KR101168741B1 - 리그닌 퍼옥시다제의 제조 방법 및 피부와 모발라이트닝에서의 이의 용도 - Google Patents

리그닌 퍼옥시다제의 제조 방법 및 피부와 모발라이트닝에서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

리그닌 퍼옥시다제의 제조방법이 제공된다. 또한, 피부 및 모발 미백에 적합한 방법 및 화장품 조성물과, 피부 및 모발 미백용 활성 성분을 포함하는 키트와 제조품이 제공된다.
리그닌 퍼옥시다제, 피부 및 모발 미백, 화장품 조성물, 파네로케이트 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)

Description

리그닌 퍼옥시다제의 제조 방법 및 피부와 모발 라이트닝에서의 이의 용도{METHODS OF PRODUCING LIGNIN PEROXIDASE AND ITS USE IN SKIN AND HAIR LIGHTENING}
본 발명은 리그닌 퍼옥시다제의 제조 방법 및 피부와 모발 미백(lightening)에서의 이의 용도에 관한 것이다.
멜라닌
사람의 피부와 모발의 색상은 식물과 미생물에도 존재하는 색소인 멜라닌의 양, 질 및 분포에 의해 지배 받는다.
멜라닌의 합성은 타이로시나제의 작용을 통해 제 2 전구체 도파퀴논으로 전환되는 전구체 L-타이로신으로부터 개시된다. 포유동물 멜라닌의 생합성에 있어서, 이러한 중간체는 두 주요 경로를 경유하여 중합될 수 있다(도 1). 아미노 그룹의 분자내 친핵성 첨가는 중합 후 암갈색 내지는 흑색 계통의 색소인 유멜라닌을 생성하는 인돌 유도체 류코도파크롬을 생성할 수 있다. 티올 화합물의 존재하에, 도파의 티오에스테르 유도체가 형성되고; 시스틴과 반응하여 시스테이닐도파를 생성하며, 이는 추가의 산화 및 중합을 거쳐 황색 내지는 적갈색 계통의 색소인 페오멜라닌을 생성한다. 결과적으로, 유멜라닌은 주로 5,6-디하이드록시인돌(DHI) 및 5,6-디하이드록시인돌-2-카복실산(DHICA) 단위로 구성되는 반면에, 페오멜라닌은 주로 벤조티아진 단위를 함유한다(Alaluf et al., 2001). 이들 두 색소의 이용도와 상호간의 비율은 중합체 색소의 화학적 조성에 영향을 미친다.
멜라닌의 합성은 표피 기저층에 존재하는 멜라노사이트 세포에 있는 멜라노좀(Cooksey et al., 1997)으로 불리는 과립체에서 일어나고; 이들 세포에서 멜라닌의 합성은 자외선(UV)에 의해 유발된다. 합성된 뒤에, 멜라닌은 표피 세포로 이동하여 거기에서 분산되며, 여기에서 멜라닌은 피부 대사 뒤에 탈색된 다음 피부 재생시에 때의 형태로 벗겨져 나간다. 멜라닌은 UV에 의해 초래된 부작용으로부터 피부를 보호하므로 임상적으로 중요하다. 그러나, 고 수준의 멜라닌은 피부와 모발의 원치않는 흑화 현상을 초래할 수 있는 반면에, 이의 불균질 분포는 미관상 불쾌감을 줄 수 있는 점과 주근깨를 초래할 수 있다.
미백 제품
피부 미백 제품이 과거 몇 년동안 점차 대중화되었다. 피부 미백 제품의 주 목적은 피부를 미백 또는 화이트닝시키거나 점, 주근깨, 임신 마크 및 검버섯과 같은 색소침착 장애를 치료하기 위한 것이다.
색소 세포의 퇴화 및 사멸에 기초한 제품으로는 전형적으로, 피부 화이트닝 및 피부 미백을 촉진하거나 피부 색소침착을 약화시키는, 하이드로퀴논, 4-이소프로필카테콜 및 하이드로퀴논 모노벤질 에테르 같은 거친 화학 물질을 포함한다. 그러한 제품은 통상적으로 비효율적이며 이들 제품의 지속적인 외부 적용에 의해 영구적인 백반(leucoderma) 및 부작용, 예를 들면 색소이상증 및 발진을 초래할 수 있으므로 피부에 유해할 수 있다.
기타 미백 제품은 전구체 L-타이로신을 제 2 전구체 도파퀴논으로 전환시키는 효소인 타이로시나제의 억제에 기초하고 있다. 이러한 부류의 제품으로는 구리 이온을 킬레이팅함으로써 타이로시나제를 억제하여 도파크롬(dopachrome)으로부터 DHICA으로의 토토머화를 억제할 수 있는 글루코스 하이드로퀴논 화합물인 아르부틴(Arbutin)이 있다.
Melanostat는 타이로시나제를 통해 작용하는 또 다른 미백 제품이다. Melanostat는 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성의 탈활에 기능을 보이는 합성 펩타이드이다.
멜라닌 생성을 억제할 수 있는 수 종의 항산화제 화합물이 또한 미백 제품으로 사용되고 있다. 멜라닌의 합성은 산화 작용을 수반하므로, 타이로신/DOPA에서 멜라닌으로의 다양한 지점에서의 산화 차단이 궁극적으로는 멜라닌 합성을 억제한다.
멜라닌 합성의 차단에 사용되는 산화제 중 하나는 멜라닌 중간체에 대한 환원제로 작용하고 산화 반응을 차단하는 L-아스코빈산(비타민 C)이며; 미백 제품에 의해 사용되는 기타 항산화제로는 통상적으로 뽕나무 또는 감초로부터 추출되는 바이오플라보노이드가 포함된다.
모발 미백 제품은 모발의 피질 내측에 있는 멜라닌에 작용한다. 모발을 미백할 수 있는 몇몇 화학물질이 존재하는데, 그러한 것들로는 염산, 차아염소산나트륨 및 과산화수소가 있다.
모발 미백에 가장 통상적으로 사용되고 있는 화학물질은 과산화수소이다. 목적하는 효과를 유지하기 위하여, 과산화수소 용액은 아세트아닐라이드, 희석산, 콜로이드 실리카, p-하이드록시벤조에이트, 옥시퀴놀린 설페이트, 페나세틴 및 주석 화합물(주석산 나트륨, 수산화 주석, 스태너스 옥토에이트)와 같은 화합물을 사용하여 안정화시켜야 한다. 모발을 미백하기 전에, 모발의 외층인 각피를 통한 과산화수소의 침투를 증진시키고, 그에 따라 산화 반응을 촉진하기 위하여 암모니아를 과산화수소 용액에 첨가한다.
본 발명을 실행에 옮기는 동안, 본 발명자들은 리그닌 퍼옥시다제 동위효소 H1이 시험관내에서 멜라닌을 산화시킬 수 있고 또한 피부와 모발을 생체내에서 미백시킬 수 있음을 밝혀내었다.
따라서, 본 발명은 피부 및 모발의 미백에 매우 적합한 화장품 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명의 일면에 따르면, 피부 영역이나 모발의 세포에 함유된 색소를 산화시키기에 적합한 방식으로 적어도 1종의 리그닌 수식 효소(modifying enzyme)를 피부 영역 또는 모발에 적용하는 단계를 포함하는, 피검자의 피부 영역 또는 모발을 미백하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일면에 따르면, 적어도 1종의 리그닌 수식 효소 및 화장품용으로 허용되는 담체를 포함하는, 피검자의 피부 영역 또는 모발을 미백하기 위한 화장품 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 리그닌 수식 효소를 포함하는 제 1 용기, 및 전자 수용체를 포함하는 제 2 용기를 포함하는, 피부 영역 또는 모발 미백용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 포장재와 포장재에 함유되고 활성 성분으로서 리그닌 수식 효소와 화장품용으로 허용되는 담체를 포함하는, 피검자의 피부 영역 또는 모발 미백용 화장품 조성물을 포함하는 제조품이 제공된다.
후술되는 본 발명의 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 방법은 적어도 1종의 리그닌 수식 효소를 포함하는 제제의 국소 적용을 통해 실행된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 방법은 적어도 1종의 리그닌 수식 효소를 포함하는 제제의 피내 또는 피하 투여를 통해 실행된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 리그닌 수식 효소는 피부 또는 모발 적용용으로 제형된 조성물에 포함된다.
후술되는 본 발명의 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 리그닌 수식 효소는 리그닌 퍼옥시다제이다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 리그닌 퍼옥시다제는 동위효소 H1이거나 동위효소 H2의 변형된 형태이다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 화장품 조성물은 전자 수용체를 추가로 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 전자 수용체는 과산화수소이다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 화장품 조성물은 베라트릴 알콜을 추가로 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 조성물은 적어도 1종의 표피 침투제를 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 조성물은 적어도 1종의 모발 침투제를 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 방법은 목적하는 미백 수준에 따라 선택되는 기간 동안 실행된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 화장품용으로 허용되는 담체는 트랜스큐톨 및/또는 부틸렌 글리콜을 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 화장품용으로 허용되는 담체는 알칸올 아민을 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 화장품 조성물내 리그닌 퍼옥시다제는 적어도 1 U/그램의 농도로 제공된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 화장품 조성물내 과산화수소는 적어도 0.005%의 농도로 제공된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 화장품 조성물내 베라트릴 알콜은 적어도 0.05%의 농도로 제공된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 피부 영역 또는 모발 미백용 키트의 제 1 용기는 베라트릴 알콜을 추가로 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 피부 영역 또는 모발 미백용 키트의 제 1 및/또는 제 2 용기(들)은 표피 침투에 적합한 화장품용으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 피부 영역 또는 모발 미백용 키트의 제 1 및/또는 제 2 용기(들)은 모발 침투에 적합한 화장품용으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본 발명의 부가적인 일면에 따르면, 피부 영역의 세포내에 함유된 색소를 산화시키기에 적합한 방식으로 리그닌 수식 효소를 피부 영역의 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 피검자의 피부 영역을 미백하는 방법이 제공된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 방법은 피부 영역의 세포에 전자 수용체를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 전자 수용체는 과산화수소이다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 방법은 피부 영역의 세포에 베라트릴 알콜을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 발현은 리그닌 수식 효소를 발현할 수 있는 발현 벡터를 세포 중으로 도입함으로써 실행된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 벡터는 바이러스 벡터이다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 벡터는 리그닌 수식 효소 암호화 서열과 기능적으로 연결된 프로모터를 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 리그닌 수식 효소는 리그닌 퍼옥시다제이다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 리그닌 퍼옥시다제는 서열번호 1에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 부가적인 일면에 따르면, (a) 소정 기간 동안 글리세롤을 함유하는 교반되고 통기된 배양 배지에서 다공성 매트릭스 상에 파네로케이트 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium) 진균을 배양한 다음; (b) 상기 소정 시간 뒤에 파네로케이트 크리소스포리움 진균으로부터 가용성 분획을 추출하여 리그닌 퍼옥시다제를 생산하는 단계를 포함하는, 리그닌 퍼옥시다제의 제조 방법이 제공된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 배양 배지는 망간 이온이 결여되어 있다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 통기된 배지는 배양 배지를 0.1-1ℓ/ℓ/min 범위의 통기율로 투입함으로써 수득된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 배양은 37℃의 온도에서 실행된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 교반된 배양 배지는 배양 배지를 50 내지 300 rpm 범위의 속도로 교반함으로써 수득된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 교반된 배양 배지는 배양 배지를 100 rpm 범위의 속도로 교반함으로써 수득된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 상기 소정 기간은 3 내지 10일 범위로부터 선택된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 상기 소정 기간은 7일이다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 글리세롤은 리터당 3 내지 20 그램의 농도 범위로 제공된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 글리세롤은 리터당 6 그램의 농도로 제공된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 배양 배지는 베라트릴 알콜을 추가로 포함한다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 베라트릴 알콜은 0.5 내지 4 mM 농도 범위로 제공된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 베라트릴 알콜은 2 mM 농도로 제공된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 리그닌 퍼옥시다제는 동위효소 H1이거나 동위효소 H2의 변형된 형태이다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 다공성 매트릭스는 폴리우레탄 발포체이다.
본 발명의 부가적인 일면에 따르면, 리터당 500 내지 2000 단위 범위의 리그닌 퍼옥시다제 효소 활성을 보이는 파네로케이트 크리소스포리움 진균의 수성 추출물이 제공된다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 리그닌 퍼옥시다제 활성은 리터당 1500 단위이다.
기재되는 바람직한 양태에서의 추가 특징에 따르면, 리그닌 퍼옥시다제 효소 활성은 동위효소 H1이거나 동위효소 H2의 변형된 형태이다.
본 발명은 피검자의 피부 영역 또는 모발을 미백하기 위한 효율적인 방법 및 이를 위한 조성물을 제공함으로써 현재 알려져 있는 구성의 단점을 성공적으로 역점을 두어 다룬다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 채용하는 모든 기술 용어 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의해 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 이하에서 후술된다. 대립되는 경우에, 정의를 포함한 특허 명세서는 조절될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시에 불과하며 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 본원에서 단지 예로서, 첨부 도면을 참조로 하여 설명된다. 이하, 상세하게 도면을 구체적으로 참조하여, 예시된 세부 사항은 예시적이고 본 발명의 바람직한 양태의 설명적인 논의를 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 원리와 개념적인 면의 가장 유용하고 용이하게 이해되는 설명이라고 생각되는 것을 제공하는 단초로 제시됨을 강조해 두고자 한다. 이러한 면에서, 본 발명의 본질적인 이해에 필요한 것 이상으로 본 발명의 구조적인 세부사항을 보여주려는 시도는 하지 않았으며, 발명의 상세한 설명과 첨부 도면을 취합하면 본 발명의 여러 형태가 어떻게 실제로 구현될 있는지가 당업자에게 자명해진다.
도면에서,
도 1은 Alaluf et al., 2001로부터 채용된 포유동물 멜라닌의 생합성에 대한 종래 기술의 개략적인 설명도이다.
도 2는 폴리우레탄 발포체상에 고정된 파네로케이트 크리소스포리움에 의한 리그닌 퍼옥시다제 생산을 위한 교반 탱크 반응기(STR)를 보여준다.
도 3은 배양액 수명의 함수로서 파네로케이트 크리소스포리움의 발효조 배양액에서의 LIP 활성을 보여준다. 실시예 섹션의 실시예 1에 기재된 바와 같이 파네로케이트 크리소스포리움을 STR 발효조에서 생장시킨 다음 실시예에 기재된 바와 같이 베라트릴 알콜을 베라트릴 알데하이드로 산화시킴으로써 세포외 유체에서 LIP 활성을 분석하였다. 에러 바(error bar)는 3회의 동일 복제 실험의 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 50 mM 타트레이트 완충액(pH 3.5) 중의 1.5 mM 베라트릴 알콜의 존재하에 과산화수소의 증가하는 농도의 함수로서 LIP (0.48 μM)에 의한, 70.5 ㎍/ml의 초기 농도에서 멜라닌의 산화를 나타낸다. 효소 반응의 개시 때 및 160초 후, 460 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 멜라닌의 산화를 측정하였고 산화된 멜라닌의 %를 계산하였다. 에러 바는 3회의 동일 복제 실험의 표준 편차를 나타낸다.
도 5는 LIP에 의한 멜라닌의 산화에 미치는 과산화수소의 증가하는 농도의 효과를 나타낸다. 멜라닌의 산화 정도는 과산화수소(0 μM)가 포함되지 않은 효소 반응과 비교하여 색의 강도 감소에 의해 가시화된다. 사진 밑의 수치는 μM로 표현한 H2O2의 농도를 표시한다.
도 6은 베라트릴 알콜(1.5 mM)과 과산화수소(600 μM)의 존재하에 50 mM 타트레이트 완충액(pH 3.5) 중의 LIP (0.48 μM)에 의한, 멜라닌의 상이한 농도에서의 산화를 나타낸다. 에러 바는 3회의 동일 복제 실험의 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 LIP 농도의 함수로서 멜라닌의 산화 정도를 나타낸다. 멜라닌(70 ㎍/ml)의 산화는 50 mM 타트레이트 완충액(pH 3.5) 중의 베라트릴 알콜(1.5 mM)과 과산화수소(700 μM)의 존재하에 LIP의 농도를 증가시킴으로써 수행되었다. 에러 바는 3회의 동일 복제 실험의 표준 편차를 나타낸다.
도 8a-b는 크림 제형에 사용될 때 LIP에 의한 멜라닌의 산화를 가시화한 것이다. LIP 크림에 활성제 크림의 첨가 후에는 멜라닌의 탈색이 관찰되지만(도 8b), LIP 크림만의 존재하에서는 탈색이 관찰되지 않았다.
도 9a-b는 피부 화이트닝에 미치는 LIP 크림의 효과를 나타낸다. 사진은 크림 제형의 LIP를 도포하고(1일 2회) 1주일 뒤에 촬영한 여성의 손의 사진이다. LIP로 처리한 영역(도 9a, 검은색 원으로 표시)이 손의 피부의 나머지 부분보다 한층 더 밝다(도 9b).
도 10은 생체내에서 모발 표백에 미치는 LIP의 효과를 나타낸다. 여성의 모발을 50 mM 카보네이트 완충액(pH 11.5)에 1시간 동안 담궜다. 모발을 10초간 25 U의 LIP와 예비 배양한 다음 베라트릴 알콜(1.5 mM)과 과산화수소(8.8 mM)의 존재하에 타트레이트 완충액(pH 3.5)에 1시간 동안 침치시켰다. LIP 없이 동일 용액으로 처리한 모발(도 10, 좌측 튜브)과 비교하여, LIP로 처리한 모발에서(도 10, 우측 튜브) 현저한 미백 효과가 관찰되었다.
도 11a-b는 피부 침투에 미치는 LIP 화이트닝 크림의 효과를 예시하는 연구대상 피검자 1번의 우측 전완의 컬러 사진이다. 도 11a - 0일에 촬영한 사진; 도 11b - 21일째에 촬영한 사진.
도 12a-c는 연구대상 피검자 1번에서 피부 화이트닝에 미치는 LIP 또는 하이드로퀴논 크림의 효과를 보여준다. LIP 또는 하이드로퀴논 크림을 우측 및 좌측 전완의 상부에 도포하면서 하부는 처리하지 않은 채 놔두었다. 피부 색소침착의 정도를 Derma Spectrometer를 사용하여 7일 간격으로 양측 전완에서 측정하였다. 도 12a - LIP 크림의 도포; 도 12b - 하이드로퀴논 크림의 도포; 청색 칼럼 - LIP 크림으로 처리한 우측 전완의 상부; 담청색 칼럼 - 우측 전완의 비처리 하부; 핑크색 칼럼 - 하이드로퀴논으로 처리한 좌측 전완의 상부; 백색 칼럼 - 좌측 전완의 비처리 하부; 도 12c는 LIP 크림(도 12c, 청색 라인) 또는 하이드로퀴논 크림(도 12c, 핑크색 라인)을 사용하여 처리 21일 후 상부 전완에서 피부 색소침착의 감소를 비교하는 선 그래프이다. 하이드로퀴논 크림을 사용한 경우에 보이는 온건한 감소에 비해, LIP 크림을 사용하여 처리 21일 후 피부 색소침착의 급격한 감소가 보임에 주목하라.
도 13a-b는 피부 침투에 미치는 LIP 화이트닝 크림의 효과를 예시하는 연구 대상 피검자 10번의 우측 전완의 컬러 사진이다. 도 13a - 0일에 촬영한 사진; 도 13b - 21일째에 촬영한 사진.
도 14a-c는 연구대상 피검자 10번에서 피부 화이트닝에 미치는 LIP 또는 하이드로퀴논 크림의 효과를 보여준다. LIP 또는 하이드로퀴논 크림을 우측 및 좌측 전완의 상부에 도포하면서 하부는 처리하지 않은 채 놔두었다. 피부 색소침착의 정도를 Derma Spectrometer를 사용하여 7일 간격으로 양측 전완에서 측정하였다. 도 14a - LIP 크림의 도포; 도 14b - 하이드로퀴논 크림의 도포; 청색 칼럼 - LIP 크림으로 처리한 우측 전완의 상부; 담청색 칼럼 - 우측 전완의 비처리 하부; 핑크색 칼럼 - 하이드로퀴논으로 처리한 좌측 전완의 상부; 백색 칼럼 - 좌측 전완의 비처리 하부; 도 14c는 LIP 크림(도 14c, 청색 라인) 또는 하이드로퀴논 크림(도 14c, 핑크색 라인)을 사용하여 처리 21일 후 상부 전완에서 피부 색소침착의 감소를 비교하는 선 그래프이다. 하이드로퀴논 크림을 사용한 경우에 보이는 온건한 감소에 비해, LIP 크림을 사용하여 처리 21일 후 피부 색소침착의 급격한 감소가 보임에 주목하라.
도 15a-b는 12명의 연구대상 피검자 모두에서 피부 화이트닝에 미치는 LIP 또는 하이드로퀴논 크림의 평균 효과를 예시하는 그래프이다. 도 15a - 평균 색소침착 스코어; 도 15b - 초기 색소침착 스코어의 분율로서 색소침착의 평균 감소.
바람직한 양태의 상세한 설명
본 발명은 피검자의 피부 영역 또는 모발의 미백에 사용될 수 있는 방법 및 화장품 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 방법은 기미, 간반, 검버섯, 주근깨, 조직 갈변증 및 흑자(黑子?lentigo)와 같은 과색소침착-관련 의학적 증상으로부터 오는 불규칙한 피부색의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 원리와 작동은 첨부 도면과 상세한 설명을 참조하여 좀더 잘 숙지될 수 있다.
본 발명의 적어도 일 양태를 상세하게 설명하기에 앞서, 본 발명은 하기의 상세한 설명에서 기재된 또는 실시예에 의해 예시된 세부 사항에 본원의 적용에 있어 제한받지 않음을 숙지하여야 한다. 본 발명은 타 양태일 수 있거나 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 채용되는 어구 및 용어는 설명을 위한 것이며 제한의 의미로 간주되어서는 아니 됨을 이해하여야 한다.
피부 색소침착의 정도는 일반인들 사이의 관심의 원천이다. 어떤 사람들은 검버섯과 임신 마크로 고생하고 있으며 그러한 색소침착된 반점이 덜 두드러지기를 원한다. 또 어떤 사람들은 피부의 색소침착을 연하고 매끄럽게 하는 피부 미백 제품으로 통상적으로 처치되는 주근깨, 간반, 기미, 조직갈변증 및 흑자로 고생한다. 그러나, 현재의 피부 미백 제품은 영구적인 백반과 색소이상증 및 발진 같은 부작용을 초래할 수 있는 하이드로퀴논 같은 거친 화학 물질이거나 피부 미백에 충분히 효율적이지 않다. 이러한 것들로는 전구체 L-타이로신을 제 2 전구체 도파퀴논으로 전환시키고 따라서 멜라닌의 생합성을 억제하는 효소인 타이로시나제의 억제에 기초한 제품이 있다. 다른 제품은 타이로신/DOPA에서 멜라닌으로의 다양한 지점에서의 산화 반응을 차단하여 궁극적으로는 멜라닌의 합성을 억제하도록 디자인 된다. 후자 그룹의 제품은 L-아스코빈산(비타민 C)과 바이오플라보노이드 같은 항산화제를 포함한다.
모발 미백 제품은 암모니아와 함께 고 농도의 과산화수소를 사용한다. 이러한 제품은 치료 대상자에게는 불쾌감의 근원이 될 수 있다.
후술되는 실시예 섹션에서 자명하게 예시되는 바와 같이, 본 발명자는 리그닌 퍼옥시다제, 특히 이의 H1 동위형이 멜라닌을 효율적으로 산화시킬 수 있고 따라서 피검자의 피부 또는 모발을 미백하는 데 사용될 수 있음을 밝혀 내었다.
비록 US 특허 5,578,296에서 배시디오마이시츠(Basidiomycetes) 진균에서의 멜라닌 분해능이 확인되고 간반 및 주근깨 치료를 위한 이러한 진균의 사용을 제시하고 있지만, 현재까지는 진균에서 멜라닌 분해를 담당하는 특이적 효소는 알려져 있지 않다.
따라서, 본 발명의 일면에 따르면, 피검자의 피부 영역 또는 모발을 미백하는 방법이 제공된다.
본 발명의 이러한 일면에 따른 방법은 피검자의 피부 영역 또는 모발에 적어도 1종의 리그닌 수식 효소를 피부 영역 또는 모발의 세포내에 함유된 색소(예를 들면, 멜라닌)를 산화시키기에 적당한 방식으로 적용함으로써 수행된다.
본원에서 사용되는 어구 "피부 영역 또는 모발을 미백하는"이란 피부 또는 모발에 함유된 멜라닌 색소의 색소 품질 또는 농도를 감소시킴으로써 피부 또는 모발의 색조 또는 색상을 감소시키는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "피검자(subject)"는 포유동물, 전형적으로는 인간, 바람직하게는 과도한 피부 또는 모발 색소침착, 또는 주근깨와 같은 피부 결함을 띠는 사람들을 말한다.
본 발명에 의해 사용되는 리그닌 수식 효소는 바람직하게는, 리그닌 분해에서 주 역할을 수행하는 리그닌 퍼옥시다제이다. 이러한 리그닌 수식 퍼옥시다제의 활성 부위 아미노산 서열 및 이러한 효소가 기질을 산화시키는 메커니즘은 호스래디시 퍼옥시다제(HRP) 및 소이빈 퍼옥시다제(SBP)의 것과 유사하다. 리그닌 수식 퍼옥시다제는 높은 산화환원 퍼텐셜로 기질의 산화를 촉매할 수 있다. 이러한 고유 능력은 높은 산화환원 퍼텐셜에 의해 표시되는[Cai and Tien (1993). J Biotechnol 30: 79-90], 저 전자 밀도의 헴 활성 부위와 일치한다.
비록 당업계에 공지된 리그닌 퍼옥시다제의 임의의 동위형이 본 발명에 의해 사용될 수 있지만(Rothschild et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:857- 861), 본 발명은 바람직하게는 H1 동위형을 사용하는데, 그 이유는 후술되는 실시예 섹션에서 예시되는 바와 같이 이러한 동위형이 시험관내 및 생체내 모두에서 멜라닌 산화 활성을 보이기 때문이다.
몇몇 방법이 본 발명에 의해 사용되는 리그닌 수식 효소의 제조에 사용될 수 있다.
예를 들면, 리그닌 퍼옥시다제 동위효소 H1은 진균 파네로케이트 크리소스포리움으로부터 제조될 수 있다. 리그닌 퍼옥시다제의 효소 활성의 고 수준은 상기 진균을 폴리우레탄 발포체 상에 또는 현탁액에 고정시킨 채로 교반 탱크 반응기(STR) 발효조에서 생장시킬 때 상기 진균으로부터 생산될 수 있다(Dosoretz et al., 1993, Appl Environ Microbiol. 59:1919-26).
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 발효조는 37℃의 배양 온도를 유지하기 위하여 냉각 시스템에 연결되며 50 내지 300 rpm, 더욱 바람직하게는 100 내지 200 rpm, 가장 바람직하게는 160 rpm의 속도로 교반된다. 리그닌 퍼옥시다제의 수율을 증가시키기 위해, 발효조는 분당 배양 배지 리터당 공기 0.1 내지 1 리터의 통기율로 통기된다. 현재의 바람직한 구성에 따르면, 발효조는 분당 배양 배지 리터당 공기 0.2 리터의 통기율로 통기된다.
후술되는 실시예 섹션의 재료 및 실험 방법하에 기재된 바와 같이, 파네로케이트 크리소스포리움을 망간 이온이 결여되고 탄소원으로서 글리세롤을 함유하는 배양 조건하에서 배양시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 글리세롤은 리터당 3 내지 20 그램의 농도 범위로 제공된다. 현재의 바람직한 구성에 따르면, 글리세롤은 리터당 6 그램의 농도로 제공된다.
상기 진균으로부터 리그닌 퍼옥시다제 동위효소 H1의 정제 과정 동안, 정제된 단백질의 효소 활성은 베라트릴 알콜의 베라트릴 알데하이드로의 산화에 기인하여 발생하는 310 nm에서의 흡광도 변화에 의해 추가로 시험된다.
리그닌 퍼옥시다제 동위효소 H1은 동위효소 H2의 전사 후 탈인산화로부터 생성될 수 있으므로(Kuan and Tien, 1989), 본 발명에 의해 사용되는 리그닌 퍼옥시다제는 리그닌 퍼옥시다제 동위효소 H2를 탈인산화시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 의해 사용되는 리그닌 수식 효소는 또한 US 특허 5,200,338에 개 시된 바와 같이 리그닌 수식 효소를 발현하도록 변형된 박테리아 세포로부터 추출될 수 있다. 예를 들면, 이.콜라이와 같은 박테리아 세포를 강력한 구조성(constitutive) 프로모터(예를 들면, SP6)의 조절적인 통제하에 위치된 LIP 암호화 서열(서열번호 1)을 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 발현 후, 박테리아 세포를 용해시켜 LIP를 크로마토그래피 기술을 이용하여 수집할 수 있다(좀더 상세한 세부 사항에 대해서는 하기 참조: Billman-Jacobe, 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 500-4; Harris and Emtage, 1986, Microbiol. Sci. 3: 28-31).
본 발명에 의해 사용되는 리그닌 수식 효소는 또한 HeLa 세포와 같은 포유동물 세포주로부터 추출될 수 있다. 이 경우에, LIP 암호화 서열은 적당한 발현 벡터(예를 들면, pCDNA3.1, Invitrogen Life Technologies, Frederick, MD, USA)내에 강력한 포유동물 프로모터(예를 들면, CMV)하에 위치된다. HeLa 세포를 발현 벡터로 형질감염시킨 후, LIP 발현 산물은 통상의 정제 및 크로마토그래피 기술(좀더 상세한 세부 사항에 대해서는 하기 참조: Cunha and Aires-Barros, 2002. Mol. Biotechnol. 20: 29-40)에 의해 세포 또는 배지로부터(예를 들면, 분비 신호를 포함도록 LIP 서열을 변형시킴으로써) 추출될 수 있다.
비록 리그닌 수식 효소는 부가적인 화합물의 병행(co)-적용의 필요없이 피부 또는 모발에 적용될 수 있지만, 리그닌 수식 효소 LIP의 미백능은 산화 활성제로서 작용하는 전자 수용체(즉, 기질을 산화할 수 있는 분자)의 존재하에, 및/또는 베라트릴 알콜(Harvey et al., 1992, Biochem Soc Trans 20: 345-9), 및 산화 매개물질로 작용하는 베라트롤과 같은 페놀 화합물의 존재하에 적용될 때 증진된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 리그닌 수식 효소는 과산화수소 같은 산화 활성제와 베라트릴 알콜 같은 산화 매개물질의 선행, 동시 또는 후속 적용과 함께 적용된다.
리그닌 수식 효소는 그 자체로 피부 또는 모발에 적용될 수 있지만, 미백 효율을 증가시키기 위해서, 리그닌 수식 효소는 바람직하게는, 예를 들면 일반적인 피부 미백, 주근깨 미백 또는 모발 미백 같은 특정의 용도를 위해 제형되는 화장품 조성물에 포함된다. 이러한 화장품 조성물은 부틸렌 글리콜 및 트랜스큐톨과 같은 표피 침투제 및 알칸올 아민 같은 모발 침투제를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "화장품 조성물"이란 상기 활성 성분(예를 들면, LIP) 및 생리학적으로 적당한 담체 및 부형제, 산화 안정제 및/또는 산화 매개물질 같은 부가적인 화학 성분을 포함하는 제제를 말한다. 화장품 조성물의 목적은 유기체에 활성 성분의 투여를 촉진하는 것이다.
이하에서, 사용되는 어구 "적당한 담체"는 유기체에 심각한 과민증을 유발하지 않고 리그닌 수식 효소의 생물학적 활성과 특성을 폐기하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다.
본원에서 사용되는 어구 "부형제"란 활성 성분의 투여를 더욱 촉진하기 위하여 화장품 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다. 제한없이 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당류와 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다.
화장품 조성물은 국소적인 방법으로, 예를 들면, 환자의 조직 영역에 직접 화장품 조성물을 투여함으로써 적용될 수 있다. 적당한 투여 경로는 예를 들면, 국소, 피하 및 피내 주사가 포함될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물은 당업계에 익히 공지된 공정에 의해, 예를 들면 통상의 혼합, 용해, 제립, 당의정 제조, 레비게이팅, 유화, 캡슐화, 인트랩핑 또는 동결건조 과정에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 화장품 조성물은 따라서 활성 성분의 제제로의 가공을 촉진하는, 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하는 통상의 방식으로 제형될 수 있다. 적당한 제형은 선택된 투여 방식에 좌우된다.
주사를 위해, 화장품 조성물의 활성 성분은 수용액에서, 바람직하게는 행크 용액, 링거 용액 또는 생리학적 염 완충액 같은 생리학적으로 적합한 완충액에서 제형될 수 있다.
이와 달리, 활성 성분은 사용에 앞서 적당한 비히클, 예를 들면, 멸균성의 발열원 비-함유수 용액으로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
치료 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 설명에 비추어, 당업자의 역량 안에 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 제제에 대해, 치료 유효량 또는 복용량은 시험관내 분석으로부터 초기에 평가될 수 있다. 실시예 섹션에 나타낸 바와 같이, LIP 및 과산화수소의 농도는 시험관내 분석으로부터 최적화될 수 있고 또한 시험관내 사용을 위해 적용될 수 있다. 또한, 복용량은 목적하는 농도 또는 역가를 달성하기 위하여 조직 배양 시스템 또는 동물 모델에서 제형될 수 있다. 그러한 정보는 사람에 있어서 유용한 복용량을 좀더 정확히 결정하는 데 사용될 수 있다.
피부 색소침착 장애(예를 들면, 간반, 기미, 조직 갈변증 및 흑자)의 중증도 및 피부의 반응성에 따라, 복용은 수 일 내지 수 주간에 걸쳐 지속되는 치료 과정으로 또는 치유가 이루어지거나 피부 장애의 감소가 달성될 때까지 단일 투여 또는 복수회 투여될 수 있다.
투여되는 조성물의 양은 물론 치료하고자 하는 피검자, 증상의 중증도, 투여 방식, 처방 의사의 판단에 좌우될 것이다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 리그닌 수식 효소는 또한 좀더 높은 농도로 제공될 수 있으며 간반, 기미, 조직 갈변증 및 흑자와 같은 피부 색소침착 장애를 치료하기 위한 약학 조성물로서 의사에 의해 처방될 수 있다.
리그닌 수식 효소를 혼입하고 피부 또는 모발 미백용으로 제형된 제형의 설명이 후술된다.
피부 미백
피부 미백을 최적화하고 조절하기 위하여, 리그닌 수식 효소는 바람직하게는 피부 미백 목적으로 제형되는 화장품 조성물에 포함된다.
본 발명의 피부 미백 화장품 조성물은 생체내에서 이용되므로, 조성물은 바람직하게는 예를 들면 최소한 National Food(NF) 등급, 일반적으로는 최소한 분석 등급, 바람직하게는 최소한 제약학적 등급에서 잠정적으로 유해한 오염물을 실질적으로 함유하지 않으며 고순도이다. 소정의 화합물이 사용에 앞서 합성되어야 하므로, 그러한 합성 또는 후속 정제는 바람직하게는 합성 또는 정제 절차 동안에 사용될 수 있는 잠재적으로 오염시키는 유독성 제제가 실질적으로 없는 제품을 생성하여야 한다.
활성 성분
리그닌 퍼옥시다제와 같은 리그닌 수식 효소는 1 내지 100 U/그램 범위로부터 선택된 농도로 본 발명의 화장품 조성물에 포함된다. 현재 알려져 있는 구성에 따르면, 본 발명의 화장품 조성물에 포함된 리그닌 수식 효소는 5 내지 100 U/그램 범위로부터 선택된 농도로 제공된다. 리그닌 수식 효소의 바람직한 농도는 조성물의 특정 용도에 따라 선택됨이 감지될 것이며, 따라서 일반적인 피부 미백을 위해서는, 5 내지 20 U/그램의 바람직한 농도가 사용되는 반면에, 주근깨 미백을 위해서는 5 내지 100 U/그램의 좀더 넓은 범위의 농도가 사용된다.
피부 미백 화장품 조성물에 의해 사용되는 전자 수용체(산화 활성제)는 바람직하게는 적어도 0.005%의 농도로 제공된 과산화수소이다. 과산화수소는 안정하지만, 중성 또는 알칼리 조건하에서는 분해되어 물과 산소의 활성 종을 형성하게 될 것이다. 산소의 활성 종은 매우 반응성이다.
리그닌 퍼옥시다제는 단지 4 이하의 pH에서, 바람직하게는 pH 2.5 내지 3.5에서 활성을 띠고 과산화수소는 그러한 pH에서 안정하므로, 화장품 조성물은 바람 직하게는 4 이하의 pH로 완충된다.
4 이하의 pH를 유지할 수 있는 임의의 완충액이 사용될 수 있다. 따라서, 아세트산, 타타르산, 인산 또는 시트르산을 사용하는 완충액이 피부 미백 화장품 조성물에 의해 사용될 수 있다.
하기 실시예 섹션에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 과산화수소는 인산으로 pH 3.5로 안정화된다.
본 발명에 의해 사용되는 산화 매개물질은 소형 방향족 분자 또는 좀더 구체적으로는 리그닌 수식 효소의 산화전위와 안정성을 증가시키는 메톡실화된 화합물이다. 본 발명에 의해 사용되는 바람직한 산화 매개물질은 베라트릴 알콜 및 베라트롤이다.
실시예 섹션에서 증명되는 바와 같이, 본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 베라트릴 알콜은 바람직하게는 적어도 0.05%의 농도로 물에 희석된다.
표피 침투제
활성 성분(예를 들면, LIP)의 경피 흡수를 증진하기 위하여, 디메틸설폭사이드, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 계면활성제, 아존, 알콜, 아세톤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜(이에 한정되지 않음)을 포함한 1종 이상의 다수의 제제가 화장품 조성물에 첨가될 수 있다.
후술되는 실시예 섹션에서 예시되는 바와 같이, 리그닌 수식 효소인 LIP, 및 활성제인 과산화수소는 바람직하게는 각각 부틸렌 글리콜 및 트랜스큐톨 같은 표피 침투제와, LIP의 피부 침투를 증진시키기 위해 최적화된 방식과 농도로 혼합된다. 본 발명에 의해 사용되는 부틸렌 글리콜은 적어도 1%의 농도로 제공되고, 트랜스큐톨은 적어도 3%의 농도로 제공된다.
담체
본원에 개시된 약학적 유효량의 제제 외에, 본 발명의 이러한 일면에 따른 화장품 조성물은 또한 피부과학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
"피부과학적으로 허용되는 담체"라는 어구는 피부, 즉 케라틴 조직에의 국소 적용에 적합하고, 양호한 심미성을 지니며, 본 발명의 활성 성분 및 여타 성분과 상용성이며, 포유동물에 사용하기에 안전하고 무독한 담체를 말한다. 담체의 유효량은 조성물의 약 50% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 80 내지 약 99.9 중량%, 더욱 바람직하게는 약 90% 내지 약 98 중량%, 가장 바람직하게는 약 90% 내지 약 95 중량% 범위에서 선택된다.
에멀션
본 발명의 조성물에 사용되는 담체는 광범위의 다양한 형태일 수 있다. 이러한 담체에는 수중유, 유중수, 수중 유중수, 실리콘 에멀션중의 수중유를 포함한(이에 한정되지 않음) 에멀션 담체, 크림, 연고, 수용액, 로션 또는 에어로졸이 포함된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 주어진 성분은 조성물내 성분의 수용성/분산성에 따라, 물 또는 오일/실리콘 상 중으로 주로 분포될 것이다.
본 발명에 따른 에멀션은 일반적으로 본원에 개시된 제제의 약학적 유효량 및 지질 또는 오일을 함유한다. 지질 및 오일은 동물, 식물, 또는 석유로부터 유래될 수 있거나 천연 또는 합성(즉, 인공) 기원일 수 있다. 바람직한 에멀션은 또한 글리세린 같은 보습제도 함유한다. 에멀션은 바람직하게는, 담체의 중량을 기준으로, 유화제 약 1 내지 약 10%, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 약 5%를 추가로 함유할 것이다. 적합한 유화제는 예를 들면, 1973년 8월 28일자로 Dickert 등에게 허여된 US 특허 No. 3,755,560; 1983년 12월 20일자로 Dixon 등에게 허여된 US 특허 No. 4,421,769; 및 McCutcheon's Detergents and Emulsifiers, North American Edition, pages 317-324 (1986)에 기재되어 있다.
에멀션은 또한 케라틴 조직에의 적용시에 발포 현상을 최소화하기 위하여 소포제를 함유할 수 있다. 소포제는 그러한 용도를 위해 당업계에 익히 알려져 있는 고분자량 실리콘과 기타 재료를 포함한다.
적합한 에멀션은 목적하는 제품형에 따라 광범위의 점도를 띨 수 있다. 바람직한 예시적인 저 점도 에멀션은 약 50 센티스토크 이하, 더욱 바람직하게는 약 10 센티스토크 이하, 가장 바람직하게는 약 5 센티스토크 이하의 점도를 갖는다. 에멀션은 또한 케라틴 조직에의 적용시 발포를 최소화하기 위하여 소포제를 함유할 수 있다. 소포제로는 그러한 용도를 위해 당업계에 익히 알려져 있는 고분자량 실리콘과 기타 재료를 포함한다.
에멀션 중 한 유형은 실리콘중수 에멀션이다. 실리콘중수 에멀션은 연속 실리콘 상과 분산된 수성 상을 함유한다. 본 발명의 바람직한 실리콘중수 에멀션은 연속 실리콘 상을 약 1 내지 약 60 중량%, 바람직하게는 약 5 내지 약 40 중량%, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 20 중량%를 포함한다. 연속 실리콘 상은 후술되는 불연속 수성 상을 함유하거나 이를 둘러싸는 외부 상으로서 존재한다.
연속 실리콘 상은 폴리오가노실록산 오일을 함유할 수 있다. 바람직한 수중 실리콘 에멀션 시스템은 본원에 개시된 약학적 유효량의 제제를 전달하기 위한 산화적으로 안정한 비히클을 제공하도록 제형된다. 이러한 바람직한 에멀션의 연속 실리콘 상은 약 50 내지 약 99.9 중량%의 오가노실록산 오일 및 약 50 중량% 이하의 비-실리콘 오일을 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 연속 실리콘 상은 연속 실리콘 상의 적어도 약 50 중량%, 바람직하게는 약 60 T 약 99.9 중량%, 더욱 바람직하게는 약 70 내지 약 99.9 중량%, 한층 더 바람직하게는 약 80 내지 약 99.9 중량%의 폴리오가노실록산 오일, 및 연속 실리콘 상의 약 50 중량% 이하, 바람직하게는 약 40% 이하, 더욱 바람직하게는 약 30% 이하, 한층 더 바람직하게는 약 10 중량% 이하, 가장 바람직하게는 약 2 중량% 이하의 비-실리콘 오일을 포함한다. 이들 유용한 에멀션 시스템은 저 농도의 폴리오가노실록산 오일을 함유하는 필적하는 유중수 에멀션보다 장기간에 걸쳐서 더 산화적 안정성을 제공할 수 있다. 연속 실리콘 상 중의 비-실리콘 오일의 농도는 조성물 중의 본 발명의 활성 화합물의 산화적 안정성을 가능하게는 좀더 증진시키기 위하여 최소화하거나 전부 회피된다. 이러한 유형의 실리콘중수 에멀션은 1997년 11월 25일자로 허여된, Mason 등의 US 특허 No. 5,691,380에 기재되어 있다.
조성물에 사용하기 위한 오가노폴리실록산 오일은 휘발성, 비-휘발성, 또는 휘발성 및 비-휘발성 실리콘의 혼합물일 수 있다. 이러한 맥락에서 사용되는 용어 "비-휘발성"이란 주위 조건하에서 액체이고 약 100℃ 이상의 인화점(1 기압하에서)을 갖는 실리콘을 말한다. 이러한 맥락에서 사용되는 용어 "휘발성"이란 모든 다른 실리콘 오일을 말한다. 적합한 오가노폴리실록산은 광범위의 휘발성과 점도에 걸친 광범위의 실리콘 중에서 선택될 수 있다. 적합한 오가노폴리실록산 오일의 예로는 당업자에게 공지되어 있으며 시판되고 있는, 폴리알킬실록산, 사이클릭 폴리알킬실록산 및 폴리알킬아릴실록산이 포함된다.
연속 실리콘 상은 1종 이상의 비-실리콘 오일을 함유할 수 있다. 연속 실리콘 상 중의 비-실리콘 오일의 농도는 조성물 중의 약학적으로 유효한 제제의 산화적 안정성을 좀더 증진시키기 위하여 최소화하거나 전부 회피된다. 적당한 비-실리콘 오일은 약 1기압에서 약 25℃ 이하의 융점을 갖는다. 연속 실리콘 상에 사용하기에 적합한 비-실리콘 오일의 예는 유중수 에멀션, 예를 들면 미네럴 오일, 식물성 오일, 합성 오일, 반합성 오일 등의 형태의 국소용 개인 관리 제품에 있어서 화학 분야에 잘 알려진 것들이다.
본 발명의 유용한 국소용 조성물은 약 30 내지 약 90%, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 85%, 가장 바람직하게는 약 70 내지 약 80%의 분산된 수성상을 포함한다. "분산된 상"이란 용어는 당업자에 익히 알려져 있으며 상이 연속상에 현탁되고 이에 의해 둘러싸이는 소형 입자 또는 소적으로서 존재함을 의미한다. 분산된 상은 또한 내부상 또는 불연속상으로도 알려져 있다. 분산된 수성상은 전술한 바의 연속 실리콘 상에 현탁되어 이에 의해 둘러싸이는 소형 수성 입자 또는 소적 의 분산액이다. 수성상은 물, 또는 물과 1종 이상의 수용성 또는 분산성 성분의 조합일 수 있다. 이러한 임의 성분의 비-제한적인 예로는 증점제, 산, 염기, 염, 킬레이트화제, 고무, 수용성 또는 분산성 알콜 및 폴리올, 완충제, 방부제, 스크리닝제, 착색제 등이 있다.
본 발명의 국소용 조성물은 전형적으로, 조성물의 중량 기준으로 분산된 수성상에 약 25 내지 약 90%, 바람직하게는 약 40 내지 약 80%, 더욱 바람직하게는 약 60 내지 약 80%의 물을 포함한다.
본 발명의 수중 실리콘 에멀션은 바람직하게는 유화제를 포함한다. 바람직한 양태에서, 조성물은 조성물의 중량 기준으로, 약 0.1 내지 약 10%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 7.5%, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 5%의 유화제를 함유한다. 유화제는 연속 실리콘 상 내부에 수성상의 분산 및 현탁에 도움을 준다.
광범위의 유화제가 본원에서 바람직한 실리콘중수 에멀션 형성에 사용될 수 있다. 공지의 또는 통상의 유화제가 조성물에 사용될 수 있으며, 단 선택된 유화제는 조성물의 필수 성분과 화학적으로 및 물리적으로 상용성이고 목적하는 분산 특징을 제공하여야 한다. 적당한 에멀션은 실리콘 유화제, 예를 들면, 국소용 개인 관리 제품에 사용하기 위해 당업자에 의해 알려져 있는, 실리콘 계면활성제, 비-실리콘 함유 유화제, 및 이들의 혼합물로서 당업자에게 또한 공지되어 있는, 유기적으로 변형된 오가노폴리실록산을 포함한다.
유용한 유화제는 광범위의 실리콘 유화제를 포함한다. 이들 실리콘 유화제는 전형적으로는, 또한 당업자에게 실리콘 계면활성제로도 알려져 있는 유기적으로 변형된 오가노폴리실록산이다. 적합한 유화제는 예를 들면, Allured Publishing Corporation에서 간행된 McCutcheon's Detergents and Emulsifiers, North American Edition; 1991년 4월 30일자로 허여된 Ciotti 등의 US 특허 5,011,681; 1983년 12월 20일자로 허여된 Dixon 등의 US 특허 No. 4,421,769; 및 1973년 8월 28일자로 허여된 Dickert 등의 US 특허 No. 3,755,560에 기재되어 있다.
기타 바람직한 국소용 담체는 연속 수성상과 거기에 분산되는 소수성 수-불용성 상("오일상")을 갖는 수중유 에멀션을 포함한다. 수중유 에멀션을 포함하는 적당한 담체의 예는 1991년 12월 17일자로 허여된 Turner, D. J. 등의 US 특허 No. 5,073,371, 및 1991년 12월 17일자로 허여된 Turner, D. J. 등의 US 특허 No. 5,073,372에 기술되어 있다, 구조화제(structuring agent), 친수성 계면활성제 및 물을 함유하는 특히 바람직한 수중유 에멀션이 이하에서 상세히 기술된다.
바람직한 수중유 에멀션은 액체 결정질 겔 네트워크 구조의 형성에 도움을 주기 위한 구조화제를 포함한다. 이론에 제한됨이 없이, 구조화제는 조성물의 안정성에 기여하는 유동학적 특징을 조성물에 제공하는 데 도움을 주는 것으로 생각된다. 구조화제는 또한 유화제 또는 계면활성제로도 작용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 조성물은 조성물의 중량 기준으로, 약 0.5 내지 약 20%, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 10%, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 5%의 구조화제를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구조화제는 스테아린산, 팔미트산, 스테아릴 알콜, 세틸 알콜, 베헤닐 알콜, 스테아린산, 팔미트산, 평균 약 1 내지 약 21개의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는 스테아릴 알콜의 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 평균 약 1 내지 약 5개의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는 세틸 알콜의 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
광범위의 음이온계 계면활성제도 본원에서 유용하다. 1975년 12월 30일자로 허여된 Laughlin 등의 US 특허 No. 3,929,678 참조. 또한, 양쪽성 및 쯔비터이온계 계면활성제 또한 유용하다.
바람직한 수중유 에멀션은 수성상에 소수성 물질을 분산시킬 수 있는 적어도 1종의 친수성 계면활성제를 약 0.05 내지 약 10%, 바람직하게는 약 1 내지 약 6%, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 3% 포함한다(국소용 담체의 중량%). 계면활성제는 최소한도로 수중에 분산되기에 충분할 정도로 친수성이어야 한다. 적당한 계면활성제는 광범위의 공지의 양이온계, 음이온계, 쯔비터이온계, 및 양쪽성 계면활성제를 포함한다. 참조: Allured Publishing Corporation에서 간행된 McCutcheon's Detergents and Emulsifiers, North American Edition; 1991년 4월 30일자로 허여된 Ciotti 등의 US 특허 5,011,681; 1983년 12월 20일자로 허여된 Dixon 등의 US 특허 No. 4,421,769; 및 US 특허 No. 3,755,560에 기재되어 있다. 선택되는 정확한 계면활성제는 조성물의 pH 및 존재하는 타 성분에 따라 좌우된다. 바람직한 것은 양이온계 계면활성제, 특히 디알킬 4급 암모늄 화합물이며 이들의 예는 1992년 9월 29일자로 허여된 McCall 등의 US 특허 No. 5,151,209; 1992년 9월 29일자로 허여된 Steuri 등의 US 특허 No. 5,151,210; US 특허 No. 5,120,532; US 특허 No. 4,387,090; US 특허 No. 3,155,591; US 특허 No. 3,929,678; US 특허 No. 3,959,461; McCutcheon's, Detergents & Emulsifiers (North American edition 1979) M. C. Publishing Co.; 및 Schwartz, et al., Surface Active Agents, Their chemistry and Technology, New York: Interscience Publishers, 1949에 기재되어 있다.
이와 달리, 다른 유용한 양이온계 유화제는 아미노-아미드를 포함한다. 이러한 양이온계 유화제의 비-제한적인 예로는 스테아르아미도프로필 PG-디모늄 클로라이드 포스페이트, 베헨아미도프로필 PG 디모늄 클로라이드, 스테아르아미도프로필 에틸디모늄 에토설페이트, 스테아르아미도프로필 디메틸 (미리스틸 아세테이트) 암모늄 클로라이드, 스테아르아미도프로필 디메틸 세테아릴 암모늄 토실레이트, 스테아르아미도프로필 디메틸 암모늄 클로라이드, 스테아르아미도프로필 디메틸 암모늄 락테이트, 및 이들의 혼합물이 포함된다.
바람직한 수중유 에멀션은 국소용 담체를 약 25 내지 약 98 중량%, 바람직하게는 약 65 내지 약 95 중량%, 더욱 바람직하게는 약 70 내지 약 90 중량%를 포함한다.
국소용 조성물
화장품 조성물은 후술되는 바와 같이 용액, 로션, 스프레이, 크림, 연고, 고약, 겔 등을 포함한 피부 적용을 위한 화장품 업계에 의해 사용되는 다양한 형태로 제형될 수 있다.
바람직하게는, 화장품 조성물은 처리되는 피부 영역상에 잔류하기에 충분한 점성을 띠게 제형되고, 손쉽게 증발하지 않으며, 및/또는 물로 세정시에 용이하게 제거되지 않으며, 오히려 비누, 클렌저 및/또는 샴푸의 보조하에 제거 가능하다.
이러한 성질을 지닌 조성물의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990 (supra); and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed., Williams & Wilkins (1995)에 상세히 설명되어 있다.
담체
로션 및 크림(이에 한정되지 않음)을 포함한 본 발명의 국소용 조성물은 피부과학적으로 허용되는 피부 연화제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 바람직하게는 약 2 내지 약 50%의 피부 연화제를 함유한다. 본원에서 사용되는 용어 "피부 연화제"는 건조의 예방 또는 완화, 및 피부의 보호에 유용한 물질을 말한다. 광범위의 적당한 피부 연화제가 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 피부 연화제로서 적합한 물질의 다수 예가 실려있는 Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, pp. 3243 (1972) 참조. 바람직한 피부 연화제는 글리세린이다. 글리세린은 바람직하게는 약 0.001 내지 약 20%, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 약 10%, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 5%, 예를 들면 3%의 양으로 사용된다.
본 발명에 따른 로션 및 크림은 일반적으로 용액 담체 시스템 및 1종 이상의 피부 연화제를 포함한다. 로션은 통상적으로 약 1 내지 약 20%, 바람직하게는 약 5 내지 약 10%의 피부 연화제; 약 50 내지 약 90%, 바람직하게는 약 60 내지 약 80%의 물; 및 본원에 기재된 제제의 약학적 유효량을 포함한다. 크림은 통상적으로 약 5 내지 약 20%, 바람직하게는 약 10 내지 약 20%의 피부 연화제; 약 45 내지 약 85%, 바람직하게는 약 50 내지 약 75%의 물; 및 본원에 기재된 제제의 약학적 유효량을 포함한다.
본 발명의 국소 적용된 화장품 조성물은 또한, 예를 들면 화장품 조성물에 방향과 피부 영양 요소를 풍부히 하기 위하여 첨가되는 부가 성분을 포함할 수 있다.
이러한 성분은 건전한 의학적 판단 범위내에서 독성, 비화합성, 불안정성, 알레르기 반응 등을 유발함이 없이 인간 케라틴 조직에 사용하기에 적합하도록 선택된다. 또한, 이러한 임의 성분은 이들이 본 발명의 활성 화합물의 혜택을 용인할 수 없게 변경시키지 않는 한 유용하다.
The CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992)에는 본 발명의 조성물에 사용하기에 적합한, 피부 관리 업계에서 통용되고 있는 광범위의 다양한 비-제한적인 화장품 성분이 기재되어 있다. 이들 성분 부류의 예로는 연마제, 흡수제, 심미 성분, 예를 들면 방향제, 피전트(pigent), 착색제, 정유, 스킨 센세이트(skin sensate), 수렴제 등(예를 들면, 클로버 오일, 멘톨, 캠포, 유칼립투스 오일, 유제놀, 멘틸 락테이트, 아메리카 풍년화), 항-좌창제, 항-케이킹제, 소포제, 항-미생물제(예를 들면, 아이오도프로필 부틸카바메이트), 항산화제, 결합제, 생물학적 첨가제, 완충제, 벌킹제, 킬레이트화제, 화학 첨가제, 착색제, 화장품용 수렴제, 화장품용 살충제, 변성제, 약물 수렴제, 외용 진통제, 조성물의 성막 특성 및 지속성(substantivity)을 보조하기 위한, 막 형성제 또는 물질, 예를 들면, 중합체, 불투명화제, pH 조절제, 추진제, 환원제, 격리제, 피부-컨디셔닝제(예를 들면, 미셀러니어스 miscellaneous 및 폐색제 occlusive를 포함한 보습제), 피부 진정제 및/또는 치유제(예를 들면, 판테놀 및 유도체(예를 들면, 에틸 판테놀), 알로에 베라, 판토테닌산 및 이의 유도체, 알란토인, 비사볼롤, 및 이칼륨 글리피지네이트), 피부 처리제, 증점제, 및 비타민과 이들의 유도체가 있다.
화장품 조성물은 피부에 직접 적용될 수 있다. 이와 달리, 화장품 조성물은 시간 방출 방식으로 피부 중으로 조성물을 방출하는 경피용 패치와 같이, 당업계에 공지되어 있는 각종 경피용 약제 전달 시스템에 의해 정상 피부 적용을 통해 전달될 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 다른 약물 전달 시스템은 가압 에어로졸 바틀, 이온 영동 요법(iontophoresis) 또는 초음파 투입법(sonophoresis)을 포함한다. 이온 영동 요법은 피부 투과성을 증가시키고 경피 전달을 촉진하는 데 사용된다. US 특허 No. 5,667,487 및 5,658,247은 피부를 가로질러 치료제의 초음파-이온 영동 요법적으로 매개된 수송에 적합한 이오노소닉(ionosonic) 장치를 개시하고 있다. 이와 달리, 또는 부가적으로, 리포좀 또는 미셀이 또한 전달 비히클로서 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 활성 성분은 멜라닌의 산화를 통해 피부 미백에 적합하다. 그러나, 산화 반응은 필요시에 환원제의 첨가에 의해 조절되고 정지될 수 있다. 이러한 시약은 별도의 화장품 조성물로 제형되어 원할 때에 피부에 적용될 수 있다.
모발 미백
활성 성분
본 발명의 교시에 따라 제형된 모발 미백 조성물은 전술한 산화제 및 매개물질을 포함한다.
하기 실시예 섹션에서 증명되는 바와 같이, 모발 미백은 타트레이트 완충액(pH 3.5) 중의 1.5 mM 베라트릴 알콜 및 8.8 mM 과산화수소의 존재하에 달성될 수 있다.
피부 연화제
피부 연화제로는 올리브 오일, 팜 오일, 콘 오일, 대두 오일과 이의 유도체, 라놀린과 이의 유도체, 예를 들면, 라놀린, 라놀린 오일, 라놀린 왁스, 라놀린 알콜 등과 같은 식물성 및 동물성 오일과 지방이 포함되며, 이에 한정되지 않는다. 기타 피부 연화제로는 메틸 미리스테이트, 프로필 미리스테이트, 부틸 미리스테이트, 프로필 스테아레이트, 프로필 이소스테아레이트, 프로필 팔미테이트 등과 같이, 미리스트산, 스테아린산, 이소스테아린산, 팔미트산 등 탄소수 10 내지 20의 지방산의 에스테르가 포함된다. 다른 피부 연화제는 스테아린산, 미리스트산, 라우르산, 이소스테아린산, 팔미트산 등을 포함하여 탄소수 10 내지 20의 지방산을 포함한다. 피부 연화제는 또한 세틸, 미리스틸, 라우릴, 이소스테아릴, 스테아릴 등과 같이 탄소수 10 내지 20의 지방 알콜을 포함한다.
비록 일부는 수용성이지만, 프로필렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 200-500 등과 같이 글리콜, 글리세롤, 솔비톨, 폴리알킬렌 글리콜 등을 포함한 다가 알콜 및 폴리에테르 유도체가 피부 연화제로서 포함된다. 수용성의 예들이 바람직하다.
계면활성제
본 발명의 모발 미백 조성물에 의해 바람직하게는 유화제/계면활성제 또한 사용된다.
계면활성제의 예로는 소수성 알킬, 알켄, 또는 축합에 이용될 수 있는 유리 반응성 수소를 갖는 알킬 방향족 작용 그룹과 친수성 알킬렌 옥사이드, 폴리에틸렌 옥사이드, 프로필렌 옥사이드, 부틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 옥사이드 또는 폴리에틸렌 글리콜과의 폴리옥시알킬렌 옥사이드 축합 산물이 포함되며 이에 한정되지 않는다. TRITON 100R 시리즈 제품이라는 이름으로 Rohm & Haas Company에 의해 판매되고 있는 약 7 내지 약 13 몰의 에틸렌 옥사이드를 갖는 옥틸페놀의 축합 산물이 특히 효과적이다.
방향제, 안정제, 염료, 항미생물제, 항균제, 항-응집제, 자외선 흡수제 등과 같은 기타 성분이 또한 본 발명의 모발 미백 조성물에 포함된다.
컨디셔너
에톡실화 모노쿼트(monoquat)과 함께 적어도 하나의 4급 암모늄 잔기를 갖는 실리콘 화합물 같이 산 가수분해에 안정한 컨디셔너제가 바람직하게는 또한 본 발명의 모발 미백 조성물을 안정화하고 임의로는 농화시키기 위해 사용된다.
또한 임의의 증점제를 포함시켜 조성물의 심미성을 향상시키고 조성물의 모발에의 적용을 촉진시킬 수 있다. 0 내지 약 3 중량%의 비-이온계 증점제가 바람직하다. 예시적인 증점제는 메틸셀룰로스, 하이드록시부틸 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸 에틸셀룰로스 및 하이드록시에틸셀룰로스, 디(수소화 탤로우)프탈산 아미드, 가교된 말레인산 무수물-메틸 비닐 에테르 공중합체, 구아 고무, 잔탄 고무 및 아라비아 고무이다.
컨디셔닝 조성물의 담체는 주로 물이지만, 유기 용매도 조성물의 제조를 촉진하기 위하여 또는 점도 조절 같은 심미성을 제공하기 위하여 포함될 수 있다. 적당한 용매는 에틸 알콜 및 이소프로필 알콜 같은 저급 알콜; 2-부톡시에탄올, 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 프로필렌 글리콜 및 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 또는 모노메틸 에테르 같은 글리콜 에테르; 및 이들의 혼합물을 포함한다. 비-수성 용매는 조성물내 담체의 총 중량 기준으로, 약 1 내지 약 50 중량%, 특히 약 5 내지 약 25 중량%의 양으로 본 발명의 컨디셔닝 조성물에 존재할 수 있다.
불투명 컨디셔너에 사용될 수 있는 비-제한적인 컨디셔닝제는 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드; 베헨트리메틸암모늄 클로라이드; 세트리모늄 브로마이드; 소이트리모늄 클로라이드; 탤로우트리모늄 클로라이드; 이수소화 탤로우디메틸암모늄 클로라이드; 베헨트리메틸암모늄 메토설페이트; Peg-2 올레암모늄 클로라이드; 이수소화 탤로우디메틸암모늄 브로마이드; 이수소화 탤로우디메틸암모늄 메토설페이트; 팔미틸트리메틸암모늄 클로라이드; 수소화 탤로우트리메틸암모늄 클로라이드; 수소화 탤로우트리메틸암모늄 브로마이드; 디세틸디메틸암모늄 클로라이드; 디스테아릴디메틸암모늄 클로라이드; 디팔미틸디메틸암모늄 클로라이드; 수소화 탤로우트리메틸암모늄 메토설페이트; 세트리모늄 토실레이트; 에이코실트리메틸암모늄 클로라이드, 및 디탤로우디메틸암모늄 클로라이드를 포함한다.
본 발명의 조성물을 불투명화하는 데 사용될 수 있는 물질은 지방 에스테르, OPACIFIER 653(Morton International, Inc.)같은 스티렌 중합체 등의 불투명화 중합체; 및 지방 알콜을 포함한다. 다음은 지방 알콜의 비-제한적인 목록이다: 세틸 알콜; 스테아릴 알콜; 세테아릴 알콜; 베헤닐 알콜; 및 아라키딜 알콜. 투명하지 않은 본 발명의 컨디셔닝 조성물은 또한 렉사민 S-13, 디세틸암모늄 클로라이드, 및 세테아레스-20을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 필요하다면, 피부 또는 모발 미백에 사용하기 위한 FDA 승인을 표시하는 사용 및 라벨에 대한 적당한 지시사항과 함께 디스펜서 장치 또는 키트로 제공될 수 있다.
피부 영역 또는 모발 미백용 키트는 예를 들면, 적절한 완충액, 담체, 침투제 등과 함께 제공된 리그닌 수식 효소를 포함하는 용기, 및 전술한 산화제 및 매개물질을 포함하는 부가 용기를 포함할 수 있다.
리그닌 수식 효소는 또한 당업계에 공지되어 있는 분자 생물학적 방법을 이용하여 피부 영역의 세포 중으로 도입될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 피검자의 피부 영역을 미백하는 방법이 제공된다. 본 발명의 이러한 일면에 따른 방법은 피부 영역의 세포에 함유된 색소를 산화시키기에 적합한 방식으로 리그닌 수식 효소를 피부 영역의 세포에서 발현시킴으로써 실행된다.
이러한 발현은 피부 세포를 프로모터 서열에 기능적으로 연결된 리그닌 수식 효소 암호화 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다.
그러한 발현 벡터를 생성하기 위해서, 리그닌 수식 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 단편(예를 들면, LIP H1 동위형, 서열번호 1)을, 포유동물 세포를 형질전환시키고 형질전환된 세포내에서 리그닌 수식 효소의 발현을 지시하기에 적합한 시판 발현 벡터 시스템에 라이게이션시킬 수 있다. 그러한 상업적으로 이용 가능한 벡타 시스템은 기존의 프로모터 또는 인핸서 서열을 치환, 복제 또는 돌연변이시키고/시키거나 예를 들면 부가적인 선별 마커를 암호화하는 서열 또는 리포터 폴리펩타이드를 암호화하는 서열과 같이 임의의 부가적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입하기 위하여 통상적으로 사용되는 재조합 기술을 통해 손쉽게 변형시킬 수 있음이 감지될 것이다.
본 발명과 사용하기에 적합한 포유동물 발현 벡터는 pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, (Invitrogen로부터 입수 가능), pCI(Promega으로부터 입수 가능), pBK-RSV 및 pBK-CMV(Stratagene으로부터 입수 가능), pTRES(Clontech으로부터 입수 가능), 및 이들의 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 이러한 일면과 사용하기에 적합한 발현 벡터는 아데노바이러스계 벡터이다. 아데노바이러스 벡터는 피부 유전자 요법을 포함한 제약학적 적용에 널리 사용되어 왔다(Ghazizadeh S, Taichman LB. (2000) Hum Gene Ther 11: 2247-51; Carter PJ, Samulski RJ. (2000). Int J Mol Med 6: 17-27).
상기 발현 벡터는 리포좀, 표피용 패치, 이온 영동 요법 또는 수용체-매개성 엔도사이토시스를 포함한(이에 한정되지 않음) 다양한 전달법을 사용하여 세포 중으로 전달될 수 있다.
후자의 방법에서, 엔도사이토시스를 거치는 것으로 알려져 있는 세포 표면 수용체에 대한 항체 또는 리간드는 공유 결합된 폴리양이온 부가물(예를 들면, 폴리라이신, 프로타민)을 통해 리그닌 수식 효소를 암호화하는 DNA 서열과 복합체를 형성한다. 이러한 복합체는 세포 표면에 대한 그들의 결합 특이성을 보유하며 이들이 정상적인 엔도사이토시스 과정을 통해 엔도좀 구획으로 진입하는 세포 중으로 포획된다. 또한, 엔도좀-라이소좀내에서 DNA의 분해를 피하도록 조치를 취하여야 한다. 세포는 형질감염 절차 동안 라이소조마트로픽제(lysosomatropic agent) 클로로퀴논으로 처리될 수 있다. 이와 달리, 엔도사이토시스에 의해 세포 안으로 진입하며 엔도좀 "브레이크 아웃"능을 보유하는 바이러스의 성분이 사용될 수 있다. 리간드-DNA 복합체와 커플링된 복제 결함 아데노바이러스는 시험관내에서 조직 배양 세포에 대한 거의 100%의 형질감염 효율을 부여한다. 예비적인 연구는 생체내에서 선택된 세포 유형에 대한 DNA를 특이적으로 표적화하는 상기 방법의 잠재능을 증명하였다(Guy J, Drabek D, Antoniou M. (1995). Mol Biotechnol 1995 3:237- 48).
표적 세포내에서 발현시킨 뒤, 상기한 전자 수용체와 매개물질이 바람직하게는 미백을 촉진하기 위하여 처리 영역에 적용된다.
표적 세포내에서 리그닌 수식 효소를 발현시키는 것이 특히 유리한데, 그 이유는 효소 자체의 세포내 전달을 위한 필요성이 극복되고 이에 따라 미백 효율이 잠재적으로 증진되기 때문이다.
본 발명의 부가적인 목적, 이점 및 신규 특징은 제한을 의미하지 않는 하기 실시예를 면밀히 검토할 때 당업자에게 자명해진다. 부가적으로, 앞서 정확하게 서술하고 하기의 특허청구범위에서 청구되는 바와 같이 본 발명의 각각의 다양한 양태와 일면은 하기 실시예에서 실험적으로 지지됨을 알게 된다.
이하, 상기의 상세한 설명과 함께 본 발명을 비-제한적인 방식으로 설명하는 하기 실시예를 참조한다.
일반적으로, 본원에서 사용하는 명명법 및 본 발명에 사용되는 실험실 절차는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 철저히 설명되어 있다. 예를 들면 하기 문헌 참조: "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology "Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes 1-111 Cellis, J. E., ed.(1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); 이용 가능한 면역분석법은 특허 및 학술 문헌에 광범위하게 기재되어 있다. 예를 들면 하기 참조: U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281, 521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); 이들 문헌 전부는 본원에 완전히 기재되는 바와 같이 참조로 편입된다. 다른 일반 참고문헌이 본 명세서 전반에 걸쳐서 제공된다. 거기에 실린 절차는 당업계에 익히 공지되어 있는 것으로 생각되며 독자의 편의를 위해 제공된다. 이들 참고문헌에 실린 모든 정보는 참조로 본원에 편입된다.
배경
파네로케이트 크리소스포리움 진균에서의 리그닌 퍼옥시다제
파네로케이트 크리소스포리움 BKM-F-1767 배양액의 세포외 유체에는 리그닌 분해 활성을 보이는 12개 이상의 헴 단백질이 존재한다. 이들은 두 유형의 당화된 헴 퍼옥시다제, 즉 리그닌 퍼옥시다제(LIP)와 망간 퍼옥시다제(MNP)로 분류된다. 동위효소 H1, H2, H6, H7, H8 및 H10은 LIP인 것으로 보고되었고 H3, H4, H5, 및 H9는 MNP로서 동정되었다(Farrell et al., 1989). 파네로케이트 크리소스포리움의 LIP 동위효소는 구조적으로 관련된 유전자 계열에 의해 암호화되고 물리적 특징, 기질 특이성 및 안정성에 있어서 상이하다(Farrell et al., 1989; Stewart et al., 1992). 이들의 분비를 이끄는 과정의 일부로서, LIP 동위효소는 단백질 분해적으로 절단되고 당화된다(Ghose, 1987; Ritch et al., 1991; Tien and Kirk, 1984). 또한, LIP 동위효소 H2, H6, H8 및 H10은 아스파리긴-결합된 올리고사카라이드에 함유된 만노스-6-포스페이트 잔기에서 인산화가 일어난다. 노화된 세포외 유체의 분석은 동위효소 H1이 아마도 H2의 해독 후 탈인산화로부터 유도되리라는 제안을 도출하였다(Kuan and Tien, 1989).
파네로케이트 크리소스포리움에 의한 리그닌 분해 효소의 발현은 질소 또는 탄소 제한에 의해 촉발되는 이디오페이즈(idiophasic) 사건이며 배양 조건 및 배지 조성에 고도로 좌우된다(Dosoretz and Grethlein, 1991; Faison and Kirk, 1985; Stewart et al., 1992; van der Woude et al., 1993). LIP의 형성은 배양액을 고 산소압에 노출시키는 것에 특히 의존한다(Dosoretz et al., 1990; Faison and Kirk, 1985). 정치 배양액 중으로의 산소 전달이 제한되고, 결과적으로 배양액 헤드스페이스내 산소의 높은 분압이 충분량의 산소가 침수된 균사에 이용될 수 있게 하는 데 필요함이 제안되었다(Leisola et al., 1983; Michel et al., 1992). 비-침지 액체 배양액에서 다공성 지지체 상에 진균을 고정시킴으로써(이는 진균에 대한 산소의 이용 가능성을 향상시켰다) 공기에 노출된 배양액에서 LIP 형성이 관찰되었다(Dosoretz et al., 1990; Popp et al., 1990). 배지내 Mn2+의 농도는 LIP 및 MNP의 형성에 악영향을 미친다. MNP의 형성은 MNP의 전사를 증진하는 Mn에 좌우되는 반면에, LIP 형성은 Mn에 의해 억제된다. Rothschild 등 (1999)은 파네로케이트 크리소스포리움의 질소-제한 및 질소-과잉 배양액 모두에서 LIP 형성에 요구되는 고 산소 수준이 Mn 결핍에 의해 대체될 수 있음을 보여주었다.
재료 및 실험 방법
리그닌 퍼옥시다제의 생산을 위한 진균 파네로케이트 크리소스포리움의 생장 - 진균 파네로케이트 크리소스포리움 BKM-F-1767 (ATCC 24725)를 2% 말트 추출물 아가 스톡 사면 배지(Difco, Detroit, MI, USA)상 4℃에서 유지시켰다.
포자 현탁액이 제조 - 스톡 사면 배지로부터의 플러그를 오토클레이빙 처리한 감자 덱스트로스 아가(PDA)를 39 g/리터의 농도로 함유하는 페트리 디쉬에 접종하여 진균의 포자를 수득하였다. PDA 플레이트를 37℃에서 2주일까지 배양하였다. 포자 현탁액의 제조를 위해, PDA 플레이트를 0.9% NaCl로 오버레잉하고 분생자 현탁액을 멸균성 글래스 울에 통과시켜 여과한 다음 포자 현탁액을 수집하였다. 포자 현탁액을 이어서 -80℃에서 동결 유지시켰다.
접종액 제조 - 포자를 멸균된 접종 배지(후술되는 처방전 참조)에 7.5 x 105 포자/ml의 최종 농도로 접종하였다. 90 ml의 혼합물을 각각의 발효 뱃치에 첨가하고(Tien and Kirk, 1988. Meth. Enzymol. 161: 238-490; Dosoretz et al., 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 131-7), 뱃치를 이어서 솜마개 밀봉하였다. 배양균을 깊이가 얕은 배양액으로서 37℃에서 48시간 동안 정치 생장시켰다. 배양액의 배양을 위해, 발효 뱃치 내용물을 2분간 믹서(Waring, England)로 블렌딩하였다.
교반 탱크 반응기(STR) 발효조에서 진균의 생장 - 진균의 생장에 앞서서, 폴리우레탄 발포체를 발효조의 냉각 튜브 주위에 배치하고 STR 발효조 전체를 멸균시켰다. 이어서, 10 리터의 발효조 배지(이하의 조제 참조)를 STR 발효조에 부어 넣고 900 ml의 블렌딩된 접종액(10개의 발효 뱃치 내용물)을 첨가하였다. 발효조를 냉각 시스템에 연결하여 37℃의 온도를 유지하고 100 rpm으로 교반하였다. 멸균된 공기를 발효조에 2 ml/분으로 도입시켰다. 생장 2일 후에 유량은 4 ml/분으로 변화시켰다. 3 내지 5일간 생장을 지속하였다.
접종 배지를 하기의 용액을 혼합하여 제조한 다음 0.45 ㎛ 필터 멤브레인(MSI, Westborough, MA, USA)으로 멸균시켰다. 액체 배지 1 리터를 제조하기 위하여, 하기 성분을 병합하였다:
파네로케이트 크리소스포리움 생장을 위한 100 ml 염기성 배지 x 10 (하기 처방전 참조)
10 ml CaCl2 원액 (13.2 g/1)(Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO, USA). 최종 농도 0.132 g/L
12 ml 글리세롤 원액(50 g/100-ml)(Frutarom, Israel). 최종 농도 6 g/L.
* 이차 증류수를 1 리터가 되게 첨가.
발효조 배지를 하기의 방식으로 제조하고 0.45 ㎛ 필터 멤브레인(MSI, Westborough, MA, USA)으로 멸균시켰다. 액체 배지 10 리터를 제조하기 위하여, 하기 성분을 병합하였다:
100 ml CaCl2 원액(13.2 g/1)(Sigma, USA). 최종 농도 0.0132 g/l
120 ml 글리세롤 원액(50 g/100-ml)(Frutarom, Israel). 최종 농도 6 g/l.
50 ml Tween-80 원액(10.8 ml/100 ml)(Sigma, USA). 최종 농도 0.54 ml/1
파네로케이트 크리소스포리움 생장을 위한 기초 배지 1000 ml x 10 (하기 처방 참조)
3.36 g의 베라트릴 알콜(Sigma, USA). 최종 농도 2 mM.
7.740 리터의 이차 증류수(DDW)를 최종 용적 10 리터가 되게 첨가.
파네로케이트 크리소스포리움 생장을 위한 기초 배지 x 10 - 파네로케이트 크리소스포리움 생장을 위한 기초 배지 x 10을 다음과 같이 제조하였다: 7.07 그램의 니트릴로트리아세트산(삼나트륨 염)을 4 리터의 DDW에 용해시켰다. 이어서, 하기 시약을 첨가하였다: 100 그램의 KH2PO4 무수물, 72.7 그램의 MgS04?7H20 (또는 67.39 그램의 MgS04?6H20), 3.5 그램의 NaCl, 0.35 그램의 FeS04?7H20, 0.63 그램의 CoCl2?6H2O, 0.35 그램의 ZnS04?7H20, 0.055 그램의 CuS04?5H20, 0.035 그램의 AlK(SO4)2?12H20, 0.035 그램의 H3BO3, 0.035 그램의 Na2Mo04?2H20, 500 ml의 2M 아세테이트 완충액 pH 4.5, 10 그램의 암모늄 타트레이트 및 50 mg 티아민. 이들 모드는 Sigma-Aldrich Corp.(St Louis, MO, USA)에 의해 공급되었다. 배지의 pH는 NaOH로 4.4 내지 4.45로 조정하였고 DDW를 가하여 최종 용적 5 리터가 되게 하였다. 배지를 4℃에서 저장하였다.
파네로케이트 크리소스포리움의 세포외 배지로부터 LIP의 분리 및 정제 - 세포외 배지를 유리 섬유를 통해 진공 여과하였다. 이어서, 여액을 0.45 ㎛ 필터 멤브레인(MSI, Westborough, MA, USA)으로 멸균시킨 다음 유체를 연동 펌프(MASTERFLEX, Vernon Hills, IL, USA)를 사용하여 중공 섬유 멤브레인에 의해 농축시켰다. 이어서, 농축된 세포외 유체를 10-kDa-컷 오프형 PM-10 멤브레인(Amicon, Danvers, MA)을 사용하여 한외여과에 의해 25배로 재농축시키고, 0.01 내지 1.00 M 나트륨 아세테이트의 두 구배를 사용하는 HPLC-음이온 교환 크로마토그래피에 의해 Mono Q 칼럼(HR5/5, Pharmacia, Piscataway, NJ)으로 정제하였다. 제 1 구배는 pH 6.0이었고 제 2 구배는 pH 4.7이었으며, 이는 LIP 동위효소 H1의 등전점(pI) 값과 동등하다. 단백질 피크를 수집하고 이들의 활성을 표준으로서 선행 뱃치로부터의 정제된 LIP 동위효소 H1를 사용하여 분석하였다. LIP H1 분획의 흡광도를 280 nm 및 409 nm에서 측정하였다(Hewlett Packard, Waldbronn, Germany). 정제된 LIP 동위효소 H1의 409 nm에서의 흡광도(A409)와 280 nm에서의 흡광도(A280)간의 비로부터 계산한, 순도의 정도(RZ)는 4.0 이상이었다. LIP 농도는 169M-1cm-1의 흡광 계수를 이용하여 409 nm에서 측정하였다.
LIP 활성의 분석 - LIP 활성은 Tien 및 Kirk(1988)에 의해 기술된 바와 같이 베라트릴 알콜에서 베라트릴 알데하이드로의 산화 동안 310 nm에서의 흡광도 변화에 의해 측정되었다. 분석 시약은 100 mM 타트레이트 완충액(pH 2.5) 중의 4 mM 베라트릴 알콜 및 0.88 mM H202로 구성된다. 분석을 위해, 0.5 ml의 파네로케이트 크리소스포리움 세포외 배지를 0.5 ml의 시약과 혼합하고 310 nm에서의 흡광도 증가를 40초 동안 기록하였다. LIP 1 단위를 분당 베라트릴 알데하이드로 산화된 베라트릴 알콜의 1 마이크로몰로서 정의한다.
LIP에 의한 멜라닌 산화의 측정 - 합성 멜라닌(Sigma, Cat# M8631, St Louis MO, USA)을 pH 8.00의 50 mM 트리스 완충액에서 다양한 농도로 제조하였다. LIP에 의한 멜라닌의 산화를 베라트릴 알콜을 함유하는 타트레이트 완충액(pH 3.5)에서 수행하고 효소 반응을 과산화수소의 첨가에 의해 개시하였다. 멜라닌 산화의 정도는 460 nm에서의 흡광도 감소를 측정함으로써 측정되었다.
크림 제조 - 바람직한 양태에서의 LIP 크림은 두 유형의 크림으로 구성된다: 효소 크림 및 활성제 크림. 각각의 크림을 두 상, 즉 수성상 및 오일상으로부터 제조하였다.
효소 크림
효소 크림용 수상:
0.35% (w/w) DMDM 히단토인(Sharon Lab, Israel);
2% (w/w) 글리세린(Cognis, Germany);
0.1% (w/w) 베라트릴 알콜(3-디메톡시벤질 알콜, Sigma, USA);
81.65% (w/w) DDW(RO Water, Israel);
0.2% (w/w) Rhodicare D(잔탄 고무, Rhodia, France);
4% (w/w) 트랜스큐톨(PEG-400, 에톡시디글리콜, Gattefosse, France);
효소 크림용 오일상:
5% 라이트 미네럴 오일;
2.5% (w/w) 드래고린(dragorin) 100 SEP(GMS & PEG-100 스테아레이트, Dragoco, Germany);
3% (w/w) 세틸 알콜(Cognis, Germany);
0.2% (w/w) 칼륨 솔베이트(Chisso Corp., Japan);
1% (w/w) brij 721 (Uniqema, Italy).
효소 크림의 제조: 효소 크림의 물과 오일상을 80℃로 가열한 다음 혼합하였다. 혼합물을 10분간 균질화하고 55℃로 냉각하였다. 이어서, pH를 락트산을 사용하여 3.5로 조정하였다.
혼합물이 40℃로 냉각되었을 때, 리그닌 퍼옥시다제를 가하였다(20 내지 50 단위/그램). 효소 혼합물을 1분간 균질화하였다.
활성제 크림
활성제 크림용 수상
82.888 (w/w) DDW(RO Water, Israel);
0.1 % (w/w) EDTA 이나트륨(Merck, Germany);
4% (w/w) 트랜스큐톨(PEG-400, 에톡시디글리콜, Gattefosse, France);
0.1% (w/w) 칼륨 솔베이트(Chisso Corp., Japan) :
활성제 크림용 오일상:
3.5% (w/w) brij 72 (Steareth-2, Uniqema, Italy);
2.5% (w/w) brij 721 (Steareth-20, Uniqema, Italy);
5% (w/w) 미네럴 오일;
1.3% (w/w) 세틸 알콜(Cognis, Germany) ;
0.5% (w/w) 실리콘 350 (Dimethicon, Dow Coming, USA);
0.1% (w/w) 칼륨 솔베이트(Chisso Corp., Japan).
활성제 크림의 제조 - 활성제 크림의 물과 오일상을 80℃로 가열한 다음 혼합하였다. 혼합물을 10분간 균질화하고 45℃로 냉각한 다음, 인산으로 pH 3.5로 조정하였다.
혼합물이 40℃로 냉각되었을 때, 과산화수소를 부드러운 교반하에 가하고(0.012%(w/w)), 정확한 pH를 확인한 다음 활성제 혼합물을 1분간 균질화하였다.
생체내에서 피부 미백 효과의 측정 - 피부 미백에 미치는 LIP의 효과를 정량하기 위하여, 처리된 손의 피부색을 미놀타 크로마미터(Minolta chromameter) (CR-200, Japan)의 3 파장을 이용하여 시험하였다; 미놀타 L은 명암을 측정하고, 미놀타 A는 적색 톤을 측정하며 미놀타 B는 황색 톤을 측정한다. 미놀타 L 값의 증가는 피부 밝기의 정도를 반영하며, 즉 더 높은 값은 더 밝은 피부에 해당한다.
실험 결과
실시예 1
파네로케이트 크리소스포리움으로부터 LIP의 정제
파네로케이트 크리소스포리움으로부터 고도로 정제된 LIP HI의 제조 - 파네로케이트 크리소스포리움으로부터 LIP 동위효소 H1을 정제하기 위하여, 진균을 상기 재료 섹션에 상세히 기술된 바와 같이 STR 발효조(도 2)에서 생장시켰다. 생장 48시간 후에 초기 LIP 활성이 검출되었고 생장을 120시간까지 유지시켰을 때 활성의 현저한 증가가 검출되었다(도 3). LIP 동위효소 H1의 정제를 위하여, 진균의 세포외 유체를 피크 LIP 활성(120 hr)에서 수집하였다. 이어서, LIP 동위효소 H1 단백질을 정제하고 이의 농도를 방법 섹션에서 기재된 바와 같이 측정하였다. 따라서, 상기 장치 및 조건을 이용하여, LIP는 신뢰할 수 있게 생산되며 이의 H1 동위효소는 HPLC로 정제될 수 있다.
실시예 2
정제된 LIP를 사용하는 수성상 산화에서 멜라닌의 최적화
LIP에 의한 멜라닌 산화에 필요한 조건을 최적화하기 위하여, 산화 반응의 각 중요 성분의 최적 농도를 독립적으로 결정하였다.
수성상에서 멜라닌의 LIP 산화는 과산화수소 농도의 함수이다 - 수성상에서 LIP에 의한 멜라닌의 산화는 과산화수소 농도에 대한 상관관계에 대해 먼저 시험하였다. 일정 농도의 멜라닌(70.5 ㎍/ml)이 1.5 mM 베라트릴 알콜의 존재하에 및 과산화수소의 증가하는 농도에 따라 0.48 μM의 정제된 LIP H1에 의해 산화되었다. 산화 정도는 과산화수소의 첨가 전 및 첨가 160초 후에 460 nm에서의 멜라닌의 흡광도를 측정함으로써 결정되었고, %로 계산하였다. 일반적으로, 멜라닌의 산화는 700 내지 900 μM의 과산화수소에서 달성되는 정체기(plateau)까지는 과산화수소의 증가하는 농도에 따라 증가하였다(도 4). 멜라닌 산화에 미치는 과산화수소의 효과는 도 5에서 반응 혼합물의 비교에 의해 추가로 증명되며, 여기에서 반응 혼합물은 증가하는 과산화수소 농도에 따라 현저히 미백된다. 따라서, 이러한 결과는 수성상 중의 멜라닌의 LIP 산화가 과산화수소 농도에 분명하게 의존성임을 증명하며, 멜라닌의 산화를 위한 과산화수소의 최적 농도는 600 내지 700 μM의 범위이다.
멜라닌의 LIP 산화는 수성상 중의 멜라닌 초기 농도의 함수이다 - LIP에 의한 수성상 중의 멜라닌 산화에 요구되는 최적 멜라닌 농도를 결정하기 위하여, 증가하는 멜라닌 농도로 산화 반응을 좀더 시험하였다. 멜라닌의 산화가 1.5 mM 베라트릴 알콜 및 600 μM 과산화수소의 존재하에 0.48 μM의 정제된 LIP H1에 의해 일어났다. 15 내지 45 ㎍/ml의 초기 멜라닌 농도에서, LIP에 의한 멜라닌 산화는 멜라닌의 초기 농도에 의존하였다. 멜라닌의 최대 산화(60%)는 45 내지 85 ㎍/ml의 멜라닌 초기 농도에서 도달되었다(도 6). 따라서, LIP에 의한 멜라닌 산화는 45 ㎍/ml 이하의 초기 멜라닌 농도와는 분명히 무관하였다.
LIP의 멜라닌 산화는 수성상의 LIP 농도에 부분적으로 좌우되었다 - 멜라닌 산화에 대한 조건을 더욱 최적화하기 위하여, 멜라닌 산화에 미치는 LIP 농도의 효과를 멜라닌(70 ㎍/ml), 과산화수소(700 μM) 및 베라트릴 알콜(1.5 μM)의 최적 농도로 시험하였다. LIP 농도를 0.25 μM에서 0.40 μM로 증가시켰을 때 멜라닌 산화는 10%에서 60%로 현격히 증가하였다. 그러나, 0.50 μM의 LIP 농도를 넘으면, 멜라닌 산화에 있어서 변화가 관찰되지 않았다(도 7). 따라서, 시험관내에서 멜라닌 산화를 위한 LIP 농도의 최적 범위는 0.40 내지 0.50 μM이다.
실시예 3
크림 제형에서 LIP를 사용하는 멜라닌의 산화
LIP 동위효소 H1의 멜라닌 산화능을 더욱 확증하기 위하여 및 생체내 피부 미백쪽으로의 중간 단계로서, LIP 활성을 수성상에 가용화된 멜라닌에 대한 크림 제형에서 시험하였다.
수성상 중의 멜라닌은 크림 제형 중의 LIP에 의해 산화된다 - 두 유형의 크림을 제조하였다: LIP 동위효소 H1 분획(25 단위/그램 크림)과 베라트릴 알콜(6 mM/Kg 크림)을 포함하는 효소 크림, 및 과산화수소(3.52 mM/Kg 크림)을 포함하는 활성제 크림. 크림 제형에서 LIP 활성의 측정을 위해, 효소 크림(0.3 그램)을 먼저 멜라닌(140 ㎍/ml)과 혼합하였으며, 회색을 띤 흑색이 관찰되었다(도 8a). 활성제 크림(0.3 그램)을 이미 멜라닌을 함유하고 있는 효소 크림에 첨가하였을 때, 색상은 즉시 베이지색으로 변하였다(도 8b). 이러한 결과는 크림 제형 중의 LIP가 멜라닌 탈색에 매우 효율적이며 사람의 피부에 대해 좀더 시험될 수 있음을 입증한다.
실시예 4
크림 제형내 정제된 LIP H1에 의한 생체내 피부 및 모발 미백
생체내에서 피부와 모발을 미백하는 LIP의 능력을 시험하기 위하여, 크림 및 수성 제형 중의 효소를 피부와 모발에 각각 가하였다.
크림 제형 중의 LIP는 생체내에서 피부를 미백한다 - 생체내에서 피부를 미백하는 크림 제형내 LIP의 능력을 시험하기 위하여, 효소 크림을 도포하여 피부에 의해 흡수시킨 다음 활성제 크림을 5분 간격으로 4회 도포하였다. 1주일간 1일 2회씩 반복하였을 때, 처리된 피부 영역의 현저한 미백이 관찰되었다(도 9). 처리된 손의 두 영역의 피부색을 미놀타 크로마미터를 사용하여 정량하였을 때, LIP 크림의 2주 도포의 뚜렷한 피부-미백 효과가 관찰되었다(표 1, % 변화). 따라서, 이들 결과는 크림 제형을 도포하기 쉽게 제조한 LIP가 생체내에서 간편하고 효율적으로 피부를 미백할 수 있고, 본원에서 상세히 설명한 바와 같이 제조되는 LIP가 다른 생체내 미백 적용에 대해서도 더욱 적응될 수 있음을 증명한다.
생체내에서 피부 미백의 정량
미놀타 L
(명도)		 미놀타 A
(적색)		 미놀타 B
(황색)
영역 I 기준선 44.8 10.5 16.34
영역 I 2주 48.8 10.6 17.93
영역 I % 변화 8.9 - 9.7
영역 II 기준선 49.91 10.38 19.28
영역 II 2주 53.8 9.39 20.63
영역 II % 변화 7.79 - 7.0
표 1은 시험된 손에서 두 영역의 미놀타 크로마미터로부터 취한 절대 수치로 나타낸 3 세트의 판독치를 예시한다. 영역 I은 도 9에서 원으로 표시한 영역에 해당하고, 영역 II는 나타내지 않은 데이터에 해당한다.
수성 제형 중의 LIP는 생체내에서 모발을 미백한다 - 색소침착의 미백은 종종 피부 이외의 멜라닌-풍부 조직에서 요구된다. 생체내 미백 효과를 좀더 자세히 시험하기 위하여, LIP를 사람의 모발에 적용하였다. LIP 적용에 앞서, 모발을 먼저 50 mM 카보네이트 완충액(pH 11.5)에 1시간 동안 침지시킨 다음 LIP를 함유하는(수중 25 U/20 ㎕) 또 다른 튜브로 이송하였다. 모발을 LIP와 10초간 배양한 다음 베라트릴 알콜(1.5 mM) 및 과산화수소(8.8 mM)의 존재하에 타트레이트 완충액(pH 3.5) 중으로 이송하였다. LIP 없이 동일 용액에서 처리한 모발(도 10, 좌측 튜브)과 비교하여, LIP의 존재하에서(도 10, 우측 튜브) 1시간 내에 현저한 미백 효과가 관찰되었다. 따라서, 이들 결과는 매우 낮은 농도의 과산화수소의 존재하에서도 수성 제형 중의 LIP는 생체내에서 모발을 효율적으로 미백할 수 있음을 증명한다.
실시예 5
LIP 제조 과정의 규모 확대
상업적 목적에 유용한 다량의 리그닌 퍼독시다제(LIP)를 생산하기 위하여, 규모 확대된 프로토콜을 이용하여 파네로케이트 크리소스포리움 진균으로부터 LIP를 정제하였다.
규모 확대된 발효 프로토콜을 이용하여 수득된 LIP의 고 활성 - 상기 방법 섹션에서 기술한 바와 같이 90 L 발효 배지를 사용하여 100 L 들이 발효조에서 발효를 수행하였다. 발효 조건은 160 rpm의 교반과 0.2 vvm의 기류를 포함하였다. 전술한 방법 섹션에 기재된 10 L 들이 발효조에서 동일한 방식으로 접종을 수행하였다. 생장 개시 7일 뒤에, 측정된 LIP 활성은 1600 단위/리터였다.
이들 결과는 다량의 고 촉매 활성 LIP가 대형 발효조와 본 발명의 규모 확대된 프로토콜을 이용하여 파네로케이트 크리소스포리움 진균으로부터 생산될 수 있음을 증명한다.
실시예 6
LIP 크림에 대한 피부과학적 시험: 정상 피부에 대한 저알레르기, 민감성 피부, 및 감작 및 챌린징 시험
LIP 크림의 피부과학적 특성을 특징 규명하기 위하여 및 화장품 제품으로서의 사용을 위한 전제 조건으로서, LIP 크림을 여러 피부과학적 시험에 투입하였다: 저알레르기 시험, 정상 피부에 대한 감작 및 챌린징 시험, 및 민감성 피부에 대한 감작 및 챌린지 시험.
방법
정상 피부에 대한 피부과학적 시험을 위한 연구대상 피검자: 본 연구에는 18 내지 64세 연령 분포의, 50명의 자원자, 즉 9명의 남성과 41명의 여성이 포함되었다. 자원자는 일반적으로 건강이 양호하였고 패치가 첩부되는 영역에서 가시적인 피부 질환 또는 이상이 없었다. 각각의 연구대상 피검자는 통지된 동의 진술서를 읽고 숙지하여 서명하도록 하였다. 배제 기준은 다음과 같았다: 임산부 또는 간호사, 중증 또는 진행성 질환 및/또는 처리 영역에 병리를 앓고 있는 피검자, 치료(예를 들면, 레티노이드, 스테로이드) 및/또는 피부 수화의 개질제를 복용하는 피검자, 불안정한 체중 또는 알콜 또는 담배의 과도한 사용을 즐기는 피검자.
연구대상 피검자의 특징을 하기 표 2에 요약하였다.
연구대상 피검자의 특징
성별 평균 연령(year) 연구에 영향을 줄 가능성이 있는 병력
F 40.36 없음
M 34.33 없음
민감성 피부에 대한 피부과학적 시험을 위한 연구대상 피검자 - 남성 6명 및 여성 44명인 총 50명의 피검자가 시험을 마쳤다: 22명의 피검자는 연령층이 18 내지 35세 범위였고 11명은 36 내지 45세 범위, 및 17명은 46 내지 65세 범위였다.
연구 중의 연관된 치료 - 패치가 적용되는 동안 시험 부위에 물을 묻히지 않았다; 피부에 변형을 주기 쉬운 전신성 또는 국소 처리는 허용되지 않았다; 클렌징 제품을 포함한 피부과학적 또는 화장품 제품의 사용이 평가되는 영역에 허용되지 않았다.
패치의 제조 - 저알레르기 시험을 위하여, 본 발명의 LIP 크림 2 mg을 CuratesR F 접착 스트립(Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG, Rengsdort)에 넣었다. 피부과학적 시험 및 민감성 피부 시험을 위해, 각각의 패치는 CuratesR F 접착 스트립에 0.07 내지 0.1 그램의 LIP 크림을 포함하였다.
드레이즈(Draize) 반복 인설트(Insult) 패치 시험을 본질적으로 문헌 "Appraisal of the Safety of Chemicals in Foods, Drugs and Cosmetics" by J. H. Draize (the Association of Food and Drug Officials of the United States 간행)에 기재된 바와 같이 수행하였다.
유도기(induction phase) - 패치를 지정된 접촉 부위에 적용하고 24시간 동안 그 자리에 유지시켰다. 이 기간의 말미에, 패치를 제거하고 부위를 피부 반응에 대하여 검사하였다. 연구대상 피검자는 24시간 동안 휴식을 취한 후 피부 부위를 다시 검사하였다. 이어서, 패치를 앞서 사용한 바와 같이 동일 부위에 적용하였다. 두 번째 적용은 첫 번째와 동일하였고 24시간 동안 그 자리에 유지시켰다. 이러한 절차를 9회 반복하였다. 연구대상 피검자는 피부 반응에 대하여 해당 부위를 검사하였고 후속 적용에 앞서 그들의 관찰 결과를 보고하였다. 연구 전반에 걸쳐서 동일 부위가 사용되었다. 각각의 적용은 Institute of Skin Research (Tel Aviv, Israel)의 스태프에 의해 실시되고 제거되었다. 품질 관리인이 연구 프로토콜에 대한 충실성을 모니터링하였다.
챌린지기 - 9차 적용 후, 2주간의 휴식기가 경과한 후 동일한 방식으로 유도기 동안 사용된 동일한 부위에 챌린지 적용을 실시하였다. 24시간 후 챌린지 적용을 제거하고 해당 부위를 검사하여 과민증 또는 감작의 증상에 대해 등급을 매겼다. 챌린지 적용 후 48시간(패치 제거 24시간 후), 및 제거 48 시간 및 72시간 후에 추적 검사를 수행하였다.
등급 매김 스케일 - 유도 및 챌린지 시험의 결과는 하기 스케일을 이용하여 등급을 매겼다; "0" = 가시적 반응 없음; "?" = 의심이 가는 반응, 즉 희미하거나 최소한의 홍반, 침윤 없음; "1" = 약한 양성 반응, 즉 홍반, 침윤, 뚜렷한 구진 없음; "2" = 강한 양성 반응, 즉, 홍반, 침윤, 구진, 뚜렷한 소포진; "3" = 과외의 양성 반응, 즉 강렬한 홍반, 침윤, 유착성 소포진/불러스(bullous) 반응; "IR" = 과민 반응, 즉 침윤/지저분한(patchy) 소포성 홍반/출혈성 및 소포성 농포 없이 뚜렷한 홍반; "NT" = 시험되지 않음.
피부과학적 시험 결과
저알레르기 시험 - 이 시험에서, LIP 크림을 함유하는 패치의 적용에 대한 반응을 패치 제거 20분, 24분 및 48시간 뒤에 기록하였다. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 50명의 연구대상 피검자 전부, LIP 크림에 대한 가시적인 피부 반응을 보이지 않았다.
저알레르기 시험의 결과
번호 피검자 성별 연령 20분 24시간 48시간
1 D.P. M 37 0 0 0
2 G.B. F 62 0 0 0
3 Z.A. F 58 0 0 0
4 S.E. F 64 0 0 0
5 E.R. F 61 0 0 0
6 G.C. F 35 0 0 0
7 S.S. F 26 0 0 0
8 D.P. F 65 0 0 0
9 E.T. F 46 0 0 0
10 I.M. F 58 0 0 0
11 M.I. F 40 0 0 0
12 G.O. F 30 0 0 0
13 M.L. F 49 0 0 0
14 S.A. M 22 0 0 0
15 C.B. F 38 0 0 0
16 B.A. F 34 0 0 0
17 S.I. F 45 0 0 0
18 K.S. F 35 0 0 0
19 S.S. F 28 0 0 0
20 F.H. F 26 0 0 0
21 R.S. F 44 0 0 0
22 A.A. F 25 0 0 0
23 S.T. M 21 0 0 0
24 F.A. M 38 0 0 0
25 S.S. F 42 0 0 0
26 S.R. M 49 0 0 0
27 S.I. M 19 0 0 0
28 C.T. F 32 0 0 0
29 C.J. M 35 0 0 0
30 H.P. F 30 0 0 0
31 F.S. F 36 0 0 0
32 P.A. F 45 0 0 0
33 P.N. M 51 0 0 0
34 M.R. F 30 0 0 0
35 S.L. F 31 0 0 0
36 T.I. F 23 0 0 0
37 V.I. F 30 0 0 0
38 L.A. F 45 0 0 0
39 T.R. F 43 0 0 0
40 C.D. F 38 0 0 0
41 S.S. F 36 0 0 0
42 L.B. F 36 0 0 0
43 M.L. F 31 0 0 0
44 A.T. M 37 0 0 0
45 G.K. F 42 0 0 0
46 B.P. F 51 0 0 0
47 L.T. F 56 0 0 0
48 I.V. F 35 0 0 0
49 P.O. F 43 0 0 0
50 C.P. F 31 0 0 0
표 3: 저알레르기 시험의 결과는 적용의 제거 20분, 24시간 또는 48시간 뒤에 등급을 매겼다.
LIP 크림에 의한 정상 피부의 감작 및 챌린징은 어떠한 피부 반응도 유발하지 않았다 - LIP 크림을 패치에 삽입하고 드레이즈 반복 인설트 패치 시험을 50명의 건강한 자원자에서 실시하였다. 각각의 패치 적용 후, 피부 반응을 전술한 방법 섹션에 기재된 등급 평가 스케일을 이용하여 기록하였다. 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 유도기의 전체 9회의 적용 동안과 챌린지기의 최종 적용 후에 50명의 자원자 모두에서 가시적인 피부 반응이 관찰되지 않았다.
LIP 크림의 유도 및 챌린지 시험의 결과
번호 피검자 성별 연령 등급 매김 스케일에 따른 결과
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 D.P. M 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 G.B. F 62 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 Z.A. F 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 S.E. F 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 E.R. F 61 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 G.C. F 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7 S.S. F 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
8 D.P. F 65 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
9 E.T. F 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 I.M. F 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
11 M.I. F 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12 G.O. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
13 M.L. F 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
14 S.A. M 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
15 C.B. F 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
16 B.A. F 34 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
17 S.I. F 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
18 K.S. F 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
19 S.S. F 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
20 F.H. F 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
21 R.S. F 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
22 A.A. F 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
23 S.T. M 21 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
24 F.A. M 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
25 S.S. F 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
26 S.R. M 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
27 S.I. M 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
28 C.T. F 32 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
29 C.J. M 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
30 H.P. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
31 F.S. F 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
32 P.A. F 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
33 P.N. M 51 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
34 M.R. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
35 S.L. F 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
36 T.I. F 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
37 V.I. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
38 L.A. F 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
39 T.R. F 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
40 C.D. F 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
41 S.S. F 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
42 L.B. F 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
43 M.L. F 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
44 A.T. M 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
45 G.K. F 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
46 B.P. F 51 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
47 L.T. F 56 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
48 I.V. F 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
49 P.O. F 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
50 C.P. F 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
표 4: 유도기(스코어 결과 Nos. 1-0) 및 챌린지기(스코어 결과 No. 10)에서 각각의 패치 적용 뒤 등급 매김 스코어. M = 남성, F = 여성.
민감성 피부에 대한 피부과학적 시험 - LIP 크림의 감작성을 좀더 자세히 특징 규명하기 위하여, 과민성 패치 시험을 민감성 피부의 50명의 건강한 자원자에서 실시하였다. 예비시험에서, 11명의 피검자가 다양한 정도의 자통(stinging)을 보이는 것으로 나타났다: 2명은 심한 민감성 피부, 8명은 보통의 민감성 피부, 및 1명은 약간 민감성 피부. LIP 크림을 포함한 과민성 패치를 자원자의 등 부위에 48시간 동안 배치하였다. 시험된 영역을 1시간, 24시간 및 48시간 후에 검사하였으며 50명의 자원자에서 어떠한 피부 반응도 없는 것으로 밝혀졌다.
이들 결과는 정상 및 민감성 피부에서 LIP 크림에 대한 저알레르기 및 과민 반응을 제외한다. 더욱이, 반복된 인설트 패치 시험의 결과는 안정한 화장품 조성물로서 LIP 크림의 용도를 또한 제시한다.
실시예 7
LIP 크림은 피부 색소침착의 화이트닝에 있어서 매우 효율적이다
피부 화이트닝에 있어서 LIP 크림의 효과를 이중맹 연구에서 종래기술의 크림과 비교하였다.
연구 설계
연구대상 피검자 - 본 연구에는 질병이 없고, 피부 질환 또는 아토피 질환(천식, 건초열, 알레르기성 비염)의 병력도 없으며 시험되는 물질 및 화장품 제제의 성분 어느 것에도 알려진 민감성이 없는 18 내지 65세의 아시아계 12명의 건강한 남성 및 여성이 포함되었다. 본 연구에서는 연구 명단에 등록하기에 앞서 치료가 전신 치료의 경우에 2주간 및 국소 치료의 경우에 3일간 중단되지 않은 한, 전신 또는 국소 치료를 위해 소염제, 항히스타민제, 또는 코르티코스테로이드 치료를 받고 있는 후보자는 베제하였다. 아울러, 진단 또는 치료의 임의 단계에서 암, 신장 질환 또는 간 질환이 있는 연구대상 후보자는 물론이고 임산부와 모유 수유 여성도 배제하였다.
연구 프로토콜 - 연구에는 이중맹 방식으로 각각 하나의 상부 전완에 적용한 두 유형의 크림이 포함되었다; 활성 성분으로서 LIP를 포함하는 본 발명의 화이트닝 크림, 및 시장 제품, 2% 하이드로퀴논(Esomed Medibrands, Israel). 크림을 1일 2회 도포하였다(즉, 아침, 저녁). 전완의 하부는 비처리 상태로 유지하였다. 연구대상 피험자는 연구를 개시할 때(0주), 및 크림 도포 뒤 1주, 2주 및 3주에서 Institute of Skin Research(Tel Aviv, Israel)의 스태프가 검사하였다. 각각의 검사에서, 피부 색소침착 및 부작용을 기록하였다.
피부 색소침착의 평가 - 피부 색소침착은 Derma Spectrometer(Cortex Technology, Denmark)와, Brenner 교수(Head of the Dermatological Department, Souraski Medical Center, Tel Aviv, Israel)와 그녀의 팀원이 만든 동일 거리 및 노광 및 가시적 검사를 이용하여 촬영한 컬러 사진을 이용하여 평가하였다.
연구 결과
LIP 크림은 도포 3주 후 피부 색소침착을 감소시켰다 - 피부 화이트닝에 있어서 LIP 크림의 효과를 평가하기 위하여, LIP 크림을 12명의 건강한 자원자의 우측 팔의 상부에 1일 2회 도포하였다. 두 연구대상 피검자의 대표적인 사진을 포함하는 도 11a-b 및 13a-b에 도시된 바와 같이, 크림 도포 3주 후 우측 전완의 상부에는 크림 도포 전보다 한층 더 희게 나타났다.
LIP 크림은 하이드로퀴논 크림보다 피부 화이트닝에 있어서 더욱 효율적이다 - 피부 색소침착 감소에 있어서 LIP 크림의 효과를 2% 하이드로퀴논의 것과 비교하였다. 크림 도포 21일 뒤에, 연구대상 피검자 No. 1의 LIP-처리 영역의 색소침착은 3.33 단위가 감소되었다(도 12a 청색 칼럼 및 도 12c 청색 곡선). 한편, 동일 전완의 비처리 영역의 색소침착은 1.13 단위가 감소하였다(도 12a, 담청색 칼럼). 한편, 하이드로퀴논 크림을 사용하여 처리 21일 뒤에 처리 영역의 색소침착은 단지 1 단위가 감소하였을 뿐이다(도 12b, 핑크색 칼럼 및 도 12c, 핑크색 곡선). 이와 유사한 효과가 도 14a-c에 도시된 바와 같이 다른 연구대상 피검자에서도 관찰되었다. 12명의 연구대상 피검자 모두로부터의 결과를 요약하였을 때, 피부 색소침착의 평균 감소는 LIP-처리 및 하이드로퀴논-처리 전완에서 각각 1.57 단위(도 15a, 청색 곡선) 및 1.49 단위(도 15a, 핑크색 곡선)인 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 피부 색소침착의 감소를 초기 피부 색소침착으로 표준화하였을 때, 피부 색소침착의 평균 감소는 LIP-처리 및 하이드로퀴논-처리 전완에 대해 각각 4.3%(도 15B, 청색 곡선) 및 3.8%(도 15b, 핑크색 곡선)였다.
종합하면, 이들 결과는 LIP 크림이 피부 색소침착의 감소에 매우 효율적임을 증명한다. 더욱이, 이들 결과는 LIP 크림의 상대적인 화이트닝 효과가 2% 하이드로퀴논 크림을 사용하여 관찰되는 상대적인 화이트닝 효과보다 더 높다는 것을 암시한다.
명확을 기하기 위해 별도의 양태의 맥락에서 기재되는 본 발명의 특정의 특질이 단일 양태로 함께 제공될 수 있음이 인식된다. 이와 반대로, 간결을 위해 단일 양태의 맥락으로 설명되는 본 발명의 다양한 특질이 또한 별도로 또는 임의의 적당한 서브 조합으로 제공될 수도 있다.
비록 본 발명이 이의 특정 양태와 관련하여 설명되었지만, 당업자에는 다양한 대안, 수정 및 변화가 이루어질 수 있음이 자명하다. 따라서, 특허청구범위의 취지와 광범위한 범주 안에 들어오는 그러한 모든 대안, 수정 및 변화를 포함시키고자 한다. 본 명세서에서 언급되는 모든 간행물, 특허, 특허출원 및 수탁번호에 의해 확인되는 서열은 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 수탁번호에 의해 확인되는 서열이 본원에 참조로 편입되도록 구체적이고 개별적으로 표시되는 것처럼 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 전부 편입된다. 또한, 본 출원의 참조 문헌의 인용 또는 확인은 그러한 참조문헌이 본 발명에 대한 종래 기술로서 이용 가능하다는 허락으로 해석되지 않아야 한다.
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  12. 1 내지 100 U/그램의 농도의 리그닌 퍼옥시다제 및 화장품용으로 허용되는 담체를 포함하는, 피검자의 피부 영역 또는 모발의 미백용 화장품 조성물.
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  14. 제 12 항에 있어서, 상기 리그닌 퍼옥시다제는 크로마토그래피에 의해 정제되는 동위효소 H1이거나 동위효소 H2의 변형된 형태인 화장품 조성물.
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  17. 제 12 항에 있어서, 상기 화장품용으로 허용되는 담체가 트랜스큐톨(transcutol) 또는 부틸렌 글리콜을 포함하는 것인 화장품 조성물.
  18. 제 12 항에 있어서, 상기 화장품용으로 허용되는 담체가 알칸올 아민을 포함하는 것인 화장품 조성물.
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  21. 제 12 항에 있어서, 베라트릴 알콜을 추가로 포함하는 화장품 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 베라트릴 알콜이 0.05% 이상의 농도로 제공되는 것인 화장품 조성물.
  23. 리그닌 퍼옥시다제를 포함하는 제 1 용기, 및 전자 수용체를 포함하는 제 2 용기를 포함하는, 피부 영역 또는 모발 미백용 키트.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 제 1 용기가 베라트릴 알콜을 추가로 포함하는 것인 키트.
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  26. 제 23 항에 있어서, 상기 리그닌 퍼옥시다제는 동위효소 H1이거나 동위효소 H2의 변형된 형태인 키트.
  27. 제 23 항에 있어서, 상기 포함된 전자 수용체가 과산화수소인 키트.
  28. 제 24 항에 있어서, 상기 베라트릴 알콜이 0.05% 이상의 농도로 제공되는 것인 키트.
  29. 제 23 항에 있어서, 상기 리그닌 퍼옥시다제가 1 내지 100 U/그램의 농도로 제공되는 것인 키트.
  30. 제 27 항에 있어서, 상기 과산화수소가 0.005% 이상의 농도로 제공되는 것인 키트.
  31. 제 23 항에 있어서, 상기 제 1 용기가 표피 침투에 적합한 화장품용으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인 키트.
  32. 제 23 항에 있어서, 상기 제 1 용기가 모발 침투에 적합한 화장품용으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인 키트.
  33. 제 31 항에 있어서, 상기 화장품용으로 허용되는 담체가 트랜스큐톨 또는 부틸렌 글리콜을 포함하는 것인 키트.
  34. 제 32 항에 있어서, 상기 화장품용으로 허용되는 담체가 알칸올 아민을 포함하는 것인 키트.
  35. 포장재 및 피검자의 피부 영역 또는 모발 미백용 화장품 조성물을 포함하는 제조품으로서, 상기 화장품 조성물은 상기 포장재 내에 함유되고, 상기 화장품 조성물은 활성 성분으로서의 1 내지 100 U/그램의 농도의 리그닌 퍼옥시다제와 화장품용으로 허용되는 담체를 포함하는 것인 제조품.
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  37. 제 35 항에 있어서, 상기 리그닌 퍼옥시다제는 크로마토그래피에 의해 정제되는 동위효소 H1이거나 동위효소 H2의 변형된 형태인 제조품.
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  39. 제 35 항에 있어서, 상기 화장품 조성물은 베라트릴 알콜을 추가로 포함하는 것인 제조품.
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  41. 제 35 항에 있어서, 상기 화장품용으로 허용되는 담체는 표피 또는 모발 침투에 적합한 조성물을 포함하는 것인 제조품.
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  51. 제 12 항에 있어서, 상기 리그닌 퍼옥시다제가
    (a) 소정 기간 동안 다공성 매트릭스상에서, 글리세롤을 함유하는 교반되고 통기된 배양 배지 중에서 파네로케이트 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium) 진균을 배양하는 단계;
    (b) 상기 소정 시간 후에 상기 파네로케이트 크리소스포리움 진균으로부터 가용성 분획을 추출하는 단계; 및
    (c) 상기 가용성 분획을 크로마토그래피 정제시켜서 상기 가용성 분획으로부터 리그닌 퍼옥시다제를 정제시키는 단계
    에 의해 수득되는 것인 화장품 조성물.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 배양 배지는 망간 이온이 결여된 것인 화장품 조성물.
  53. 제 51 항에 있어서, 상기 통기된 배지는, 상기 배양 배지를 0.1 내지 1 ℓ/ℓ/min 범위의 통기율로 처리함으로써 수득되는 것인 화장품 조성물.
  54. 제 51 항에 있어서, 상기 배양은 37℃의 온도에서 실행되는 것인 화장품 조성물.
  55. 제 51 항에 있어서, 상기 교반된 배양 배지는 상기 배양 배지를 50 내지 300 rpm 범위의 속도로 교반함으로써 수득되는 것인 화장품 조성물.
  56. 제 51 항에 있어서, 상기 교반된 배양 배지는 상기 배양 배지를 160 rpm의 속도로 교반함으로써 수득되는 것인 화장품 조성물.
  57. 제 51 항에 있어서, 상기 소정 기간이 3 내지 10일 범위로부터 선택되는 것인 화장품 조성물.
  58. 제 51 항에 있어서, 상기 소정 기간이 7일인 화장품 조성물.
  59. 제 51 항에 있어서, 상기 글리세롤이 리터당 3 내지 20 그램의 농도 범위로 제공되는 것인 화장품 조성물.
  60. 제 51 항에 있어서, 상기 글리세롤이 리터당 6 그램의 농도로 제공되는 것인 화장품 조성물.
  61. 제 51 항에 있어서, 상기 배양 배지가 베라트릴 알콜을 추가로 포함하는 것인 화장품 조성물.
  62. 제 61 항에 있어서, 상기 베라트릴 알콜이 0.5 내지 4 mM의 농도 범위로 제공되는 것인 화장품 조성물.
  63. 제 61 항에 있어서, 상기 베라트릴 알콜이 2 mM의 농도로 제공되는 것인 화장품 조성물.
  64. 제 51 항에 있어서, 상기 리그닌 퍼옥시다제가 동위효소 H1이거나 동위효소 H2의 변형된 형태인 화장품 조성물.
  65. 제 51 항에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 폴리우레탄 발포체인 화장품 조성물.
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