KR101182417B1 - Artificial Nanofiber Amnion Membranes and Method of Making The Same - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목적은 양막의 성분이 함유된 나노섬유 인공양막을 제공함을 목적으로 한다. 보다 구체적으로, 양막 성분 및 콜라겐 혼합물 및 폴리우레탄의 공 방사 (co-spinning) 하여 나노섬유 인공양막을 제공하는 것이다.
본 발명의 인공양막은 가격적인 면에서 절감효과를 가지고 있으며, 전기방사의 장점으로 부피에 대한 표면적이 넓은 점을 이용하여 화상이나 상처치료 효과를 기대할 수 있다. An object of the present invention is to provide a nanofiber artificial amniotic membrane containing the components of the amniotic membrane. More specifically, co-spinning of the amniotic membrane component and collagen mixture and polyurethane provides a nanofiber artificial amnion.
The artificial amniotic membrane of the present invention has a cost-effectiveness effect, and can be expected to treat burns or wounds by using a wide surface area for volume as an advantage of electrospinning.
Description
본 발명은 양막의 성분을 함유한 나노섬유 인공양막 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 양막의 성분 및 콜라겐 혼합물 및 폴리우레탄을 공 방사하여 나노섬유 인공양막을 제조하는 방법 및 인공양막에 관한 것이다.
The present invention relates to a nanofiber artificial amniotic membrane containing a component of the amniotic membrane and a method of manufacturing the same. More specifically, the present invention relates to a method for producing a nanofiber artificial amniotic membrane by co-spinning a component of amnion and collagen mixture and polyurethane.
태반은 일반적으로 태아와 모체에서 유래한 조직으로부터 형성되는데, 모체의 자궁점막에서 유래한 탈락막과 수정란에서 유래한 융모막, 양막 등으로 이루어져 있는 것으로서 태아와 모체 사이의 물질교환이 일어나는 기관을 말한다. The placenta is generally formed from tissues derived from the fetus and the mother. The placenta is composed of the decidual membrane derived from the uterine mucosa of the mother and the chorion and amniotic membrane derived from the fertilized egg.
양막은 융모막 (chorion laeve membrane)이 붙어있으며, 태아를 보호하고 떠 받혀주기 위한 양수로 채워져 있는 태반을 구성하고 있는 가장 안쪽에 있는 투명하고 얇은 막이다. 양막은 콜라겐으로 이루어져있고, 각종 성장 인자 (growth factor) 즉, 표피세포 성장인자 (EGF, epidermal growth factor), 섬유아세포 성장인자 (FGF, fibroblast growth factor), 각질세포 성장인자 (KGF, keratinocyte growth factor), 신경 성장인자(nerve growth factor : NGF), 간장 성장인자(hepatic growth factor : HGF)등을 포함하고 있다.The amnion is the innermost transparent, thin membrane that is attached to the chorion laeve membrane and constitutes the placenta filled with amniotic fluid to protect and support the fetus. The amnion is composed of collagen, and various growth factors such as epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF) and keratinocyte growth factor (KGF) ), Nerve growth factor (NGF), hepatic growth factor (hepatic growth factor (HGF), etc. are included.
양막은 이와 같은 성장 인자 (growth factor)를 포함하고 있어, 1900년대 초기에 화상치료용 드레싱으로 사용되기 시작하여 그 효능의 우수성이 알려짐에 따라 근래에 와서는 화상뿐만 아니라 피부 찰상 (dermabrasion), 궤양 말기 (lower extremity ulcers), 나병으로 인한 피부장애 (leprotic dermal lesions), 스티븐-존슨 증후군 (stevens-johnson syndrom), 복구를 위한 외과 수술, 후두학, 안과학 등과 선천적 질병, 파킨스 증후군 (parkinson syndrom), 말초와 중앙신경의 축색 (axonal)의 재생을 촉진하는데 사용되고 있다 [tyszkiewicz et.al, amnion allografts prepared in the central tissue bank in warsaw, annals of transplantation, vol.4, no.3-4, 1999, pp.85-90].Amniotic membranes contain these growth factors, which began to be used as dressings for burn treatment in the early 1900s, and as their superiority is known, they have recently been used to treat not only burns but also dermabrasions and ulcers. Lower extremity ulcers, leprotic dermal lesions, stevens-johnson syndrom, surgical operations for recovery, laryngology, ophthalmology and congenital diseases, parkinson syndrom It has been used to promote the regeneration of peripheral and central axons [tyszkiewicz et.al, amnion allografts prepared in the central tissue bank in warsaw, annals of transplantation, vol. 4, no. 3-4, 1999, pp. 85-90].
일반적으로, 2도 이내의 가벼운 화상의 경우처럼 피부의 손상이 표피에 국한될 경우에는 피부조직의 재생이 가능하지만 심부화상과 같은 진피가 손상된 상처의 경우 재생이 되지 않기 때문에 자가 피부를 이식하는 것이 통례이다. 그러나 이식하기 까지는 역시 일정기간 환부를 피복하여 보호하여야 한다. 따라서 이러한 창상피복제는 적당한 수분의 투과성을 유지하면서 세균 등과 같은 외부환경을 차단하며 인체를 보호할 수 있는 기능을 할 수 있어야 한다. 현재까지 임상에서는 이러한 손상부위를 보호하기 위한 창상피복제로서 우레탄중합체, 로이신중합체 (poly-L-leucine) 등과 같은 합성고분자 막을 사용하여 왔으나 이들 재료는 생물학적 기능을 가지고 있지 못하기 때문에 그 이용에 한계가 있을 수밖에 없다. 따라서 보다 적극적으로 피부를 재생하기 위해 적당한 수분투과성 고분자막과 생체적합성 구조체를 복합화한 막을 만들어 피부조직이 재생되면 탈락하도록 설계된 것들이 있으며, 그 가운데 비교적 성공적인 것이 1980년대 초에 발표된 바이오브레인 (biobrane)으로서, 콜라겐으로 피복된 나이론 직조체와 미세한 다공성 실리콘막으로 구성된 2중 구조를 가지고 있으며, 피부와의 밀착성이 좋고 신축성도 있기 때문에 창상면에 잘 부착되며 실리콘막을 통해 일상적으로 도포한 항생제가 환부에 전달될 수도 있는 장점을 가지고 있어 2도 이내의 화상 또는 같은 정도의 피부박리 상태의 창상에 널리 사용되고 있다.In general, when the damage to the epidermis is limited to the epidermis, such as a mild burn within 2 degrees, regeneration of the skin tissue is possible. It is customary. However, until transplantation, the affected area must also be covered and protected for some time. Therefore, the wound dressing should be able to block the external environment such as bacteria and protect the human body while maintaining the permeability of appropriate moisture. To date, the clinic has used synthetic polymer membranes such as urethane polymers and poly-L-leucine as wound coatings to protect these damaged areas. However, these materials have limited biological use, so they are limited in their use. There is no choice but to be. Therefore, in order to regenerate the skin more actively, there are those that are designed to be combined with a suitable water-permeable polymer membrane and a biocompatible structure and to be eliminated when the skin tissue is regenerated. Among them, a relatively successful biobrane released in the early 1980s is It has a double structure consisting of a nylon weave coated with collagen and a fine porous silicone membrane. Because it has good adhesion to the skin and elasticity, it adheres well to the wound surface and antibiotics applied routinely through the silicone membrane are delivered to the affected area. It has the advantage that it can be widely used in burns within 2 degrees or in the same degree of peeling.
또한 2도 이상의 심한 상처의 경우 현재는 진피대체물을 이식 후 약 2주 후에 부분층 식피편으로 덮어주거나, 배양한 표피세포로 덮는 방법을 이용하고 있으며, 이 때 필수적으로 선행되어야 할 진피대체물은 콜라겐을 스폰지나 젤형태로 만들어 이용하거나 생분해성 고분자를 이용하여 만들고 있다.In the case of severe wounds above 2 degrees, the dermal replacement is currently covered with a partial layer of epidermis or about 2 weeks after transplantation, and the epidermal replacement is essential. It is made by using sponge or gel form or using biodegradable polymer.
콜라겐 스폰지를 전층 피부 결손 상처에 사용하면, 상처 부위에서 섬유 모세포와 모세혈관이 스폰지 내에 침투해서 증식하고, 자가 콜라겐의 합성에 의하여 콜라겐 섬유가 형성되어, 진피 모양의 조직이 구축된다. 그 후 콜라겐 스폰지는 극히 순수하게 분해 흡수된다. 따라서 이 진피 모양의 조직은 완전한 자기 진피 조직이 된다. 재료 자체가 생체 진피 조직으로 바뀌어지기 때문에 이 스폰지는 진피대체물이라고도 불리운다.
When collagen sponges are used for whole skin defect wounds, fibroblasts and capillaries penetrate into the sponges and proliferate at the wound site, and collagen fibers are formed by the synthesis of autologous collagen, thereby constructing dermal tissue. The collagen sponge is then decomposed and absorbed in an extremely pure manner. Thus, this dermal tissue becomes a complete self-dermal tissue. The sponge is also called the dermal substitute because the material itself is turned into living dermal tissue.
이에 본 발명자는 상처 치료제나 화상치료제로서 저렴하게 활용하기 위해 양막의 성분 및 콜라겐을, 기계적 강도를 높일 수 있는 폴리우레탄을 공 방사 시켜 나노섬유 인공양막을 완성하기에 이르렀다. Accordingly, the present inventors have completed the nanofiber artificial amniotic membrane by co-spinning polyurethane components that can enhance mechanical strength of components and collagen of amniotic membranes to be used at low cost as a wound treatment or burn treatment.
본 발명의 목적은 양막의 성분이 함유된 나노섬유 인공양막 및 이의 제조방법을 제공함을 목적으로 한다. 보다 구체적으로 양막의 성분 및 콜라겐 혼합물, 폴리우레탄을 공 방사하여 나노섬유 인공양막을 제조하는 방법 및 나노섬유 인공양막을 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide a nanofiber artificial amniotic membrane containing a component of the amniotic membrane and a manufacturing method thereof. More specifically, to provide a method for producing a nanofiber artificial amnion by co-spinning the components and collagen mixture of the amnion, polyurethane, and nanofiber artificial amnion.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention
(a) 양막을 아세트산 (acetic acid) 및 3-머캅토프로피온산 (3-mercaptopropionic acid) 존재 하에 초음파를 방사하여 양막의 성분을 추출하는 단계;(a) radiating the amniotic membrane in the presence of acetic acid and 3-mercaptopropionic acid to extract components of the amniotic membrane;
(b) 상기 추출 된 양막의 성분을 콜라겐 (collagen)과 같이 용매에 용해시키는 단계;(b) dissolving the components of the extracted amniotic membrane in a solvent such as collagen;
(c) 폴리우레탄을 용매에 용해시키는 단계;(c) dissolving the polyurethane in a solvent;
(d) 상기 (b)단계의 용액과 (c)단계의 용액을 공 방사 (co-spinning)하여 나노섬유를 제조하는 단계;(d) co-spinning the solution of step (b) and the solution of step (c) to produce nanofibers;
를 포함하는 인공양막의 제조방법을 제공한다.It provides a method of manufacturing artificial amniotic membrane comprising a.
상기 (a) 단계의 아세트산은 5~30% 아세트산인 것이 바람직하다.The acetic acid of step (a) is preferably 5-30% acetic acid.
상기 (a) 단계의 양막의 성분 추출은 Component extraction of the amniotic membrane of step (a)
(ㄱ) 양막에 용매인 5~30% 아세트산 및 3-머캅토프로피온산을 가하고 초음파 처리하는 단계;(A) adding sonication 5-30% acetic acid and 3-mercaptopropionic acid to the amnion and sonicating;
(ㄴ) 초음파 처리 후 원심분리시켜 상등액을 얻는 단계;(B) centrifugation after sonication to obtain a supernatant;
(ㄷ) 상기 상등액에서 용매를 제거하고 동결 건조시키는 단계;(C) removing the solvent from the supernatant and freeze drying;
를 포함하는 것이 바람직하다.It is preferable to include.
상기 양막의 성분은 성장 인자인 것이 바람직하다.The component of the amnion is preferably a growth factor.
상기 성장 인자는 EGF (epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor), KGF (keratinocyte growth factor), NGF (nerve growth factor), HGF (hepatic growth factor)인 것을 포함할 수 있다.
The growth factor may include EGF (epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor), KGF (keratinocyte growth factor), NGF (nerve growth factor), HGF (hepatic growth factor).
상기 (b) 단계의 용매는 1,1,1,3,3,3-헥사플로로-2-프로판올(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, HFP) 또는 5~15mM 염산 (HCL)인 것이 바람직하다.
The solvent of step (b) is 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, HFP) or 5 Preference is given to ˜15 mM hydrochloric acid (HCL).
상기 (c) 단계의 용매는 N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide, DMF) 및 테트라히드로푸란 (tetrahydrofuran, THF)인 것을 포함할 수 있다. The solvent of step (c) may include N, N-dimethylformamide (N, N-dimethylformamide, DMF) and tetrahydrofuran (THF).
상기 N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide, DMF) 및 테트라히드로푸란 (tetrahydrofuran, THF)의 비율은 1:1 인 것이 바람직하다.The ratio of N, N-dimethylformamide (N, N-dimethylformamide, DMF) and tetrahydrofuran (THF) is preferably 1: 1.
또한 본 발명은 양막 성분, 콜라겐, 폴리우레탄이 함유된 나노섬유 인공양막을 제공한다. 상기 인공양막은 상기에 따른 방법으로 제조 된 인공양막을 포함할 수 있다.The present invention also provides a nanofiber artificial amniotic membrane containing amnion components, collagen, polyurethane. The artificial amniotic membrane may comprise an artificial amniotic membrane prepared by the method according to the above.
본 발명의 인공양막은 가격적인 면에서 절감효과를 가지고 있으며, 전기방사의 장점으로 부피에 대한 표면적이 넓은 점을 이용하여 화상이나 상처치료 효과를 기대할 수 있다.
The artificial amniotic membrane of the present invention has a cost-effectiveness effect, and can be expected to treat burns or wounds by using a wide surface area for volume as an advantage of electrospinning.
도 1은 a는 섬유모양을 하고 있는 양막의 기저막 (basement membrane)의 그림을 나타낸 것이고 (하얀색 화살표) b는 재구성한 양막을 SEM으로 나타낸 것이다.
도 2는 동결 건조된 양막과 전기방사를 통하여 재구성된 양막의 기계적 성질 (mechanical property)을 비교한 것이다.
도 3은 동결 건조된 양막과 전기방사를 통하여 재구성된 양막의 기계적 성질 (mechanical property)을 비교한 것이다.
도 4는 PU와 PU/coll, PU/coll/AM의 세포의 증식과 관련된 것이다.
도 5는 PU와 PU/coll, PU/coll/AM의 표면에 세포의 부착에 관한 것이다.Figure 1 shows a figure of the basement membrane (white arrow) of the fibrous amnion (white arrow), b shows the reconstituted amniotic membrane by SEM.
FIG. 2 compares the mechanical properties of the lyophilized amniotic membrane and the reconstituted amniotic membrane through electrospinning.
Figure 3 compares the mechanical properties of the lyophilized amniotic membrane and the reconstituted amniotic membrane through electrospinning.
4 is related to the proliferation of cells of PU and PU / coll, PU / coll / AM.
Figure 5 relates to the adhesion of cells to the surface of PU and PU / coll, PU / coll / AM.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예에서는 양막성분, 콜라겐 및 폴리우레탄을 함유한 인공양막을 제조하는 방법을 제공한다. In order to achieve the object of the present invention as described above, an embodiment of the present invention provides a method for producing an artificial amnion containing amnion components, collagen and polyurethane.
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, More specifically, in one embodiment of the present invention,
(a) 양막을 아세트산 (acetic acid) 및 3-머캅토프로피온산 (3-mercaptopropionic acid) 존재 하에 초음파를 방사하여 양막의 성분을 추출하는 단계;(a) radiating the amniotic membrane in the presence of acetic acid and 3-mercaptopropionic acid to extract components of the amniotic membrane;
(b) 상기 추출 된 양막의 성분을 콜라겐 (collagen)과 같이 용매에 용해시키는 단계;(b) dissolving the components of the extracted amniotic membrane in a solvent such as collagen;
(c) 폴리우레탄을 용매에 용해시키는 단계;(c) dissolving the polyurethane in a solvent;
(d) 상기 (b)단계의 용액과 (c)단계의 용액을 공 방사 (co-spinning)하여 나노섬유를 제조하는 단계;(d) co-spinning the solution of step (b) and the solution of step (c) to produce nanofibers;
를 포함하는 인공양막의 제조방법을 제공한다.It provides a method of manufacturing artificial amniotic membrane comprising a.
상기 아세트산(acetic acid)은 5~30% 아세트산(acetic acid)이 바람직하고 10% 아세트산(acetic acid)이 보다 바람직하다.The acetic acid is preferably 5-30% acetic acid, more preferably 10% acetic acid.
상기 양막은 융모막 (chorion laeve membrane)이 붙어있으며, 태아를 보호하고 떠 받혀주기 위한 양수로 채워져 있는 태반을 구성하고 있는 가장 안쪽에 있는 투명하고 얇은 막이다. 양막은 콜라겐으로 이루어져있고, 각종 성장 인자 (growth factor) 즉, 표피세포 성장인자 (EGF, epidermal growth factor), 섬유아세포 성장인자 (FGF, fibroblast growth factor), 각질세포 성장인자 (KGF, keratinocyte growth factor), 신경 성장인자(nerve growth factor : NGF), 간장 성장인자(hepatic growth factor : HGF)등을 포함하고 있다. 이런 양막의 성분을 추출하는 방법으로는 보다 구체적으로,The amniotic membrane is the innermost transparent and thin membrane attached to the chorion laeve membrane and constitutes the placenta filled with amniotic fluid to protect and support the fetus. The amnion is composed of collagen, and various growth factors such as epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF) and keratinocyte growth factor (KGF) ), Nerve growth factor (NGF), hepatic growth factor (hepatic growth factor (HGF), etc. are included. More specifically, the method of extracting the components of the amniotic membrane,
(ㄱ) 양막에 용매인 5~30% 아세트산 및 3-머캅토프로피온산을 가하고 초음파 처리하는 단계;(A) adding sonication 5-30% acetic acid and 3-mercaptopropionic acid to the amnion and sonicating;
(ㄴ) 초음파 처리 후 원심분리시켜 상등액을 얻는 단계;(B) centrifugation after sonication to obtain a supernatant;
(ㄷ) 상기 상등액에서 용매를 제거하고 동결 건조시키는 단계;(C) removing the solvent from the supernatant and freeze drying;
를 포함하는 것이 바람직하다.It is preferable to include.
본 발명의 일실시예에서는 상기 초음파 처리를 통하여 양막을 가용화 시킬 수 있다. 또한 10% 아세트산 (acetic acid) 및 3-머캅토프로피온 산 (3-mercaptopropionic acid)을 용매로 사용함으로서 양막의 가용화의 효율을 높일 수 있고, 양막의 주요 성분을 최대한 손상 없이 추출할 수 있게 된다. In an embodiment of the present invention, the amnion may be solubilized through the ultrasonication. In addition, by using 10% acetic acid (acetic acid) and 3-mercaptopropionic acid (3-mercaptopropionic acid) as a solvent, it is possible to increase the efficiency of solubilization of the amniotic membrane and to extract the main components of the amnion without damaging as much as possible.
상기 원심분리는 5000~9000rpm 10~50분으로 하는 것이 바람직하다. 원심분리 후 침전물은 버리고 얻은 상등액을 1~3일 동안 투석 시켜 3-mercaptopropionic acid 및 10% acetic acid를 제거할 수 있고 , 동결건조기 (Freeze Dryer)를 이용하여 동결 건조시켜 스폰지로 만드는 것이 바람직하다. The centrifugation is preferably set to 5000 ~ 9000 rpm 10 ~ 50 minutes. After centrifugation, the precipitate is discarded and the obtained supernatant is dialyzed for 1-3 days to remove 3-mercaptopropionic acid and 10% acetic acid, and it is preferable to freeze-dry with a freeze dryer to make a sponge.
또한 본 발명의 일실시예에서는 상기 양막의 성분 추출방법에 의해서 추출된 양막 성분 추출물을 콜라겐 (collagen)과 같이 용매에 녹일 수 있다. 콜라겐 (collagen)은 동물의 뼈, 연골, 껍질, 피부, 혈관 벽, 신장의 사구체, 물고기의 허물 껍질, 비늘, 해파리, 불가사리, 극피동물인 해삼 등의 동물과 수산생물에 까지 넓게 함유된 자연원 소재이다. 이러한 콜라겐은 물, 묽은 산, 묽은 알카리에 녹지 않으며 끓이면 젤라틴(Gelatine)이 되어 용해되는 등 복잡한 섬유상 구조로서 2개의 폴리펩티드 사슬이 감겨 수소결합으로 결합된 구조로 구성되어 있는 경단백질(scleroprotein), 교원질(膠原質, gelatinoid)로서 얻어진다. 콜라겐은 단세포동물에서는 만들어지지 않고 다세포동물에서 만들어지지만 생체 조직에서의 단백질의 분리로서 유기용매 추출, 산, 알카리 처리 후 트립신(trypsin), 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 작용시켜 불용성 상태로 콜라겐(collagen)을 얻는다. 콜라겐은 피부의 윤기, 탄력 및 조직 구성의 주요성분으로 골다공증과 주름살 제거 등 노화를 방지하며, 지혈작용 및 항체 작용 등 체내 중요한 작용과 구성을 이루고 있다. 또한, 콜라겐은 본 발명의 일실시예에서 세포와 세포를 연결하는 고리, 접착제 같은 역할, 몸과 장기의 구조재로서 세포기능의 활성화 및 세포 증식작용, 지혈작용과 마크로파지와 림프구의 힘을 강하게 하여 면역작용을 발휘하는 역할을 할 수 있다. In addition, in one embodiment of the present invention, the amniotic component extract extracted by the component extraction method of the amnion may be dissolved in a solvent, such as collagen. Collagen is a natural source of animal bones, cartilage, shells, skin, walls of blood vessels, glomeruli of kidneys, slough shells of fish, scales, jellyfish, starfish, sea cucumbers, etc. It is material. This collagen is a complex fibrous structure that is insoluble in water, dilute acid, and dilute alkali, and dissolves when boiled to become gelatin (Gelatine). It is obtained as gelatinoid. Collagen is not made in unicellular animals but is made in multicellular animals, but it is separated from protein in living tissues. After collagen extraction, acid and alkali treatment, trypsin and hyaluronidase are applied to collagen in insoluble state. collagen). Collagen is the main component of skin's luster, elasticity and tissue composition. It prevents aging, such as osteoporosis and wrinkle removal, and has important functions and compositions in the body such as hemostasis and antibody. In addition, collagen in the embodiment of the present invention, the role of connecting the cells to the cell, the adhesive-like role, the activation of cell function and cell proliferation as a structural material of the body and organs, hemostatic action and the strength of the macrophage and lymphocytes immunity It can play a role.
상기 양막 성분 추출물 및 콜라겐 (collagen)을 같이 용해시킬 용매로는 이에 제한되지 않으나, 1,1,1,3,3,3-헥사플로로-2-프로판올(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, HFP) 또는 5~15mM 염산 (HCL)인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 10mM 염산을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
The solvent to dissolve the amnion component extract and collagen (collagen) together, but is not limited thereto, 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (1,1,1,3,3 , 3-hexafluoro-2-propanol, HFP) or 5-15 mM hydrochloric acid (HCL). More preferably 10 mM hydrochloric acid.
또한 본 발명의 일실시예에서는 폴리우레탄 (polyurethane, PU)을 용매에 녹일 수 있다. 폴리우레탄 (polyurethane, PU)은 생체적합성이 뛰어나 일찍이 인공심장 밸브, 소구경 인공혈관, 각종 생체이식제의 코팅 재료로서 자주 이용 되어 왔다. 이러한 폴리우레탄을 전기 방사하여 나노부직포로 만들어 창상이나 화상부위에 사용할 경우 다공 특성으로 인하여 수분증발과 산소교환이 용이하게 이루어지며 세포를 재생시키고 2차 감염을 방지하므로 상처피복재로 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 일실시예에서는 양막 성분 추출물 및 콜라겐이 용해된 용액 및 폴리우레탄이 용해된 용액을 공 방사 시키는 것이다. In addition, in one embodiment of the present invention, polyurethane (polyurethane, PU) may be dissolved in a solvent. Polyurethane (PU) has been frequently used as a coating material for artificial heart valves, small caliber artificial blood vessels, and various biografts because of its excellent biocompatibility. When the polyurethane is electrospun and made into a non-woven fabric for use on wounds or burns, moisture evaporation and oxygen exchange can be easily performed due to its porous properties, and can be used as a wound coating material because it regenerates cells and prevents secondary infection. Therefore, in one embodiment of the present invention is to co-spin the solution in which the amniotic membrane component extract and collagen is dissolved and the solution in which the polyurethane is dissolved.
상기 폴리우레탄을 용해시키는 용매로는 이에 제한되지 않으나, N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide, DMF) 및 테트라히드로푸란 (tetrahydrofuran, THF)인 것이 바람직하다. 상기 DMF 및 THF의 비율은 이에 제한되지 않으나 1:1 인 것이 바람직하다.The solvent for dissolving the polyurethane is not limited thereto, but is preferably N, N-dimethylformamide (NMF) and tetrahydrofuran (THF). The ratio of the DMF and THF is not limited thereto, but preferably 1: 1.
상기 양막 성분 추출물 및 콜라겐 (collagen)을 같이 용해된 용액과 폴리우레탄 (polyurethane, PU)이 용해된 용액의 공 방사는 이 분야에서 공지된 방법에 따라 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로 양막 성분 추출물 및 콜라겐이 용해된 용액은 위쪽에서 syringe speed 0.2~1.0ml/h, needle size 20~25G, 전압 10~20Kv, 폴리우레탄이 용해된 용액은 뒤쪽에서 syringe speed 0.5~3ml/h, needle size 10~30G, 전압 10~30Kv로 공 방사 하는 것이 바람직하다.Co-spinning of the solution in which the amniotic membrane component extract and collagen are dissolved together with the solution in which polyurethane (polyurethane, PU) is dissolved may be performed according to a method known in the art. More specifically, the amnion component extract and the collagen-dissolved solution in the upper syringe speed 0.2 ~ 1.0ml / h, needle size 20 ~ 25G, voltage 10 ~ 20Kv, polyurethane dissolved solution in the syringe speed 0.5 ~ 3ml / h, needle size 10 ~ 30G, voltage 10 ~ 30Kv it is preferable to radiate.
상기와 같이 공 방사하여 제조된 나노 섬유는 직경이 260내지 320㎛가 될 수 있다.The nanofibers manufactured by co-spinning as described above may have a diameter of 260 to 320 μm.
일반적으로 나노 섬유는 부피 대비 표면적 비율이 높고, 표면 작용기에 대한 유연성 등이 뛰어나기 때문에 많은 응용 분야에서 사용되고 있다. 특히 생체 조직과 흡사하게 만든 인공 단백질로 나노 섬유를 만들어서 사용할 경우 바로 몸속으로 흡수되는 붕대나 인조 피부로 이용된다.In general, nanofibers are used in many applications because of their high surface area to volume ratio and excellent flexibility to surface functional groups. In particular, if artificial fibers are made of artificial proteins that are similar to biological tissues, they are used as bandages or artificial skins that are absorbed into the body.
상기 나노 섬유를 제조하는 방법에는 드로잉(drawing), 템프레이트 합성(template synthesis), 상 분리(phaseseparation), 자기 조합(self assembly), 전기 방사(electrospinning) 등이 있다.Methods of manufacturing the nanofibers include drawing, template synthesis, phase separation, self assembly, electrospinning, and the like.
특히, 상기 나노 섬유 제조 방법 중 다양한 고분자로부터 나노 섬유를 연속적으로 대량으로 생산할 수 있는 방법으로, 본 발명의 일실시예에서는 전기방사 방법을 사용하였다.In particular, as a method capable of continuously producing a large amount of nanofibers from a variety of polymers of the nanofiber manufacturing method, in one embodiment of the present invention used an electrospinning method.
상기 전기 방사 방법은 전극의 한극을 고분자의 용액 내에, 다른 한극을 수집기(collector)에 위치한 서로 반대 극성을 가지는 두 전극 사이에 고전압을 인가함으로써 노즐을 통해 액체 분사물(jet)이 방출되도록 하여 방출된 용액이 수집기 표면에 섬유사 형태로 직접 방사되도록 하는 것이다.In the electrospinning method, a liquid jet is discharged through a nozzle by applying a high voltage between one electrode of an electrode in a polymer solution and another electrode between two electrodes having opposite polarities positioned at a collector. The resulting solution is to be spun directly in the form of fibres on the surface of the collector.
이때, 상기 전기 방사 방법으로 제조된 나노 섬유는 고분자 용액의 성질, 분자쇄 구조, 점도, 탄성, 전도성, 극성 및 표면 장력 등의 재료상의 요소와 전기장의 세기, 전극 사이의 거리, 고분자 용액의 공급 속도 등의 기계적 요소에 큰 영향을 받을 수 있다.
At this time, the nanofibers produced by the electrospinning method are the material properties, molecular chain structure, viscosity, elasticity, conductivity, polarity and surface tension of the polymer solution and the strength of the electric field, the distance between the electrode, supply of the polymer solution It can be greatly affected by mechanical factors such as speed.
또한 본 발명의 일실시예에서는 양막 성분, 콜라겐, 폴리우레탄이 함유된 나노섬유 인공양막을 제공한다. 인공양막은 상기 제조 방법으로 제조된 것을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 나노섬유 인공양막은 양막 성분, 콜라겐, 폴리우레탄의 특성을 모두 함유하고, 전기방사의 장점으로 부피에 대한 표면적이 넓은 점을 가진 인공양막일 수 있다. In addition, an embodiment of the present invention provides a nanofiber artificial amnion containing amnion components, collagen, polyurethane. Artificial amniotic membrane may further include those prepared by the above manufacturing method. The nanofiber artificial amniotic membrane of the present invention contains all of the properties of the amniotic membrane component, collagen, and polyurethane, and may be an artificial amniotic membrane having a wide surface area with respect to volume as an advantage of electrospinning.
본 발명의 인공양막은 도 3과 같이 연신율 (Elongation percentage)이 우수했으며, 세포의 증식에 독성이 없는 것을 알 수 있다(도 4 및 도 5 참조). 상기와 같은 점을 이용하여 화상이나 상처치료제로서 활용이 가능하다.
The artificial amniotic membrane of the present invention was excellent in elongation percentage (Elongation percentage), as shown in Figure 3, it can be seen that there is no toxicity in the proliferation of cells (see Figure 4 and 5). It can be utilized as a burn or wound treatment using the above points.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples. The following examples are only illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereby.
<< 실시예Example >>
1. 재료1. Material
양막 (amnion membrane, AM(bioland, korea)), 아세트산 (acetic acid(samchun)), 3-머캅토프로피온 산 (3-mercaptopropionic acid(aldrich)), 반투막 (Dialysis tubing(sigma)), 폴리우레탄 (polyurethane, PU), 콜라겐 (collagen, coll, bioland), 테트라히드로푸란 (tetrahydrofuran, THF), 1,1,1,3,3,3-헥사플로로-2-프로판올 (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, HFP), N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide, DMF)를 준비 하였다.
Amnion membrane (AM (bioland, Korea)), acetic acid (acetic acid (samchun)), 3-mercaptopropionic acid (aldrich), semipermeable membrane (Dialysis tubing (sigma)), polyurethane ( polyurethane, PU), collagen (collagen, coll, bioland), tetrahydrofuran (THF), 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (1,1,1,3 , 3,3-hexafluoro-2-propanol, HFP) and N, N-dimethylformamide (N, N-dimethylformamide, DMF) were prepared.
2. 실험 방법2. Experimental method
양막의 Amniotic 가용화Solubilization 및 양막의 성분 추출 And extraction of components of the amniotic membrane
양막을 10% 아세트산 (acetic acid) 1.25mol/L로 3-머캅토프로피온 산(3-mercaptopropionic acid) ice에 3% (w/v, g/ml)로 초음파 (sonication(power:50%)) 처리하여 가용화 시켰다. 그 후 7000rpm 30분으로 원심분리 시키고 상등액을 2일 동안 투석 시켜 3-mercaptopropionic acid 및 10% acetic acid를 제거했으며, 동결건조기 (Freeze Dryer)를 이용하여 동결 건조시켜 스폰지로 만들었다.
Amnion was sonicated at 3% (w / v, g / ml) on 3-mercaptopropionic acid ice at 1.25 mol / L with 10% acetic acid (sonication (power: 50%)). Treated and solubilized. After centrifugation at 7000rpm for 30 minutes, the supernatant was dialyzed for 2 days to remove 3-mercaptopropionic acid and 10% acetic acid, and freeze-dried using a freeze dryer to make a sponge.
전기 방사 (Electrospinning ( ElectrospinningElectrospinning ))
양막 성분과 콜라겐을 HFP에 7:1의 비율로 8% (w/v, g/ml)가 되도록 하고, PU (8wt%)는 DMF 와 THF (1:1비율)에 8% (w/v, g/ml)가 되게 용해시켰다. 전기 방사를 이용하여 양막 성분과 콜라겐은 위쪽에서 (syringe speed : 0.4ml/h, needle size : 22G, 15Kv)방사하고 PU는 뒤쪽에서 공 방사 하였다 (1ml/h, needle size : 18G, 15Kv).
Amnion components and collagen were added to HFP at a ratio of 7: 1 at 8% (w / v, g / ml), and PU (8wt%) at 8% (w / v) at DMF and THF (1: 1 ratio). , g / ml). Using electrospinning, amnion components and collagen were spun from the top (syringe speed: 0.4ml / h, needle size: 22G, 15Kv) and PU was spun from the back (1ml / h, needle size: 18G, 15Kv).
세포의 증식 및 부착 실험Cell proliferation and adhesion experiment
PU, PU/coll, PU/coll/AM 세가지 샘플을 직경이 13mm되게 자른 다음 24웰 플레이트 (plate well)에 고정시키고 NIH 3T3 fibroblast를 4.2 X 104/ml 씩 플레이트에 1ml씩 배양 하여 주었다. 37°C, 5% CO2에서 배양한 후에 1일 3일 7일 간격으로 MTT assay를 이용하여 세포의 증식을 알아보았다. 또한 crystal violet 염색을 이용하여 부직포에 부착되어 있는 세포를 확인해 보았다.
Three samples of PU, PU / coll, and PU / coll / AM were cut to a diameter of 13 mm, fixed in a 24-well plate, and NIH 3T3 fibroblasts were incubated in a plate of 4.2 × 10 4 / ml at 1 ml. After culturing at 37 ° C and 5% CO2, the proliferation of cells was examined using MTT assay at an interval of 3 days and 7 days a day. Also, crystal violet staining was used to identify the cells attached to the nonwoven fabric.
3. 실험 결과3. Experimental Results
인공양막Artificial amnion
도 1을 보면, PU (초록색 화살표 : 약간의 브리지를 형성하고 있음) 사이에 coll/AM (노란색 : PU에 비해 곧은 섬유 모양)이 사이사이에 들어가 있음을 볼 수 있다.1, it can be seen that coll / AM (yellow: straight fiber shape compared to PU) is interposed between PUs (green arrows: forming some bridges).
기계적 성질 ( mechanical property ) Mechanical properties (mechanical property )
동결 건조된 양막과 전기방사를 통하여 재구성된 양막의 기계적 성질 (mechanical property)을 비교하여 보면, 인장강도 (UTS, ultimate tensile strength) 값은 동결 건조된 양막과 전기방사를 통하여 재구성된 양막은 비슷하였다(도 2참조).When comparing the mechanical properties of the reconstituted amniotic membrane with the lyophilized amniotic membrane, the ultimate tensile strength (UTS) values were similar to those of the lyophilized amniotic membrane and the reconstituted amniotic membrane. (See Figure 2).
연신율 (Elongation percentage)의 경우 재구성된 양막에서 elongation at breaks이 더욱 좋은 것을 알 수 있었다(도 3참조).
In the case of elongation percentage, elongation at breaks was better in the reconstituted amniotic membrane (see FIG. 3).
세포의 증식 및 부착 실험결과Experimental results of cell proliferation and adhesion
세포의 증식의 경우 시간이 경과할수록 PU와 PU/coll, PU/coll/AM의 차이가 나는 것을 확인 할 수 있었다. PU/coll/AM에서 세포수가 줄어들지 않고 증식하는 것으로 보아 부직포로 만든 AM (양막)이 세포의 증식에 독성이 없는 것을 알 수 있다(도 4참조).In the case of cell proliferation, the difference between PU and PU / coll and PU / coll / AM was confirmed as time passed. It can be seen that AM (amniotic membrane) made of nonwoven fabric is not toxic to the proliferation of cells because it can be seen that the cell number is not reduced in PU / coll / AM (see FIG. 4).
PU와 PU/coll, PU/coll/AM의 표면에 세포의 부착의 경우 도 5에서 보라색점이 세포를 나타내는데, PU보다 PU/coll, PU/coll/AM에서 세포가 훨씬 더 많이 부착되는 것을 관찰할 수 있었다. AM이 세포의 부착에 독성이 없는 것으로 보인다.
In the case of attachment of cells to the surface of PU, PU / coll, and PU / coll / AM, the purple dots indicate cells in FIG. 5, and the adhesion of the cells to PU / coll and PU / coll / AM is much higher than that of PU. Could. AM does not appear to be toxic to cell attachment.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Although embodiments of the present invention have been described above with reference to the accompanying drawings, those skilled in the art to which the present invention pertains may be embodied in other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. I can understand that. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.
Claims (10)
(b) 상기 추출된 양막의 성분을 콜라겐과 같이 1,1,1,3,3,3-헥사플로로-2-프로판올(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, HFP)에 용해시키는 단계;
(c) 폴리우레탄을 N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide, DMF) 및 테트라히드로푸란 (tetrahydrofuran, THF)의 혼합용매에 용해시키는 단계;
(d) 상기 (b)단계의 용액과 (c)단계의 용액을 공 방사 (co-spinning)하여 나노섬유를 제조하는 단계; 를 포함하는 인공양막의 제조방법.
(a) The amniotic membrane is irradiated with ultrasonic waves in the presence of 5-30% acetic acid aqueous solution and 3-mercaptopropionic acid, and thus EGF (epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor), KGF (keratinocyte growth factor) and NGF (nerve growth factor) Extracting a component of the amnion comprising one or more growth factors selected from the group consisting of HGF (hepatic growth factor);
(b) 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol), such as collagen , HFP);
(c) dissolving the polyurethane in a mixed solvent of N, N-dimethylformamide (NMF) and tetrahydrofuran (THF);
(d) co-spinning the solution of step (b) and the solution of step (c) to produce nanofibers; Method of manufacturing artificial amniotic membrane comprising a.
상기 (a) 단계의 양막의 성분 추출은
(ㄱ) 양막에 용매인 5~30% 아세트산 수용액 및 3-머캅토프로피온산을 가하고 초음파 처리하는 단계;
(ㄴ) 초음파 처리 후 원심분리시켜 상등액을 얻는 단계;
(ㄷ) 상기 상등액에서 아세트산 수용액 및 3-머캅토프로피온산을 제거하고 동결 건조시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 1,
Component extraction of the amniotic membrane of step (a)
(A) adding 5% to 30% acetic acid aqueous solution and 3-mercaptopropionic acid as a solvent to the amnion and sonicating;
(B) centrifugation after sonication to obtain a supernatant;
(C) removing the acetic acid solution and 3-mercaptopropionic acid from the supernatant and freeze drying;
≪ / RTI >
상기 (c) 단계에 있어서, N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide, DMF) 및 테트라히드로푸란 (tetrahydrofuran, THF)의 혼합비율은 1:1의 부피비인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1,
In the step (c), the mixing ratio of N, N-dimethylformamide (N, N-dimethylformamide, DMF) and tetrahydrofuran (THF) is characterized in that the volume ratio of 1: 1.
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