KR101144974B1 - Large-volume stacking method using the electroosmotic flow pump in capillary electrophoresis interlocked with mass spectrometry and the equipment for it - Google Patents

Abstract

본 발명은 질량분석기와 연동된 모세관 전기영동에서 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태킹방법 및 이를 위한 장치에 관한 것으로, 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태킹방법(Large-volume stacking using the electroosmotic flow pump; LVSEP)을 모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석(capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry ; CE/ESI-MS)에 매우 간단하게 적용할 수 있는 방법 또는 장치를 도입하여 저농도 시료의 분석시 감도를 획기적으로 개선할 수 있는 발명이다. The present invention relates to a large volume stacking method using an electroosmotic flow pump and a device therefor in capillary electrophoresis interlocked with a mass spectrometer, and a large volume stacking method using an electroosmotic flow pump (Large-volume stacking using the electroosmotic flow pump) ; LVSEP) can be applied to capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry (CE / ESI-MS) to significantly improve sensitivity when analyzing low-concentration samples. It is an invention that can be made.

이를 위하여 본 발명은 모세관 전기영동에서 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태킹방법을 질량분석기와 연동하여 사용할 수 있는 방법에 있어서, 시료가 스태킹하는 동안 질량분석기의 오리피스쪽의 모세관 아웃렛에 런 버퍼 저장용기를 임시적으로 설치하여 시료주입 반대방향의 런 버퍼를 공급하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하여 모세관 전기영동에서 스태킹된 시료를 질량분석기에서 분석하는 방법을 채택한다. To this end, the present invention provides a method in which a large volume stacking method using an electroosmotic flow pump in capillary electrophoresis can be used in conjunction with a mass spectrometer. Temporarily install the method comprising the step of supplying the run buffer in the opposite direction of the sample injection, and adopts a method for analyzing the sample stacked in capillary electrophoresis in the mass spectrometer.

모세관 전기영동(CE), 질량분석기(MS), LVSEP, EOF Capillary Electrophoresis (CE), Mass Spectrometry (MS), LVSEP, EOF

Description

질량분석기와 연동된 모세관 전기영동에서 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태킹방법 및 이를 위한 장치{Large-volume stacking method using the electroosmotic flow pump in capillary electrophoresis interlocked with mass spectrometry and the equipment for it} Large-volume stacking method using the electroosmotic flow pump in capillary electrophoresis interlocked with mass spectrometry and the equipment for it}

본 발명은 질량분석기와 연동된 모세관 전기영동에서 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태킹방법 및 이를 위한 장치에 관한 것으로, 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태킹방법(Large-volume stacking using the electroosmotic flow pump; LVSEP)을 모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석(capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry ; CE/ESI-MS)에 매우 간단하게 적용할 수 있는 방법 또는 장치를 도입하여 저농도 시료의 분석시 감도를 획기적으로 개선할 수 있는 발명이다. The present invention relates to a large volume stacking method using an electroosmotic flow pump and a device therefor in capillary electrophoresis interlocked with a mass spectrometer, and a large volume stacking method using an electroosmotic flow pump (Large-volume stacking using the electroosmotic flow pump) ; LVSEP) can be applied to capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry (CE / ESI-MS) to significantly improve sensitivity when analyzing low-concentration samples. It is an invention that can be made.

최근 들어 모세관 전기영동(capillary electrophoresis; CE)와 질량분석법(mass spectrometry; MS)을 결합한 검출법에 많은 관심을 가지고 있다. CE는 고효율과 높은 분리도를 갖는 분리 방법이며 이 방법이 MS와 결합하여 구조적으로 많은 정보를 주게 됨으로써 CE/MS는 더욱 강력한 분석 장비가 되고 있다. 그러나 CE 에서 적은 양의 시료 사용으로 인해 감도가 떨어지는 단점이 있는데, 이를 극복하는 방법이 필요하다. 특히 단백질이나 대사체 분석에 있어 저농도 시료의 정성분석을 위한 감도 개선 방법들이 요구되고 있다. 온라인 샘플 선농축(On-line sample preconcentration)의 방법과 MS가 결합한 CITP/ESI-MS, SPE-CE/MS 등의 여러 논문들이 보고되었다. Recently, there has been a great deal of interest in detection methods that combine capillary electrophoresis (CE) and mass spectrometry (MS). CE is a separation method with high efficiency and high degree of separation, which combines with MS to give a lot of structural information, making CE / MS a more powerful analytical instrument. However, there is a disadvantage that the sensitivity is reduced due to the use of a small amount of sample in the CE, there is a need to overcome this. Especially in the analysis of proteins and metabolites, methods for improving sensitivity for qualitative analysis of low concentration samples are required. On-line sample preconcentration method and MS combined CITP / ESI-MS and SPE-CE / MS have been reported.

모세관 전기영동 방법은 전하를 띤 종류의 분리방법으로 매우 뛰어난 것이지만 매우 낮은 농도의 것은 그 감도를 높이기 위한 많은 노력들이 진행되고 있으며, 그 중 모세관내에서 시료를 스태킹하는 방법이 있다. 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태킹(Large-volume stacking using the electroosmotic flow pump; LVSEP)은 낮은 전기 전도도를 갖는 용액에 녹아 있는 음이온 시료를 모세관에 다량 주입한 후 역전압을 걸면, 시료의 매트릭스가 전기삼투흐름(electroosmotic flow; EOF)에 의해 시료 주입부 쪽으로 제거되어 높은 분리도를 가지면서 시료가 농축되는 방법으로 몇 백배 수준의 농축 효과를 기대할 수 있다. Capillary electrophoresis is an excellent method of separation of charges, but very low concentrations have been made to increase the sensitivity. Among them, there is a method of stacking a sample in a capillary tube. Large-volume stacking using the electroosmotic flow pump (LVSEP) injects a large amount of anion sample dissolved in a solution with low electrical conductivity into a capillary tube and applies a reverse voltage. It can be expected to have several hundred times the concentration effect by removing the sample by the electroosmotic flow (EOF) toward the sample inlet and concentrating the sample with high separation.

이를 위해서는 시료 이온의 전기영동속도(electrophoretic velocity; EPV)보다 EOF가 작아야 하기 때문에 음이온 시료의 경우, 중성이거나 낮은 pH 버퍼에 전기삼투흐름 변형제(EOF modifier)를 첨가하는 방법을 사용할 수 있으며, 양이온의 경우에는 EOF 크기를 충분히 줄이고 동시에 역방향으로 만들어야 하는데 낮은 pH 버퍼에 양이온 계면활성제(cationic surfactant)를 첨가하거나 코팅된 모세관(coated capillary)을 사용할 수 있을 것이다. To this end, the EOF must be less than the electrophoretic velocity (EPV) of the sample ions. For anion samples, an electroosmotic modifier can be added to the neutral or low pH buffer. In this case, the EOF size should be reduced sufficiently and at the same time reversed. Cationic surfactants may be added to the low pH buffer or coated capillary may be used.

LVSEP는 비교적 쉬운 방법으로서 높은 농축 효과를 기대할 수 있는 방법임에 도 불구하고, MS와 연결하여 잘 사용되지는 않았다. 음이온의 LVSEP는 시료의 매트릭스가 시료의 전기영동방향(electrophoretic migration)과 반대방향인 EOF 펌프에 의해 제거되면서 아웃렛(outlet)으로부터 런버퍼(run buffer)가 채워져야 하므로 일반적으로 아웃렛 버퍼 저장용기(outlet buffer reservoir)가 없는 CE/MS 시스템에 적용하기가 쉽지 않았다. 일반적으로 MS 검출 시 검출기 쪽의 아웃렛 저장용기(outlet reservoir)를 사용하지 않으므로, 농축되는 동안 시료주입 반대 방향의 런 버퍼(run buffer) 흐름을 공급해 줄 수 없었기 때문이다. 상기 런 버퍼는 아웃렛쪽의 런 버퍼를 말한다. 최근 개조된 시이쓰 플로우(sheath flow) 장치로 LVSEP/MS를 보고한 Guor-Rong group이 있다. 그러나, 이 방법은 장치를 구성해야 하는 어려움이 있고, 스태킹(stacking)이 완료되자마자 극성 스위칭(polarity switching)을 해야 하며, 아웃렛(outlet)의 런 버퍼를 제거한 뒤 시이쓰 용액(sheath liquid)로 빠른 시간 안에 교체해주어야 하는 번거로움이 있었다. Although LVSEP is a relatively easy method and can be expected to have a high concentration effect, it is not well used in connection with MS. Anion's LVSEP is typically an outlet buffer reservoir as the matrix of the sample is removed by the EOF pump in the opposite direction of the sample's electrophoretic migration, as the run buffer must be filled from the outlet. It was not easy to apply to CE / MS system without buffer reservoir. In general, since MS does not use an outlet reservoir on the detector side, it cannot provide a run buffer flow in the opposite direction of sample injection during concentration. The run buffer refers to a run buffer on the outlet side. There is a Guor-Rong group that recently reported LVSEP / MS as a modified Sheath flow device. However, this method has a difficulty in configuring the device, requires polarity switching as soon as stacking is completed, removes the run buffer of the outlet, and uses a sheath liquid. There was a hassle to replace in a short time.

본 발명에서는 상기한 문제를 해결하기 위한 것으로 LVSEP/MS를 누구든지 손쉽게 적용할 수 있도록 제시하고자 한다. In the present invention to solve the above problem is to propose to anyone can easily apply LVSEP / MS.

런 버퍼를 담은 버퍼 바이얼(buffer vial)을 아웃렛에 두어 농축되는 동안 추가하는 방법을 이용하였다. 런 버퍼를 농축되는 시간 동안만 위치시키는 방법을 사용하고 농축 후에는 제거할 수 있도록 임시적인 아웃렛 저장용기(outlet reservoir)를 사용한다. 별도의 장치를 설비하지 않아도 상용화된 시이쓰 플로우 인터페이스(sheath flow interface)를 채택함으로써 많은 사람들이 손쉽게 이용할 수 있으며, 안정적인 분사를 제공하여 시이쓰 플로우(sheath flow)에 의한 묽힘 현상이 있다고 하더라도 최소 수백배 이상 CE/MS의 감도를 개선을 보여줄 수 있다. A buffer vial containing the run buffer was placed in the outlet and added during concentration. The run buffer is placed only during the time of concentration and a temporary outlet reservoir is used for removal after concentration. Adopting a commercially available sheath flow interface without the need for a separate device, it can be easily used by many people and provides stable spraying to minimize the number of thinning caused by the sheath flow. It can be seen to improve the sensitivity of CE / MS more than 100 times.

또한 EOF를 줄여 스태킹이 잘 일어날 수 있도록 하는 과제가 있다. 이전에 본 발명자는 비수용액성 버퍼(non-aqueous buffer)를 사용하여 간단하면서도 EOF를 줄일 수 있는 LVSEP를 보고하였는데, 더욱이 이 방법은 비수용액성(non-aqueous)에서 물질의 용해도가 높은 친유성 물질 분석에 더 용이하며, MS와 연결해서 사용한다면 휘발성이 좋아 안정한 분사를 가능하게 하므로 ESI-MS에 매우 적합하다는 장점이 있다.In addition, there is a problem that stacking can occur well by reducing EOF. Previously, we have reported LVSEP using a non-aqueous buffer to reduce EOF, which is simple, and furthermore, this method can be used to analyze lipophilic substances with high solubility in non-aqueous materials. It is easier to use, and when used in connection with MS, it has a high volatility and enables stable injection, so it is very suitable for ESI-MS.

상기한 과제를 위하여 본 발명은 모세관 전기영동에서 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태킹방법을 질량분석기와 연동하여 사용할 수 있는 방법에 있어 서, 시료가 스태킹하는 동안 질량분석기의 오리피스쪽의 모세관 아웃렛에 런 버퍼 저장용기를 임시적으로 설치하여 시료주입 반대방향의 런 버퍼를 공급하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하여 모세관 전기영동에서 스태킹된 시료를 질량분석기에서 분석하는 방법을 채택한다. 이를 보다 구체적인 단계로 보면, 모세관 전기영동에서 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태킹방법을 질량분석기와 연동하여 사용할 수 있는 방법에 있어서, 런버퍼보다 전도도가 낮은 용액을 매트릭스로 하는 시료를 모세관에 주입하는 단계; 모세관의 인렛부분에 런버퍼를 두는 단계; 질량분석기의 오리피스쪽의 모세관 아웃렛에 런 버퍼가 담겨진 아웃렛 저장용기를 두어 모세관 아웃렛이 잠기도록 하는 단계; 모세관의 인렛부분에 역전압을 걸어주어 시료의 스태킹을 시작하는 단계; 모세관 전기영동의 전류변화를 관찰하여 전류의 변화가 급격히 일어날 때, 상기 아웃렛 저장용기를 제거하는 단계; 질량분석기에서 시이쓰 용액을 흘려주고 전기분무 전압을 가하여 농축된 시료가 질량분석기로 이동하도록 하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다. In order to solve the above problems, the present invention provides a method for using a large volume stacking method using an electroosmotic flow pump in capillary electrophoresis in conjunction with a mass spectrometer, in the capillary outlet on the orifice side of the mass spectrometer while the sample is stacked. Temporarily installing the run buffer storage container and supplying the run buffer in the opposite direction of the sample injection, and adopts a method for analyzing the sample stacked in capillary electrophoresis in the mass spectrometer. In a more specific step, in a method in which a large volume stacking method using an electroosmotic flow pump in capillary electrophoresis can be used in conjunction with a mass spectrometer, a sample having a lower conductivity than a run buffer as a matrix is injected into the capillary tube. Making; Placing a run buffer in the inlet portion of the capillary; Placing an outlet reservoir containing a run buffer in the capillary outlet on the orifice side of the mass spectrometer to lock the capillary outlet; Applying a reverse voltage to the inlet portion of the capillary to start stacking the sample; Observing the current change in capillary electrophoresis to remove the outlet reservoir when the current change suddenly occurs; And flowing the sheath solution from the mass spectrometer and applying an electrospray voltage to move the concentrated sample to the mass spectrometer.

또한, 상기 역전압을 걸어주는 단계에서 전기삼투흐름(EOF)이 시료의 전기영동속도보다 작도록 하며 이를 위하여, 음이온 시료의 경우 비수용액성 용매를 버퍼로 사용하거나 중성 또는 낮은 pH의 버퍼에 EOF 변형제를 첨가하여 사용하며, 양이온 시료의 경우 버퍼에 양이온 계면활성제를 첨가하거나 코팅된 모세관을 사용하는 것을 특징으로 하며, 상기 비수용액성 용매는 메탄올과 같은 유기용매인 것이 바람직하다. In addition, in the step of applying the reverse voltage, the electroosmotic flow (EOF) is smaller than the electrophoretic speed of the sample. For this purpose, in the case of the anion sample, the non-aqueous solvent is used as a buffer or the EOF is transformed into a neutral or low pH buffer. In the case of cationic samples, a cationic surfactant is added to the buffer or a coated capillary is used. The non-aqueous solvent is preferably an organic solvent such as methanol.

그리고, 모세관 전기영동장치에서 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태 킹된 시료를 질량분석기와 결합하여 사용할 수 있는 모세관 전기영동-질량분석기 장치에 있어서, 상기 모세관 전기영동장치의 모세관 아웃렛과 상기 질량분석기의 샘플러 오리피스 콘(sampler orifice cone) 사이에 버퍼 용액이 담겨 있는 아웃렛 저장용기를 착탈가능하도록 구비하며, 모세관 아웃렛이 저장용기의 버퍼 용액에 잠기게 하여 접촉하도록 하는 것을 특징으로 하여 매우 간단하게 모세관 전기영동 장치와 질량분석기를 결합할 수 있는 모세관 전기영동-질량분석기 장치를 제공할 수 있다. And, in the capillary electrophoresis-mass spectrometer device that can be used in combination with a mass spectrometer a large volume stacking sample using an electroosmotic flow pump in the capillary electrophoresis device, the capillary outlet of the capillary electrophoresis device and the mass spectrometer It is provided with a detachable outlet reservoir containing a buffer solution between the sampler orifice cone, and capillary electrophoresis is characterized in that the capillary outlet is immersed in the buffer solution of the reservoir so as to be in contact. A capillary electrophoretic-mass spectrometer device capable of combining a device and a mass spectrometer can be provided.

본 발명에서는 농축되는 동안 전기분무 이온화 방출기(ESI emitter) 부분에 착탈가능한 임시의 버퍼 바이얼(buffer vial)과 같은 것을 두는 방법으로 전기삼투흐름 펌프를 이용한 큰 부피 스태킹(Large-volume stacking using the electroosmotic flow pump)을 ESI-MS와 연결시켜 LVSEP/MS를 간편하게 수행하는 방법을 제시하였다. 널리 잘 사용되지 못했던 LVSEP/MS 방법을 쉬운 방법으로 개선시켜 CE/MS의 감도 개선법의 하나로 제시하였으며, 본 발명에서는 일반적으로 많이 사용되는 상용화된 시이쓰 용액 인터페이스(sheath liquid interface)를 이용함으로써, 별도의 장치없이도 누구나 손쉽게 CE/MS의 감도를 증가시킬 수 있는 방법을 보여주었다는 점에서 가장 큰 의의가 있다. 대부분의 질량분석기에 적용이 가능하며 또한 스태킹 과정이 끝난 후 분무팁(spray tip)을 움직이지 않아도 되기 때문에 ESI 감도(sensitivity)와 안정성(stability)이 변하지 않으며, 스태킹과 분리를 연 속적으로 할 수 있다는 장점이 있다. 그리하여 CZE/MS에서 검출 되지 않았던 농도의 물질을 본 발명의LVSEP/MS의 방법을 이용하여, 최소 수백배의 감도 개선을 이루어 ppb 수준의 농도 물질을 검출할 수 있으며, 저농도 물질의 정성분석을 용이하게 하여 앞으로 대사물질(metabolite)분석에 있어 고효율인 CE와 구조분석이 용이한 MS의 장점을 이용하여 적용하는 것이 기대된다. Large-volume stacking using the electroosmotic in the present invention by placing something like a temporary buffer vial that is detachable to the ESI emitter portion during concentration. We presented a simple way to run LVSEP / MS by connecting a flow pump) to ESI-MS. The LVSEP / MS method, which has not been widely used, has been proposed as an easy method for improving the sensitivity of the CE / MS. In the present invention, a commercially available sheath liquid interface is commonly used. Most significant is that it showed how anyone can easily increase the sensitivity of CE / MS without the device. Applicable to most mass spectrometers, and since the spray tip does not have to be moved after the stacking process, the ESI sensitivity and stability do not change, and stacking and separation can be performed continuously. There is an advantage. Thus, by using the LVSEP / MS method of the present invention, the concentration of the substance that was not detected in the CZE / MS can be improved at least several hundred times to detect the concentration of the ppb level substance, and the qualitative analysis of the low concentration substance is easy. In the future, it is expected to apply the advantages of high-efficiency CE and MS for easy structural analysis in metabolite analysis.

이하에서는 본 발명을 보다 상세히 설명하며, 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 당업자에 자명한 사실은 간략히 언급하거나 생략한다. 예를 들면, 일반적인 ESI-MS 질량분석기는 당업자에 있어 잘 알려진 것이며, 그 구조적인 상세한 설명등은 생략하는 것이다. DETAILED DESCRIPTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail, and the facts apparent to those skilled in the art will be briefly mentioned or omitted in order not to obscure the subject matter of the present invention. For example, a general ESI-MS mass spectrometer is well known to those skilled in the art, and the detailed description thereof is omitted.

우선 도 4는 LVSEP의 기본적 원리를 설명하기 위한도면이다. 첫번째 그림은 샘플로 모세관 전체를 채우는 것이고, 두번째 그림은 역전압을 가하여 샘플을 스태킹하는 동안 시료의 버퍼 매트릭스를 제거하는 것이며, 세번째 그림은 높은 농도로 스태킹되어 있는 샘플을 분리할 수 있다는 것을 보여주는 모식도이다. LVSEP는 런버퍼(run buffer)보다 전도도가 낮은 용액에 들어 있는 시료를 모세관에 다량 주입한 후 모세관의 주입부에 역전압을 걸어주게 되면 전기장이 많이 가해지는 시료 매트릭스에서의 이온들의 속도가 런버퍼영역에서보다 빠르기 때문에 음이온은 시료 용액의 앞쪽에 쌓이게 된다. 동시에 EOF는 모세관 주입부 쪽으로 향하는 방향이기 때문에 시료 매트릭스는 모세관 밖으로 빠져나가게 된다. 시료가 다량 주입되어 있는 초기에는 EOF가 시료의 전기영동속도(electrophoretic velocity; EPV)보다 크지만 시료 매트릭스가 빠져나가서 분리가 일어날 때는 EOF가 더 작아야만 한다. 일반적인 조건에서는 EOF가 음이온들의 전기영동속도(electrophoretic velocity)보다 크기 때문에 EOF를 낮춰야 한다. 이를 위해서 EOF를 크게 줄일 수 있는 비수용액성용매(non-aqueous solvent)인 메탄올과 같은 유기용매를 버퍼의 용매로 사용하는 것이 바람직하다. 크게 감소된 EOF로 인해서 농축된 시료의 EPV(electrophoretic velocity)는 이 EOF를 극복하고 검출기 쪽으로 진행하면서 서로 분리된다. First, Figure 4 is a view for explaining the basic principle of the LVSEP. The first figure fills the entire capillary with the sample, the second figure removes the sample's buffer matrix while stacking the sample by applying reverse voltage, and the third figure shows that the sample can be separated at high concentrations. to be. LVSEP injects a large amount of sample into a capillary in a solution with a lower conductivity than run buffer, and applies reverse voltage to the inlet of the capillary. Because it is faster than in the region, anions will accumulate in front of the sample solution. At the same time, the EOF is directed towards the capillary inlet, causing the sample matrix to exit the capillary. EOF is initially greater than the electrophoretic velocity (EPV) of the sample when the sample is heavily injected, but the EOF must be smaller when the sample matrix exits and separation occurs. Under normal conditions, EOF should be lowered because EOF is greater than the electrophoretic velocity of the anions. To this end, it is preferable to use an organic solvent, such as methanol, which is a non-aqueous solvent that can greatly reduce EOF, as a solvent of the buffer. Due to the significantly reduced EOF, the electrophoretic velocities (EPVs) of the concentrated samples are separated from each other as they overcome this EOF and proceed toward the detector.

LVSEP는 낮은 전기 전도도를 갖는 용액에 녹아 있는 음이온 시료를 모세관에 다량 주입한 후 역전압을 걸면, 시료의 매트릭스가 EOF에 의해 시료 주입부 쪽으로 제거되어 높은 분리도를 가지면서 시료가 농축되는 방법으로 몇 백배 수준의 농축 효과를 기대할 수 있다. 이를 위해서는 시료 이온의 EPV 보다 EOF가 작아야 하기 때문에 음이온 시료의 경우, 중성이거나 낮은 pH 버퍼에 EOF 변형제(modifier)를 첨가하는 방법을 사용하며, 양이온의 경우에는 EOF 크기를 충분히 줄이고 동시에 역방향으로 만들어야 하는데 낮은 pH 버퍼에 양이온 계면활성제(cationic surfactant)를 첨가 하거나 코팅된(coated capillary)를 사용할 수 있을 것이다. 이에 대하여는 관련 당업자들의 연구가 많이 진행되어 있는 것으로 구체적인 물질에 대한 것은 생략한다. 본 발명자도 비수용액성 버퍼를 사용하여 간단하면서도 EOF를 줄일 수 있는 LVSEP를 보고한 바가 있는데 이러한 것은 비 수용액성에서 물질의 용해도가 높은 친유성 물질 분석에 더 용이할 것이며, MS와 연결해서 사용시 휘발성이 좋아 안정한 분사를 가능하게 하므로 ESI-MS에 매우 적합할 것이므로 본 발명에서도 이를 채택하는 것이 바람직하다. LVSEP is a method in which a large amount of anion sample dissolved in a solution having low electrical conductivity is injected into the capillary and subjected to reverse voltage.The matrix of the sample is removed by EOF to concentrate the sample with high separation. A 100-fold enrichment effect can be expected. For this purpose, the EOF must be smaller than the EPV of the sample ions. For anion samples, an EOF modifier is added to the neutral or low pH buffer, and in the case of cations, the EOF size should be sufficiently reduced and reversed at the same time. Cationic surfactants may be added to the low pH buffer or coated capillary may be used. In this regard, many studies by those skilled in the art are in progress, and specific materials will be omitted. The inventors have also reported LVSEP using a non-aqueous buffer to reduce EOF, which is simpler and easier to analyze for lipophilic substances with high solubility in non-aqueous solutions. It is preferable to adopt this in the present invention because it will be very suitable for ESI-MS because it enables a stable injection.

이러한 LVSEP의 원리를 질량분석기와 결합하기 위해서는 약간의 변형이 필요한데, 본 발명에서는 질량분석기의 MS 오리피스(orifice) 쪽의 모세관 아웃렛에 런 버퍼 저장용기(runrun reservoir)를 둠으로써, EOF에 의한 펌핑에 의해 제거되는 매트릭스가 빠지는 공간을 런 버퍼가 채울 수 있게 하였다. 모세관 전기영동장치의 모세관 아웃렛과 상기 질량분석기의 샘플러 오리피스 콘(sampler orifice cone) 사이에 버퍼 용액이 담겨 있는 아웃렛 저장용기를 착탈가능하도록 구비하며, 모세관 아웃렛이 저장용기의 버퍼 용액에 잠기게 하여 접촉하도록 구성하는 것이 매우 중요하다. In order to combine the principle of LVSEP with a mass spectrometer, a slight modification is required. In the present invention, a run buffer reservoir is placed in a capillary outlet on the MS orifice side of the mass spectrometer, thereby providing pumping by EOF. This allows the run buffer to fill the space freed by the matrix being removed. A detachable reservoir reservoir containing a buffer solution is provided between the capillary outlet of the capillary electrophoresis device and the sampler orifice cone of the mass spectrometer, and the capillary outlet is immersed in the buffer solution of the reservoir. It is very important to configure it.

LVSEP 과정 중에 전류를 관찰하면 시료 매트릭스가 빠지고 런 버퍼가 채워질 때 전류가 급격히 변화한다. 이 때 모세관 아웃렛(capillary outlet)에 놓았던 런 버퍼 저장용기를 제거하고 전기분무 전압(electrospray voltage)을 주게 되면 CE와 MS를 통해 걸리는 전체 전압의 크기가 줄어들기 때문에 몇 분 후 전류값이 약간 변한다. 농축이 완료되면 시료는 모세관 아웃렛(capillary outlet)쪽으로 이동하면서 분리되어 질량분석기로 검출이 가능해진다. LVSEP가 일어나는 동안 런 버퍼 저장용기를 설치하는 방법은 기존의 낮은 흐름 인터페이스(low-flow interface)를 이용한 방법에 비해 특별한 장치의 제작이 필요 없어서 훨씬 간단하며, 대부분의 질량분석기에 적용이 가능하다. 이러한 점이 본 발명의 강점이다. 또한 스태킹 과 정이 끝난 후 분무팁(spray tip)을 움직이지 않아도 되기 때문에 ESI 감도(sensitivity)와 안정성(stability)이 변하지 않으며, 스태킹과 분리를 연속적으로 할 수 있다는 장점이 있다. Observation of the current during the LVSEP process causes the sample matrix to drop and the current to change rapidly when the run buffer is filled. At this point, removing the run buffer reservoir from the capillary outlet and giving the electrospray voltage reduces the magnitude of the total voltage across the CE and MS, resulting in a slight change in the current value after a few minutes. When the concentration is complete, the sample moves to the capillary outlet, separates, and can be detected by a mass spectrometer. The installation of the run buffer reservoir during LVSEP is much simpler than the conventional low-flow interface, requiring no special equipment and can be applied to most mass spectrometers. This is the strength of the present invention. In addition, since the spray tip does not need to be moved after the stacking process, the ESI sensitivity and stability do not change, and stacking and separation can be performed continuously.

보다 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 살펴본다. Looking at the present invention through a more specific embodiment.

본 발명의 실시예에서 사용하는 약품과 장치는 다음과 같다. 암모늄포메이트(Ammonium formate)는 Sigma (St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였고, 테트라클로로페놀(tetrachlorophenol; TECP)과 펜타클로로페놀(pentachlorophenol ;PCP)은 Aldrich (Milwaukee, WI, USA)에서 구입하였으며 이를 시료로 하여 사용하였다. 소디윰하이드록사이드를 odium hydroxide)와 암모니아수는 Sigma (St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였고, 메탄올과 이소프로필알코올은 HPLC grade로 Mallinckrodt Baker (Paris, Kentucky, USA)에서 구입하여 사용하였다. 증류수는 Milli-Q Water Purification System (Millipore, Bedford, MA, USA)으로 제조하였다.Drugs and devices used in the embodiment of the present invention are as follows. Ammonium formate was purchased from Sigma (St. Louis, Mo, USA), while tetrachlorophenol (TECP) and pentachlorophenol (PCP) were purchased from Aldrich (Milwaukee, WI, USA). It was used as a sample. Sodium hydroxide, odium hydroxide, and ammonia water were purchased from Sigma (St. Louis, Mo, USA), and methanol and isopropyl alcohol were purchased from Mallinckrodt Baker (Paris, Kentucky, USA) by HPLC grade. Distilled water was prepared by Milli-Q Water Purification System (Millipore, Bedford, MA, USA).

CE 시스템은 P/ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, USA)와 32 Karat Software (Beckman Coulter, Fullerton, USA)를 사용하였다. Fused silica capillary (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA)는 내경 50 mm와 길이 90 cm를 가지고 실험했으며 MS와 연결할 때 UV 검출은 따로 하지 않았다. 분리전압(Separation voltage)은 -20 kV를 걸어주었다. 시료는 모세관의 전체 부피를 다 채웠으며, 시료는 모두 메탄올에 묽혀서 사용했다. 런버퍼는 ESI-MS에 적합한 휘발 성의 암모니아포메이트(ammonium formate)를 메탄올에 녹여 10-50 mM을 사용했으며, pH 미터를 사용하여 겉보기(apparent) pH 8.0으로 맞추었다. 질량 분석기는 Q-TOF Ultima Global (Waters-Micromass, Manchester, UK)를 사용하였고, 인터페이스는 Z-spray nano-ESI를 이용하여 negative mode로 검출하면서, 시이쓰용액(sheath liquid)은 80% 이소프로필알코올(isopropyl alcohol)을 시린지 펌프((Harvard Apparatus, South Natick, MA, USA) 를 이용해 1.2 ㎕/min의 속도로 흘려 주었다. 이온화 소스 블록(Ionization source block)온도는 80도, 탈용매화 가스 플로우(desolvation gas flow)는 50 L/hr로 유지하였고, 안정적인 분무를 위하여 공급하는 질소 뉴블라이저 가스(nitrogen nebulizer gas)는 20 psi 전후 수준으로 조절하여 사용하였다. 전기분부 전압은 -2.4-2.8 kV 사이 값을 이용하였다. The CE system used P / ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, USA) and 32 Karat Software (Beckman Coulter, Fullerton, USA). Fused silica capillary (Polymicro Technologies, Phoenix , AZ, USA) is UV detection time has experimented with the inner diameter 50 m length and 90 m cm MS and to connect is not particularly. Separation voltage was -20 kV. The sample filled the entire volume of the capillary tube, and the samples were all diluted with methanol. Runbuffer dissolves volatile ammonium formate suitable for ESI-MS in methanol, using 10-50 mM, and adjusted to an apparent pH 8.0 using a pH meter. The mass spectrometer used Q-TOF Ultima Global (Waters-Micromass, Manchester, UK), the interface was detected in negative mode using Z-spray nano-ESI, while the sheath liquid was 80% isopropyl Alcohol (isopropyl alcohol) was flowed at a rate of 1.2 μl / min using a syringe pump (Harvard Apparatus, South Natick, MA, USA). The ionization source block temperature was 80 degrees and desolvation gas flow ( The desolvation gas flow was maintained at 50 L / hr, and the nitrogen nebulizer gas supplied for stable spraying was adjusted to a level of about 20 psi, and the electric component voltage was between -2.4 and 2.8 kV. Was used.

먼저 모세관에 버퍼를 채운 후에 -20 kV를 걸어주고 1psi 의 압력을 함께 가하면서 동시에 시이쓰 용액을 흘려주고, 전기분무 전압(electrospray voltage)을 걸어 주어 안정적으로 분사가 잘 되는 분무 위치를 잡은 후, 시이쓰 플로우를 끄고 전기분무 전압을 0 kV로 하고, CE의 모세관에 가했던 전압을 중지 한다. 그 다음, 다량의 시료 주입을 위해서 우선 메탄올에 희석하여 낮은 농도로 만든 시료를 압력을 이용하여 전체 모세관에 다 차도록 주입한 후 인렛에는 런버퍼로서 메탄올을 이용해 만든 20 mM 암모니윰포메이트(ammonium formate) pH 8.0을 둔다. 아웃렛은 질량분석기의 오리피스(MS orifice)와 모세관 아웃렛(capillary outlet) 사이의 좁은 공간에 두어야 하므로 크기가 작은 200 mL의 PCR vial을 이용하여 인렛과 같은 버 퍼를 채운다. 아웃렛의 작은 저장용기에는 9 cm정도의 바(bar)를 부착한다(마치 국자 모양과 같다). 도 1과 같이 아웃렛 저장용기에 모세관 아웃렛이 잠기도록 하고 아웃렛 저장용기에 부착된 막대(bar)를 프레임에 테잎으로 고정한 후, 분리전압(separation voltage)을 -20 kV 로 걸어준다. 이 때, 시이쓰 용액(sheath liquid)은 흘려 주지 않고, 전기분무 전압(electrospray voltage)은 0 kV를 주기 때문에, 어떤 이온도 MS로 이온화되어 들어가지 않으므로 TIC 값이 0이 된다. 이 때 모세관 내부에서 음이온의 시료가 시료 영역 앞단에 쌓이게 되고, 시료 이동 반대 방향의 EOF의 흐름으로 인해 시료 매트릭스가 제거되면서 아웃렛쪽으로부터 런 버퍼가 공급된다. 스태킹(Stacking, 농축)이 일어나는 과정을 CE 전류(current)로 모니터링을 하면, 초기에는 전류값이 0에 가깝다가 갑작스런 증가가 일어나는데 전류 값이 CZE(capillary zone electrophoresis)의 전류값과 비슷한 값으로 도달하는 시점 (약 25분 내외 소요) 즉, 스태킹이 완료되는 시점에서 아웃렛의 부가적인 런 버퍼 바이얼을 제거한다. 도 2는 이러한 것을 보여주는데 실행 시작 초기에는 전류값이 0 이었다가 약 20분 전후로 급작스런 증가를 보여 7 mA 값에 도달한다. 이 때 모세관 아웃렛에 놓았던 버퍼 저장용기를 제거하고 전기분무 전압을 주게 되면 CE와 MS를 통해 걸리는 전체 전압의 크기가 줄어들기 때문에 25분의 전류값이 약 0.6 mA가 감소 하는 이유가 여기에 있다. 농축이 완료되면 시료는 모세관 아웃렛쪽으로 이동하면서 분리되어 질량분석기로 검출이 가능해진다. First, fill the capillary with buffer, apply -20 kV, apply 1 psi pressure, flow the sheath solution, apply electrospray voltage, and get a stable spraying position. Turn off the flow and turn the electrospray voltage to 0 kV and stop the voltage applied to the CE capillary. Then, in order to inject a large amount of sample, first, a diluted sample of methanol and a low concentration of the sample were injected into the entire capillary using pressure, and then the inlet was made of 20 mM ammonium formate using methanol as a run buffer. Leave pH 8.0. The outlet should be placed in a narrow space between the MS orifice of the mass spectrometer and the capillary outlet, so a small 200 ml L PCR vial is used to fill the inlet-like buffer. A small storage container of the outlet is attached with a bar about 9 cm (just like a ladle). After the capillary outlet is locked to the outlet storage container as shown in FIG. 1 and the bar (bar) attached to the outlet storage container is fixed to the frame with tape, the separation voltage is applied at -20 kV. At this time, since the sheath liquid does not flow and the electrospray voltage gives 0 kV, since no ions are ionized into MS, the TIC value becomes zero. At this time, a sample of negative ions accumulate in front of the sample region inside the capillary tube, and the run buffer is supplied from the outlet side while the sample matrix is removed due to the flow of EOF in the opposite direction of the sample movement. When the process of stacking is monitored by CE current, the current value is close to zero, then sudden increase occurs, and the current value reaches a value similar to the current value of capillary zone electrophoresis (CZE). At the point of completion (approximately 25 minutes), that is, when stacking is completed, to remove the additional run buffer vials of the outlet. Figure 2 shows this, at the beginning of the run the current value is zero and shows a sudden increase around 20 minutes to reach the 7 m A value. This is why the 25 minute current decreases by approximately 0.6 m A because removing the buffer reservoir from the capillary outlet and applying the electrospray voltage reduces the magnitude of the total voltage across the CE and MS. . When the concentration is complete, the sample moves to the capillary outlet and is separated for detection by mass spectrometry.

이 때 모세관에서는 모세관 내부가 런 버퍼로 채워지고 시료는 농축된 지역을 이루고 있는데, 이후 일반적인 CZE/MS처럼 시이쓰 용액(sheath liquid)을 흘려 주고, 뉴불라이저 가스(nebulizer gas)를 공급하며, 전기분무 전압을 가하여 네거티브 모드(negative mode)에서 검출하면 각 시료의 유동성(mobility)에 따라서 분리되어 검출된다. MS의 크로마토그램(chromatogram)에서는 스태킹이 완료된 후 CZE/MS와 같이 검출할 때, 비로소 TIC가 일정 수준의 값으로 기록되기 시작한다. 도 3은 50 nM 시료를 메탄올에 녹여 모세관 전체 부피를 다 채운 후 -20 kV 를 걸어 20 mM 암모늄포메이트 pH 8.0 에서 실험한 것으로 클로로 페놀의 Mass electropherogram을 아주 잘 보여주고 있는 것으로 그 감도가 뛰어나다. In the capillary, the inside of the capillary is filled with a run buffer and the sample is concentrated. Then, the sheath liquid is flowed, the nebulizer gas is supplied, and the electricity is supplied, as in general CZE / MS. When the spray voltage is applied and detected in the negative mode, the detection is separated according to the mobility of each sample. In the chromatogram of MS, when the stacking is completed and detected with CZE / MS, the TIC begins to be recorded at a certain level. 3 is a 50 nM sample dissolved in methanol to fill the entire capillary volume, and experimented at 20 mM ammonium formate pH 8.0 at -20 kV, showing a very good mass electropherogram of chlorophenol.

앞서 언급한 대로 LVSEP가 일어나는 동안 런 버퍼 저장용기를 사용하는 방법은 기존의 낮은 흐름 인터페이스(low-flow interface)를 이용한 방법에 비해 특별한 장치의 제작이 필요 없어서 훨씬 간단하며, 대부분의 질량분석기에 적용이 가능하다. 또한 스태킹과정이 끝난 후 분무팁(spray tip)을 움직이지 않아도 되기 때문에 ESI 감도(sensitivity)와 안정성(stability)가 변하지 않으며, stacking과 분리를 연속적으로 할 수 있다는 장점이 있다. 이 방법은 실험 실행 전에 잠시 놓아 둔 아웃렛의 런 버퍼 저장용기를 스태킹이 완료되는 시점에서 제거하기만 하면 되고, 나머지 실험 절차는 통상의 sheath flow CZE/MS를 하면 되는 간단한 방법이다. 또한 모세관의 위치에 대한 영향 없이 부가적인 저장용기만을 움직여서 사용하기 때문에 ESI의 안정성이 감소될 염려도 없다.As mentioned earlier, the use of run buffer reservoirs during LVSEP is much simpler than conventional low-flow interfaces, as there is no need to create a special device and is applicable to most mass spectrometers. This is possible. In addition, since the spray tip does not need to be moved after the stacking process, the ESI sensitivity and stability do not change, and stacking and separation can be performed continuously. This method simply removes the run buffer storage of the outlet that has been left for a while before the experiment is completed, and the rest of the experimental procedure is a simple method of performing normal sheath flow CZE / MS. In addition, there is no concern that the stability of the ESI may be reduced because only the additional storage container is moved without using the capillary position.

LVSEP 모드는 시료 매트릭스를 제거하고 물질을 농축시키는 방법이다. 낮은 전기전도도인 물이나 메탄올을 기초로 하여 실제 샘플에서 약품(drug) 물질 농축 및 분리, 과실(fruits)에서 pesticide 검출, 수돗물의 물질 분석 등에 많이 적용되었다. 기존의 적용된 방법들은 대개 UV에서 이루어졌으나, LVSEP/MS에 적용하여 TOF-MS나 Tandem MS-TOF 를 이용한다면 더욱 감도 높은 정성 분석이 가능할 것이다. LVSEP mode is a method of removing the sample matrix and concentrating the material. Based on the low conductivity of water or methanol, it has been applied to the concentration and separation of drug substance in real samples, the detection of pesticide in fruits and the analysis of tap water. Existing methods are usually done in UV, but more sensitive qualitative analysis will be possible if applied to LVSEP / MS and using TOF-MS or Tandem MS-TOF.

상기한 본 발명의 실시형태에 의해 본 발명이 한정되는 것이 아니라 당업자의 입장에서 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위내에서 다양한 변화가 부가 및 변경이 가능함은 물론 균등한 타 실시예가 가능할 것이며, 이는 본 발명의 기술적 사상내의 것이다. The present invention is not limited by the above-described embodiments of the present invention, and various changes may be added and changed within the scope of the technical spirit of the present invention from the viewpoint of those skilled in the art, and other equivalent embodiments may be possible. It is within the technical idea of this invention.

도 1은 본 발명에 따른 CE/ESI-MS 연동장치의 개략적 원리를 설명하는 구성도이며, 1 is a configuration diagram illustrating a schematic principle of a CE / ESI-MS interworking device according to the present invention;

도 2는 CE에서 모세관 인렛부분에 역전압을 걸어서 시료를 스태킹을 시작할 때, EOF에 의해 시료 매트릭스가 빠지고 모세관 아웃렛부분의 런 버퍼가 채워질 때의 CE 전류변화를 보여주는 그래프이며, FIG. 2 is a graph showing the change in CE current when the sample matrix is removed by EOF and the run buffer of the capillary outlet is filled when the sample is started by applying a reverse voltage to the capillary inlet at CE.

도 3은 본 발명에 따라 CE와 MS가 연동된 장치를 가지고 실험한 클로로페놀의 Mass elecropherogram을 보여주는 그래프이다. 3 is a graph showing the mass elecropherogram of the chlorophenol experimented with the CE and MS in accordance with the present invention.

도 4는 LVSEP 방법에 대한 개략적인 설명을 하기 위한 개념도를 보여준다. 4 is a conceptual diagram for explaining the outline of the LVSEP method.

Claims (6)

모세관 전기영동에서 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태킹방법(LVSEP)을 ESI-MS(전자분무-질량분석기)와 연동하여 사용할 수 있는 방법에 있어서, 모세관 전기영동장치의 모세관 아웃렛과 질량분석기의 오리피스 사이에 버퍼용액이 담겨 있는 아웃렛 저장용기를 착탈가능하도록 구비하여 상기 모세관 아웃렛이 저장용기의 버퍼용액에 잠기게 접촉하도록 하고, 시료가 스태킹된 후 상기 아웃렛 저장용기를 제거하고 전기분무 전압을 가함으로써 시료의 스태킹과 분리를 연속적으로 시행될 수 있는 것을 특징으로 하는, 모세관 전기영동에서 스태킹된 시료를 질량분석기에서 연속으로 분석하는 방법. In capillary electrophoresis, a large volume stacking method using an electroosmotic flow pump (LVSEP) can be used in conjunction with an ESI-MS (electrospray-mass spectrometer), wherein the capillary outlet of the capillary electrophoresis device and the orifice of the mass spectrometer It is provided with a detachable outlet storage container containing a buffer solution so that the capillary outlet is in contact with the buffer solution of the storage container submerged, and after the sample is stacked, remove the outlet storage container and apply an electrospray voltage A method for continuously analyzing a sample stacked in capillary electrophoresis, characterized in that the stacking and separation of the sample can be carried out continuously in a mass spectrometer. 모세관 전기영동에서 전기삼투흐름펌프를 이용한 큰 부피 스태킹방법(LVSEP)을 ESI-MS(전자분무-질량분석기)와 연동하여 사용할 수 있는 방법에 있어서, In capillary electrophoresis, a large volume stacking method (LVSEP) using an electroosmotic flow pump can be used in conjunction with an ESI-MS (electrospray-mass spectrometer). 런버퍼보다 전도도가 낮은 용액을 매트릭스로 하는 시료를 모세관에 주입하는 단계;Injecting a sample having a lower conductivity than the run buffer as a matrix into the capillary; 모세관의 인렛부분에 런버퍼를 두는 단계;Placing a run buffer in the inlet portion of the capillary; 질량분석기의 오리피스쪽의 모세관 아웃렛에 런 버퍼가 담겨진 아웃렛 저장용기를 두어 모세관 아웃렛이 잠기도록 하는 단계;Placing an outlet reservoir containing a run buffer in the capillary outlet on the orifice side of the mass spectrometer to lock the capillary outlet; 모세관의 인렛부분에 역전압을 걸어주어 시료의 스태킹을 시작하는 단계;Applying a reverse voltage to the inlet portion of the capillary to start stacking the sample; 모세관 전기영동의 전류변화를 관찰하여 전류의 변화가 급격히 일어날 때, 상기 아웃렛 저장용기를 제거하는 단계; Observing the current change in capillary electrophoresis to remove the outlet reservoir when the current change suddenly occurs; 질량분석기에서 시이쓰 용액을 흘려주고 전기분무 전압을 가하여 농축된 시료가 질량분석기로 이동하도록 하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 모세관 전기영동에서 스태킹된 시료를 질량분석기에서 연속으로 분석하는 방법. Flowing a sample solution in a mass spectrometer and applying an electrospray voltage to move the concentrated sample to the mass spectrometer, wherein the sample stacked in capillary electrophoresis is continuously analyzed in the mass spectrometer . 제 2항에 있어서,3. The method of claim 2, 상기 역전압을 걸어주는 단계에서 전기삼투흐름(EOF)이 시료의 전기영동속도보다 작도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.Electrostatic osmotic flow (EOF) in the step of applying the reverse voltage characterized in that less than the electrophoretic speed of the sample. 제 3항에 있어서, The method of claim 3, 음이온 시료의 경우 비수용액성 용매를 버퍼로 사용하거나 중성 또는 낮은 pH의 버퍼에 EOF 변형제를 첨가하여 사용하며, For anionic samples, use a nonaqueous solvent as a buffer or add an EOF modifier to a buffer of neutral or low pH. 양이온 시료의 경우 버퍼에 양이온 계면활성제를 첨가하거나 코팅된 모세관을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.For cationic samples, a method comprising adding a cationic surfactant to the buffer or using a coated capillary. 제 4항에 있어서, The method of claim 4, wherein 상기 비수용액성 용매는 메탄올과 같은 유기용매인 것을 특징으로 하는 방법.Wherein the non-aqueous solvent is an organic solvent such as methanol. 삭제delete

Images