KR101169336B1 - Derivative of CD9-specific human antibody - Google Patents
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Abstract
본 발명은 CD9-특이적인 인간항체 유래의 유도체에 관한 것으로, 구체적으로 CD9-특이적인 인간항체인 10E4를 유전자 조작하여 제작한, 서열번호 15로 기재되는 항-CD9 2가 scFv 및 인간 항체의 Fc가 순차적으로 연결된, 항-CD9 2가 항체 단쇄가 다이설파이드 결합에 의해 연결된 항-CD9 4가 항체에 관한 것이다. 상기 항-CD9 4가 항체는 10E4 IgG에 비해 CD9에 약 6배 높은 결합친화력을 보이고 CD9을 과발현하고 있는 암세포에 특이적으로 결합하므로, 생체 내 진단 및 in vivo 영상화용 항체로 유용하게 이용할 수 있다.The present invention relates to derivatives derived from CD9-specific human antibodies, specifically the anti-CD9 bivalent scFv described in SEQ ID NO: 15 produced by genetic engineering of CD9-specific human antibody 10E4 and Fc of a human antibody. The anti-CD9 bivalent antibody, in which is linked sequentially, relates to an anti-CD9 tetravalent antibody in which the single chain is linked by disulfide bonds. The anti-CD9 tetravalent antibody shows about 6 times higher binding affinity to CD9 than 10E4 IgG and specifically binds to cancer cells overexpressing CD9, and thus may be useful as an antibody for in vivo diagnosis and in vivo imaging. .
CD9, 항-CD9 4가 항체, 생체 내 진단, 생체내 영상화 CD9, anti-CD9 tetravalent antibody, in vivo diagnostics, in vivo imaging
Description
본 발명은 CD9-특이적인 인간항체 유래의 유도체에 관한 것이다.The present invention relates to derivatives derived from CD9-specific human antibodies.
CD9은 테트라스파닌계(tetraspanin family)의 멤버에 속하는 약 24~27 kD의 세포표면 당단백질 수용체로서, 세포 발달, 활성, 성장 및 운동성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 신호전달 작용(signal transduction events)을 조절한다고 알려져 있다. 또한, 세포 부착(Anton ES et al., J. Neurosci. 15:584-595, 1995) 및 세포 이동(Klein-Soyer C et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20:360-369, 2000)을 조절할 수 있고, 혈소판-유발 내피세포 증식(platelet-induced endothelial cell proliferation)에 관여(Masellis Smith A & Shaw AR J. Immunol. 152:2768-2777, 1994)하는 혈소판활성화(platelet activation)와 집성(aggregation)을 유도(trigger)한다. 아울러, 근육세포 융합(muscle cell fusion)을 촉진하고 근관 유지(myotube maintenance)에 기여하는 등, 세포 내의 다 양한 현상에 관여하는 것으로 알려져 있다. CD9 is a cell surface glycoprotein receptor of about 24 to 27 kD belonging to the members of the tetraspanin family and is responsible for signaling transduction events that play an important role in regulating cell development, activity, growth and motility. It is known to regulate. It also regulates cell adhesion (Anton ES et al ., J. Neurosci . 15: 584-595, 1995) and cell migration (Klein-Soyer C et al ., Arterioscler Thromb Vasc Biol . 20: 360-369, 2000). Platelet activation and aggregation, which may be involved in platelet-induced endothelial cell proliferation (Masellis Smith A & Shaw AR J. Immunol . 152: 2768-2777, 1994). Trigger In addition, it is known to be involved in various phenomena in cells, such as promoting muscle cell fusion and contributing to myotube maintenance.
CD9 등의 테트라스파닌 계열은 4개의 막통과 부위(trans-membrane segments)를 가지고, 막의 세포내 부위(intracellular side)에 N-과 C-말단이 둘 다 놓여져 있다. 이러한 정렬 모델(alignment model)은 각기 첫 번째와 두 번째, 및 세 번째와 네 번째 막통과 부위(trans-membrane segment) 사이에 두 개의 세포외 고리(extracellular loop; ECL)가 돌출되어 있다. 따라서 테트라스파닌은 다양한 세포내 과정들과 연관되어 있으며, 그들의 다양한 기능들은 분자적 촉진자(molecular facilitators)로서 작용 가능한 그들의 능력과 관련되어 있을 것으로 시사된다. 또한, 일부의 인테그린(integrin) 뿐 아니라 CD81 및 CD63과 같은 동일한 테트라스파닌 계열의 분자들을 비롯한, 수많은 파트너 도메인들과 연관되어 상호작용하는 것으로 알려져 '테트라스파닌 웹(Tetraspanin web)'으로 불리기도 한다(Radford KJ et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 222:13-18, 1996; Le Naour F et al., Mol. Cell. Proteomics 5:845-857, 2006).The tetraspanin family such as CD9 has four trans-membrane segments, and both N- and C-terminus are placed on the intracellular side of the membrane. This alignment model has two extracellular loops (ECL) protruding between the first and second, and the third and fourth trans-membrane segments, respectively. Thus, tetraspanin is involved in a variety of intracellular processes, and their various functions are suggested to be related to their ability to act as molecular facilitators. It is also known as the 'Tetraspanin web', which is known to interact with numerous partner domains, including some integrins as well as the same tetraspanine family of molecules such as CD81 and CD63. (Radford KJ et al ., Biochem. Biophys. Res. Comm . 222: 13-18, 1996; Le Naour F et al ., Mol. Cell. Proteomics 5: 845-857, 2006).
CD9의 두 번째 세포외 고리(EC2 또는 LEL)가 세포 부착에 중요하다는 보고가 있고(George A et al., Blood 100:4502-4511, 2002), 테트라스파닌 계열의 다른 분자들은 EC2 도메인이 글리코실화(Glycosylate)되어 있는 반면에, CD9은 ECL1 도메인이 글리코실화되어 있고, CD9의 EC2가 DT(Diphteria Toxin)에 대한 DTR의 활성을 증가시키는데 중요하다는 보고가 있다(Hidetoshi H et al., 289:782-790, 2001). 상기 보고 외에도 많은 연구자가 CD9의 EC2 도메인의 기능에 관심을 기울여 오고 있으나 아직까지 그 기능이 확실하게 밝혀지진 않고 있다.The second extracellular ring of CD9 (EC2 or LEL) has been reported to be important for cell attachment (George A et al ., Blood 100: 4502-4511, 2002), and other molecules of the tetraspanin family are glyco with the EC2 domain. While glycosylated, CD9 is glycosylated in the ECL1 domain, and it has been reported that EC2 of CD9 is important for increasing the activity of DTR against Diphteria Toxin (DT) (Hidetoshi H et al ., 289: 782-790, 2001). In addition to the above report, many researchers have been interested in the function of the EC2 domain of CD9, but its function is not yet clear.
CD9은 암과 관련하여 운동성-관련 항원(motility-related antigen, MRP-1)이라고 불리기도 하며, 세포 운동성(cell motility) 및 종양 전이(tumor metastasis)와 관련된다고 보고되고 있는데(Miyake M & Hakomori S, Biochemistry 30:3328-3334, 1991), 암에서 CD9의 역할은 암의 종류에 따라 상반되는 결과를 보여 다소 논란이 있다. 예를 들어, 대장암(Mori M et al., Clin. Cancer Res. 4:1507-1510, 1998), 유방암(Miyake M et al., Cancer Res. 55:4127-4131, 1995), 폐암(Higachiyama M et al., Cancer Res. 55:6040-6044, 1995; Funakoshi T et al., Oncogene 22:674-687, 2003) 및 췌장암(Sho M et al., Int. J. Cancer 79:509-516, 1998) 환자들에서 CD9의 발현이 감소하였으며, 이는 침윤(invasion), 전이(metastasis) 및 환자의 나쁜 예후와 관련된다고 보고되었다. 그러나 머리 및 목 등의 편평상피세포암(Erovic BM et al., Head Neck 25:848-857, 2003) 및 위암(Hori H et al., J. Surg. Res. 117:208-215, 2004)에서는 암의 진행 정도가 높을수록 CD9 발현이 증가한다고 보고되었다. 이러한 상반되는 CD9에 대한 보고를 통해, CD9이 조직-특이적(tissue-specific)인 특성을 나타내는 것으로 추정된다.CD9, also called motility-related antigen (MRP-1) in connection with cancer, has been reported to be associated with cell motility and tumor metastasis (Miyake M & Hakomori S). , Biochemistry 30: 3328-3334, 1991). The role of CD9 in cancer has been somewhat controversial, with contradictory results depending on the type of cancer. For example, colorectal cancer (Mori M et al ., Clin. Cancer Res . 4: 1507-1510, 1998), breast cancer (Miyake M et al ., Cancer Res . 55: 4127-4131, 1995), lung cancer (Higachiyama M et al ., Cancer Res . 55: 6040-6044, 1995; Funakoshi T et al ., Oncogene 22: 674-687, 2003) and pancreatic cancer (Sho M et al ., Int. J. Cancer 79: 509-516 , 1998) CD9 expression has been reduced in patients, which has been reported to be associated with invasion, metastasis and poor prognosis of patients. However, squamous cell carcinoma of the head and neck (Erovic BM et al ., Head Neck 25: 848-857, 2003) and gastric cancer (Hori H et al ., J. Surg. Res . 117: 208-215, 2004) It was reported that as the cancer progresses, CD9 expression increases. Reporting of these conflicting CD9s suggests that CD9 exhibits tissue-specific properties.
난소암에서의 CD9의 기능에 관한 연구는 전혀 보고된 바 없으나, 난소암에서의 CD9 발현에 대해 마이크로어레이(Microarray) 또는 면역조직화학법(immunohistochemistry)을 통해 보고되었고(Drapkin R et al., Hum Pathol. 35:1014-1021, 2004; Peters DG et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 14:1717-1723, 2005; Houle, C. D., et al., Gynecol Oncol 86:69-78, 2002), 결과가 상반되고 있다. 그러나 많은 난소암 환자들의 조직 결과에서 나쁜 예후와 CD9 과발현의 상관관계가 높은 점에 착안하여, 본 발명자들은 난소암 특이적인 타겟으로서의 CD9의 가능성과 진단 및 치료제로서 사용 가능한 CD9 특이적인 중화능을 가진 인간항체의 필요성에 따라 CD9의 두 번째 EC2 도메인을 항원으로 이에 대한 중화능을 가진 인간항체를 제조한 바 있다.No studies on the function of CD9 in ovarian cancer have been reported, but have been reported through microarray or immunohistochemistry for CD9 expression in ovarian cancer (Drapkin R et al ., Hum Pathol . 35: 1014-1021, 2004; Peters DG et al ., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev . 14: 1717-1723, 2005; Houle, CD, et al ., Gynecol Oncol 86: 69-78, 2002). It is contradictory. However, in view of the high correlation between the poor prognosis and CD9 overexpression in the tissue outcomes of many ovarian cancer patients, the present inventors have shown the possibility of CD9 as an ovarian cancer specific target and the CD9 specific neutralizing ability to be used as a diagnostic and therapeutic agent. According to the needs of human antibodies, a human antibody having a neutralizing ability against the second EC2 domain of CD9 was prepared.
이에, 본 발명자들은 이전에 제조한 CD9-특이적인 인간항체 10E4를 생체내 진단 및 in vivo 영상화에 사용하기 위해, CD9에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv 형태를 유전공학적으로 조작하여 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 결합되어 4가 형태(tetra form)로 제조하였고, 상기 방법으로 제조된 항-CD9 4가 항체가 전체(whole) 10E4 IgG에 비해 약 6배 높은 결합친화력을 보이며, CD9을 과발현하고 있는 암세포에 특이적으로 결합하고 또한 생체내에서 약 2주의 반감기를 가지는 전체 IgG에 비해 3-4일의 비교적 짧은 반감기를 지니는 장점을 가짐으로써, 생체내 진단 및 in vivo 영상화용 항체로 유용하게 사용될 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have genetically engineered a scFv form of an antibody that specifically binds CD9 to disulfide bonds for use in vivo diagnosis and in vivo imaging of previously prepared CD9-specific human antibody 10E4. bound to the tetravalent form, and the anti-CD9 tetravalent antibody prepared by the above method showed about 6 times higher binding affinity than whole 10E4 IgG and overexpressed CD9. It has the advantage of having a relatively short half-life of 3-4 days compared to total IgG which specifically binds to cancer cells and which has a half-life of about 2 weeks in vivo, and thus can be usefully used as an antibody for diagnosis and in vivo imaging. The present invention was completed by confirming that it can be done.
본 발명의 목적은 CD9-특이적인 인간항체의 유도체를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide derivatives of CD9-specific human antibodies.
본 발명의 다른 목적은 상기 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the derivative and an expression vector comprising the same.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a transformant prepared by introducing the expression vector into a host cell.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 CD9-특이적인 인간항체의 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method of producing a derivative of a CD9-specific human antibody by culturing the transformant.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 유도체의 진단적 유효량을 포함하는 CD9이 과발현되는 암질환의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for detecting cancer diseases in which CD9 is overexpressed, which comprises a diagnostically effective amount of a derivative of the human antibody.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 CD9이 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for immunodetection of cancer in which CD9 is overexpressed in vitro, including contacting the detection composition with cancer cells.
본 발명의 다른 목적은 상기 암의 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 생체내 CD9이 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for imaging cancer in which CD9 is overexpressed in vivo, comprising administering to the subject a diagnostically effective amount of the composition for detecting cancer.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용하는 CD9이 과발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for in vivo treatment of cancer in which CD9 is overexpressed using the composition for detection.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용하는 CD9이 과발현되는 암 치료의 예후 평가 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for evaluating the prognosis of cancer treatment in which CD9 is overexpressed using the detection composition.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 유도체를 포함하는, CD9이 과발현되는 암질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer diseases in which CD9 is overexpressed, including the derivative of the human antibody.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 유도체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 CD9이 과발현되는 암질환의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of radioimmunity of cancer diseases in which CD9 is overexpressed, including the derivative of the human antibody and the therapeutic radioisotope.
본 발명의 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 상기 인간 항체의 유도체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 CD9이 과발현되는 암질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a cancer disease in which CD9 is overexpressed, comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a derivative of the human antibody.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 15로 기재되는 항-CD9 2 가 scFv 및 인간 항체의 Fc가 순차적으로 연결된, 항-CD9 2가 항체 단쇄가 다이설파이드 결합에 의해 연결된 항-CD9 4가 항체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides the anti-CD9 bivalent scFv and the anti-CD9 bivalent antibody single chain is connected by disulfide bond, the sequential linkage of the Fc of the human antibody described in SEQ ID NO: 15 Provides antibodies.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 15로 기재되는 항-CD9 2가 scFv 및 인간 항체의 Fc가 순차적으로 연결된 항-CD9 2가 항체 단쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a polynucleotide encoding the anti-CD9 bivalent antibody single chain of the anti-CD9 bivalent scFv and the Fc of the human antibody in sequence described in SEQ ID NO: 15, and the expression vector comprising the polynucleotide to provide.
또한, 본 발명은 상기 항-CD9 2가 항체 단쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.The present invention also provides a transformant prepared by introducing an expression vector comprising a polynucleotide encoding the anti-CD9 bivalent antibody single chain into a host cell.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 1) culturing the transformant; And
2) 상기 배양액으로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는 항-CD9 4가 항체의 제조방법을 제공한다.2) It provides a method for producing an anti-CD9 tetravalent antibody comprising the step of purifying the antibody from the culture.
또한, 본 발명은 상기 항-CD9 4가 항체의 진단적 유효량을 포함하는 CD9이 과발현되는 암질환의 검출용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for detecting cancer diseases in which CD9 is overexpressed comprising a diagnostically effective amount of the anti-CD9 tetravalent antibody.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 CD9이 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for immunodetection of cancer in which CD9 is overexpressed in vitro, including contacting the detection composition with cancer cells.
또한, 본 발명은 1) 상기 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계; 및,In addition, the present invention comprises the steps of 1) administering a diagnostically effective amount of the composition for detection to a subject; And,
2) 상기 개체에 대한 검출영상을 수득하는 단계를 포함하는 생체내 CD9이 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공한다.2) provides a method for imaging cancer in which CD9 is overexpressed in vivo, including obtaining a detection image of the subject.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 상기 검출용 조성물을 개체의 정맥내 투여하는 단계;1) administering the detecting composition intravenously;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계; 및,2) identifying tumor cells by detecting the composition of step 1); And,
3) 단계 2)에서 확인된 종양 세포를 수술적 절제에 의해 제거하는 단계를 포함하는 CD9이 과발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공한다.3) A method of in vivo treatment of a cancer in which CD9 is overexpressed, comprising the step of removing the tumor cells identified in step 2) by surgical resection.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 상기 검출용 조성물을 종양 세포가 제거된 환자의 정맥내 투여하는 단계;1) administering the detection composition intravenously in a patient from which tumor cells have been removed;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계; 및,2) identifying tumor cells by detecting the composition of step 1); And,
3) 단계 2)에서 종양 세포가 검출되지 않으면, 종양 세포가 모두 제거된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 CD9이 과발현되는 암 치료 환자의 예후 평가 방법을 제공한다.3) If the tumor cells are not detected in step 2), it provides a method for assessing the prognosis of the cancer treatment patients overexpressed CD9, characterized in that it is determined that all the tumor cells have been removed.
또한, 본 발명은 상기 항-CD9 4가 항체를 포함하는, CD9이 과발현되는 암질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer diseases in which CD9 is overexpressed, comprising the anti-CD9 tetravalent antibody.
또한, 본 발명은 상기 항-CD9 4가 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 CD9이 과발현되는 암질환의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of radioimmunity of cancer diseases in which CD9 is overexpressed comprising the anti-CD9 tetravalent antibody and a therapeutic radioisotope.
아울러, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항-CD9 4가 항체를 CD9이 과발현되는 암질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 CD9이 과발현되는 암질환을 치료하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of treating a cancer disease in which CD9 is overexpressed, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the anti-CD9 tetravalent antibody to a subject having a cancer disease in which CD9 is overexpressed.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.Hereinafter, the term used by this invention is demonstrated.
"패닝(panning)"은 파아지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파아지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다."Panning" refers to the surface of a peptide that has a property of binding to a target molecule (antibody, enzyme, cell surface receptor, etc.) from a phage library that displays the peptide on the coat of the phage. The process of selecting only a phage.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 15로 기재되는 항-CD9 2가 scFv 및 인간 항체의 Fc가 순차적으로 연결된, 항-CD9 2가 항체 단쇄가 다이설파이드 결합에 의해 연결된 항-CD9 4가 항체를 제공한다.The present invention provides an anti-CD9 tetravalent antibody in which an anti-CD9 bivalent antibody single chain is linked by disulfide bonds, wherein the anti-CD9 bivalent scFv and the Fc of a human antibody are sequentially linked as described in SEQ ID NO: 15.
상기 항-CD9 2가 항체는 CD9에 특이적인 결합능을 보이는 항체 10E4의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv 분자(scFv)가 유전자 조작 기술에 의해 링커로 연결된 형태이다(도 2 참조). 이때, 상기 유전자 조작 기술을 용이하게 수행하기 위해, 상기 scFv의 385번째 염기가 점 돌연변이 될 수 있다(도 1 참조). 상기 항체는 전체(whole) 항체 형태로, 상기 전체 항체는 항-CD9 2가 항체 및 Fc로 구성된 단쇄의 Fc 영역이 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. The anti-CD9 bivalent antibody is a form in which a single-chain Fv molecule (scFv) including a V H domain and a V L domain of antibody 10E4 showing specific binding ability to CD9 is linked by a linker by genetic engineering technique (see FIG. 2). ). At this time, in order to facilitate the genetic manipulation technique, the 385th base of the scFv may be point mutated (see FIG. 1). The antibody is in the form of a whole antibody, in which the Fc region of the single chain consisting of an anti-CD9 divalent antibody and an Fc is connected by disulfide bonds.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 파지 표출 기술(Phage Display Technology)을 이용하여 CD9에 특이적으로 결합하는 10E4 scFv를 스크리닝한 후, 이를 링커로 연결한 항-CD9 2가 scFv 및 인간 항체의 Fc가 순차적으로 연결된 단쇄 를 발현하는 벡터를 제조한 후(도 1 내지 도 3 참조), 상기 벡터가 형질도입된 세포로부터 항-CD9 2가 항체를 발현하였다(도 4 참조). 상기 발현된 항-CD9 2가 항체를 비환원 조건 및 환원 조건에서 전기영동하여 분석한 결과, 상기 항-CD9 2가 항체가 서로 결합하여 CD9 4가 항체를 이루는 것을 확인하였다(도 5 참조).In a specific embodiment of the present invention, after screening a 10E4 scFv that specifically binds CD9 using phage display technology, the anti-CD9 bivalent scFv and Fc of the human antibody linked to the linker After preparing a vector expressing sequentially linked single chains (see FIGS. 1 to 3), the anti-CD9 bivalent antibody was expressed from cells transduced with the vector (see FIG. 4). As a result of analyzing the expressed anti-CD9 bivalent antibody under non-reducing conditions and reducing conditions, it was confirmed that the anti-CD9 bivalent antibodies bind to each other to form a CD9 tetravalent antibody (see Fig. 5).
상기 방법으로 수득한 항-CD9 4가 항체는 10E4 IgG에 비해 약 6배 정도의 높은 친화력으로 항원인 CD9 단백질에 결합하였고(표 2 및 도 6 참조), CD9이 과발현된 난소암 세포주 2774의 표면에 10E4 IgG와 항-CD9 4가 항체가 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 7 및 도 8 참조). 이에, 항-CD9 4가 항체가 실제로 암 세포주 표면에 특이적이고 선별적으로 결합하므로 생체 진단 및 in vivo 영상화에 사용할 수 있을 것이다.The anti-CD9 tetravalent antibody obtained by the above method binds to the antigen CD9 protein with an affinity about 6 times higher than that of 10E4 IgG (see Table 2 and FIG. 6), and the surface of CD9 overexpressed ovarian cancer cell line 2774 It was confirmed that 10E4 IgG and anti-CD9 tetravalent antibody specifically bind to (see FIGS. 7 and 8). Thus, the anti-CD9 tetravalent antibody actually specific and selectively binds to the surface of cancer cell lines and thus may be used for biodiagnosis and in vivo imaging.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 15로 기재되는 항-CD9 2가 scFv 및 인간 항체의 Fc가 순차적으로 연결된 항-CD9 2가 항체 단쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a polynucleotide encoding the anti-CD9 bivalent antibody single chain of the anti-CD9 bivalent scFv and the Fc of the human antibody in sequence described in SEQ ID NO: 15, and the expression vector comprising the polynucleotide to provide.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 파지 표출 기술(Phage Display Technology)을 이용하여 CD9에 특이적으로 결합하는 10E4 scFv를 스크리닝한 후, 이를 링커로 연결한 항-CD9 2가 scFv 및 인간 항체의 Fc가 순차적으로 연결된 단쇄를 발현하는 벡터를 제조한 후(도 1 내지 도 3 참조), 상기 발현된 항-CD9 2가 항체를 비환원 조건 및 환원 조건에서 전기영동하여 분석한 결과, 상기 항-CD9 2가 항체가 서로 결합하여 CD9 4가 항체를 이루는 것을 확인하였다(도 5 참조).In a specific embodiment of the present invention, after screening a 10E4 scFv that specifically binds CD9 using phage display technology, the anti-CD9 bivalent scFv and Fc of the human antibody linked to the linker After preparing a vector expressing sequentially linked single chains (see FIGS. 1 to 3), the expressed anti-CD9 bivalent antibody was analyzed by electrophoresis under non-reducing and reducing conditions. It was confirmed that the antibodies bind to each other to form a
본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 항체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.The polynucleotide encoding the antibody of the present invention does not change the amino acid sequence of the antibody expressed from the coding region due to degeneracy of the codon or in consideration of the codon preferred in the organism to express the antibody. Various modifications may be made to the coding region within the region, and various modifications or modifications may be made within a range that does not affect the expression of the gene even in portions other than the coding region, and such modified genes are also included in the scope of the present invention. Will be well understood. That is, as long as the polynucleotide of the present invention encodes a protein having equivalent activity, one or more nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, which are also included in the scope of the present invention. The sequence of such polynucleotides may be single or double chained and may be DNA molecules or RNA (mRNA) molecules.
상기 발현벡터의 제작 시에는, 상기 항체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.When preparing the expression vector, expression control sequences such as promoters, terminators, enhancers, and the like, sequences for membrane targeting or secretion, etc., depending on the type of host cell in which the antibody is to be produced. It can be appropriately selected and various combinations depending on the purpose.
본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성 적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.Expression vectors of the present invention include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, and viral vectors. Suitable expression vectors include signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals and enhancers and can be prepared in various ways depending on the purpose. The promoter of the expression vector may be constitutive or inducible. The signal sequence includes a PhoA signal sequence and an OmpA signal sequence when the host is Escherichia sp., And an α-amylase signal sequence and a subtilisin signal when the host is Bacillus sp. For example, the MFα signal sequence, the SUC2 signal sequence, and the like may be used when the host is a yeast, and the insulin signal sequence, the α-interferon signal sequence, the antibody molecular signal sequence, or the like may be used when the host is an animal cell. This is not restrictive. The expression vector may also include a selection marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable expression vector, includes the origin of replication.
또한, 본 발명은 상기 항-CD9 2가 항체 단쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.The present invention also provides a transformant prepared by introducing an expression vector comprising a polynucleotide encoding the anti-CD9 bivalent antibody single chain into a host cell.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 파지 표출 기술(Phage Display Technology)을 이용하여 CD9에 특이적으로 결합하는 10E4 scFv를 스크리닝한 후, 이를 링커로 연결한 항-CD9 2가 scFv 및 인간 항체의 Fc가 순차적으로 연결된 단쇄를 발현하는 벡터를 제조한 후(도 1 내지 도 3 참조), 상기 발현된 항-CD9 2가 항체를 비환원 조건 및 환원 조건에서 전기영동하여 분석한 결과, 상기 항-CD9 2가 항체가 서로 결합하여 CD9 4가 항체를 이루는 것을 확인하였다(도 5 참조).In a specific embodiment of the present invention, after screening a 10E4 scFv that specifically binds CD9 using phage display technology, the anti-CD9 bivalent scFv and Fc of the human antibody linked to the linker After preparing a vector expressing sequentially linked single chains (see FIGS. 1 to 3), the expressed anti-CD9 bivalent antibody was analyzed by electrophoresis under non-reducing and reducing conditions. It was confirmed that the antibodies bind to each other to form a
본 발명에 따른 상기 발현벡터를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 항체를 대량 생산할 수 있다. 숙주세포의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세포일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 동물 세포는 자가 또는 동종 이계 동물 세포일 수 있다. 자가 또는 동종 이계 동물 세포에 도입하여 제조된 형질전환체는 개체에 투여되어 암을 치료하는 세포치료 등에 이용될 수도 있다. 상기 숙주세포로의 발현벡터 도입방법은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.The expression vector according to the present invention may be transformed into an appropriate host cell, for example, E. coli or yeast cell, and then cultured in the transformed host cell, thereby producing a large amount of the antibody according to the present invention. Suitable culture methods, media conditions, and the like according to the type of host cell can be easily selected by those skilled in the art from known techniques known to those skilled in the art. The host cell may be a prokaryote such as E. coli or Bacillus subtilis . It may also be eukaryotic cells derived from yeast, insect cells, plant cells, animal cells, such as Saccharomyces cerevisiae . More preferably, said animal cell may be an autologous or allogeneic animal cell. Transformants prepared by introducing into autologous or allogeneic animal cells may be used in cell therapies for administration to a subject to treat cancer. The expression vector introduction method into the host cell may be any method known to those skilled in the art.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 1) culturing the transformant; And
2) 상기 배양액으로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는 항-CD9 4가 항체의 제조방법을 제공한다.2) It provides a method for producing an anti-CD9 tetravalent antibody comprising the step of purifying the antibody from the culture.
상기 배양 배지로는 당업자에게 공지된 배양 배지 중 형질전환체에 적합한 배지를 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 상기 항체 정제 방법은 당업자에게 공지된 어떠한 정제 방법도 사용 가능하다.As the culture medium, it is preferable to select a medium suitable for the transformant from the culture medium known to those skilled in the art. The antibody purification method may be any purification method known to those skilled in the art.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 파지 표출 기술(Phage Display Technology)을 이용하여 CD9에 특이적으로 결합하는 10E4 scFv를 스크리닝한 후, 이를 링커로 연결한 항-CD9 2가 scFv 및 인간 항체의 Fc가 순차적으로 연결된 단쇄 를 발현하는 벡터를 제조한 후(도 1 내지 도 3 참조), 상기 발현된 항-CD9 2가 항체를 비환원 조건 및 환원 조건에서 전기영동하여 분석한 결과, 상기 항-CD9 2가 항체가 서로 결합하여 CD9 4가 항체를 이루는 것을 확인하였다(도 5 참조).In a specific embodiment of the present invention, after screening a 10E4 scFv that specifically binds CD9 using phage display technology, the anti-CD9 bivalent scFv and Fc of the human antibody linked to the linker After preparing a vector expressing sequentially connected single chains (see FIGS. 1 to 3), the expressed anti-CD9 bivalent antibody was analyzed by electrophoresis under non-reducing and reducing conditions, and the anti-CD9 2 It was confirmed that the antibodies bind to each other to form a
또한, 본 발명은 상기 항-CD9 4가 항체의 진단적 유효량을 포함하는 CD9이 과발현되는 암질환의 검출용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for detecting cancer diseases in which CD9 is overexpressed comprising a diagnostically effective amount of the anti-CD9 tetravalent antibody.
상기 CD9이 과발현되는 암은 편평상피세포암, 위암, 난소선암 및 난소암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 CD9이 과발현되는 암은 모두 가능하다.The cancer in which CD9 is overexpressed is preferably squamous cell carcinoma, gastric cancer, ovarian adenocarcinoma and ovarian cancer, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서, CD9에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 CD9이 과발현된 암질환의 검출용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, the monoclonal antibody showing the binding capacity and specificity for CD9 can be usefully used as a composition for the detection of cancer diseases overexpressed CD9.
상기 항체는 치료용 방사선 동위원소, 형광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제 또는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 검출가능한 표지에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되거나 연결된다. 바람직한 치료용 방사선 동위원소의 예로는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합을 포함한다.The antibody is directly or indirectly linked or linked to any one or more detectable labels selected from the group consisting of therapeutic radioisotopes, phosphors, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors or ligands. Examples of preferred therapeutic radioisotopes include 3 H, 11 C, 14 C, 18 F, 64 Cu, 76 Br, 86 Y, 99 m Tc, 111 In, 123 I, 177 Lu and mixtures and combinations thereof. .
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 CD9이 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for immunodetection of cancer in which CD9 is overexpressed in vitro, including contacting the detection composition with cancer cells.
상기 CD9이 과발현되는 암은 편평상피세포암, 위암, 난소선암 및 난소암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 CD9이 과발현되는 암은 모두 가능하다.The cancer in which CD9 is overexpressed is preferably squamous cell carcinoma, gastric cancer, ovarian adenocarcinoma and ovarian cancer, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서, CD9에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 CD9이 과발현된 암질환의 검출에 유용하게 이용될 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, monoclonal antibodies showing binding capacity and specificity for CD9 may be usefully used for the detection of cancer diseases in which CD9 is overexpressed.
상기 검출용 조성물은 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.The detection composition may be bound to a solid substrate to facilitate subsequent steps such as washing or separation of the complex. Solid substrates include synthetic resins, nitrocellulose, glass substrates, metal substrates, glass fibers, microspheres and microbeads. In addition, the synthetic resins include polyester, polyvinyl chloride, polystyrene, polypropylene, PVDF and nylon.
또한, 암세포는 상기 검출용 조성물과 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.In addition, cancer cells may be diluted to a suitable degree prior to contact with the detection composition.
또한, 본 발명은 1) 상기 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계; 및,In addition, the present invention comprises the steps of 1) administering a diagnostically effective amount of the composition for detection to a subject; And,
2) 상기 개체에 대한 검출영상을 수득하는 단계를 포함하는 생체내 CD9이 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공한다.2) provides a method for imaging cancer in which CD9 is overexpressed in vivo, including obtaining a detection image of the subject.
상기 CD9이 과발현되는 암은 편평상피세포암, 위암, 난소선암 및 난소암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 CD9이 과발현되는 암은 모두 가능하다.The cancer in which the CD9 is overexpressed is preferably squamous cell carcinoma, gastric cancer, ovarian adenocarcinoma and ovarian cancer, but not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서, CD9에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 CD9이 과발현된 암의 영상화 방법에 유용하게 이용될 수 있다.In specific embodiments of the present invention, monoclonal antibodies showing binding capacity and specificity for CD9 may be usefully used for imaging CD9 overexpressed cancer.
상기 검출영상은 근적외광 이미징, PET, MRI 또는 초음파 이미징에 의해 수 득되는 것을 특징으로 한다.The detection image is characterized in that it is obtained by near-infrared imaging, PET, MRI or ultrasound imaging.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 상기 검출용 조성물을 개체의 정맥내 투여하는 단계;1) administering the detecting composition intravenously;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계; 및,2) identifying tumor cells by detecting the composition of step 1); And,
3) 단계 2)에서 확인된 종양 세포를 수술적 절제에 의해 제거하는 단계를 포함하는 CD9이 과발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공한다.3) A method of in vivo treatment of a cancer in which CD9 is overexpressed, comprising the step of removing the tumor cells identified in step 2) by surgical resection.
상기 CD9이 과발현되는 암은 편평상피세포암, 위암, 난소선암 및 난소암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 CD9이 과발현되는 암은 모두 가능하다.The cancer in which CD9 is overexpressed is preferably squamous cell carcinoma, gastric cancer, ovarian adenocarcinoma and ovarian cancer, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서, CD9에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 CD9이 과발현된 암의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.In specific embodiments of the present invention, monoclonal antibodies showing binding capacity and specificity for CD9 may be usefully used for the treatment of cancers overexpressed with CD9.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 상기 검출용 조성물을 종양 세포가 제거된 환자의 정맥내 투여하는 단계;1) administering the detection composition intravenously in a patient from which tumor cells have been removed;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계; 및,2) identifying tumor cells by detecting the composition of step 1); And,
3) 단계 2)에서 종양 세포가 검출되지 않으면, 종양 세포가 모두 제거된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 CD9이 과발현되는 암 치료 환자의 예후 평가 방법을 제공한다.3) If the tumor cells are not detected in step 2), it provides a method for assessing the prognosis of the cancer treatment patients overexpressed CD9, characterized in that it is determined that all the tumor cells have been removed.
상기 CD9이 과발현되는 암은 편평상피세포암, 위암, 난소선암 및 난소암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 CD9이 과발현되는 암은 모두 가능하다.The cancer in which CD9 is overexpressed is preferably squamous cell carcinoma, gastric cancer, ovarian adenocarcinoma and ovarian cancer, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서, D9에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 CD9이 과발현된 암의 예후 평가에 유용하게 이용될 수 있다.In specific embodiments of the present invention, monoclonal antibodies showing binding capacity and specificity for D9 may be usefully used for prognostic evaluation of cancers overexpressing CD9.
또한, 본 발명은 상기 항-CD9 4가 항체를 포함하는, CD9이 과발현되는 암질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer diseases in which CD9 is overexpressed, comprising the anti-CD9 tetravalent antibody.
상기 CD9이 과발현되는 암은 편평상피세포암, 위암, 난소선암 및 난소암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 CD9이 과발현되는 암은 모두 가능하다.The cancer in which CD9 is overexpressed is preferably squamous cell carcinoma, gastric cancer, ovarian adenocarcinoma and ovarian cancer, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서, CD9에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 CD9이 과발현된 암질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, the monoclonal antibody showing the binding capacity and specificity for CD9 can be usefully used as a composition for the prevention or treatment of cancer diseases overexpressed CD9.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 CD9에 특이적인 항체 또는 상기 형질전환체를 선택적으로 함유할 수 있으며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 위해서 상기에 기재된 유효성분 이외에 추가로 약제학적 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액 및 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있으며, 표적 세포에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 세포에 특이적인 항체 또는 기타 리간드를 상기의 담체와 함께 결합시켜 사용할 수 있다. 아울러, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may optionally contain the antibody specific for the CD9 or the transformant, and may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the above components. In addition, the administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredient described above. For example, as a pharmaceutically acceptable carrier, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes, and a mixture of one or more of these components may be used. If desired, other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents can be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, and emulsions, and antibodies specific for the target cells to act specifically on the target cells. Or other ligand may be used in combination with the above carrier. In addition, it can be preferably formulated according to each disease or component using an appropriate method in the art or a method published in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 약학적 조성물은 안정제 또는 완충제와 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered parenterally, and parenteral administration is by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intrathoracic injection. To formulate into parenteral formulations, the pharmaceutical compositions of the present invention are mixed with stabilizers or buffers to prepare solutions or suspensions, which are formulated in unit dosage forms of ampoules or vials.
본 발명의 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 주사용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 또는 동결-건조 기술을 이용하여 냉동건조된 형태로 제조될 수 있다. 냉동건조된 약학적 조성물은 전형적으로 약 4℃에서 유지되며, 보조제를 함유하거나 함유하지 않은 안정화 용액, 예를 들면, 식염수 또는/및 HEPES에 의해 복원될 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared in various forms depending on the route of administration. For example, the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in the form of sterile aqueous solutions or dispersions suitable for injectable use, or may be prepared in lyophilized form using freeze-drying techniques. Lyophilized pharmaceutical compositions are typically maintained at about 4 ° C. and may be restored by stabilization solutions, such as saline or / and HEPES, with or without adjuvant.
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 투여될 약학적 조성물의 양에 영향을 미치는 인자들로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식, 투여 빈도, 치료가 진행 중인 특정 질병, 질병의 심각성, 질병의 병력, 개체가 다른 치료제와 함께 협력 치료법이 진행중인 지의 여부, 및 치료가 진행중인 개체의 연령, 키, 체중, 건 강, 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행중인 환자의 체중이 증가할 수록 본 발명의 약학적 조성물을 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다.In practicing the methods of the invention, factors affecting the amount of pharmaceutical composition to be administered include, but are not limited to, the mode of administration, frequency of administration, the specific disease being treated, the severity of the disease, the history of the disease, the subject Whether the cooperative therapy is in progress along with other therapeutic agents, and the age, height, weight, health, and physical condition of the individual in whom the treatment is in progress. In general, it is desirable to administer a larger amount of the pharmaceutical composition of the present invention as the weight of the patient undergoing treatment increases.
또한, 본 발명은 상기 항-CD9 4가 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 CD9이 과발현되는 암질환의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of radioimmunity of cancer diseases in which CD9 is overexpressed comprising the anti-CD9 tetravalent antibody and a therapeutic radioisotope.
상기 CD9이 과발현되는 암은 편평상피세포암, 위암, 난소선암 및 난소암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 CD9이 과발현되는 암은 모두 가능하다.The cancer in which CD9 is overexpressed is preferably squamous cell carcinoma, gastric cancer, ovarian adenocarcinoma and ovarian cancer, but is not limited thereto.
바람직한 치료용 방사선 동위원소의 예로는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합을 포함한다. 상기 치료용 방사선 동위원소는 상기 항체와 결합되거나 항체가 결합된 운반체에 포함되는 것을 특징으로 한다.Examples of preferred therapeutic radioisotopes include 3 H, 11 C, 14 C, 18 F, 64 Cu, 76 Br, 86 Y, 99 m Tc, 111 In, 123 I, 177 Lu and mixtures and combinations thereof. . The therapeutic radioisotope is characterized in that it is included in the carrier to which the antibody is bound or to which the antibody is bound.
아울러, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항-CD9 4가 항체를 CD9이 과발현되는 암질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 CD9이 과발현되는 암질환을 치료하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of treating a cancer disease in which CD9 is overexpressed, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the anti-CD9 tetravalent antibody to a subject having a cancer disease in which CD9 is overexpressed.
상기 CD9이 과발현되는 암은 편평상피세포암, 위암, 난소선암 및 난소암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 CD9이 과발현되는 암은 모두 가능하다.The cancer in which CD9 is overexpressed is preferably squamous cell carcinoma, gastric cancer, ovarian adenocarcinoma and ovarian cancer, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서, CD9에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 CD9이 과발현된 암질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.In specific embodiments of the present invention, monoclonal antibodies showing binding capacity and specificity for CD9 may be usefully used for the treatment of cancer diseases in which CD9 is overexpressed.
본 발명이 적용가능한 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.The subjects to which the present invention is applicable are vertebrates and preferably mammals, more preferably experimental animals such as rats, rabbits, guinea pigs, hamsters, dogs and cats, most preferably apes such as chimpanzees and gorillas. It is an animal.
본 발명의 항체의 투여방법은 사용목적에 따라 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 등에 투여하는 방법)로 할 수 있으며, 바람직하게는 정맥 투여가 바람직하다. 경우에 따라 고형암에 대한 투여에서는 항체의 접근을 빠르고 용이하게 하기 위하여 국부적인 투여가 바람직할 수도 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 1회 투여량은 약 5 내지 500 ㎎/m2의 양으로 일 단위 또는 주 단위로 투여될 수 있다. 상기 유효량은 상기 환자를 치료하는 의사의 재량에 따라 조절될 수 있다.The method of administering the antibody of the present invention may be parenteral administration (eg, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, or topical administration) depending on the purpose of use, and preferably intravenous administration. In some cases, for administration to solid cancers, local administration may be desirable to facilitate and quick access of the antibody. Dosage varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of the patient. Single doses may be administered in daily or weekly amounts in an amount of about 5 to 500 mg / m 2 . The effective amount can be adjusted at the discretion of the physician treating the patient.
본 발명의 항체는 암환자의 치료를 위하여 단독 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제와 병행하여 사용될 수 있다.Antibodies of the invention can be used alone or in combination with surgery, hormone therapy, drug therapy and biological response modifiers for the treatment of cancer patients.
본 발명의 항-CD9 4가 항체는 10E4 IgG에 비해 CD9에 약 6배 높은 결합친화력을 보이고 CD9을 과발현하고 있는 암세포에 특이적으로 결합하므로, 생체 내 진단 및 in vivo 영상화용 항체로 유용하게 이용할 수 있다.Since the anti-CD9 tetravalent antibody of the present invention shows a binding affinity about 6 times higher than CD9 and specifically binds to cancer cells overexpressing CD9, the anti-CD9 tetravalent antibody can be usefully used as an antibody for in vivo diagnosis and in vivo imaging. Can be.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 항원 CD9-EC(extracellular loop) 2 단백질의 제조Example 1 Preparation of Antigen CD9-EC (Extracellular Loop) 2 Protein
<1-1> CD9-EC2 클로닝(Cloning)<1-1> CD9-EC2 Cloning
삼성병원에서 인간 CD9 유전자를 함유하고 있는 플라스미드를 분양받았다. 상기 플라스미드를 주형 DNA로 하고, 상기 CD9의 EC2 도메인(서열번호 3)만을 증폭시키기 위한 정방향 프라이머(서열번호 1: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTCCCACAAGGATGAG-GTGAT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 2: 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAAGATGTGGAATT-TATTGTCGA-3')를 사용하여 유전자를 하기 조건으로 증폭한 후, SfiI(20 unit/㎕; R0123L, NEB, USA)으로 처리한 후, 본 발명자들이 제조한 벡터 pYW600(대한민국 특허출원 제2008-0086232호)에 서브클로닝하였다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng, 각 프라이머는 10 p㏖ 및 Pfu DNA 폴리머라아제(2.5 unit/㎕)는 0.5 ㎕이 되도록 넣어 주었고, 초기 변성 과정으로 94℃에서 2분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 30초간 30회 반복하였고, 72℃에서 10분간 연장반응을 수행하여 PCR 산물을 얻었다.Samsung Hospital received a plasmid containing the human CD9 gene. Using the plasmid as a template DNA, a forward primer (SEQ ID NO: 1'5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTCCCACAAGGATGAG-GTGAT-3 ') and a reverse primer (SEQ ID NO: 2'5'-) for amplifying only the EC2 domain (SEQ ID NO: 3) of the CD9 TAGCGGCCGACGCGGCCAAGATGTGGAATT-TATTGTCGA-3 ') was amplified by the following condition a gene, Sfi I (20 unit / ㎕ using; R0123L, NEB, USA) after treatment with, to a vector pYW600 (Patent Application Republic of Korea prepared inventors claim 2008-0086232). PCR conditions were 50 μl of total reaction solution, 100 ng of template, 10 pmol of each primer and 0.5 μl of Pfu DNA polymerase (2.5 unit / μl), and the initial denaturation at 94 ° C. After the treatment for 2 minutes, it was repeated 30 times at 94 ℃, 30 seconds at 59 ℃, 30 times at 72
상기 서브클로닝된 벡터 10 ㎕와 XL1-blue 100 ㎕를 잘 섞어서 얼음에서 10분간 반응시킨 후, 42℃에서 1분 30 초간 열충격을 주고 다시 얼음에 5분간 두었 다. LB 배지 900 ㎕를 넣어 37℃에서 1시간 동안 재생시킨 후, 12,000 rpm으로 30 초간 원심 분리하여 전체 세포를 LB-Amp 고체배지에서 형질전환된 세포를 선별하였다. 상기 선별된 세포를 추가로 배양하여 증폭시킨 후, 미니-프렙 키트(Nucleogen, 한국)를 이용하여 벡터를 정제하였고, 염기서열을 확인하였다.10 μl of the subcloned vector and 100 μl of XL1-blue were mixed well and reacted on ice for 10 minutes, and then subjected to thermal shock at 42 ° C. for 1 minute and 30 seconds, and then placed on ice for 5 minutes. 900 μl of LB medium was added and regenerated at 37 ° C. for 1 hour, followed by centrifugation at 12,000 rpm for 30 seconds to select whole cells transformed in LB-Amp solid medium. After further culturing and amplifying the selected cells, the vector was purified using a mini-prep kit (Nucleogen, Korea), and the nucleotide sequence was confirmed.
<1-2> 형질감염 및 발현 상등액 채취<1-2> Transfection and Expression Supernatant Collection
본 발명자들은 293E 세포를 150 ㎜ 디쉬(dish) 당 2×107로 접종하였고, 37℃, CO2 인큐베이터에서 16-20시간 정도 세포 집합도(cell confluency)가 70-80% 정도가 될 때까지 배양하였다. 또한, 실시예 1-1의 CD9-EC2 DNA(538 ㎍/㎕) 20 ㎍ 및 PEI(Polyethylenimine M.W ~ 25,000, Polysciences, 2 ㎎/㎖) 40 ㎍을 DMEM(No FBS)를 섞어준 후, 상기 혼합액을 RT에서 20분 정도 두었다. 이후 상기 배양된 세포에 상기 혼합액을 한 방울씩 떨어뜨려 주면서 잘 흔들어 주었다. 하루 정도 지나서 PBS로 세척한 다음 DMEM(No FBS)을 넣고 2-3일 마다 상등액을 수거하였고, 2,000 rpm에서 5분 정도 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 이후, Top-filter(Millipore, USA)로 여과한 후 정제에 사용하였다. 상기 여과된 상등액은 총 부피가 450 ㎖ 정도 되었다.We inoculated 293E cells at 2 × 10 7 per 150 mm dish, until the cell confluency was about 70-80% at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 16-20 hours. Incubated. In addition, 20 μg of CD9-EC2 DNA (538 μg / μl) of Example 1-1 and 40 μg of PEI (Polyethylenimine MW ~ 25,000, Polysciences, 2 mg / mL) were mixed with DMEM (No FBS), and then the mixture solution. Was left at RT for 20 minutes. Thereafter, the mixture was shaken well while dropping the mixed solution dropwise. After one day, washed with PBS, DMEM (No FBS) was added and the supernatant was collected every 2-3 days, centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes to remove cell debris. Thereafter, the resultant was filtered with Top-filter (Millipore, USA) and used for purification. The filtered supernatant had a total volume of about 450 ml.
<1-3> CD9-EC2 단백질의 정제<1-3> Purification of the CD9-EC2 Protein
우선 Econo-컬럼(1×5 ㎝, Bio-Rad, USA)을 PBS로 세척한 후, 결합 완충용액인 pH 7.0의 20 mM 인산나트륨 완충용액 30 ㎖를 흘려주면서 Protein A(Amersham, USA) 500 ㎕로 충진하였다. 상기 충진된 컬럼에 페리-스타트 펌프(Peristaltic pump, Bio-Rad)를 이용하여 실시예 1-2의 여과된 상등액을 0.5 ㎖/분의 속도로 흘려주어 결합시킨 후 PBS로 2 ㎖/분으로 1시간 동안 세척하였다. 0.1 M 글리신-HCl(pH2.5) 500 ㎕를 이용하여 단백질을 용리시킨 후, 1/10 부피의 1 M Tris-HCl, pH 9.0을 넣어 중화시켰다. 6개의 용리 분획 중 #1 및 #2 분획을 회수하여, 10K 투석막(dialysis membrane)에 넣어 4L PBS에서 밤새 투석하였다. 상기 모든 과정은 4℃ 냉방에서 실시하였고, 정량 후 나누어 -70℃에서 보관하였다. 상기 정제한 후, 10% SDS-PAGE 겔로 확인하였다.First, Econo-column (1 × 5 cm, Bio-Rad, USA) was washed with PBS, and then 500 mL of Protein A (Amersham, USA) was poured with 30 ml of 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Filled with. Using the Peristaltic pump (Peristaltic pump, Bio-Rad) to the packed column by combining the filtered supernatant of Example 1-2 at a rate of 0.5 mL / min, and then combined with PBS at 2 mL /
<실시예 2> 10E4 항체 제조Example 2 Preparation of 10E4 Antibody
<2-1> 라이브러리 파아지의 제조<2-1> Preparation of Library Phage
다양성을 가진 인간 유래 scFv 라이브러리 세포 2.7×1010를 2×YTCM [Tryptone(CONDA, 1612.00) 17 g, Yeast extract(CONDA, 1702.00) 10 g, NaCl(sigma, S7653-5 ㎏) 5 g, chloramphenicol(sigma, C0857) 34 ㎍/㎖)], 2% glucose(sigma, G5400) 및 5 mM MgCl2(sigma, M2393)을 포함하는 배지(3 L)에서 37℃에서 2~3시간 동안 배양한 후(OD600=0.5~0.7), 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시켜 2×YTCMK[2×YTCM, Kanamycin(sigma, K1876) 70 ㎍/㎖, 1 mM IPTG(ELPISBIO, IPTG025)] 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상등액에 4% PEG(Fluka, 81253) 6000과 3% NaCl(sigma, S7653)을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응하였다. 다 시 원심분리(8000 rpm, 20분, 4℃)한 후, 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000 rpm, 10 분, 4℃)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 상등액을 새 튜브에 넣어 4℃에서 보관하였다.2.7 × 10 10 of human-derived scFv library cells with variability were 2 × YTCM [17 g of Tryptone (CONDA, 1612.00), 10 g of Yeast extract (CONDA, 1702.00), 5 g of NaCl (sigma, S7653-5 kg), chloramphenicol ( sigma, C0857) 34 μg / ml)], 2% glucose (sigma, G5400) and 5 mM MgCl 2 (sigma, M2393) incubated for 2 to 3 hours at 37 ° C. (3 L) OD 600 = 0.5-0.7), helper phage was infected to 70 μg / ml of 2 × YTCMK [2 × YTCM, Kanamycin (sigma, K1876), 1 mM IPTG (ELPISBIO, IPTG025)] medium at 30 ° C. Incubated for 16 hours. The cultured cells were centrifuged (4500 rpm, 15 minutes, 4 ° C), and then dissolved in the supernatant by adding 4% PEG (Fluka, 81253) 6000 and 3% NaCl (sigma, S7653) to ice for 1 hour. Reacted. After centrifugation (8000 rpm, 20 minutes, 4 ° C.), PBS was added to the pellet to dissolve, followed by centrifugation (12000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.) to add supernatant containing library phage to a new tube. Store at ° C.
<2-2> 패닝(Panning) 과정<2-2> Panning Process
실시예 2에서 수득한 정제된 CD9-EC2 50 ㎍을 Immunosorb 튜브(Nunc 470319)에 4 ㎖의 코팅 완충용액[coating buffer; Na2CO3(sigma, S7795) 1.59 g, NaHCO3(sigma, S8875) 2.93 g, NaN3(sigma, S2002), 0.2 g]으로 4℃에서 16시간 정도 회전기(rotator)로 코팅한 후, 실온에서 2시간 동안 PBS에 녹여 skim milk[(BD,232100)-4% in 1XPBS]를 사용하여 면역튜브(immunotube)에서 차단하였다. 면역튜브에 실시예 2-1에서 제조한 라이브러리 파아지 2 ㎖을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰고 PBST(0.05%)로 5회, PBS로 2회 세척하였다. 세척 후 특이적으로 결합한 scFv-파아지들만 100 mM TEA(Sigma T-0886)로 용리하여, 용출된 파아지들을 대장균(XL1-Blue, stratagene, 200249)에 감염시켜 증폭했다. 첫 번째 패닝에서 증폭된 파아지를 PBST 세척 횟수만 늘려서(2차: 23번, 3차: 23번) 동일한 방법으로 2차 및 3차 패닝을 수행하였다.50 [mu] g of purified CD9-EC2 obtained in Example 2 was placed in an Immunosorb tube (Nunc 470319) with 4 ml of coating buffer [coating buffer; 1.59 g of Na 2 CO 3 (sigma, S7795), 2.93 g of NaHCO 3 (sigma, S8875), NaN 3 (sigma, S2002), 0.2 g] and coated with a rotator at 4 ° C. for about 16 hours. After dissolving in PBS for 2 hours at skim milk [(BD, 232100) -4% in 1XPBS] was blocked in the immunotube (immunotube). 2 ml of the library phage prepared in Example 2-1 was added to the immunotube and reacted at room temperature for 2 hours, washed 5 times with PBST (0.05%) and twice with PBS. After washing, only specifically bound scFv-phages were eluted with 100 mM TEA (Sigma T-0886), and the eluted phages were amplified by infecting E. coli (XL1-Blue, stratagene, 200249). Phage amplified in the first panning was increased only by the number of PBST washes (second: 23, third: 23), and second and third panning was performed in the same manner.
<2-3> 파아지 항체 스크리닝(Screening)<2-3> Phage Antibody Screening
2차 및 3차 패닝하여 얼려두었던 세포 저장물(stock)을 5 ㎖의 2×YTCM, 2% Glucose, 5 mM MgCl2 배지에 OD600=0.1이 되게 넣어준 다음, 37℃에서 2~3시간(OD600=0.5~0.7) 배양하였다. 이후 M1 헬퍼 파아지를 감염시키고 2×YTCMK, 5 mM MgCl2, 1 mM IPTG 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 다클론 파아지 항체군에서 수득한 콜로니를 2×YTCM, 2% 글루코즈, 및 5 mM MgCl2를 포함한 배지에 1 ㎖ 96-딥 웰 플레이트(deep well plate)(바이오니아, 90030))에 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포에서 OD600에서 값이 0.1이 되도록 100 ~ 200 ㎕를 취해 1 ㎖의 2×YTCM, 2% 글루코즈, 및 5 mM MgCl2를 포함한 배지에 넣은 다음, 96-딥 웰 플레이트에 37℃에서 OD600에서 그 값이 0.5 ~ 0.7이 되도록 2 ~ 3시간 동안 배양하였다. M1 헬퍼 파지를 MOI값이 1 : 20 되도록 감염시켜 2×YTCMK, 5 mM MgCl2, 및 1 mM IPTG를 포함하는 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 원심분리(4500 rpm, 15 min, 4℃)한 후, 상층액을 취해 4% 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 6000과 3% NaCl을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 반응시켰다. 상기 반응물을 다시 원심분리(8000 rpm, 20 min, 4℃)한 후 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000 rpm, 10 min, 4℃)하여 상층액을 취해 새 튜브에 옮겨 2차 및 3차 패닝하여 수득한 단일 클론 scFv-파지를 4℃에서 보관하였다.Second and third panning of frozen cell stock (stock) was added to 5 ml of 2 × YTCM, 2% Glucose, 5 mM MgCl 2 medium to OD 600 = 0.1, followed by 2-3 hours at 37 ° C. (OD 600 = 0.5 ~ 0.7) was incubated. M1 helper phages were then infected and incubated in 2 × YTCMK, 5 mM MgCl 2 , 1 mM IPTG medium at 30 ° C. for 16 hours. Colonies obtained from the polyclonal phage antibody group were placed at 37 ° C. in a 1 ml 96-deep well plate (Bionia, 90030) in a medium containing 2 × YTCM, 2% glucose, and 5 mM MgCl 2 . Incubated for 16 hours. Take 100-200 μl of the cultured cells to a value of 0.1 at OD 600 and place in a medium containing 1 ml of 2 × YTCM, 2% glucose, and 5 mM MgCl 2 , and then 37 ° C. in a 96-deep well plate. Incubated for 2 to 3 hours at OD 600 so that the value is from 0.5 to 0.7. M1 helper phages were infected with a MOI of 1: 20, 2 × YTCMK, 5 mM MgCl 2 , and The medium containing 1 mM IPTG was incubated at 30 ° C. for 16 hours. After centrifugation (4500 rpm, 15 min, 4 ℃) of the cultured cells, the supernatant was taken and dissolved by adding 4% polyethylene glycol (PEG) 6000 and 3% NaCl, and then reacted for 1 hour on ice. I was. The reaction was centrifuged again (8000 rpm, 20 min, 4 ° C.) and then dissolved by adding PBS to the pellet, followed by centrifugation (12000 rpm, 10 min, 4 ° C.) to take the supernatant and transfer to a new tube. Monoclonal scFv-phage obtained by tertiary panning was stored at 4 ° C.
또한, 96-웰 임뮤노-플레이트(well immuno-plate)에 CD9-ECL2-Fc 항원(0.1 ㎍/well)을 4 ℃에서 16시 동안 코팅시킨 후, PBS에 녹인 탈지유(4%)를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖를 사용하여 씻어준 다음 패닝하여 얻은 단일클론 scFv-파지(each 100 scFv-phage)를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 세척한 후 2차 항체인 anti-M13-HRP를 1/2000로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖로 씻어준 후에 발색하여 흡광도 490 nm에서 측정하였고, 결합능이 가장 강한 단일클론을 선별하였다.In addition, a 96-well immuno-plate was coated with CD9-ECL2-Fc antigen (0.1 μg / well) at 4 ° C. for 16 hours, followed by using skim milk (4%) dissolved in PBS. Each well was blocked. Each well was washed with 0.2 ml of PBS-tween20 (0.05%), followed by panning, and 100 μl of monoclonal scFv-phage (each 100 scFv-phage) was added to each well and allowed to react at room temperature for 2 hours. Each well was washed four times with 0.2 ml of PBS-tween20 (0.05%), and then the anti-M13-HRP, a secondary antibody, was diluted to 1/2000 and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with 0.2 ml of PBS-tween20 (0.05%), color development was measured at absorbance of 490 nm, and the strongest single clone was selected.
상기 선별된 단일 클론 1 ㎕와 Taq.DNA polymerase(젠닥스 5U/㎕) 0.2 ㎕, 50 p/㎕의 정방향 프라이머(pelB5, 서열번호 6: 5'-CTAGATAACGAGGGCAAATCATG-3') 및 역방향 프라이머(cla3, 서열번호 7: 5'-CGTCACCAATGAAACCATC-3') 0.2 ㎕, 10X 완충용액 3 ㎕, 10 mM dNTP mix 0.6 ㎕, 증류수 24.8 ㎕를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행한 결과, 서열번호 4로 기재되는 중쇄 및 서열번호 5로 기재되는 경쇄를 확인하였다.1 μl of the selected monoclonal and 0.2 μl of Taq. DNA polymerase (Gendax 5U / μl), 50 p / μl of the forward primer (pelB5, SEQ ID NO: 6 ′ 5′-CTAGATAACGAGGGCAAATCATG-3 ′) and reverse primer (cla3, SEQ ID No. 7: 5'-CGTCACCAATGAAACCATC-3 '), colony PCR (iCycler iQ, BIO-RAD) was performed by mixing 0.2 µl, 3 µl of 10X buffer, 0.6 µl of 10 mM dNTP mix, and 24.8 µl of distilled water. The heavy chain described by
CD9-EC2을 항원으로 이용하여 선별된, 서열번호 4로 기재되는 중쇄를 암호화하는 유전자가 삽입된 벡터 및 서열번호 5로 기재되는 경쇄를 암호화하는 유전자가 삽입된 벡터를 293E 세포에 공동으로 형질도입한 후, 상기 형질전환 세포를 배양한 상등액에서 전체 IgG로 전환된 10E4 항체를 수득하였다.Jointly transduced 293E cells with a vector having a gene encoding the heavy chain as set out in SEQ ID NO: 4 and a vector with the gene encoding the light chain as set out as SEQ ID NO: 5 selected using CD9-EC2 as the antigen After that, 10E4 antibody converted to total IgG was obtained from the supernatant cultured with the transformed cells.
<실시예 3> 항-CD9 4가 항체 제조Example 3 Preparation of Anti-CD9 Tetravalent Antibody
<3-1> 10E4내 <3-1> within 10E4 sfisfi I 위치의 점 돌연변이Point mutation at position I
도 1에서 나타난 바와 같이, 10E4 항체의 scFv(서열번호 8)의 385번에 위치하는 sfiI 제한효소 위치는 앞으로 수행할 클로닝에 방해가 되므로, 이를 제거하기 위해 서열번호 9(10E4-sfi mutF: gatcaccgtctcctcaggGctcgggggcctcggaggaggaggtag) 및 서열번호 10(10E4-sfi mutR: ctacctcctcctccgaggcccccgagccctgaggagacggtgatc)로 기재되는 올리고뉴클레오티드와 점 돌연변이 유도 키트(TOPchange site-directed mutagenesis kit, Cat# TM001, Enzynomics, Korea)를 이용하여 점 돌연변이(site mutagenesis)를 수행하였다.As shown in Figure 1, the position of the sfi I restriction enzyme located at 385 of the scFv (SEQ ID NO: 8) of the 10E4 antibody interferes with the cloning to be carried out, so in order to remove it SEQ ID NO: 9 (10E4-sfi mutF: gatcaccgtctcctcaggGctcgggggcctcggaggaggaggtag) and oligonucleotides set forth in SEQ ID NO: 10 (10E4-sfi mutR: ctacctcctcctccgaggcccccgagccctgaggagacggtgatc) and a point mutation induction kit (TOPchange site-directed mutagenesis kit, Cat # TM001, Enzynomics, mutagenesis) Was performed.
<3-2> 2×10E4 발현벡터 제작<3-2> 2 × 10E4 Expression Vector
도 2에서 나타난 바와 같이, sfiI 제한효소 위치가 제거된 10E4가 링커로 연결된 2×10E4(서열번호 15)를 제조하기 위해, 실시예 3-1에서 수행한 점 돌연변이 산물을 주형으로 표 1의 프라이머쌍을 이용하여 융합 PCR을 수행하였다. 상기 융합 PCR 산물과 pNATABH 벡터(대한민국 특허출원 제2008-0092736호)를 변형시켜 제조한 YK602H 벡터를 sfiI 제한효소를 이용하여 절단한 후, 연결시켜 2×10E4-Fc 발현벡터를 제작하였다(도 3).As shown in Figure 2, in order to prepare a 2 × 10E4 (SEQ ID NO: 15) in which the 10E4 sfi I restriction enzyme position is linked by a linker, the point mutation product performed in Example 3-1 as a template of Table 1 Fusion PCR was performed using primer pairs. The YK602H vector prepared by modifying the fusion PCR product and the pNATABH vector (Korean Patent Application No. 2008-0092736) was cut using sfi I restriction enzyme, and then linked to prepare a 2 × 10E4-Fc expression vector (FIG. 3).
<3-3> 형질감염 및 발현 상등액 채취<3-3> Transfection and Expression Supernatant Collection
상기 제작된 발현벡터의 염기서열을 확인한 후, 실시예 1-2의 방법으로 293E 세포에 형질감염시킨 후, 상등액을 2~3일마다 수거하여 여과하였다. 상기 여과된 상등액은 총 부피가 450 ㎖ 정도 되었다. 상기 여과된 상등액을 각 24 ㎕를 10% SDS-PGAE 상에 적재(loading)하여 100 V로 2 시간 정도 내린 후 NC 막(millipore, USA)으로 85 V로 2시간 이동시켰다. 상기 이동이 끝난 막을 차단 완충용액(4% skim milk in TBST)으로 RT에서 1시간 차단시켰다. 이후, a-His-HRP(Sigma, USA)를 상기 차단 완충용액에 1:4000으로 희석(하여 RT에서 1 시간 동안 결합(binding)시켰다. TBST로 10분에 한 번씩 5번 정도 세척한 후 현상(Intron, USA)시켜 분비(secretion)된 단백질을 확인하였다.After confirming the nucleotide sequence of the prepared expression vector, after transfection into 293E cells by the method of Example 1-2, the supernatant was collected every 2-3 days and filtered. The filtered supernatant had a total volume of about 450 ml. 24 μl of the filtered supernatant was loaded on 10% SDS-PGAE, lowered to 100 V for about 2 hours, and then transferred to NC membrane (millipore, USA) at 85 V for 2 hours. The transfer membrane was blocked for 1 hour at RT with blocking buffer (4% skim milk in TBST). Then, a-His-HRP (Sigma, USA) was diluted 1: 4000 in the blocking buffer and bound for 1 hour at RT. After washing 5 times every 10 minutes with TBST, (Intron, USA) confirmed secreted proteins.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 형질감염 후 5일까지 항-CD9 4가 항체가 발현되어 분비되었다.As a result, anti-CD9 tetravalent antibodies were expressed and secreted up to 5 days after transfection as shown in FIG. 4.
<3-4> 항-CD9 4가 항체 단백질 정제 및 분자량 확인<3-4> Anti-CD9 tetravalent antibody protein purification and molecular weight confirmation
실시예 3-3의 여과된 상등액으로부터 실시예 1-3의 방법으로 단백질을 정제한 후, 4가 형태로 발현된 것을 확인하기 위해, 비환원 조건 및 환원 조건으로 전기영동으로 확인하였다.After purifying the protein by the method of Example 1-3 from the filtered supernatant of Example 3-3, in order to confirm that it is expressed in tetravalent form, it was confirmed by electrophoresis under non-reducing conditions and reducing conditions.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 환원 조건(도 5b)에서 약 75 KDa의 단량체가 확인되었고, 비환원 조건에서 약 150kDa의 항-CD9 4가 항체를 기대하였으나, 상기 항-CD9 4가 항체가 이량체를 형성하여 약 300kDa의 크기로 형성하는 것으로 추측되었다.As a result, as shown in FIG. 5, a monomer of about 75 KDa was identified under reducing conditions (FIG. 5B), and an anti-CD9 tetravalent antibody of about 150 kDa was expected under non-reducing conditions, but the anti-CD9 tetravalent antibody was It was assumed that the dimer was formed to a size of about 300 kDa.
<실시예 4> 항-CD9 4가 항체의 특성Example 4 Properties of Anti-CD9 Tetravalent Antibody
<4-1> 10E4 IgG와 항-CD9 4가 항체의 결합친화력 확인<4-1> Confirmation of binding affinity between 10E4 IgG and anti-CD9 tetravalent antibody
상기 4가 10E4 IgG가 항원인 CD9에 대해 특이적으로 결합할 수 있는지를 확인하였다. 구체적으로, 두 개의 96웰 면역 플레이트(NUNC, 439454)에 CD9-EC2 항원을 웰 당 100 ng 씩 4℃에서 16시간 정도 코팅 완충용액으로 처리하여 코팅한 후, PBS에 녹인 skim milk(4 %)를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 각 웰 마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖으로 씻어준 다음 항-CD9 4가 항체를 각 웰에 100 nM부터 1/3씩 순차적으로 희석하여 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이때, 10E4 IgG와 정상 인간 IgG를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 세척한 후 이차 항체인 항-인간 Fc-HRP(Thermo Sci, USA)를 1:3000으로 희석하여 실온에서 30분 동안 반응하였다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖으로 세척한 후에 OPD 정제(Sigmap 8787-TAB)를 PC 완충용액[C6H8O7?H2O(sigma, C0706) 5.1 g, Na2HPO4(sigma, S7907) 7.3 g]에 녹인 기질 용액을 만들어 웰당 100 ㎕씩 넣어 5분 동안 발색시킨 다음 490 ㎚에서 흡광도를 Spectrophotometer로 측정하였다. ELISA 결과는 Graphpad prism ver.4 software(Graphpad Software Inc., USA)를 사용하여 분석하였다.It was confirmed whether the tetravalent 10E4 IgG can specifically bind to CD9 which is an antigen. Specifically, two 96-well immune plates (NUNC, 439454) were coated with 100 ng of CD9-EC2 antigen per well at 4 ° C. for 16 hours at 4 ° C., then skim milk (4%) dissolved in PBS. Each well was blocked using. Each well was washed with 0.2 ml of PBS-tween20 (0.05%), and then the anti-CD9 tetravalent antibodies were diluted sequentially from 100 nM to 1/3 in each well and reacted at room temperature for 2 hours. At this time, 10E4 IgG and normal human IgG were used as positive and negative controls, respectively. Each well was washed four times with 0.2 ml of PBS-tween20 (0.05%), and then the secondary antibody, anti-human Fc-HRP (Thermo Sci, USA), was diluted 1: 3000 and reacted at room temperature for 30 minutes. . After washing with 0.2 ml of PBS-tween20 (0.05%), the OPD tablet (Sigmap 8787-TAB) was purified by PC buffer [C 6 H 8 O 7? Substrate solution dissolved in 5.1 g of H 2 O (sigma, C0706), 7.3 g of Na 2 HPO 4 (sigma, S7907)] was added and 100 μl per well was developed for 5 minutes, and the absorbance was measured at 490 nm using a spectrophotometer. ELISA results were analyzed using Graphpad prism ver.4 software (Graphpad Software Inc., USA).
그 결과, 표 2 및 도 6에서 나타난 바와 같이 항-CD9 4가 항체가 10E4 IgG에 비해 약 6배 정도의 높은 친화력을 나타내어 항원인 CD9 단백질에 결합하였다. 이로써, 본 발명의 항-CD9 4가 항체가 성공적으로 제조된 것을 확인하였다.As a result, as shown in Table 2 and FIG. 6, the anti-CD9 tetravalent antibody showed about 6-fold higher affinity than 10E4 IgG, thereby binding to the antigen CD9 protein. This confirmed that the anti-CD9 tetravalent antibody of the present invention was produced successfully.
<4-2> 암세포주에서 10E4 IgG와 항-CD9 4가 항체의 결합친화력 확인<4-2> Confirmation of Binding Affinity of 10E4 IgG and Anti-CD9 Tetravalent Antibodies in Cancer Cell Lines
100 ㎜ 플레이트에서 CD9이 과발현된 난소선암(ovarian adenocarcinoma) 세포주 2774(ATCC CRL-10303)를 PBS로 2번 세척한 후, 무효소 PBS 기반-해리 완충용액(Gibco)을 첨가해서 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 이후, 세포를 스크래퍼로 모은 후, 1300 rpm에서 3분 동안 원심분리해서 펠렛을 2% PBF(2% FBS가 든 1XPBS)용액으로 두 번 세척한 후, 2% PBF 용액을 넣어 재현탁하여 ≥5×105 세포의 농도로 준비하였다. The ovarian adenocarcinoma cell line 2774 (ATCC CRL-10303) overexpressed CD9 in a 100 mm plate was washed twice with PBS, followed by adding reactive nitrogen PBS based-dissociation buffer (Gibco) for 10 minutes at 37 ° C. Incubated for Thereafter, the cells were collected with a scraper, centrifuged at 1300 rpm for 3 minutes, the pellet was washed twice with 2% PBF (1XPBS containing 2% FBS) solution, and then resuspended in 2% PBF solution. Prepared at a concentration of x10 5 cells.
이때, 상업적으로 구매한 항 CD9의 ALB6 항체(Beckman Coulter, USA)를 양성대조군으로 사용하였고, 정상 마우스 IgG를 음성대조군으로 사용하였다. 얼음에서 1시간 동안 반응한 후, 1300 rpm으로 4℃에서 3분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 200 ㎕의 2% PBF 용액으로 3번 세척한 후, 2% PBF 용액에 1:100으로 희석시킨 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)-conjugated anti-human Fc(vector FI-3000) 100 ㎕를 넣어 잘 섞어주고, 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 추가로 세척한 다음, 500 ㎕의 2% PBF 용액을 첨가하여 FACS 용 튜브(Falcon)에 시료를 옮겨서 볼텍싱한 후, 염색된 세포들을 유세포분석기(Beckman Coulter)로 분석하였다. 매번 실험시 정상 인간 IgG를 동일한 조건으로 처리하여 내부 대조군으로 사용하였다. 데이터는 WINMDI2.9 software(//facs.scripps.edu/software.html, The Scripps Research Institute)를 사용하여 분석하였다.At this time, the commercially purchased anti-CD9 ALB6 antibody (Beckman Coulter, USA) was used as a positive control, normal mouse IgG was used as a negative control. After reacting for 1 hour on ice, the supernatant was removed by centrifugation for 3 minutes at 4 ℃ at 1300 rpm. After washing three times with 200 μl of 2% PBF solution, 100 μl of fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated anti-human Fc (vector FI-3000) diluted 1: 100 in 2% PBF solution was added. Mix well and react for 30 minutes on ice. After further washing, samples were transferred to a FACS tube (Falcon) by adding 500 μl of 2% PBF solution and vortexed, and the stained cells were analyzed by a Beckman Coulter. In each experiment, normal human IgG was treated under the same conditions and used as an internal control. Data was analyzed using WINMDI2.9 software (//facs.scripps.edu/software.html, The Scripps Research Institute).
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 CD9이 과발현된 난소암 세포주 2774의 표면에 10E4 IgG와 항-CD9 4가 항체가 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 이에, 항-CD9 4가 항체가 실제로 암 세포주 표면에 특이적이고 선별적으로 결합하므로 생체 진단 및 in vivo 영상화에 사용할 수 있을 것이다.As a result, as shown in FIG. 7, it was confirmed that 10E4 IgG and anti-CD9 tetravalent antibodies specifically bind to the surface of CD9 overexpressed ovarian cancer cell line 2774. Thus, the anti-CD9 tetravalent antibody actually specific and selectively binds to the surface of cancer cell lines and thus may be used for biodiagnosis and in vivo imaging.
<4-3> 면역형광법<4-3> Immunofluorescence
12웰 플레이트에 멸균 커버슬립을 놓아둔 후, 20% FBS/1×PBS에서 밤새도록 인큐베이션 하여 코팅하였다. 2774 세포를 4×104 세포/웰로 접종하여 밤새도록 인큐베이션 한 후, 3.7% 파라포름알데히드(Sigma)로 실온에서 30분 동안 세포고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 0.05% 트리톤 X-100을 상온에서 10분간 반응시킨 후, 추가로 PBS로 3회 세척하였다. 정상 염소 혈청(5% in PBS)를 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBS로 2회 세척하였다. 아비딘/바이오틴 차단 키트(vector SP-2001, Vectorlabs, USA)로 이용하여 검출하였다. 구체적으로, 아비딘 용액으로 10분 동안 상온에서 처리한 후, PBS로 2회 세척하였다. 이후, 1차 항체로 IgG 10E4(1 ㎎/㎖) 및 항-CD9 4가 항체(1 ㎎/㎖)를 바이오틴 용액에 다양한 농도로 희석하여 상기 세포에 처리한 후, 1시간 동안 결합반응을 수행하였다. PBS로 3회 세척한 후, 2차 항체로 hu IgG-biotin(vector BA 3080, Vectorlabs)을 10 mM phosphate, 0.15 M NaCl에 섞어주어 상온에서 30 분간 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하였다. 3차 항체로 avidin-FITC(vector A2011, Vectorlabs)를 0.1 M sodium bicarbonate, 0.15 M NaCl에 섞어준 후, 상온에서 30분간 반응시켰다. PBS로 3회 세척한 후, DAPI + mounting media(vector H-1000, Vectorlabs)로 처리한 후 현미경으로 관찰하였다.The sterile coverslips were placed in a 12 well plate and then incubated overnight in 20% FBS / 1 × PBS for coating. 2774 cells were inoculated at 4 × 10 4 cells / well and incubated overnight, followed by cell fixation with 3.7% paraformaldehyde (Sigma) for 30 minutes at room temperature. The fixed cells were washed three times with PBS, and then reacted with 0.05% Triton X-100 for 10 minutes at room temperature, followed by three additional washes with PBS. Normal goat serum (5% in PBS) was reacted at room temperature for 1 hour, and then washed twice with PBS. Detection with avidin / biotin blocking kit (vector SP-2001, Vectorlabs, USA). Specifically, the mixture was treated with avidin solution at room temperature for 10 minutes, and then washed twice with PBS. Thereafter, IgG 10E4 (1 mg / ml) and anti-CD9 tetravalent antibody (1 mg / ml) were diluted to various concentrations in a biotin solution as a primary antibody, and then treated with the cells, followed by binding for 1 hour. It was. After washing three times with PBS, hu IgG-biotin (vector BA 3080, Vectorlabs) as a secondary antibody was mixed with 10 mM phosphate, 0.15 M NaCl and reacted at room temperature for 30 minutes and washed three times with PBS. As a third antibody, avidin-FITC (vector A2011, Vectorlabs) was mixed with 0.1 M sodium bicarbonate and 0.15 M NaCl, and then reacted at room temperature for 30 minutes. After washing three times with PBS, treated with DAPI + mounting media (vector H-1000, Vectorlabs) and observed under a microscope.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 항-CD9 4가 항체는 10E4 항체에 의한 CD9 특이적인 결합능에 뒤지지 않을 정도로 특이성과 결합능을 갖는 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 8, it was confirmed that the anti-CD9 tetravalent antibody had specificity and binding ability so as not to fall behind CD9 specific binding ability by the 10E4 antibody.
또한, 일반적으로 whole IgG 형태의 항체는 생체 내에서 약 2~3주의 반감기를 가지 데 비해, 본원발명의 항-CD9 4가 항체와 같은 엔지니어링 항체는 2일이내의 비교적 짧은 반감기를 지니는 장점으로 생체내 진단 및 in vivo 영상화 항체로 사용하는데 적합하다(Partha S. Chowdhury and George Vasmatzis,"Engineering scFvs for Improved Stability", Recombinant Antibodies for Cancer Therapy: Methods and Protocols Series: Methods in Molecular Biology, 207: 237-254, 2002; British Journal of Cancer, 87: 405??413, 2002)In addition, in general, antibodies of the whole IgG form have a half-life of about 2 to 3 weeks in vivo, while engineering antibodies such as the anti-CD9 tetravalent antibody of the present invention have a relatively short half-life within 2 days. Suitable for use as diagnostic and in vivo imaging antibodies (Partha S. Chowdhury and George Vasmatzis, "Engineering scFvs for Improved Stability", Recombinant Antibodies for Cancer Therapy: Methods and Protocols Series: Methods in Molecular Biology, 207: 237-254 , 2002; British Journal of Cancer, 87: 405 ?? 413, 2002)
즉, 본 발명의 항-CD9 4가 항체는 10E4 IgG에 비해 CD9에 약 6배 높은 결합친화력을 보이고 CD9을 과발현하고 있는 암세포에 특이적으로 결합하므로, 생체 내 진단 및 in vivo 영상화용 항체로 유용하게 이용할 수 있다.That is, the anti-CD9 tetravalent antibody of the present invention exhibits a binding affinity about 6 times higher to CD9 than 10E4 IgG and specifically binds to cancer cells overexpressing CD9, which is useful as an antibody for in vivo diagnosis and in vivo imaging. Available.
도 1은 CD9-10E4 ScFv의 모식도이다.1 is a schematic diagram of CD9-10E4 ScFv.
도 2는 2×10E4-Fc 발현을 위한 모식도이다.2 is a schematic diagram for 2 × 10 E4-Fc expression.
도 3은 2×10E4-Fc 발현벡터의 개열지도이다.3 is a cleavage map of a 2 × 10 E4-Fc expression vector.
도 4는 항-CD9 4가 항체의 발현을 나타낸 도이다.Figure 4 shows the expression of anti-CD9 tetravalent antibodies.
도 5는 항-CD9 4가 항체의 형태를 확인한 도이다:5 shows the morphology of anti-CD9 tetravalent antibodies:
a: 비환원; 및,a: non-reducing; And,
b: 환원.b: reduction.
도 6은 항-CD9 4가 항체의 CD9에 대한 결합능을 확인한 도이다.Figure 6 is a diagram confirming the binding capacity of the anti-CD9 tetravalent antibody to CD9.
도 7 및 도 8은 CD9을 과발현하는 암세포주의 표면에 본 발명의 항-CD9 4가 항체가 특이적으로 결합하는 것을 확인한 도이다:7 and 8 show that the anti-CD9 tetravalent antibody of the present invention specifically binds to the surface of cancer cell lines overexpressing CD9:
7: FACS; 및,7: FACS; And,
8: 면역형광법.8: immunofluorescence.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration Enzynomics Co. Ltd. <120> Derivative of CD9-specific human antibody <130> 9P-04-74 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD9-EC2 Forward primer <400> 1 cagggggccg tgggggcctc ccacaaggat gaggtgat 38 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD9-EC2 Reverse primer <400> 2 tagcggccga cgcggccaag atgtggaatt tattgtcga 39 <210> 3 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD9-EC2 <400> 3 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Val His Ser Gln Gly Ala Val Gly Ala Ser His Lys Asp Glu Val Ile 20 25 30 Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Leu Lys Thr 35 40 45 Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala Ile His Tyr Ala Leu 50 55 60 Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile 65 70 75 80 Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe Thr Val Lys Ser Cys Pro 85 90 95 Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys Phe His Ile Leu Ala Ala 100 105 110 Ser Ala Ala Ser His His His His His His Ser Gly Leu Val Pro Arg 115 120 125 Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 130 135 140 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 145 150 155 160 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 165 170 175 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 180 185 190 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 195 200 205 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 210 215 220 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 225 230 235 240 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 245 250 255 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 260 265 270 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 275 280 285 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 290 295 300 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 305 310 315 320 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 325 330 335 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 340 345 350 Leu Ser Pro Gly Lys Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 355 360 365 Ser Ala Val Asp His His His His His His His His 370 375 380 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD9-EC2 10E4 HC <400> 4 Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp 20 25 30 Asp Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ala Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Asp Ile Arg Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Val Gly Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Ala Leu Ile Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD9-EC2 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- 2009-05-04 KR KR1020090038984A patent/KR101169336B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
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|---|
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Also Published As
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