KR101154008B1 - Microfluidic device for transfection of neurons and calculating method of optimum shear stress for transfection of neurons using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 단면적 즉, 횡폭이 상이한 다수의 챔버를 통해 통과되는 배지 플로우의 유속을 각 챔버별로 다르게 형성시킴으로써, 각각의 챔버에서 서로 다른 크기의 전단 응력을 발생시키고, 그에 따라 각 챔버에서의 형질전환 효율을 측정함으로써, 신경세포의 형질전환 효율을 높일 수 있는 최적의 전단 응력을 구할 수 있게 하는 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치 및 이를 이용한 신경세포의 형질전환을 위한 최적의 전단 응력 산출방법에 관한 것이다.According to the present invention, the flow rates of the medium flow passing through a plurality of chambers having different cross-sectional areas, ie, widths, are formed differently for each chamber, thereby generating shear stresses of different sizes in each chamber, and accordingly the characteristics of each chamber. By measuring the conversion efficiency, the microfluidic device for the transformation of neurons and the optimal shear stress for the transformation of neurons using the same to obtain the optimal shear stress to increase the transformation efficiency of neurons It is about a method.
Description
본 발명은 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치 및 이를 이용한 신경세포의 형질전환을 위한 최적의 전단 응력 산출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 단면적이 상이한 다수의 챔버를 통해 통과되는 배지 플로우의 유속을 각 챔버별로 다르게 형성시킴으로써, 각각의 챔버에서 서로 다른 크기의 전단 응력을 발생시키고, 그에 따라 각 챔버에서의 형질전환 효율을 측정함으로써, 신경세포의 형질전환 효율을 높일 수 있는 최적의 전단 응력을 구할 수 있게 하는 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치 및 이를 이용한 신경세포의 형질전환을 위한 최적의 전단 응력 산출방법에 관한 것이다.The present invention relates to a microfluidic device for the transformation of neurons and a method for calculating the optimal shear stress for the transformation of neurons using the same, and more particularly, to a medium flow of passage through a plurality of chambers having different cross-sectional areas. By forming the flow rate differently in each chamber, the shear stress of different sizes are generated in each chamber, and the transformation efficiency in each chamber is measured accordingly, so that the optimal shear stress can increase the transformation efficiency of neurons. The present invention relates to a microfluidic device for transforming neurons and an optimal shear stress calculation method for transforming neurons using the same.
신경 발생학, 생리학, 기능학 등은 특정한 신경계 유전자에 관계되어 있어서, 유전자 표현형과 신경계의 조작은 유전자의 작용이나 조절을 이해하는데 매우 중요하다. 그로 인해, 많은 신경학 연구는 신경의 유전자 변형에 관심을 갖고 있으며, 유전자 물질을 신경세포에 효과적으로 형질전환시키기 위한 방법의 발달을 수반한다.Neurodevelopment, physiology, and functionality are related to specific nervous system genes, so genetic phenotype and manipulation of the nervous system are very important for understanding gene function and regulation. As such, many neurological studies are concerned with the genetic modification of nerves and involve the development of methods for effectively transforming genetic material into neurons.
이러한 형질전환을 위한 유전자 전달 기술로서, 바이러스를 수송체로 사용하는 바이러스성 방법(viral vector-based transfer method)과, 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법(nonviral delivery technique)이 널리 알려져 있다.As gene transfer techniques for transformation, viral vector-based transfer methods using viruses as transporters and nonviral delivery techniques using synthetic phospholipids or synthetic cationic polymers, etc. It is widely known.
바이러스는 그 자체의 생활 메커니즘상 다른 세포의 핵에 자신의 DNA를 넣은 상태로 기생하여 살기 때문에 아주 효율적인 DNA전달 체계로 볼 수 있다. 즉, 바이러스를 이용한 DNA전달 체계에서는 복제가 불가능한 바이러스 내부에 전달하고자 하는 유전자를 넣어서 이를 이용한다. 이러한 기술은 형질전환을 시키는데 상당히 효율적인 것이 장점이다. 그러나 이런 기술은 여러 가지 단점이 있는데, 본질적인 측면에서 보면 비활성화 바이러스를 사용하였다고는 하지만 RCV(Recombination Competent Virus)의 출현이 가능하다는 위험성이 있으며, 면역 반응을 일으켜서 여러 번 사용이 힘들다는 것 등이 있다.Viruses live as parasitic organisms with their DNA in the nucleus of other cells due to their own living mechanisms, making them a very efficient DNA delivery system. In other words, in a DNA delivery system using a virus, a gene to be delivered is inserted into a virus that is impossible to replicate. This technique has the advantage that it is quite efficient for transformation. However, this technique has a number of disadvantages. In essence, the inactivated virus is used, but there is a risk that the recombination virus (RCV) can emerge, and the immune response may be difficult to use several times. .
비바이러스성 방법에는 인산칼슘(calcium-phosphate), DEAE-덱스트란(dextran), 리포펙틴(lipofectin) 등의 양이온 리포솜(cationic liposome) 등이 DNA를 포장하는 시료로 사용된다. 비바이러스성 방법은 바이러스성 방법에 비해 안정성 측면에서 아주 우세한 강점이 있으며, 이입하고자 하는 유전자의 크기에 큰 제한이 없다. 그러나 비바이러스성 형질전환 방법은 외래의 유전자를 분열 후 세포(post-mitotic cell) 중 하나인 신경세포에 주입하는 것이 어렵기 때문에 신경계에 사용하기에는 낮은 효율을 가지고 있다. 게다가, 형질전환 시간, DNA와 매개물의 양과 같은 결정적인 몇몇 변수만이 최적화되어 있어 신경세포 유전자 조작에 빈약하게 이용되고 있는 실정이다.In the non-viral method, cationic liposomes such as calcium phosphate, DEAE-dextran, lipofectin, and the like are used as DNA packaging samples. Non-viral methods have a strong advantage in terms of stability compared to viral methods, there is no big limitation on the size of the gene to be imported. However, the non-viral transformation method has a low efficiency for use in the nervous system because it is difficult to inject foreign genes into neurons, one of post-mitotic cells. In addition, only a few critical variables such as transformation time, amount of DNA and mediators have been optimized and are poorly used for neuronal gene manipulation.
한편, 이러한 비바이러스성 형질전환 방법 중에서도 리포솜을 이용한 형질전환 방법이 주로 연구되어 왔다. 일반적으로 비누나 세제에 사용되는 계면활성제들 같이 꼬리(tail)가 하나인 지질들은 보통 미셀을 형성하고 꼬리가 두 개인 지질은 2분자 막으로 구성된 폐쇄소포체를 형성하게 되는데, 이와 같이 구형의 폐쇄된 2분자 막의 구조를 갖는 것을 소포체(vesicle)라 하고, 이 소포체 중 주요 지질성분이 천연 또는 합성의 인지질로 구성된 폐쇄소포체를 리포솜(liposome)이라고 한다. 이러한 리포솜은 동식물의 세포막과 매우 유사한 성분과 구조로 되어 있어서 세포막 기능 연구에 사용되기도 하며, 생체막과의 친화력을 이용하여 형질전환 등에 사용되고 있다.Meanwhile, among these non-viral transformation methods, transformation methods using liposomes have been mainly studied. Generally, one-tailed lipids, such as surfactants used in soaps or detergents, usually form micelles and two-tailed lipids form closed vesicles consisting of two-molecular membranes. A vesicle having a structure of a two-molecule membrane is called a vesicle, and a closed endoplasmic reticulum composed of natural or synthetic phospholipids is called a liposome. These liposomes are very similar in composition and structure to the cell membranes of animals and plants, which are used for cell membrane function studies, and are used for transformations using affinity with biological membranes.
DNA는 그 자체만으로는 체내에 투여해도 표적세포 내로 들어가지 못한다. 리포솜은 이러한 DNA를 내부에 함유(encapsulation)시키거나 정전기적으로 결합(binding)한 형태로 세포막을 통과하여 세포 내로 전달할 수 있다.DNA alone does not enter the target cells even when administered in the body. Liposomes can be delivered into cells through cell membranes in encapsulation or electrostatic binding of such DNA.
세포의 표면에는 다양한 당지질(glycolipid)과 당단백질(glycoprotein)의 말단부위가 돌출되어 있고, 그 구성 성분 중 시알 산(sialic acid)에 의해 세포 표면이 음전하를 갖게 한다. 전체적으로 양전하를 띠는 리포솜/DNA 복합체(이하 '리포플렉스')는 음으로 하전된 세포 표면에 정전기적으로 쉽게 접근할 수 있게 된다.On the surface of the cell, various glycolipids and terminal ends of glycoproteins protrude, and the surface of the cell is negatively charged by sialic acid. The positively charged liposome / DNA complex (hereinafter referred to as lipoplex) provides electrostatically easy access to negatively charged cell surfaces.
이러한 리포플렉스(Lipoplex)의 세포내 전달과정은 다음과 같이 크게 4단계로 요약될 수 있다.The intracellular delivery of such lipoplexes can be summarized into four stages as follows.
① 리포플렉스 형성① Lipoplex Formation
리포솜을 DNA와 서서히 결합하면서 DNA를 수축시켜 리포솜과의 결합체인 리포플렉스(Lipoplex)를 형성한다.Liposomes are slowly combined with DNA to shrink the DNA to form lipoplexes, which are conjugates with liposomes.
② 세포 내 유입(endocytosis)② endocytosis
리포플렉스를 투여하여 리포솜이 세포막과 결합(융합)하면서, 세포 내로 유입되어 엔도솜(endosome)을 형성한다. 이후 엔도솜을 깨고 세포질 내로 나와서 DNA를 유리시킨다.Liposomes are administered to bind (fusion) the cell membranes and enter the cells to form endosomes. The endosome is then broken and released into the cytoplasm to release the DNA.
③ 핵 내 이동③ movement within the nucleus
DNA가 핵 내로 이동하며, 이때 핵 내 경로 서열(nuclear localization signal)이 필요할 수도 있다. DNA는 핵공(nuclear pore)을 통해 핵 내부로 들어간다.DNA moves into the nucleus, where a nuclear localization signal may be required. DNA enters the nucleus through a nuclear pore.
④ 유전자 발현④ Gene expression
전달된 유전자가 전사 및 번역되어 단백질을 생산하는 과정으로 전달된 유전자의 특성에 따라 작용명령을 전달하고 작동되기 시작한다.Transmitted genes are transcribed and translated to produce proteins, depending on the nature of the genes that are transmitted and begin to act.
위에서 기술한 4단계 중 세포내 유입 단계에서 리포플렉스와 목적세포의 접촉 빈도, 그리고 접촉 면적의 증가는 형질전환의 효율 증가를 이끈다.Increasing the contact frequency of lipoplex and the target cell and the contact area in the intracellular inflow phase of the above four steps leads to an increase in the efficiency of transformation.
한편, 해리스(Harris)와 조르지오(Giorgio)는 대류(convective flow)에 의해 단층세포에 대한 리포플렉스의 전달이 증가된다는 것을 증명했다. 즉, 대류에 의해 발생한 전단 응력(shear stress)이 리포플렉스와 세포 표면의 접촉 비율을 증가시키게 되어, 초기 신경세포에 대한 형질전환 효율이 향상될 수 있게 된다.Harris and Giorgio, on the other hand, have demonstrated that lipoplex delivery to monolayer cells is increased by convective flow. That is, the shear stress caused by convection increases the ratio of contact between the lipoplex and the cell surface, so that the transformation efficiency of the initial neuron can be improved.
그러나 세포는 다양한 물리적, 화학적 환경에 따라 다르게 행동한다. 따라서 대류의 흐름 속도는 형질전환이 의존하는 세포 주기에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.But cells behave differently in different physical and chemical environments. Therefore, the flow rate of convection is known to affect the cell cycle upon which transformation depends.
그러므로 특정 신경세포에 대해 전단 응력이 형질전환 효율에 미치는 영향을 정확하게 확인하고, 또한 신경세포의 형질전환을 위한 최적의 전단 응력(shear stress)을 발생시킬 수 있는 장치의 개발이 요구된다.
Therefore, there is a need for the development of a device capable of accurately identifying the effect of shear stress on the transformation efficiency for a specific neuron and generating an optimal shear stress for transformation of the neuron.
본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 리포플렉스를 이용한 신경세포의 형질전환 효율을 높일 수 있는 최적의 전단 응력을 용이하게 구할 수 있게 하는 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치 및 이를 이용한 신경세포의 형질전환을 위한 최적의 전단 응력 산출방법를 제공하는 것을 본 발명의 주요한 목적으로 한다.The present invention has been made to solve the above-mentioned conventional problems, fine for the transformation of neurons to easily obtain the optimal shear stress that can increase the transformation efficiency of neurons using lipoplexes It is a main object of the present invention to provide a flow device and an optimal shear stress calculation method for transformation of neurons using the same.
또한 본 발명은, 신경세포의 형질전환을 위한 주요 변수로서의 전단 응력과 형질전환 효율의 상관 관계를 용이하게 측정할 수 있게 하는 것을 또 다른 목적으로 한다.In addition, another object of the present invention is to be able to easily measure the correlation between the shear stress and the transformation efficiency as a major variable for transformation of neurons.
상기와 같은 목적을 해결하기 위한 본 발명에 따른 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치는, 신경세포가 배양되는 배양 디시에 부착되어, 배양 디시의 신경세포를 형질전환시키기 위한 미세유동 장치에 있어서, 배양 디시에 부착되는 플레이트 구조의 베이스; 베이스의 중심부에 고정 부착되고, 신경세포의 형질전환을 위한 리포플렉스가 함유된 배지 플로우가 주입되는 유동 채널; 배양 디시의 신경세포가 삽입될 수 있도록 저면이 개방되고, 상기 배지 플로우가 통과될 수 있도록 유동 채널에 연통되며, 배지 플로우에 의한 전단 응력이 서로 다르게 형성되도록 각각 상이한 횡폭을 가지는 다수의 챔버; 및 베이스의 저면에 고정 결합되고, 저면이 개방되어 배양 디시에 연통되며, 내부가 진공 상태를 이루면서 배양 디시의 표면에 고정 부착되는 고정 채널;을 포함하는 것을 특징으로 한다.Microfluidic device for transformation of neurons according to the present invention for solving the above object is attached to a culture dish cultured neurons, microfluidic device for transforming neurons in the culture dish A base of the plate structure attached to the culture dish; A flow channel fixedly attached to the center of the base and into which a medium flow containing a lipoplex for transformation of neurons is injected; A plurality of chambers each having a different width so that the bottom surface is open to allow the nerve cells of the culture dish to be inserted, the fluid channels are communicated with the flow channel, and the shear stresses caused by the medium flow are differently formed; And a fixed channel fixedly coupled to the bottom of the base, the bottom being open to communicate with the culture dish, and fixedly attached to the surface of the culture dish while the interior thereof is in a vacuum state.
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아울러, 상기 미세유동 장치는, 유동 채널의 일측 끝단에 형성되고, 유동 채널에 주입되기 위한 배지가 저장되는 리저버; 유동 채널의 타측 끝단에 형성되고, 리저버에 저장된 배지가 유동 채널을 통해 각 챔버를 지나가도록 흡입하는 펌핑부;를 더 포함하여 구성될 수도 있다.In addition, the microfluidic device, the reservoir is formed at one end of the flow channel, the reservoir for storing the medium to be injected into the flow channel; It is formed on the other end of the flow channel, the pumping unit for sucking the medium stored in the reservoir to pass through each chamber through the flow channel; may be further configured to include.
그리고 본 발명에 따른 신경세포의 형질전환을 위한 최적의 전단 응력 산출방법은, 형질전환을 위한 신경세포가 배양되는 배양 디시를 준비하는 단계; 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치를 준비하는 단계; 미세유동 장치를 배양 디시에 부착시키는 단계; 신경세포의 형질전환을 위한 리포플렉스가 함유된 배지 플로우를 일정하게 유동 채널에 주입하는 단계; 상기 배지 플로우가 순차적으로 각 챔버를 통과하면서, 각 챔버의 상이한 횡폭에 따라 서로 다른 전단 응력을 형성하는 단계; 배지 플로우의 전단 응력에 의해 리포플렉스가 각 챔버의 신경세포를 형질전환시키는 단계; 각 챔버별로 신경세포의 형질전환 효율을 측정하여, 형질전환 효율이 가장 높은 챔버를 추출하는 단계; 하기의 수학식을 이용하여, 상기에서 추출된 형질전환 효율이 가장 높은 챔버에서의 전단 응력을 계산하는 단계;를 포함하여 구성되고,And the optimal shear stress calculation method for transformation of neurons according to the present invention, preparing a culture dish cultured neurons for transformation; Preparing a microfluidic device for transformation of neurons; Attaching the microfluidic device to the culture dish; Constantly injecting a medium flow containing a lipoplex for transformation of neurons into a flow channel; As the medium flow sequentially passes through each chamber, creating different shear stresses according to different widths of each chamber; Lipoplexes transform neurons in each chamber by shear stress of the medium flow; Measuring transformation efficiency of neurons for each chamber, extracting a chamber having the highest transformation efficiency; Comprising: using the following equation, calculating the shear stress in the chamber with the highest transformation efficiency extracted from the above;
(τ는 전단 응력을 나타내고, μ는 배지의 점성(viscosity)을 나타내며, h와 w는 각각 챔버의 높이(100μm)와 너비를 나타내고, Q는 단위 부피당 배지의 유속을 나타낸다.)(τ represents shear stress, μ represents the viscosity of the medium, h and w represent the height (100 μm) and width of the chamber, respectively, and Q represents the flow rate of the medium per unit volume.)
여기서 상기 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치는, 배양 디시에 부착되는 플레이트 구조의 베이스; 베이스의 중심부에 고정 부착되고, 신경세포의 형질전환을 위한 리포플렉스가 함유된 배지 플로우가 주입되는 유동 채널; 배양 디시의 신경세포가 삽입될 수 있도록 저면이 개방되고, 상기 배지 플로우가 통과될 수 있도록 유동 채널에 연통되며, 배지 플로우에 의한 전단 응력이 서로 다르게 형성되도록 각각 상이한 횡폭을 가지는 다수의 챔버;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.Wherein the microfluidic device for transformation of the neurons, the base of the plate structure attached to the culture dish; A flow channel fixedly attached to the center of the base and into which a medium flow containing a lipoplex for transformation of neurons is injected; A plurality of chambers each having a different transverse width so that the bottom surface is open to allow the nerve cells of the culture dish to be inserted into the culture channel, and the flow channel is allowed to pass through the culture flow; Characterized in that it comprises a.
상기와 같은 구성을 가지는 본 발명에 따른 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치 및 이를 이용한 신경세포의 형질전환을 위한 최적의 전단 응력 산출방법에 의하면, 신경세포의 형질전환을 위한 주요 변수로서의 전단 응력과 형질전환 효율의 상관 관계를 용이하게 측정할 수 있게 된다.According to the microfluidic device for the transformation of neurons according to the present invention having the configuration as described above and an optimal shear stress calculation method for transformation of neurons using the same, shear as a major variable for transformation of neurons The correlation between stress and transformation efficiency can be easily measured.
또한 본 발명에 의하면, 신경세포의 형질전환 효율을 높일 수 있는 최적의 전단 응력을 용이하게 구할 수 있다.In addition, according to the present invention, it is possible to easily obtain the optimum shear stress that can increase the transformation efficiency of neurons.
또한 본 발명에 의하면, 리포플렉스를 이용하여 신경세포를 형질전환시킴에 있어서, 다른 변수를 모두 고정한 상태에서 배지 플로우의 유속과 챔버의 너비를 조절함으로써 유일한 변수인 전단 응력을 용이하게 조절할 수 있게 된다.In addition, according to the present invention, in transforming nerve cells using lipoplex, it is possible to easily control the shear stress which is the only variable by adjusting the flow rate of the medium flow and the width of the chamber while all other variables are fixed. .
또한 본 발명에 의하면, 분열되거나 분열되기 전의 신경세포 모두에 대해 형질전환 효율을 높이기 위한 최적의 전단 응력을 구할 수 있게 된다.In addition, according to the present invention, it is possible to obtain the optimum shear stress for improving the transformation efficiency for all the neurons before division or division.
또한 본 발명에 의하면, 체내에서 다양한 부피를 갖는 혈관을 통한 세포치료와 같은 생체모방의 전단 응력 유발 현상에도 유용하게 이용될 수 있다.In addition, according to the present invention, it can be usefully used in the shear stress induced phenomenon of biomimetics, such as cell therapy through blood vessels having various volumes in the body.
도 1 내지 도 3은 본 발명에 따른 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치를 나타내는 사시도, 측면도 및 평면도.
도 4는 전단 응력에 따른 초기 신경세포와 NIE-115 세포 형질전환 효율을 나타내는 사진.
도 5 및 도 6은 전단 응력에 따른 초기 신경세포와 NIE-115 세포 형질전환 효율을 나타내는 그래프.1 to 3 is a perspective view, a side view and a plan view showing a microfluidic device for transformation of neurons according to the present invention.
Figure 4 is a photograph showing the initial neuronal and NIE-115 cell transformation efficiency according to shear stress.
5 and 6 are graphs showing the transformation efficiency of early neurons and NIE-115 cells according to shear stress.
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치에 대한 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다.Hereinafter, with reference to the accompanying drawings will be described in detail a preferred embodiment of the microfluidic device for transformation of neurons according to the present invention.
도 1 내지 도 3에는 본 발명에 따른 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치를 나타내는 사시도, 측면도 및 평면도가 도시되어 있다.1 to 3 are a perspective view, a side view and a plan view showing a microfluidic device for transformation of neurons according to the present invention.
도 1 내지 도 3을 참조하면, 본 발명에 따른 미세유동 장치는 신경세포가 배양되는 배양 디시(Culture Dish)에 부착되어 신경세포를 형질전환(trancfection)시키기 위한 것으로서, 배양 디시에 부착되는 플레이트 구조의 베이스(10), 베이스(10)의 중심부에 고정 부착되어 신경세포의 형질전환을 위한 리포플렉스(lipoplex)가 함유된 배지 플로우(medium flow)가 통과하는 유동 채널(30), 상기 유동 채널(30)에 연통되고 횡폭이 서로 다르게 형성되는 다수의 챔버(40)를 포함하여 구성된다.1 to 3, the microfluidic device according to the present invention is attached to a culture dish in which nerve cells are cultured, and is used for transfection of the nerve cells, and the plate structure is attached to the culture dish. The
여기서, 상기 배양 디시에 부착되는 베이스(10)는 유동 채널(30) 및 각 챔버(40)를 지지하기 위한 몸체를 구성하는 것으로서, PDMS(Polydimethylsiloxane) 재질의 플레이트 구조로 이루어지는 것이 바람직하다. 즉, 상기 베이스(10)는 PDMS를 이용하여 신속 조형(rapid prototyping) 및 소프트 리소그래피(soft lithography) 방식으로 만들어진다. 그리고 베이스(10)의 마스터(master) 틀을 만들기 위해 SU-8 네거티브 포토레지스트(negative photoresist)가 사용된다.Here, the
이러한 베이스(10)는 신경세포가 배양되고 있는 배양 디시의 표면에 직접 접촉하지 않은 상태에서, 배양 디시에 가역적으로 고정 부착되도록 구성되는 것이 바람직하다.The
이를 위해, 본 발명에 따른 미세유동 장치는, 베이스(10)의 저면에 고정 결합되고, 저면이 개방되어 배양 디시에 연통되며, 내부가 진공 상태를 이루면서 배양 디시의 표면에 고정 부착되는 고정 채널(70)을 더 포함하여 구성되는 것이 바람직하다.To this end, the microfluidic device according to the present invention is fixedly coupled to the bottom of the
또한 본 발명에 따른 미세유동 장치는, 상기 고정 채널(70) 내부를 진공 상태로 만들어서 베이스(10)를 배양 디시에 고정시킬 수 있도록 고정 채널(70) 내부의 공기를 외부로 흡입하기 위한 진공 튜브(60)를 더 포함하여 구성될 수 있다.In addition, the microfluidic device according to the present invention is a vacuum tube for sucking the air inside the fixed
상기 베이스(10)의 저면에는 환형의 고정 채널(70) 상면이 고정 결합되는데, 이때 고정 채널(70)의 저면은 개방되어 배양 디시의 표면에 연통되는 구조로 이루어진다. 따라서 진공 튜브(60)를 통해 공기를 흡입하면, 고정 채널(70) 내부가 진공 상태를 이루면서 배양 디시의 표면에 고정 부착되고, 결국 미세유동 장치는 배양 디시의 표면에 가역적으로 고정 결합된다. 또한 상기 진공 튜브(60)를 통해 공기를 주입하게 되면, 고정 채널(70)은 배양 디시의 표면에 단순 접촉 상태가 되고, 결국 미세유동 장치를 배양 디시의 표면에서 분리시킬 수 있게 된다.An upper surface of the annular fixed
한편, 이러한 고정 채널(70)을 디자인함에 있어서 별다른 제한은 없고, 그 폭의 범위는 50 ~ 500μm 정도가 바람직하다.On the other hand, there is no restriction in designing such a fixed
그리고 미세유동 장치를 배양 디시에 고정시키기 위한 고정 채널(70)과, 미세유동 장치의 각 챔버(40)를 연결하는 유동 채널(30) 사이의 누설을 막기 위해, 고정 채널(70)과 유동 채널(30)은 대략 0.2 ~ 2mm 정도 떨어져 있게 구성되는 것이 바람직하다.And a fixed
따라서 각 챔버들(40)과 진공의 고정 채널(70)들이 상호 떨어져 있기 때문에, 고정 채널(70)들을 진공 상태로 만들어서 미세유동 장치를 배양 디시에 결합할 때, 신경세포가 배양 디시에 미리 존재하고 있어도 미세유동 장치의 결합으로 인해 실험에 관계하는 세포에는 손상이 발생하지 않게 된다.Therefore, since the
그리고 상기 베이스(10)의 중심부에는 외부의 배지 플로우를 이동시키기 위한 유동 채널(30)이 고정 부착되고, 상기 유동 채널(30)에 주입되는 배지 플로우에는 신경세포의 형질전환을 위한 리포플렉스가 함유되어 있다.In addition, a
또한 본 발명에 따른 미세유동 장치는, 상기 배지 플로우를 유동 채널(30)에 주입시키기 위해, 유동 채널(30)의 일측 끝단에 형성되어 유동 채널(30)에 주입되기 위한 배지가 저장되는 리저버(reservior)(20)와, 유동 채널(30)의 타측 끝단에 형성되어 리저버(20)에 저장된 배지를 흡입하는 펌핑부(50)를 더 포함하여 구성되는 것이 바람직하다.In addition, the microfluidic device according to the present invention is formed in one end of the
이처럼, 유동 채널(30)의 일측 끝단에는 유동 채널(30)에 주입되기 위한 배지(신경세포의 형질전환을 위한 리포플렉스 함유)가 저장되는 리저버(20)가 형성된다. 그리고 유동 채널(30)의 타측 끝단에는 리저버(20)에 저장된 배지를 흡입하여 유동 채널(30)을 통해 각 챔버(40)로 순환시키기 위한 펌핑부(50)가 형성된다.As such, at one end of the
따라서 펌핑부(50)를 통해 리저버(20)에 저장된 배지를 흡입하면, 리저버(20)에 저장된 배지와, 그 배지에 수용된 리포플렉스가 유동 채널(30)을 따라 이동하면서 각 챔버(40)를 순차적으로 지나가게 되고, 각 챔버(40)를 지나는 동안 배지에 수용된 리포플렉스가 신경세포의 표면에 점착된 후, 배지 플로우에 의해 발생되는 전단 응력에 의해 리포플렉스가 신경세포를 형질전환시키게 된다.Therefore, when the medium stored in the
그리고 이러한 유동 채널(30)의 중간 중간에는 횡폭이 서로 다른 따라서, 단면적이 서로 다른 다수의 챔버(40)가 일정 간격으로 떨어져서 순차적으로 위치하고, 각 챔버(40)는 유동 채널(30)에 연통된다. 따라서 리저버(20)에서 유동 채널(30)에 주입된 일련의 배지 플로우가 유동 채널(30)을 통해 이동하면서 순차적으로 각 챔버(40)를 통과하게 된다.In the middle of the
여기서, 상기 각 챔버(40)는 배양 디시의 신경세포가 삽입될 수 있도록 저면이 개방되는 구조로 이루어지고, 저면을 제외한 각 챔버(40)의 나머지 부분, 즉 상면 및 양 측면은 폐쇄된 구조로 이루어지는 것이 바람직하다.Here, each of the
따라서 베이스(10)를 배양 디시에 부착시키면 베이스(10)의 중심부에 형성된 각 챔버(40)들은 배양 디시의 표면에 접촉하게 되고, 이때 각 챔버(40)의 저면이 개방된 구조로 이루어지므로, 배양 디시에서 배양되고 있던 신경세포들이 각 챔버(40)에 삽입되어, 그 삽입된 챔버(40) 안에서 배양되는 상태가 된다.Therefore, when the
또한 상기 각 챔버(40)의 횡폭, 따라서 단면적이 서로 다른 크기로 이루어지고, 그로 인해 각 챔버(40)를 지나가는 배지 플로우의 유속(flow rate) 역시 챔버(40)별로 상이하게 나타나게 된다.In addition, the width of each
그리고 신경세포의 형질전환을 위한 리포플렉스를 함유한 배지 플로우가 순차적으로 각 챔버(40)를 통과하는 과정에서, 배지에 함유된 리포플렉스가 각 챔버(40)에서 배양되고 있는 신경세포에 점착된다. 이때, 각 챔버(40)를 지나가는 배지 플로우는 리포플렉스에 대해 전단 응력을 발생시킴으로써, 리포플렉스가 신경세포에 보다 쉽게 삽입될 수 있게 하여 신경세포의 형질전환을 돕게 된다. In addition, the lipoplexes contained in the medium adhere to the neurons being cultured in each
한편, 상기 배지 플로우는 서로 다른 횡폭을 따라서, 단면적을 가지는 챔버(40)의 구조로 인해 각 챔버(40) 별로 상이한 유속을 형성하게 되고, 이처럼 상이한 배지 플로우의 유속으로 인해 각 챔버(40) 별로 상이한 전단 응력이 발생하게 된다.On the other hand, the medium flow is to form a different flow rate for each
이처럼 각 챔버(40)에서 발생되는 전단 응력은 해당 챔버(40)를 지나가는 순간의 배지의 유속에 의해 결정된다. 그리고 유동 채널(30)에 주입되는 배지 플로우의 유속을 일정하게 하면, 결국 챔버(40)를 통과할 때 배지 플로우의 유속은 각 챔버(40)의 단면적에 의해 결정되고, 각 챔버(40)에서 발생되는 전단 응력은 하기의 수학식을 통해 계산될 수 있다.Thus, the shear stress generated in each
여기서, τ는 전단 응력을 나타내고, μ는 배지의 점성을 나타내며, h와 w는 각각 챔버의 높이(100μm)와 너비를 나타내고, Q는 단위 부피당 배지의 유속을 나타낸다. 이때, 상기 단위 부피당 배지의 유속(Q)은 리저버(20)에서 유동 채널(30)에 공급될 때의 배지 플로우 유속을 나타내므로, 이러한 단위 부피당 배지의 유속(Q)는 일정하게 유지될 수 있다.Where τ represents the shear stress, μ represents the viscosity of the medium, h and w represent the height (100 μm) and width of the chamber, respectively, and Q represents the flow rate of the medium per unit volume. At this time, the flow rate (Q) of the medium per unit volume indicates the flow rate of the medium flow when supplied to the
따라서 상기 수학식 1에서 배지의 점성(μ)과 단위 부피당 배지의 유속(Q)은 일정하게 유지되므로 상수가 되고, 챔버(40)의 높이(h)와 너비(w)만 변수로 남게 되므로, 결국 각 챔버(40)를 통과하는 배지 플로우에 의해 형성되는 전단 응력은 챔버(40)의 단면적에 의해 결정된다고 할 것이다.Therefore, since the viscosity (μ) of the medium and the flow rate (Q) of the medium per unit volume are kept constant in Equation 1, only the height (h) and the width (w) of the
또한 도 1 및 도 3에 도시된 바와 같이 모든 챔버(40)의 높이(h)를 동일하게 설정하고 너비(w)만 서로 다르게 설정하면, 각 챔버(40)를 통과하는 배지 플로우에 의해 형성되는 전단 응력은 챔버(40)의 너비(w)에 의해 결정된다고 할 것이다. 반대로, 챔버(40)의 너비(w)를 동일하게 하여 상수로 설정하면, 전단 응력은 각 챔버(40)의 높이(h)에 의해 결정될 수 있을 것이다.In addition, as shown in FIGS. 1 and 3, if the height h of all the
이러한 방식으로 각 챔버(40)를 지나가는 배지 플로우에 의해 발생되는 전단 응력을 구하고, 또한 각 챔버(40)에서 배양되는 신경세포에 대한 형질전환 효율을 측정하여, 신경세포의 형질전환 효율을 높일 수 있는 최적의 전단 응력을 구할 수 있게 된다. 또한 최적의 전단 응력을 발생시킬 수 있는 변수로서, 챔버(40)의 단면적, 챔버(40)의 높이와 너비 중 어느 하나를 구할 수도 있게 된다.In this manner, the shear stress generated by the medium flow passing through each
한편, 상기에서 설명한 미세유동 장치를 이용하여 신경세포의 형질전환을 위한 최적의 전단 응력을 산출하는 과정에 대해 살펴본다.On the other hand, using the microfluidic device described above looks at the process of calculating the optimal shear stress for transformation of neurons.
우선, 형질전환을 위한 신경세포가 배양되는 배양 디시를 준비하고, 또한 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치를 준비한다. 이러한 미세유동 장치의 구성은 전술한 바와 같다.First, a culture dish in which nerve cells for transformation are cultured is prepared, and a microfluidic device for transformation of nerve cells is also prepared. The configuration of such a microfluidic device is as described above.
그리고 미세유동 장치를 배양 디시에 부착시키게 되는데, 전술한 바와 같이 고정 채널(70) 내부를 진공 상태를 만드는 방식으로 미세유동 장치를 배양 디시에 가역적으로 고정 부착시킬 수 있다.Then, the microfluidic device is attached to the culture dish. As described above, the microfluidic device may be reversibly fixed to the culture dish in such a manner as to vacuum the inside of the fixed
이후, 신경세포의 형질전환을 위한 리포플렉스가 함유된 배지 플로우를 일정하게 유동 채널(30)에 주입하면, 상기 배지 플로우가 순차적으로 각 챔버(40)를 통과하면서, 각 챔버(40)의 상이한 단면적에 따라 서로 다른 전단 응력을 형성하게 된다.Thereafter, when a medium flow containing a lipoplex for transformation of nerve cells is constantly injected into the
그리고 배지 플로우의 전단 응력에 의해 리포플렉스가 각 챔버(40)의 신경세포를 형질전환시키게 되는데, 각 챔버(40) 별로 전단 응력이 상이하게 나타나므로 각 챔버(40) 별로 형질전환 효율(trancfection efficiency)도 상이하게 나타나게 된다.The lipoplex transforms neurons in each
따라서 각 챔버(40)별로 신경세포의 형질전환 효율을 측정하여, 형질전환 효율이 가장 높은 챔버(40)를 추출하고, 상기 수학식 1을 이용하여 형질전환 효율이 가장 높은 챔버(40)에서의 전단 응력을 계산함으로써, 신경세포를 형질전환시키기 위한 최적의 전단 응력을 구할 수 있게 된다.Therefore, by measuring the transformation efficiency of the neurons for each
이하에서는 상기와 같이 구성되는 본 발명에 따른 미세유동 장치를 이용하여 신경세포의 형질전환을 위한 최적의 전단 응력을 구하는 과정의 실험예를 살펴본다.
Hereinafter, look at the experimental example of the process of obtaining the optimum shear stress for the transformation of neurons using the microfluidic device according to the present invention configured as described above.
1. 세포 배양1. Cell culture
초기 신경세포는 E18 랫(rat)의 피질 조직에서 얻어서 종래의 일반적인 방법으로 배양한다. 예를 들어, CMF-HBSS 용액(칼슘과 마그네슘이 결여되고 4.2 mM 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 1 mM 피루브산염(pyruvate), 0.3% 소혈청알부민(bovine serum albumin)이 보충된 행크스액)에서 diE18 랫(rat) 엠브리오(embryo)를 절개해서 얻은 피질의 조직을 CMF로 행구고, 37℃에서 7분 동안 0.5 mM EDTA와 0.125% 트립신을 함유하는 CMF-HBSS 용액에서 트립신 처리한다.Early neurons are obtained from cortical tissues of E18 rats and cultured in a conventional manner. For example, diE18 in CMF-HBSS solution (Hanks solution lacking calcium and magnesium, supplemented with 4.2 mM sodium bicarbonate, 1 mM pyruvate, 0.3% bovine serum albumin) Cortical tissue obtained by dissecting rat embryo is rinsed with CMF and trypsinized in CMF-HBSS solution containing 0.5 mM EDTA and 0.125% trypsin at 37 ° C. for 7 minutes.
10% 우아혈청(fetal calf serum)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 트립신 처리를 중지시킨다. 1분동안 1000 rpm에서 원심분리하여 조직 펠릿을 얻고, 배양 배지(B27, 굴타맥스(GlutaMAX), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin?treptomycin)이 보충된 뉴로배설 배지(Neurobasal medium)에서 재차 현탁한 후, 파스퇴르 피펫트로 분쇄하고, 4×106 cells/ml 밀도로 만든다.Stop trypsin treatment with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) with 10% fetal calf serum. Tissue pellets are obtained by centrifugation at 1000 rpm for 1 minute, resuspended in neuroexcretion medium (Neurobasal medium) supplemented with culture medium (B27, GlutaMAX, penicillin-treptomycin), Grind with Pasteur pipette and make to 4 × 10 6 cells / ml density.
그리고 N1E-115 세포는 이미 공지된 프로토콜에 따라 배양된다. 예를 들어, N1E-115 세포들은 배양 배지(0.13% NaHCO3를 함유하고, 2% L-글루타민(L-glutamine), 120 U/ml 페니실린, 12 U/ml 스트렙토마이신, 13% 우태혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM)에서 성장된다.
And N1E-115 cells are cultured according to already known protocols. For example, N1E-115 cells contain culture medium (0.13% NaHCO3, 2% L-glutamine, 120 U / ml penicillin, 12 U / ml streptomycin, 13% fetal bovine) serum) is grown in DMEM).
2. 실험 절차2. Experimental procedure
초기 신경세포는 4×106 cells/ml 밀도의 신경세포 배양 배지에서 6-웰 플레이트(well plate)로 코팅된 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)에 접종된다. 이때, 미세유동 장치를 신경세포 배양 디시에 부착시키기 전에 각 챔버 안에 거품이 들어가지 않도록 한다. 한편, 산소 플라즈마 처리는 유동 채널(30)의 표면을 친수성으로 만들어주데 도움이 될 수 있다.Initial neurons are seeded in poly-L-lysine coated with a 6-well plate in 4 × 10 6 cells / ml neuronal culture medium. At this time, before the microfluidic device is attached to the nerve cell culture dish, bubbles do not enter each chamber. Oxygen plasma treatment, on the other hand, may help to make the surface of the
미세유동 장치를 배양 디시에 부드럽게 안착시킨 후, 0.38mm 폴리에틸렌 튜브를 10ml 주사기에 연결하여 진공 튜브를 통해 공기를 흡입함으로써 고정 채널(70) 내부를 진공 상태로 만들면, 미세유동 장치는 배양 디시에 가역적으로 고정 결합된 상태가 된다.After the microfluidic device is gently seated in the culture dish, the 0.38 mm polyethylene tube is connected to a 10 ml syringe to draw the air through the vacuum tube to vacuum the inside of the fixed
그리고 미세유동 장치가 고정 부착된 배양 디시의 복합체를 37℃, 5% 이산화탄소의 배양기에 넣는다.The microfluidic device is fixedly attached to the incubator of culture dish with 37 ° C. and 5% carbon dioxide.
한편, pcDNA/GFP 벡터를 이용하면 녹색 형광 단백질 발현을 통해 형질전환 효율을 쉽게 측정 할 수 있다.On the other hand, using the pcDNA / GFP vector, the transformation efficiency can be easily measured through green fluorescent protein expression.
그리고 리포플렉스(Lipoplex)를 다음과 같이 준비한다.Then prepare a lipoplex as follows.
리포펙타민(Lipofectamine) 2000 1μg과 플라스미드(plasmid) 1μg을 각각 옵티-멤 I 리듀스드 세럼 배지(Opti-MEM I Reduced Serum Medium)로 분리해서 희석하고, 상온에서 혼합한다.1 μg of Lipofectamine 2000 and 1 μg of plasmid are separated and diluted with Opti-MEM I Reduced Serum Medium and mixed at room temperature.
그 결과물인 리포플렉스를 리저버(20)에 넣어주고, 0.38mm 폴리에틸렌 튜브로 연결된 시린지 펌프로 2시간 동안 흡입하여 유동 채널(30) 내에 배지의 흐름을 준다.The resulting lipoplexes are placed in the
진공을 끄고, 배양 디시에 있는 형질전환 된 세포를 미세유동 장치에서 분리하고, 탐지 전 1일동안 개방된 배양 배지에서 배양한다.The vacuum is turned off and the transformed cells in the culture dish are separated in the microfluidic device and incubated in open culture medium for one day before detection.
3군데의 다른 곳의 형광사진을 니콘 E800 업라이트 현미경(Nikon E800 upright microscope)로 얻고, 형질전환 효율을 전체 세포에 대한 GFP 발현 세포의 수로 구한다.Fluorescence photographs from three different locations are obtained with a Nikon E800 upright microscope and the transformation efficiency is determined by the number of GFP expressing cells for the whole cell.
그리고 각 챔버(40)의 전단 응력은 전술한 수학식 1을 이용하여 계산한다.
And the shear stress of each
3. 실험 결과3. Experimental Results
배양 디시에 있는 세포는 배지 흐름에 의한 전단 응력이나 세포에 대한 리포플렉스 캐스팅에 의해 형질전환 중 세포에 손상을 가속화시켜 떨어지거나 죽기 쉽다. 그러므로 전단 응력이 형질전환 효율에 미치는 영향을 조사하기 전에, 세포에 손상을 주지 않는 가장 높은 효율을 보이는 한계의 전단 응력을 조사할 필요가 있다.Cells in the culture dish are prone to fall or die by accelerating damage to the cells during transformation by shear stress caused by medium flow or lipoplex casting to the cells. Therefore, before investigating the effect of shear stress on transformation efficiency, it is necessary to investigate the shear stress at the limit of the highest efficiency that does not damage cells.
0.1 ~ 0.5μl/min의 다양한 부피당 흐름 속도를 조사하였다.Various flow rates per volume of 0.1-0.5 μl / min were investigated.
너비가 가장 좁은 챔버(100μm)는 부피당 흐름속도가 0.5μl/min에서 형질전환 몇 시간 후 씻겨 내려가거나 죽는데, 이때의 전단 응력은 0.38 dyne/cm2이다. 너비가 100μm인 챔버에서 0.4μl/min의 흐름(0.30 dyne/cm2)은 세포가 씻겨 내려가지 않을 것 같지만, 세포가 형질전환과 GFP 발현 후 죽기 시작했다.The narrowest chamber (100 μm) was washed down or killed after several hours of transformation at a flow rate per volume of 0.5 μl / min, with a shear stress of 0.38 dyne /
이것은 세포 표면에 흐름 외에 리포플렉스의 무리한 충돌이 손상을 준다는것을 나타낸다. 전단 응력과 리포플렉스는 세포가 노출되는 동안 유해하게 작용할 수 있다. 미세유동 장치 안에서의 세포 손상은 상기 두가지 원인의 복합적인 영향을 이해할 수 있게 해준다.This indicates that excessive collisions of lipoplexes in addition to flow to the cell surface damage them. Shear stress and lipoplexes can act detrimentally during cell exposure. Cell damage in the microfluidic device makes it possible to understand the combined effects of the two causes.
이 사전 실험을 기본으로, 모든 실험에서 형질도입에 대한 흐름속도의 영향을 반영하기 위해 부피당 흐름을 0.3μㅣ/min에서 실행하였고, 이것은 가장 작은 챔버(100μm 너비)에서 형질전환 이후 세포의 죽음을 막는 가장 높은 흐름 속도이다.Based on this preliminary experiment, the flow per volume was run at 0.3 μl / min in all experiments to reflect the effect of flow rate on transduction, and this resulted in cell death after transformation in the smallest chamber (100 μm wide). The membrane is the highest flow rate.
결국, 본 발명에 따른 미세유동 장치를 이용하면 전단 응력을 제외한 형질전환 효율에 영향을 주는 모든 변수를 한 번에 고정할 수 있으므로, 전단 응력과 형질전환 효율의 상관 관계를 정확하게 측정할 수 있게 된다.After all, by using the microfluidic device according to the present invention, all variables affecting the transformation efficiency except for the shear stress can be fixed at one time, thereby accurately measuring the correlation between the shear stress and the transformation efficiency. .
도 4의 (A) ~ (C)와 도 5는 서로 다른 전단 응력에 따른 초기 신경세포(primary neuron)의 형질전환 효율(trancfection efficiency)의 특징을 나타낸다. 그리고 도 4의 (D) ~ (F)와 도 6은 서로 다른 전단 응력에 따른 N1E-115 세포의 형질전환 효율(trancfection efficiency)의 특징을 나타낸다.4 (A) to (C) and FIG. 5 show characteristics of transfection efficiency of primary neurons according to different shear stresses. 4 (D) to (F) and FIG. 6 show characteristics of transfection efficiency of N1E-115 cells according to different shear stresses.
상기 도 4에서, (A)는 초기 신경세포에 대해 전단 응력이 없는 경우의 GFP 발현을 나타내고, (B)는 초기 신경세포에 대해 2.2 × 10-2 dyne/cm3의 전단 응력이 가해진 경우의 GFP 발현을 나타내며, (C)는 초기 신경세포에 대해 9.1 × 10-2 dyne/cm3의 전단 응력이 가해진 경우의 GFP 발현을 나타낸다. 그리고 (D)는 N1E-115 세포에 대해 전단 응력이 없는 경우의 GFP 발현을 나타내고, (E)는 N1E-115 세포에 대해 2.2 × 10-2 dyne/cm3의 전단 응력이 가해진 경우의 GFP 발현을 나타내며, (F)는 N1E-115 세포에 대해 9.1 × 10-2 dyne/cm3의 전단 응력이 가해진 경우의 GFP 발현을 나타낸다.In FIG. 4, (A) shows GFP expression when there is no shear stress on the initial neurons, and (B) shows when shear stress of 2.2 × 10 −2 dyne / cm 3 is applied to the initial neurons. GFP expression, (C) represents GFP expression when shear stress of 9.1 × 10 −2 dyne / cm 3 was applied to early neurons. And (D) represents GFP expression when there is no shear stress on N1E-115 cells, and (E) expresses GFP expression when 2.2 × 10 −2 dyne / cm 3 is applied to N1E-115 cells. (F) shows GFP expression when shear stress of 9.1 × 10 −2 dyne / cm 3 was applied to N1E-115 cells.
그리고 도 5와 도 6은 각각 초기 신경세포와 N1E-115 세포에 대한 GFP 발현 효율을 나타내는 그래프이다.5 and 6 are graphs showing the expression efficiency of GFP for early neurons and N1E-115 cells, respectively.
낮은 흐름속도에서 초기 신경세포와 N1E-115의 p-밸류(p-values)는 각각 [0.030, 0.009, 0.010, 0.050]와 [0.007, 0.030, 0.060, 0.070]과 같다. 낮은 p-values는 실험결과를 증명하는데 도움을 준다.At low flow rates, the p-values of early neurons and N1E-115 are [0.030, 0.009, 0.010, 0.050] and [0.007, 0.030, 0.060, 0.070], respectively. Low p-values help to verify the experimental results.
도 4(A~C) 및 도 5를 참조하면, 전단 응력이 증가할수록 형질전환 효율은 흐름이 없을 때와 비교해서 3배 증가하였다. 그러나 0.228에서의 효율은 증가하지 않고 조금 감소하였다. 또한 너무 높은 전단 응력에서는 중요한 형질도입 효율의 증가가 발견되지 않았다.Referring to FIGS. 4A and 5, as the shear stress is increased, the transformation efficiency is increased by three times compared to when there is no flow. However, the efficiency at 0.228 did not increase but decreased slightly. In addition, no significant increase in transduction efficiency was found at too high shear stress.
이러한 물리적 현상을 고려할 때, 유전적 표현은 삽입된 플라스미드의 수, 그리고 리포플렉스와 세포 표면 사이의 충돌과 접착 횟수에 비례해야 한다. 흐름속도의 증가는 충돌 횟수를 증가시키지만, 동시에 리포플렉스가 세포 표면에 녹기 전에 세포 표면으로부터 씻겨내려 가므로 접착에는 부정적이다.Given these physical phenomena, the genetic representation should be proportional to the number of plasmids inserted and the number of collisions and adhesions between the lipoplex and the cell surface. Increasing the flow rate increases the number of collisions, but at the same time is negative for adhesion as the lipoplex is washed away from the cell surface before it melts on the cell surface.
따라서 전단 응력의 증가는 형질전환 효율을 증가시킬 수 있지만, 너무 높은 전단 응력은 오히려 형질전환 효율을 감소시키게 되므로, 이를 통해 형질전환 효율을 극대화시킬 수 있는 최적의 전단 응력을 구할 수 있을 것이다.Therefore, the increase of the shear stress can increase the transformation efficiency, but too high shear stress will reduce the transformation efficiency, so through this it will be able to obtain the optimal shear stress to maximize the transformation efficiency.
한편, 세포벽 안으로 DNA 이동은 전사가 일어나는 핵 안으로 들어가야 한다. 이때, 초기 신경세포와 같이 분할되지 않은 세포는 작은 핵공을 통해 큰 외부의 DNA가 들어가므로 높은 효율의 형질전환을 얻기 어렵다. 반대로, 분할된 세포는 상대적으로 외부의 DNA가 형질전환되기 쉽다.DNA migration into the cell wall, on the other hand, must enter the nucleus where transcription occurs. At this time, cells that are not divided, such as early neurons, enter large external DNA through small nuclear pores, and thus, high efficiency transformation is difficult to obtain. In contrast, divided cells are relatively susceptible to transformation of external DNA.
도 4(D~F)와 도 6을 참조하면, 전단 응력의 증가로 인해 NIE-115 세포의 형질전환 효율이 44% 증가된 결과가 나타내는데, 이것은 전단 응력이 없을 때보다 2배 증가한 것이다.Referring to Figures 4 (D ~ F) and 6, the increase in the shear stress results in a 44% increase in the transformation efficiency of NIE-115 cells, which is a two-fold increase compared to the absence of shear stress.
그러나 너무 높은 전단 응력은 오히려 NIE-115 세포의 형질전환 효율을 감소시키는데, 이러한 결과는 초기 신경세포에서도 비슷하게 나타난다.However, too high shear stress rather reduces the transformation efficiency of NIE-115 cells, which is similar in early neurons.
이러한 결과로부터 전단 응력은 분열되거나 분열되기 전의 신경세포에 DNA분자의 삽입을 증가시켜서 형질전환 효율을 증가시킨다는 결론을 도출할 수 있고, 결국 본 발명에 따른 미세유동 장치는 분열되거나 분열되기 전의 신경세포에 리포플렉스를 형질전환시키기 위한 최적의 전단 응력을 구할 수 있는 장치라고 할 것이다.From these results, it can be concluded that the shear stress increases the efficiency of transformation by increasing the insertion of DNA molecules into neurons before they are divided or divided, so that the microfluidic device according to the present invention is the neurons before being divided or divided. It will be said that the device can find the optimal shear stress for transforming lipoplex.
결론적으로, 전단 응력의 증가는 형질전환 효율을 증가시킬 수 있지만, 너무 높은 전단 응력은 오히려 형질전환 효율을 감소시키게 되므로, 본 발명에 따른 미세유동 장치에 구비된 다양한 너비를 가지는 다수의 챔버를 이용하여 다양한 크기의 전단 응력을 발생시킴으로써, 형질전환 효율을 극대화시킬 수 있는 최적의 전단 응력을 구할 수 있게 된다.In conclusion, an increase in shear stress can increase transformation efficiency, but too high shear stress will result in a decrease in transformation efficiency, thus utilizing multiple chambers having various widths provided in the microfluidic device according to the present invention. By generating shear stresses of various sizes, it is possible to obtain an optimal shear stress that can maximize transformation efficiency.
이상의 설명에서 본 발명은 신경세포의 형질전환에 관련하여 도시 및 설명하였지만, 특허청구범위에 의해 나타난 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 한도 내에서 다른 세포들의 형질전환에도 적용할 수 있다는 것을 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 쉽게 알 수 있을 것이다.Although the invention has been shown and described in relation to the transformation of neurons in the above description, it is also possible in the art that the invention can also be applied to transformation of other cells without departing from the spirit and scope of the invention as indicated by the claims. Anyone with ordinary knowledge can easily know.
10; 베이스 20; 리저버
30; 유동 채널 40; 챔버
50; 펌핑부 60; 진공 튜브
70; 고정 채널10;
30;
50; A pumping
70; Fixed channel
Claims (4)
배양 디시에 부착되는 플레이트 구조의 베이스;
베이스의 중심부에 고정 부착되고, 신경세포의 형질전환을 위한 리포플렉스가 함유된 배지 플로우가 주입되는 유동 채널;
배양 디시의 신경세포가 삽입될 수 있도록 저면이 개방되고, 상기 배지 플로우가 통과될 수 있도록 유동 채널에 연통되며, 배지 플로우에 의한 전단 응력이 서로 다르게 형성되도록 각각 상이한 횡폭을 가지는 다수의 챔버; 및
베이스의 저면에 고정 결합되고, 저면이 개방되어 배양 디시에 연통되며, 내부가 진공 상태를 이루면서 배양 디시의 표면에 고정 부착되는 고정 채널;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치.In the microfluidic device is attached to the culture dish cultured nerve cells, transforming the nerve cells of the culture dish,
A base of a plate structure attached to the culture dish;
A flow channel fixedly attached to the center of the base and into which a medium flow containing a lipoplex for transformation of neurons is injected;
A plurality of chambers each having a different width so that the bottom surface is open to allow the nerve cells of the culture dish to be inserted, the fluid channels are communicated with the flow channel, and the shear stresses caused by the medium flow are differently formed; And
A fixed channel fixedly coupled to the bottom of the base, the bottom being open to communicate with the culture dish, and fixedly attached to the surface of the culture dish while forming a vacuum therein;
Microfluidic device for transformation of neurons comprising a.
유동 채널의 일측 끝단에 형성되고, 유동 채널에 주입되기 위한 배지가 저장되는 리저버;
유동 채널의 타측 끝단에 형성되고, 리저버에 저장된 배지가 유동 채널을 통해 각 챔버를 지나가도록 흡입하는 펌핑부;
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치.The method of claim 2,
A reservoir formed at one end of the flow channel and storing a medium for being injected into the flow channel;
A pumping part formed at the other end of the flow channel and suctioning the medium stored in the reservoir to pass through each chamber through the flow channel;
Microfluidic device for transformation of neurons, further comprising a.
신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치를 준비하는 단계;
미세유동 장치를 배양 디시에 부착시키는 단계;
신경세포의 형질전환을 위한 리포플렉스가 함유된 배지 플로우를 일정하게 유동 채널에 주입하는 단계;
상기 배지 플로우가 순차적으로 각 챔버를 통과하면서, 각 챔버의 상이한 횡폭에 따라 서로 다른 전단 응력을 형성하는 단계;
배지 플로우의 전단 응력에 의해 리포플렉스가 각 챔버의 신경세포를 형질전환시키는 단계;
각 챔버별로 신경세포의 형질전환 효율을 측정하여, 형질전환 효율이 가장 높은 챔버를 추출하는 단계;
하기의 수학식 1을 이용하여, 상기에서 추출된 형질전환 효율이 가장 높은 챔버에서의 전단 응력을 계산하는 단계;
[수학식 1]
(τ는 전단 응력을 나타내고, μ는 배지의 점성(viscosity)을 나타내며, h와 w는 각각 챔버의 높이(100μm)와 너비를 나타내고, Q는 단위 부피당 배지의 유속을 나타낸다.)
를 포함하여 구성되고,
상기 신경세포의 형질전환을 위한 미세유동 장치는,
배양 디시에 부착되는 플레이트 구조의 베이스;
베이스의 중심부에 고정 부착되고, 신경세포의 형질전환을 위한 리포플렉스가 함유된 배지 플로우가 주입되는 유동 채널;
배양 디시의 신경세포가 삽입될 수 있도록 저면이 개방되고, 상기 배지 플로우가 통과될 수 있도록 유동 채널에 연통되며, 배지 플로우에 의한 전단 응력이 서로 다르게 형성되도록 각각 상이한 횡폭을 가지는 다수의 챔버;
를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 신경세포의 형질전환을 위한 최적의 전단 응력 산출방법.Preparing a culture dish in which neurons for transformation are cultured;
Preparing a microfluidic device for transformation of neurons;
Attaching the microfluidic device to the culture dish;
Constantly injecting a medium flow containing a lipoplex for transformation of neurons into a flow channel;
As the medium flow sequentially passes through each chamber, creating different shear stresses according to different widths of each chamber;
Lipoplexes transform neurons in each chamber by shear stress of the medium flow;
Measuring transformation efficiency of neurons for each chamber, extracting a chamber having the highest transformation efficiency;
Calculating a shear stress in the chamber having the highest transformation efficiency extracted using Equation 1 below;
[Equation 1]
(τ represents shear stress, μ represents the viscosity of the medium, h and w represent the height (100 μm) and width of the chamber, respectively, and Q represents the flow rate of the medium per unit volume.)
It is configured to include,
Microfluidic device for transformation of the neuron,
A base of a plate structure attached to the culture dish;
A flow channel fixedly attached to the center of the base and into which a medium flow containing a lipoplex for transformation of neurons is injected;
A plurality of chambers each having a different width so that the bottom surface is open to allow the nerve cells of the culture dish to be inserted, the fluid channels are communicated with the flow channel, and the shear stresses caused by the medium flow are differently formed;
Optimum shear stress calculation method for transformation of neurons, characterized in that comprises a.
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---|---|---|---|
KR1020100006827A KR101154008B1 (en) | 2010-01-26 | 2010-01-26 | Microfluidic device for transfection of neurons and calculating method of optimum shear stress for transfection of neurons using the same |
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KR20110087415A KR20110087415A (en) | 2011-08-03 |
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KR (1) | KR101154008B1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101429585B1 (en) | 2012-03-16 | 2014-08-13 | 한양대학교 에리카산학협력단 | The gradient sensing of lung epithelial cells in a microfluidic device |
-
2010
- 2010-01-26 KR KR1020100006827A patent/KR101154008B1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
논문1:GENE THERAPY* |
논문2:LAB ON A CHIP* |
논문3:LANGMUIR |
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---|---|---|---|---|
KR101429585B1 (en) | 2012-03-16 | 2014-08-13 | 한양대학교 에리카산학협력단 | The gradient sensing of lung epithelial cells in a microfluidic device |
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