according to the compound of the present invention increased. The results showed that the compound of the present invention has an effect of killing cancer cells.

실험예 3: MELK 발현 억제 효과 측정Experimental Example 3: Measurement of the Effect of Inhibiting MELK Expression

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 MELK 발현 억제 능력을 확인하기 위해, 상기 화합물을 10% 우태아혈청이 첨가된 RPMI 배지에서 배양한 교종암세포(SNB19) 및 인간중추신경계 암세포(XF498)에 각각 처리한 후, 48시간 후 RNA 추출 용액(Invitrogen)을 이용하여 세포의 총 RNA를 각각 분리하였다. 분리된 RNA를 주형으로 하여 올리고 dT(바이오니아)와 cDNA 합성 키트(바이오니아)를 사용하여 DNA 증폭기(Biorad)에서 42℃에서 반응하여 cDNA를 제조하였다. 상기 제조된 cDNA에 MELK-특이적 프라이머(서열번호 1 및 2) 및 실시간 PCR 반응 시약(CyberGreen, Qiagene)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 구체적인 PCR 조건은 다음과 같다: 94℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 30초(40 사이클). MELK 발현량은 실시간 PCR(MX3000P, Stratagene)로 측정하고 MxPro 소프트웨어(Stratagene)를 사용하여 계산하였다. In order to confirm the ability to inhibit MELK expression of the compound of Formula 1 according to the present invention, the compound was treated to glioma cancer cells (SNB19) and human central nervous system cancer cells (XF498) cultured in RPMI medium to which 10% fetal calf serum was added. After 48 hours, total RNA of the cells was isolated using RNA extraction solution (Invitrogen). Using the isolated RNA as a template, cDNA was prepared by reacting the oligo dT (Bionia) and cDNA synthesis kit (Bionia) at 42 ° C. in a DNA amplifier (Biorad). PCR was performed on the prepared cDNA using MELK-specific primers (SEQ ID NOs: 1 and 2) and real-time PCR reaction reagents (CyberGreen, Qiagene). Specific PCR conditions were as follows: 94 ° C., 10 seconds; 55 ° C., 30 seconds; 72 ° C., 30 seconds (40 cycles). MELK expression was measured by real-time PCR (MX3000P, Stratagene) and calculated using MxPro software (Stratagene).

측정 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보는 바와 같이, 무처리 대조군에 비해 화학식 1의 화합물을 처리한 세포(SNB19-1 및 XF498-1)의 경우 MELK의 발현량이 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물이 암을 예방 또는 치료하는데 효과적임을 입증한다.
The measurement results are shown in FIG. 3. As shown in FIG. 3, the expression levels of MELK were significantly decreased in the cells treated with the compound of Formula 1 (SNB19-1 and XF498-1) compared to the untreated control group. The above results demonstrate that the compound of formula 1 according to the present invention is effective in preventing or treating cancer.

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Claims

하기 화학식 1로 표시되는 퀴녹살린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
<화학식 1>

A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a quinoxaline derivative represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
&Lt; Formula 1 >

제 1 항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 퀴녹살린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는염이 10 내지 20 μM의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
The method of claim 1,
A quinoxaline derivative represented by Chemical Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is contained in an amount of 10 to 20 μM.

제 1 항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 퀴녹살린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는염이 모성 배아 류신 지퍼 키나아제(maternal embryonic leucine zipper kinase)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
The method of claim 1,
A quinoxaline derivative represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof inhibits the expression of a maternal embryonic leucine zipper kinase.

제 1 항에 있어서,
상기 암이 뇌암, 위암, 유방암, 대장암, 췌장암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.The method of claim 1,
Pharmaceutical composition, characterized in that the cancer is selected from the group consisting of brain cancer, stomach cancer, breast cancer, colon cancer, pancreatic cancer and liver cancer.