KR101144094B1

KR101144094B1 - 개화 지연 또는 성장 억제 기능을 지니는 폴리펩티드, 이를암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR101144094B1
Application number: KR1020090014883A
Authority: KR
Inventors: 남홍길; 박경목; 이동희; 김정식; 임평옥
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2009-02-23
Filing date: 2009-02-23
Publication date: 2012-05-24
Also published as: CN102421793A; EP2399929A4; US20110321198A1; WO2010095910A3; KR20100095868A; JP2012518406A; EP2399929A2; JP5409817B2; WO2010095910A2

Abstract

본 발명은 개화 지연 또는 성장 억제 기능을 지니는 폴리펩티드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도를 개시한다. 구체적으로 본 발명은 개화 지연 또는 성장 억제 기능을 지니는 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 개화 지연 표현형을 지니는 식물체의 제조방법, 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제조방법, 형질전환 식물체의 선별 방법, 및 식물체의 개화 지연 또는 성장 억제 유도 물질의 스크리닝 방법을 개시한다.

개화, 성장, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드

Description

개화 지연 또는 성장 억제 기능을 지니는 폴리펩티드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도{Polypeptide Having a Function of Delaying Flowering or Suppressing Growth, Polynucleotide Encoding the Polypeptide and Uses Thereof}

본 발명은 지베렐린 신호를 조절함으로써 개화 지연 또는 성장 억제 기능을 지니는 폴리펩티드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도에 관한 것이다.

지베렐린은 식물체에 존재하는 여러 호르몬 중 하나로, Gibberella fujikuroi라는 벼의 키다리 병원균이 분비하는 물질에서 발견되었다.

지베렐린(GA)은 식물에서 옥신과 함께 작용하여 무상식물의 줄기의 젊은 조직에 대한 생장 촉진 효과를 나타내며, 곡류 종자의 α-아밀라아제라는 가수분해효소를 활성화시켜, 종자의 발아를 용이하게 하고 종자의 휴면 타파에 관여한다. 또한 개화시기를 조절하는데 있어, 저온이나 광주기를 필요로 하는 식물에 GA를 처리할 경우, 개화가 촉진되며 꽃눈이 형성되는 현상이 나타나며, 특이적으로 GA는 수 정 과정이 없는 경우에도, 착과 및 과실의 성장에 관해 이를 촉진한다고 알려져 있다. 따라서 GA의 경우, 농업이나 화훼등에 있어서, 여러 작물이 사용되고 있으며, 다양한 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 예컨대 가을 보리 및 복숭아, 배, 사과, 포도의 저온 대체 개화 촉진, 국화과 식물의 꽃눈 형성 촉진, 여름 국화 및 시크라멘, 프리뮬라의 꽃 개화 촉진, 시금치 담배의 발아촉진, 가지 및 우엉, 무, 유채의 휴면타파, 맥주 및 맥아의 제조에 이용되는 아밀라아제 촉진등이 있다. 이 뿐만 아니라, GA 생합성 저해제인 ancyumidol(A-Rest) 혹은 paclobutrazol(Bonzi)를 처리하여 키/마디가 작고 단단한 식물을 만들어서, 바람이나 태풍등에 의하여 쓰러지는 것을 방지하는 데도 사용된다.

최근 들어서는 이러한 GA에 대한 생리학적 현상을 분자 수준에서 풀고자 하는 노력이 대두되고 있으며, 초기에는 여러 작물에서 녹색혁명을 주도하였던 난쟁이 표현형에 변이체(reduced height(rth), dwarf-1(dl), anther ear1(An1)-옥수수; semi-dwarf(sd-1), Dwarf1, dl-qu; ls, le, na-콩)나, 웃자라는 변이체(la cry³-콩; procera(pro)- 토마토; slender(sln)- 보리; SLN-콩)등을 분석하여, GA에 대한 식물의 반응성에 대한 연구의 깊이를 더 했으며, 2000년대에 들어서는 이들 유전자 클로닝이 되면서( rth(Peng et al., 1999, Nature 400:256-261), dl(Spray et al., 1996, PNAS 93:10515-10518), an1(Bensen et al., 4995, Plant Cell 7:75-84), sd-1(Sasaki et al., 2002, Nature 416:701-702), dwarf1(Ashikari et al., 1999, PNAS 67:11638-11643), el (Lester ea al., 1997, Plant Cell 9:1435-1443), na(Davidson et al., 2003, Plant Physiol. 131:335-344), GA를 합성, 인지, 반응 등에 관여하는 유전자를 발굴하기 시작하였다. 이러한 연구는 애기장대를 모델로 하여, 분자 유전학적 방법론을 통해 더 체계적으로 이루어 졌다.

특히 GA의 반응성에 대한 대량의 변이체 스크리닝(GA에 반응성이 적은 왜소체, GA를 처리하면 야생형으로 돌아가는 변이체, 항상 GA 반응을 보이는 호리한 변이체)을 통해, 크게 GA의 합성에 관련 유전자(GA1, GA4, GA5 등), GA의 신호 전달에 관련한 유전자(heterotrimeric G ptotein, GAI, RGA, SPY, SLY 등), GA의 반응에 관련한 유전자(GA-MYB, α-amylase)를 발굴하였다. 또한 최근들어 GA 호르몬 수용체가 벼에서 발견되면서(GID1:Uefuchi-Tanaka et al., 2005, Nature 437:693-698), GA의 분자적 기전을 이해하는데 큰 획을 긋게 되었고, 현재는 발견된 이들 유전자의 상호 관련성을 밝힘으로써 GA 신호경로를 총체적이고, 체계적인 방법을 통해 분자적으로 이해하려는 노력이 계속되고 있다.(Schwechheimer et al., 2008 Curr. Opin. Plant Biol., 10:461-465)

이와 함께, GA는 개화 조절에 있어서도 주요한 호르몬으로 작용한다고 알려져 있다. 애기장대의 경우 개화시기는 빛, 온도, 광주기 등의 외부 신호와 영향상태, 호르몬 등의 내부 신호들의 상호 연관 작용을 통하여 조절된다고 알려져 있고, 세부적으로 개화 조절 경로는 크게 광주기경로, 내재적경로, 춘화경로, 지베렐린(GA, gibberellin) 경로가 알려져 있다(Mouradov et al., 2002, Plant Cell, 14: S111-130). 특히 GA가 결핍되어 있는 변이체인 gal의 겨우, 단일 조건에서 꽃이 피지 않는다고 알려져 있으며(Wilson et al., 1992, Plant Physiol. 100:403-408), 따라서 GA는 단일 조건에서 개화를 조절하는데 중요한 역할을 할 것으로 생각되고 있다. 이러한 GA에 관한 개화시기는 flowering promoting factor1(FPF1)(Kania et al., 1997, Plant Cell 9:1327-1337), GA-MYB(Gocal, et al., 2001, Plant Physiol., 127:1682-1693). 등을 매개해서, SOC1(Moon et al., 2003, Plant J., 35:613-623) 그리고 LFY 유전자를(Blazquez, et al., 1998, Plant Cell 10:791-800) 통해 개화가 일어나는 것으로 알려져 있다.

한편 경작 식물에 있어서 성체의 크기나 개화시기를 조절하는 것은 중요한 의미를 갖는다. 성장 조절의 경우 1960년대 아시아에서 그린 혁명을 이루게 했을 만큼 수확량의 증대를 가져왔고, 현재에도 유럽 등지에서 풍해, 저온 등의 방지를 위해 성장 조절제를 처리하는 것을 볼 때, 성장 조절은 경작 식물의 수확량과 밀접한 연관이 있다고 할 수 있다. 또한 개화 시기의 조절의 경우에도 개화 시기를 조절함으로써 계절의 변화에 상관없이 수확시기를 결정하고, 주변 환경에 영향을 받지 않는 품종의 개발이 가능하다. 이러한 이유에서 식물 생물공학 분야의 종사자들은 유전자 조작의 방법으로 개화 시기를 조절하기 위해 노력하고 있다.

본 발명은 이러한 배경하게 이루어진 것이다.

본 발명의 목적은 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 가지는 폴리펩티드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 개화 지연 표현형을 지니는 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 개화 지연 표현형 또는 성장 억제 표현형을 지니는 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용한 형질전환 식물체의 선별 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물체의 개화 지연 또는 성장 억제 유도 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 일 측면에 있어, 개화 지연 및/또는 성장 억제(왜화 유도) 기능을 가지는 폴리펩티드에 대한 것이다.

본 발명자(들)는 하기 실시예에서 확인되는 바와 같이, 특정 유전자를 평소 발현 양보다 과발현시키는 활성 태깅 방법(Activation Tagging Method; Weigel et al., 2000, Plant Physiology, 122:1003-1013; 그 내용은 하기 실시예를 포함한 본 명세서 포함되는 것으로 간주된다)을 이용하여 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 보이는 애기장대 형질전환체를 제작ㆍ선발하고, TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain Reaction; Liu et al., 1995, Plant J. 8: 457-463; 그 내용은 하기 실시예를 포함한 본 명세서 포함되는 것으로 간주된다) 방법으로 상기 애기장대 형질전환체에서 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형에 관여하는 유전자를 클로닝하여 서열번호 1에 개시된 그 유전자의 염기 서열과 서열번호 2에 개시된 그 유전자가 암호화하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 확인하였고, 상기 형질전환체에서 보이는 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형이 상기 유전자의 과발현에 의한 효과인지를 RNA 겔 블럿으로 확인하였으며, 마지막으로 상기 유전자를 과발현시키는 재조합 벡터를 애기장대에 도입하였을 때 그 형질전환체가 상기 활성 태깅 방법으로 형질전환된 애기장대 형질전환체의 표현형과 동일하게, 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 나타냄을 확인할 수 있었다.

구체적으로 본 발명의 식물체의 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 가지는 폴리펩티드는 하기의 폴리펩티드들 중의 하나이다.

(a) 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드;

(b) 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드;

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드

상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, 상기 "개화 지연 및/또는 성장 억제 기능"이란 후술하는 바의 본 발명의 유전자(구체적으로는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 유전자)가 과발현되었을 때 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 나타내도록 하는데 관여하는 기능을 의미하는 것으로 정의된다.

또 상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, 상기 "서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"는 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 비교하였을 때 여전히 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 보유한다고 보기에 충분한 정도의 서열번호 2의 아미노산 서열의 일부분을 포함하는 폴리펩티드로서 정의된다. 여전히 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 보유한다면 충분하므로, 상기 폴리펩티드의 길이 그리고 그러한 폴리펩티드가 가지는 활성(즉 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능)의 정도는 특별히 문제되지는 않는다. 즉 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 활성이 낮더라도, 여전히 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 보유하는 폴리펩티드라면 그 길이야 어떻든 상기 "서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"에 포함된다는 것이다. 통상의 당업자라면, 즉 본 출원시를 기준으로 공지된 관련 선행기술을 평균적으로 숙지하고 있는 자라면, 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 일부분이 결실되더라도 그러한 폴리펩티드는 여전히 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 가질 것이라고 기대할 것이다. 그러한 폴리펩티드로서 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 결실된 폴리펩티드를 들 수 있다. 그것은 일반적으로 N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 결실되더라도 그러한 폴리펩티드는 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 가진다고 당업계에 공지되어 있기 때문이다. 물론 경우에 따라서는, N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능에 필수적이어서 N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 결실된 폴리펩티드가 상기 기능을 나타내지 않는 경우가 있을 수 있겠지만, 그럼에도 그러한 비활성의 폴리펩티드를 활성의 폴리펩티드와 구분하고 검출해내는 것은 당업자의 통상의 능력 범위 내에 속한다. 나아가 N-말단 부분 또는 C-말단 부분 뿐만 아니라 그 이외의 다른 부분이 결실되더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 가질 수 있다. 여기서도 당업자라면 그의 통상의 능력의 범위 내에서 이러한 결실된 폴리펩티드가 여전히 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 가지는가를 충분히 확인할 수 있을 것이다. 특히 본 명세서가 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 개시하고 있고 나아가 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자가 애기장대에서 과발현되었을 때 그 애기장대가 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 보이는가를 분명히 확인한 실시예를 개시하고 있다는 점에서, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 일부 서열이 결실된 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것인가를 당업자는 그의 통상의 능력 범위 내에서 충분히 확인할 수 있다는 것이 자명해진다. 그러므로 본 발명에 있어서 상기 "서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"는 상기 정의와 같이 본 명세서의 개시 내용에 기초하여 당업자가 그의 통상의 능력 범위 내에서 제조 가능한 개화 지연이나 성장 억제 기능을 가지는 결실된 형태의 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미로서 이해되어야 한다.

또한 상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, "상기 (a) 및 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"란 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하지만, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 가지는 기능, 즉 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 여전히 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 여기서도 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 여전히 보유하기만 한다면 그러한 폴리펩티드가 가지는 활성의 정도나 아미노산이 치환된 비율은 문제되지 않는다. 바꿔 얘기해서, 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 그 활성이 아무리 낮더라도 또 많은 수의 치환된 아미노산을 포함하고 있다고 하더라도 그러한 폴리펩티드가 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 보유하기만 한다면 본 발명에 포함된다는 것이다. 하나 이상의 아미노산이 치환되더라도 치환되기 전의 아미노산이 치환된 아미노산과 화학적으로 등가라면, 그러한 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 여전히 본래의 폴리펩티드의 기능을 보유할 것이다. 예컨대, 소수성 아미노산인 알라닌이 다른 소수성의 아미노산, 예를 들면 글리신, 또는 보다 더 소수성인 아미노산, 예를 들면 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩티드는 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다. 마찬가지로, 음으로 하전된 아미노산 예컨대, 글루탐산이 다른 음으로 하전된 아미노산, 예컨대 아스파르산으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩티드도 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이며, 또한 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 아르기닌이 다른 양으로 하전된 아미노산, 예컨대, 리신으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩티드 또한 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다. 또한 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 부분에서 치환된 아미노산(들)을 포함하는 폴리펩티드도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다. 당업자라면, 그 전술한 바의 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하면서도, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 가지는 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 여전히 보유하는 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 또한 당업자라면 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 여전히 위 기능을 가지는가를 확인할 수 있다. 더구나 본 명세서가 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 개시하고 있고 또한 나아가 애기장대에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자가 과발현 되었을 때 그 애기장대가 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 보이는지를 분명히 확인한 실시예를 개시하고 있기 때문에, 본 발명의 "상기 (a) 및 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 당업자에게 용이하게 실시 가능한 것임이 분명하다. 그러므로 "상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하면서도 여전히 개화 지연이나 성장 저해 기능을 가지는 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미로서 이해되어야 한다.

이처럼 "상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하면서도 여전히 개화 지연이나 성장 억제 기능을 가지는 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미이지만, 그럼에도 활성의 정도라는 관점에서 봤을 때, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열과 서열 상동성이 높을수록 바람직하다. 상기 폴리펩티드는 서열 상동성의 하한에 있어서 60% 이상의 서열 상동성을 지니는 것이 바람직한 반면, 서열 상동성의 상한에 있어서는 당연히 100%의 서열 상동성을 지니는 것이 바람직하다.

보다 더 구체적으로 위 서열 상동성은 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 99.9%의 순서대로 높아질수록 바람직하다. 여기서 99.9%의 서열 상동성은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에서 하나의 아미노산이 치환된 경우이다.

그리고 본 발명의 "상기 (a) 및 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 '서열번호 2의 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드' 뿐만 아니라 '서열번호 2의 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드'를 포함하므로 전술한 바의 모든 설명은 '서열번호 2의 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드'에 대해서 뿐만 아니라 '서열번호 2의 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드'에 대해서도 적 용되는 것으로 간주 되어진다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 대한 것이다. 여기서 "전술한 바의 폴리펩티드"란 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 지니면서 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드, 및 위 폴리펩티드들과 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 포함할 뿐만 아니라, 전술한 바의 바람직한 양태의 모든 폴리펩티드들을 포함하는 의미이다. 그러므로 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 개화 지연 및/또는 성장 저해 기능을 지니면서, 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 이러한 폴리펩티드들에 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 암호화는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 나아가 바람직한 양태로서 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 지니면서 전술한 바의 서열 상동성의 순서대로 그 서열 상동성을 지니는 모든 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 아미노산 서열이 밝혀졌을 때, 그러한 아미노산 서열에 기초하여 그러한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 당업자라면 용이하게 제조할 수 있다.

그럼에도 여전히 활성의 측면에 봤을 때, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기 서열의 일부분을 포함하는 것이 바람직하고, 서열번호 1의 염기 서열 전체를 포함하는 것이 바람직하다. 여기서 "서열번호 1의 염기 서열의 일부분"이란 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 기능, 즉, 개화 지 연 및/또는 성장 저해 기능을 여전히 보유한다고 보기에 충분한 길이의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 여기서도 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 기능을 보유하기만 한다면 그 활성이 본래의 폴리펩티드, 즉, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 가지는 활성에 비하여 낮더라도 문제되지 않는다.

한편, 상기 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 청구범위를 포함하는 이하에서, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드, 생물체 특히 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 분리된 폴리뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드를 함유한 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하며, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA의 중합체를 모두 포함하는 것으로서 정의된다. 그러므로 상기 "단리된 폴리뉴클레오티드"란 cDNA를 포함하여 뉴클레오티드들을 화학적으로 중합시킨 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 나아가 생물체 특히 애기장대에서 분리되는 genomic DNA를 포함한다. 여기서, 본 명세서가 개시하고 있는 서열번호 2의 아미노산 서열, 이를 코딩하는 서열번호 1의 염기서열, 및 당업계에 공지된 기술 등에 기초하는 한, cDNA를 포함하여 상기 화학적 합성되는 폴리뉴클레오티드의 제조 및 상기 gDNA의 분리 등은 당업자의 통상의 능력 범위 내에 속할 것이다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 서열번호 1의 염기 서열의 일부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 일부분에 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드에 대한 것이다. 여기서 상기 "서열번호 1의 염기 서열의 일부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드"란 애기장대를 포함하는 식물에서 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 가지는 유전자를 동정 및/또는 단리하기에 충분한 길이의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말하며, 또 상기 "서열번호 1의 염기서열의 일부분에 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드"란 서열번호 1의 염기서열의 일부분과 비교하여 하나 이상의 치환된 뉴클레오티드를 포함하면서도 애기장대를 포함하는 식물에서 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 가지는 유전자를 동정 및/또는 단리하기에 충분한 정도의 서열 의존적 결합력을 지니는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 당업자는 애기장대나 다른 식물에서 본 명세서가 개시하고 있는 서열번호 1의 염기 서열에 기초하여 이를 이용하는 한, 그의 통상의 능력 범위내에서 애기장대나 다른 식물로부터 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 기닌 유전자를 동정 및/또는 단리할 수 있다. 그러므로 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 길이에 상관 없이 또는 그 폴리뉴클레오티드의 서열번호 1의 염기 서열과의 서열 상동성의 정도와 상관없이 애기장대나 다른 식물로부터 개화 지연 및/또는 성장 저해 기능을 지닌 유전자를 동정 및/또는 단리하기에 충분한 서열 길이 및/또는 서열 의존적 결합력을 지니는 모든 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일반적으로 기능이 공지된 유전자의 염기 서열을 미지의 유전자의 염기 서열과 비교하여 그 미지의 유전자가 대비된 공지의 유전자와 동일한 기능을 가지는 것으로 추정하기 위해서, 그리고 미지의 유전자를 단리하기 위한 프로브로서 사용되기 위해서는 30개 이상의 연속되는 뉴클레오티드 서열이 필요하다고 알려져 있다. 그러므로 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1에 개시된 염기 서열에서 30개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 그럼에도 여전히 본 발명 의 폴리뉴클레오티드는 30개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 폴리(또는 올리고)뉴클레오티드를 포함한다. 그것은 서열번호 1에 개시된 염기 서열과 100%의 서열 상동성을 지니거나 동정 및/또는 단리 조건(버퍼의 pH나 농도 등)이 엄격하다면 애기장대나 다른 식물로부터 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 지닌 유전자를 동정 및/또는 단리하기에 충분할 수 있기 때문이다. 여기서 애기장대나 다른 식물로부터 개화 지연이나 성장 억제 기능을 지닌 유전자를 동정 및/또는 단리하기에 충분한 30개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제작ㅇ검출해내는 것, 그러한 폴리뉴클레오티드를 이용하여 애기장대나 다른 식물로부터 개화 지연이나 성장 저해 기능을 지닌 유전자를 동정 및/또는 단리해내는 것은 통상의 당업자의 능력 범위 내에 속한다.

한편, 상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, "식물체"란 개화를 통하여 번식하는 식물체나 그 크기가 작아짐으로써 인간에게 유용한 결과를 줄 수 있는 모든 식물체를 포함하는 의미이다. 여기서 크기가 작아짐으로써 인간에게 유용한 결과를 줄 수 있는 식물체의 직접적인 예로 농작물의 생장을 저해하는 각종 잡초 식물이나 관상 목적의 분재 식물 등이 여기에 포함될 것이며, 인간이 식용으로 하고 있거나 할 수 있는 식물 등도 식용의 간편성, 운반의 편리성 등의 이유로 상기 식물체의 범위에 포함될 것이다. 구체적으로 상기 식물체에는 경작지 등의 잡초 식물류, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류 등을 들 수 있다.

또한 상기 "식물체"는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직, 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 개화 지연 및/또는/또는 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법에 관한 것이다.

상기에서 "개화 지연"의 의미는 온도, 낮과 밤의 길이 등 재배 조건이 동일한 경우에 있어서 야생형 식물체의 개화 시기보다 늦은 경우를 의미한다.

또 상기에서 "성장 억제"란 식물의 생체량이 그 야생형 식물의 생체량에 비해 적은 것을 의미하며, 바람직하게는 식물 줄기의 생체량 및/또는 식물 잎의 생체량이 야생형의 식물의 그것(들)에 비하여 적은 것을 의미한다. 여기서 생체량이란 잎, 줄기 등 식물 기관의 무게, 길이 및/또는 크기를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 개화 지연 및/또는/또는 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제작 방법은 (I) 식물체에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자를 과발현시키는 단계, 및 (Ⅱ) 개화 지연 및/또는/또는 성장 억제 표현형이 유발된 식물체를 선별하는 단계를 포 함하여 이루어진다.

상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, 상기 "과발현"이란 온도, 낮과 밤의 길이 등 재배 조건이 동일한 경우에 있어서, 야생형 식물체의 발현 수준 이상의 발현을 의미한다.

본 명세서에서 "서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자"란 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자의 동족체(homologue)로서 식물의 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 유발하는 기능을 지니면서, 식물의 종류에 따른 진화적 경로의 상이로 인하여 서열번호 1의 염기서열과 다른 염기서열로 이루어진 모든 유전자를 포함하는 의미이다. 여기서 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 서열 상동성이 높을수록 바람직하고, 가장 바람직하게는 당연히 100%의 서열상동성을 지닐 때이다. 한편, 서열 상동성의 하한에 있어서는 상기 유전자가 서열번호 1의 염기서열과 60% 이상의 서열 상동성을 지니는 경우가 바람직할 것이다. 보다 더 구체적으로는 위 서열 상동성이 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 순서대로 높아질수록 바람직하다.

상기 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자의 또 다른 바람직한 예로서는 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의하여 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자의 기능적 등가물을 들 수 있다. 이 기능적 등가물은 달리 표현 하면 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다.

상기 단계 (Ⅰ)의 과발현시키는 단계는 전술한 바의 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 전술한 바의 폴리뉴클레오티드를 식물체로 형질전환시키는 단계를 포함하여 구성된다.

본 명세서에서 상기 "형질전환"이란 외래성폴리뉴클레오티드(본 발명에서는 상기 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미함; 이하 같음)가 도입됨에 의한 숙주 식물의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 식물, 더 정확하게는 숙주 식물의 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 식물 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 식물의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두를 포함한다.

한편, 외래성 폴리뉴클레오티드로 식물을 형질전환시키는 방법은 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman 편집, Academic Press)을 사용할 수 있다.

외래성폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton 등, 1977, Cell 11:263:271), 직접 외래성폴리뉴클레오티드를 식물 세포 내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz 등, 1985, Mol. Genet. 199:178-182).

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성폴리뉴클레오티드로 형질전환된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 유식물체, 식물 세포, 종자, 성숙 식물 등을 감염시키는 방법이다. 여기서 형질전환된 유식물체, 식물 세포, 종자 등은 당업자가 공지된 적절한 조건하에서 배양 또는 재배하여 성숙한 식물로 성장ㅇ발육시킬 수 있다.

한편, 상기 형질전환시키는 단계는, (a) 상기 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 작동 가능하게 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계, 및 (b) 이러한 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다.

더 바람직하게는 상기 형질전환시키는 단계는, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 작동 가능하게 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계, 이러한 재조합 발현벡터를 아그로박테리움 박테리아에 형질전환시키는 단계, 및 이러한 형질전환된 아그로박테리움 박테리아로 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하는 경우이다. 특히, 상기 형질전환된 아그로박테리움 박테리아는 형질전환된 아그로박테리움 투메페이시언스인 것이 바람직하다.

상기 "조절 뉴클레오티드 서열"이란 그 존재가 그에 연결된 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 모든 서열을 포함하는 의미로서 이해된다. 이러한 조절 뉴클레오티드 서열은 리더 서열, 인핸서 서열, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 전사종결 서열, 복제 개시점, 리보솜 결합 부위 등을 포함한다.

상기 "작동 가능하게 삽입한다"는 것은 어떤 유전자의 전사 및/또는 번역이 영향을 받도록 삽입한다는 것을 의미한다. 예컨대 어떠한 프로모터가 그와 함께 삽입된 유전자의 전사에 영향을 준다면 그 유전자는 작동 가능하게 삽입된 것이다.

프로모터 서열은 유도성 프로모터(inducible promoter sequence)와 구조성 프로모터(constitutive promoter sequence) 모두 사용가능하다. 구조성 프로모터로는 예컨대 CaMV 프로모터, CsVMV 프로모터, Nos 프로모터 등을 들 수 있고, 유도성 프로모터(유도 인자의 존재로 인하여 그에 연결된 유전자의 발현이 활발해지는 것을 가능하게 하는 프로모터)로서는, 예컨대, 구리 이온에 의해 활성화되는 효모 메탈로티오네인 프로모터(Mett 등, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 90:4567, 1993), 치환 벤젠설폰아미드에 의해 활성화되는 In2-1 및 In2-2 프로모터(Hershey 등, Plant Mol. Biol., 17:679, 1991), 글루코코르티코이드에 의해 조절되는 GRE 조절 서열(Schena 등, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 88:10421, 1991), 에탄올 조절성 프로모터(Caddick 등, Nature Biotech., 16:177, 1998), 리뷸로스 비스-포스페이트 카르복실라제(ssRUBISCO)의 소 서브유니트에서 유래한 광 조절성 프로모터(Coruzzi 등, EMBO J., 3:1671, 1984; Broglie 등, Science, 224:838, 1984), 만노핀 신타제 프로모터(Velten 등, EMBO J., 3:2723, 1984), 노팔린 신타제(NOS) 및 옥토핀 신타제(OCS) 프로모터, 열 충격 프로모터(Gurley 등, Mol. Cell. Biol., 6:559, 1986; Severin 등, Plant Mol. Biol., 15:827, 1990) 등을 들 수 있다.

한편, 상기 재조합 벡터는 선별 마커 유전자를 포함할 수 있다. 여기서 "마커 유전자"란 그러한 마커 유전자를 포함하는 형질전환체의 선별을 가능하게 하는 형질을 암호화하는 유전자를 의미한다. 마커 유전자는 항생물질 내성 유전자일 수 있고 제초제 내성 유전자일 수도 있다. 적합한 선별 마커유전자의 예로는 아데노신 데아미나제의 유전자, 디히드로폴레이트 리덕타제의 유전자, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제의 유전자, 티미딘 키나제의 유전자, 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제의 유전자, 포스핀노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자 등을 들 수 있다.

한편, 본 발명의 실시예에서는 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 유전자를 발현벡터 pCambia1302 벡터에 삽입시켜 재조합 벡터 pCambia1302-SIL1을 제작한 다음 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움 투메페이시언스에 형질전환시키고 그 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스를 애기장대에 형질전환시켰다.

이러한 본 발명의 실시 양태를 고려할 때, 상기 형질전환시키는 단계는, 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 유전자를 식물에 형질전환시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 특히 pCambia1302-SIL1을 식물에 형질전환시키는 단계를 포함할 때이다. 가장 바람직하게는 상기 재조합 벡터 특히 pCambia1302-SIL1로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스를 식물에 형질전환시키는 단계를 포함할 때이다.

한편, 상기 (Ⅱ) 선별 단계는 (Ⅰ) 단계를 수행한 후 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 보이는 식물체를 육안으로 선별하거나 형질전환 시에 선별 마커 유전자가 함께 형질전환될 경우에는 선별 마커 유전자를 이용하여 선별할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 개화 지연 및/또는/또는 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제조방법에 의하여 얻어진 식물체에 관한 것이다. 본 발명의 식물체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자가 과발현됨으로써, 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 지니게 된 식물체로 이해될 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 전술한 바의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 마커 유전자로 사용하여 형질전환된 식물체를 선별하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 형질전환된 식물체의 선별 방법은 (Ⅰ) 목적유전자, 식물체 개화 지연 및/또는 성장 억제 기능을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 전술한 바의 폴리뉴클레오티드 및 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계, (Ⅱ) 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형이 유발된 식물체를 선별하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 명세서에서 "목적유전자"란 발현시키고자 하는 유전자로서 목적하는 생성물(즉 RNA나 폴리펩티드)을 암호하하는 일정 길이의 폴리뉴클레오티드 서열로서 정의될 수 있는데, 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 절단된 형태, 융합된 형태, 태그된 형태일 수 있으며, cDNA 또는 gDNA일 수 있고, 천연 형태의 생성물을 암호화하는 서열이거나 원하는 돌연변이 형태의 생성물을 암호화하는 서열일 수 있다.

상기 (Ⅰ) 발현벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계는 그 발현벡터를 아그로박테리움 박테리아에 형질전환시키는 단계, 및 이러한 형질전환된 아그로박테리움 박테리아로 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 여기서 아그로박테리움 박테리아는 아그로박테리움 튜머파시엔스인 것이 바람직하다.

기타 본 발명의 형질전환된 식물체의 선별 방법에 대해서는 본 발명의 개화 지연 표현형을 지니는 식물체의 제조방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 식물체 개화 지연 유도 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 식물체의 성장 억제 유도 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

상기 방법들은 (I) 식물체에 임의의 화학 물질 또는 생물학적 물질을 처리하는 단계 및 (Ⅱ) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자를 과발현시키는 물질을 검출하는 단계를 포함하여 이루어진다.

상기 "서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자"는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 (I) 식물체에 임의의 화학 물질 또는 생물학적 물질을 처리하는 단계에서, 화학 물질의 처리는 식물체에 화학 물질이 접촉되도록 처리하면 되고, 생물학적 물질의 처리는 상기 본 발명의 개화 지연 식물체의 제조방법과 관련하여 설명한 것처럼, 유전공학적 방법으로 처리하면 된다.

한편, 상기 검출된 물질 특히 생물확적 물질로서는 서열번호 1의 염기서열의 센스 뉴클레오티드, 상기 센스 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 그 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스 등을 들 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 지니는 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 개화 지연 표현형을 지니는 식물체의 제조방법, 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제조방법, 형질전환 식물체의 선별 방법, 및 개화 지연 또는 성장 억제 유도 물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 지니는 애기장대 형질전환체의 제작 및 선발

개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 지니는 애기장대 형질전환체의 제작 및 선발은 바이겔 등(Weigel et al., 2000, Plant Phtsiology, 122:1003-1013)의 방법에 의하여 수행되었다.

실험은 먼저 도 2a에 도시된 바와 같이 4개의 CaMV 35S 인핸서가 T-DNA의 오른쪽 경계(right border)부근에 존재하고 바스타 제초제에 대한 저항성을 부여하는 bar 유전자(phophinithricin acetylltransferase gene)를 포함하고 있는 활성 태깅 벡터pSK1015(Activation tagging vector pSK1015; Weigel et al., 2002, Plant Physiol., 122; 1003-1013; 독일 Weigel 실험실에서 분양)를 전기천공(eletroporation)방법으로 아그로박테리움 투메페이시언스 ABI균주(Agrobacterium tumefaciences strain ABI; Lazo et al., 1991, Biotechnology 9:963-967; 미국 Amassino 실험실에서 분양)에 도입시키고, 카나마이신(kanamycin)과 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 배지에서 선발하였다. 이후, pSK1015벡터가 삽입된 상기 아그로박테리움 균주를 플로랄 딥핑방법(Clough et al., 1998, Plant J., 16:735-743)에 따라 애기장대 야생형 콜롬비아에 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 애기장대의 종자를 받아 바스타 제초제에 저항성이 있는 형질전환체를 선별하여, 약 23℃로 온실에서 5000개의 T1라인을 성장시켰으며, 이들 중 개화 및 성장이 저해되고 있는 식물을 육안으로 관찰하여 야생형에 비하여 개화가 느리고 성장 속도가 저해되고 있는 변이체 1개의 라인을 선별하여, 상기 변이체를 sill-1D(short internode and late flowering1)라 명명하였다. 이후 선발된 애기장대 형질전환체(sill-1D)와 애기장대 콜롬비아 야행형(Col(wt))을 23℃ 온도에서 16/8의 주기로 조절되는 생장 조절기(growth chambers)내에서 각각 재배하였다. 그 결과 도 1A 및 B에서 확인되는 바와 같이 애기장대 형질전환체 sill-1D는 장일과 단일에서 모두 애기장대 콜롬비아 야행형(Col(wt))에 비하여 꽃이 피는 시기가 늦어지고, 꽃이 피는 시점에서 잎의 수가 증가하는 개화 지연의 표현형을 보였다. 또한 sill-1D는 도 1C에서 보여지듯이 다 성장한 후에도 야생형보다 키가 절반정도로 성장이 저해되어 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 2> 상기 표현형을 보이는 형질전환 식물체에서 과발현 유전자의 동정

상기 <실시예 1>에서 선발된 애기장대 형질전환체에서 개화 지연 및/또는 성장 저해 표현형에 관여하는 유전자를 클로닝하기 위하여, TAIL-PCR (Liu et al., 1995, Plant J. 8: 457-463)을 실시하였다.

각각 서열번호 3 내지 5의 염기서열을 가지는 세 개의 임의적 프라이머(Arbitray Primer; AD1, AD2, AD3)와, 서열번호 6 내지 8의 염기서열을 지니는 3개의 특이적 프라이머 (AT1, AT2, AT3이라고 명명 함)가 사용 되었다. PCR은 Applied Biosystems사의 2700 thermocyclers를 사용하였다. Taq 효소는 Takara Extaq을 사용하였다.

TAIL-PCR은 3단계의 PCR 반응으로 진행되었는데, 각 단계의 PCR 반응은 아래와 같은 조건에서 수행되었다.

(제1단계의 PCR 반응)

제1단계의 PCR 반응에서 주형 DNA로서는 <실시예 1>에서 얻어진 애기장대 형질전환체에서 genomic DNA를 추출 (Dellaporta et al., 1983, Plant Mol. Biol. Rep. 1:19-21) 하여, 전체 25㎕ 양으로, 1단계 PCR을 수행하였다. 각 반응은 세 개의 튜브(AD1, AD2, 혹은 AD3)에서 이루어 졌다. 제1단계의 PCR 반응에 있어서의 최종 농도 및 수행된 사이클의 횟수 및 조건은 다음과 같다.

(최종 농도)

주형 DNA: 100 ng

AT1 0.2 μM

AD1, AD2, or AD3 primer 2 μM

dNTP mix: 0.8 mM

Taq 효소: 0.5 U

(첫번째 반응 사이클)

93℃에서 1분, 95℃에서 1분을 반응 이후, 94℃에서 30초, 62℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초 세 단계를 5회 반복, 94℃에서 30초, 25℃에서 3분을 수행한다. 이후에 3분 이상의 시간을 두고 72℃까지 온도를 천천히 증가시킨 후 72℃에서 2.5분, 그리고 94℃에서 10초, 68℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초, 94℃에서 10초, 68℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초, 94℃에서 10초, 44℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초 아홉 단계를 15회 반복한 다음, 이후에 72℃에서 1분을 1회 반응한다.

(제2단계의 PCR 반응)

제2단계의 PCR 반응에서 주형 DNA로서는 제1단계 PCR 반응 용액 50 ㎕중에서 1 ㎕을 취하여 멸균된 물 49 ㎕을 넣어 1/50으로 희석하여 사용하였다. 각 1단계 반응 때 사용한 임의적 프라이머를 동일하게 사용하여 반응시켰으며, 전체 반응 용액의 양은 25 ㎕이다. 제2단계의 PCR 반응에 있어서 최종 농도 및 수행된 사이클의 횟수 및 조건은 다음과 같다.

(최종 농도)

주형 DNA: 1 ㎕

AT2 0.2 μM

AD1, AD2, or AD3 primer: 2 μM

dNTP mix: 0.8 mM

Taq 효소: 0.5 U

(사이클의 회수 및 조건)

94℃에서 10초, 64℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초, 94℃에서 10초, 64℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초, 94℃에서 10초, 44℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초로 각 12회 반복하고, 마지막에 72℃에서 1분간 반응한다.

(제3단계의 PCR 반응)

제3단계의 PCR 반응에서 주형 DNA로서는 제2단계 PCR 반응 용액 25 ㎕ 중에서 1 ㎕을 취하여 멸균된 물 9 ㎕을 넣어 1/10으로 희석하여 사용하였다. 각 1단계 반응때 사용한 임의적 프라이머를 동일하게 사용하여 반응시켰으며, 전체 반응 용액의 양은 50 ㎕이다. 제3단계의 PCR 반응에 있어서 최종 농도 및 수행된 사이클의 횟수 및 조건은 다음과 같다.

(최종 농도)

주형 DNA: 1 ㎕

AT 3 0.2 μM

AD1, AD2, or AD3 primer: 2 μM

dNTP mix: 0.8 mM

Taq 효소: 1 U

(사이클의 회수 및 조건)

94℃에서 15초, 44℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초 동안 각 20회 반복하고, 72℃ 1분간 반응한다.

위와 같이 PCR 반응을 3단계에 걸쳐 실시한 후, 그 결과물을 아가로스 젤 전기영동을 실시하고, 해당 칼럼을 분리하여 시퀀서 (ABI3730; Applied Biosystem Inc.)로 시퀀싱 하였다. 결정된 염기서열을 토대로 애기장대 게놈 데이터 베이스 (database)를 참조하여 인핸서와 가장 가까운 전사해독틀을 찾아내었다. 그 결과 도 2A와 같이 애기장대 게놈에서 At5g10950 프로모터 부근에 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 상기 유전자는 7개의 엑손으로 되어있고 (도 2B), 서열번호 1에 개시된 1185개의 염기서열과, 서열번호 2에 개시된 395개의 아미노산 (도 2C)으로 구성 되어진 유전자임을 확인하였다. 여기서 그 유전자 및 단백질을 각각 SIL1 유전자 및 SIL1 단백질이라고 명명하였다.

<실시예 3> RNA 겔 블럿(RNA gel Blot)을 통한 SIL1 유전자의 과발현 여부의 확인

SIL1 유전자가 형질전환 애기장대 (sil1-1D)에서 과발현 여부를 확인하기 위하여, SIL1 cDNA 단편을 탐침으로 사용하여 RNA 겔 블럿을 실시하였다. 먼저 애기장대 콜롬비아 야생형(Col-O(wt))과 <실시예 1>에서 얻어진 애기장대 형질전환체 sil1-1D에서 TRIzol-Reagent (Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 전체 RNA를 각각 추출하였다. 추출한 각 RNA 30 ㎍을 1.2% 포름알데하이드-아가로스 겔(formaldehyde-agarose gel) 상에서 분리하였고, 분리한 RNA를 진공 수송 시스템(vacuum transport system, GE healthcare Bioscience)을 사용하여 나일론 막(Hybond N⁺, GE healthcare Bioscience)으로 옮겼다. 나일론 막을 UV-크로스링커(UV-crosslinker, Stratagene)에서 자외선에 노출시킨 후, 65℃에서 1시간 동안 건조하였다. 건조된 나일론 막을 방사능 표지된 프로브(radio-labeled probes)로 처리한 다음 쳐치 앤 길버트 용액(Church and Gilbert solution; 25mM sodium phosphate, 1mM EDTA, 7% SDS, 1% BSA)을 사용하여 65℃에서 16시간 동안 혼성화(hybridization) 반응을 수행하였다. 이때 탐침으로는, 애기장대 cDNA에서 서열번호 9의 정방향 프라이머 (forward primer) 0.2 uM과 서열 번호 10의 역방향 프라이머 (reverse primer), dNTP(각각 2.5mM)를 가하고 진엠프 2700 (GeneAmp 2700, Applied Biosystems)을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 3분 동안 변성시키고, 각 회마다 94℃에서 15초, 53℃에서 30초 및 72℃에서 1분 30초로 35회의 사이클(cycle)을 수행하였으며, 72℃에서 7분 동안 가열하여 반응을 종료하였다. PCR로 증폭된 유전자를 1% 아가로즈 겔에서 100 V로 1시간 동안 전기영동한 다음, 유전자 밴드를 잘라내어 겔 용출 키트(gel elution kit, Qiagen)를 이용하여 SIL1 유전자를 용출하였다. 상기 용출한 DNA와 랜덤 프라이밍 키트(random priming kit, GE healthcare Bioscience, USA)과 5 ㎕ dCTP (1mCi/㎕, PerkinElmer)를 사용하여 제조회사의 사용법에 따라 방사능을 표지하여 탐침으로 사용하였다. 상기 혼성화 반응 후, 나일론 막을 65℃에서 2x SSC (Sodium chloride/Sodium Citrate) 및 0.2% SDS (Sodium dodecyl sulfate) 조성의 세척액으로 10분 동안 세척한 다음 1x SSC 및 0.1% SDS 조성의 세척액으로 10분 동안 세척하였으며, 마지막으로 0.1x SSC 및 0.1% SDS 조성의 세척액으로 세척하였다. 세척한 나일론 막은 BAS film에 이틀 노출 시킨 뒤, phosphorimager (BAS2000, Fuji)를 사용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 2D에 나타내었다.

도 2D에서 보는 바와 같이, 야생형에서는 SIL1의 mRNA 발현이 극히 낮거나 거의 없는데 비하여, 애기장대 형질전환체 (sil1-1D)에서는 상기 유전자가 상당히 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> SIL1 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체 제조, 그리고 세포내 발현 관찰

<실시예 1>에서 얻어진 형질전환 애기장대의 표현형이 SIL1 유전자가 과발현으로 인한 것인지를 확인하기 위하여, 먼저 SIL1 유전자를 pCambia 1302 벡터(Caberra, Australia; Hajdukiewicz et al, 1994, Plant Mol. Biol. 25:989-994)에 넣어 발현하였다. 이를 위해, 애기장대 cDNA에서 <실시예 3>에서 용출하여 얻은 SIL1 탐침 DNA를 GEM-T 이지 벡터 키트(GEM T easy vector kit, Promega)를 사용하여 T 벡터에 서브클로닝 (subcloning) 하였다. 2 ㎍의 상기 클론을 각각 2 ㎕ (10 U/㎕) 의 NheI 과 SpeI 제한 효소로, 그리고 2 ㎍의 pCambia 1302는 2 ㎕ (10 U/㎕)의 제한효소 SpeI 으로 37℃에서 2시간 동안 처리한 후, 겔 용출 키트를 이용하 여 SIL1 유전자를 포함하는 1.19 kb의 DNA 단편과 10.5 kb의 pCambia 1302 벡터의 DNA 단편을 용출한 다음, T4 리가제 (T4 ligase, Roche) 를 1 ㎕ (1 ㎍/㎕) 로 처리하여 16℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 이렇게 동정된 SIL1 유전자를 포함하는 벡터(이를 pCambia 1302-SIL1이라 명명)를 전기천공법을 이용하여 아그로박테리움(Agrobacterium tumefacience AGL1 strain)에 도입하여 카나마이신(kanamycin)이 포함된 배지에서 선발하였다. 이후, pCambia 1302-SIL1 클론을 가진 아그로박테리움 균주를 플로랄 딥핑 방법(Clough et al., Plant J., 16(6):735-743, 1998)에 따라 애기장대 야생형 콜롬비아(columbia)에 형질전환 시켰다. 이후, 상기 형질전환 된 애기장대로부터 종자를 받은 후, 15 ㎍/㎖ 의 하이그로마이신 (Hygromycin)이 포함된 배지에서 저항성을 나타내는 형질전환체를 선발하였다. 이후, 상기 형질전환된 애기장대를 생장실에서 생장시킨 후 개화지연 및 성장 억제 양상을 조사한 결과, sil1-1D 변이체에서 나타났던 노화지연 표현형이 그대로 재현됨을 확인할 수 있었다. 이로부터, 개화지연 및 성장 억제 표현형이 SIL1 유전자의 활성화를 통해 나타났음을 알 수 있었다. 이 중 한 라인에 대해 잎을 채취하여 1 ㎍/㎕의 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 시약을 처리한 후 형광현미경 (Axio Vert 200; Carl Zeiss, Gottingen)을 통해 SIL1-GFP (for green fluorescence protein) 형광단백질의 형광 신호를 관찰한 결과, 도2E 에서 보는 바와 같이 DAPI와 같이 핵내에 존재하는 것을 볼 수 있으며, 이는 SIL1이 세포내에서 핵에서 작용하는 단백질임을 보여준다.

<실시예 5> sil1-1D 의 변이체에서 GA에 대한 하배축 성장 길이 반응조사

<실시예 1> 에서 보는 바와 같이 sil1-1D의 경우, 장일 조건과 단일 조건 모두에서 개화지연을 보이며, 성체의 생장이 저해되어 있고, 잎이 짙은 녹색을 띠는 현상을 보이고 있다. 이는 많은 경우, GA의 반응성이나 생합성이 낮아 졌을 때 일어나는 현상이다. 따라서 sil1-1D에서 GA의 반응성을 조사하기 위해 백색광하에서 다양한 농도의 GA가 들어 있는 1% 자당(sucrose)이 포함된 1/2 Gamborg B5 (Duchefa) 배지에서 7일간 키운 다음, 15개의 어린 식물 개체의 하배축 성장을 조사하였다. 도 3A에서 보는 바와 같이 백색광하에서 GA의 농도가 증가할 수록, 야생형 (Col) 식물의 하백축 성장이 증가하고 있는 것을 볼 수 있다. 반면에 sil1-1D은 야생형에 비해 하배축 성장에 대한 반응 농도가 낮고, 반응성 떨어져 있음을 확인 할 수 있다. 이는 sil1-1D의 하배축 성장에 있어 GA에 대한 반응성이 낮아져 있음을 알 수 있다.

<실시예 6> sil1-1D 의 변이체에서 Paclobutrazol에 대한 발아 반응조사

일반적 GA는 <실시예 5>에서 보여준 하배축 성장뿐만 아니라, 발아에도 작용한다고 알려져 있다. 하배축 성장이나, 성체의 크기가 작은 것은 세포의 길이 성장에 문제가 있는 것인데, 이러한 세포 길이 성장에는 일반적으로 GA, 옥신, 브라시노스테로이드 (BA)가 관여하지만, 발아의 경우 GA, ABA 등의 식물 호르몬이 주로 관여하며, GA의 반응 역시 분자적으로 다른 원리에 의해 반응하는 것으로 알려져 있다. 따라서 sil1-1D이 GA에 반응성에 결함이 있어 개화 지연 및/또는 왜소 표현형이 나타난 다는 것을 뒷받침하기 위에, GA 생합성을 방해하는 팩클로부트라졸 (Paclobutrazol, PAC)를 처리하여 야생형 (Col)과 sil1-1D에서 발아 효율을 비교 하였다. 도3B에서 보는 바와 같이 야생형은 0.35 mg/L PAC를 처리했을 때도 거의 100%의 발아 효과를 보이는 반면, sil1-1D의 경우, 약 50%의 발아 효과를 보이는 등, 전반적으로 PAC에 의한 GA 합성이 저해 했을 때, 발아 효율이 낮아지고, 발아 반응성 역시 낮은 농도에서 반응하는 것을 볼 수가 있었다. 이는 sil1-1D이 GA에 대한 발아 효과 증진에 있어, 반응성이 낮아져 있음을 볼 수 있다. 또한 데이터를 종합해 볼 때, SIL1을 과발현 시켰을 때, GA의 반응성에 영향을 주어, 성체의 성장이 억제되고, 개화가 지연되는 현상을 보인다고 말할 수 있다.

도 1A는 애기장대 콜롬비아 야생형(Co1-0(wt))과 개화 지연 표현형을 보이는 애기장대 변이체(si11-1D)의 장일(LD)/단일(SD) 조건 하에서의 꽃대가 올라오는 시점을 비교하여 보여주는 사진이다. DAP는 days after planting으로 씨를 심을 후 경과한 날짜를 의미한다. 장일/단일 조건에서 si11-1D 변이체는 개화가 현저히 지연되어 있음을 볼 수 있다.

도 1B는 도 1A의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. Number of rosette leaves는 꽃피는 시점에서의 좌엽의 개수를 나타내고 Bolting time은 씨를 심은 후. 꽃피는 데 걸리는 날짜를 나타내며, Long day은 장일을 short day는 단일을 의미한다.

도 1C는 생장 후, 야생형과 si11-1D 변이체의 식물 성체 크기를 비교한 사진이다. si11-1D 변이체는 성체가 된 후에 야생형 성체의 크기를 절반 정도의 성장을 보여준다.

도 2A는 개화 지연 및/또는 성장 억제 표현형을 보이는 애기장대 형질전환체의 게놈 내로 삽입되어진 액티베이션 태깅 벡터 pSKI015의 모식도이다. pSKI015는 애기장대 게놈에서 At5g10950 상위 발현 조절자 근처에 삽입되어 있다. 4ㅧ35S Enh는 4개의 연속된 35S 인핸서(enhancer)이고, Bar^R는 바스타 제초제 저항성 유전자이며, Amp^R는 엠피실린 저항성 유전자이며, Col E1 Ori는 E. coli 복제기원(replication origin)이다.

도 2B는 애기장대의 At5g10950의 유전자 구조를 표현하였다. 이 유전자는 7 개의 액손과 6개의 인트론으로 이루어져 있으며, 1185개의 nucleotide로 구성되어 있다.

도 2C는 애기장대의 At5g10950의 코딩 단백질의 아미노산 서열을 표현하였다. 이 단백질은 395개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 박스로 표기된 부분은 컴퓨터를 통한 단백질 서열 분석을 통해 핵 이동 신호 도메인(Nuclear licalization signal)으로 추정되는 부위를 표현하였다.

도 2D는 야생형과 si11-1D 변이체에서 T-DNA가 들어간 위치의 주변 유전자인 At5g10950의 유전자의 발현을 RNA 겔 블릿 분석으로 검출한 결과이다. 28S rRNA는 사용한 RNA의 양을 비교해 보여주며 At5g10950는 si11-1D 변이체에서 현저히 증가하였다.

도 2E는 pCambia 1302-SIL1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대에서 SIL1의 단백질의 발현 위치를 기공세포에서 관찰한 결과이다. 첫 번째 그림은 광학 현미경상에서 기공세포를 본 것이며, 두 번째 그림의 녹색 형광은 SIL1과 GFP 결합단백질에서 유도되는 것이고, 세 번째 그림의 푸른색 형광은 DAPI 염색을 통해 핵을 관찰한 것이다. 마지막 그림은 세 그림을 모두 겹쳐 놓은 것으로 녹색 형광과 푸른색 형광이 겹치는 것을 볼 수 있다.

도 3A는 다양한 농도의 지베렐린(GA) 처리했을 때, 야생형과 si11-1D 변이체의 하배축(hypocoty1) 성장 반응을 그래프로 표현하였다. GA 농도에 따라 야생형의 하배축 성장이 길어지는 반면, si11-1D 에서는 GA에 대한 성장 반응이 야생형에 비해 줄어들어 있는 것을 볼 수 있다.

도 3B는 GA 생합성 저해제인 팩클로부트라졸(Paclobutrazol, PAC)를 다양한 농도로 처리하였을 때, 야생형과 si11-1D 변이체의 발아(Germination) 효율을 그래프로 표현하였다. PAC 농도에 따라 야생형의 발아 효율이 줄어드는 것을 볼 수 있는데, si11-1D 에서는 PAC에 의한 발아 저해 효과가 더 높은 것을 볼 수 있다.

<110> Pohang university of science and technology <120> Polypeptide Having a Function of Delaying Flowering or Suppressing Growth, Polynucleotide Encoding the Polypeptide and Uses Thereof <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1188 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggttggtt ctaggaagcg ttcatcagcc aagaacagac ttgtttcttc ttcaactcgt 60 tcttctggga aggataaggt ttctgatgct cgtaaatatg gtgaagcctt ggtgggttca 120 aggatacgag tttggtggcc gatggacagc aaattctata agggtgtggt ggattcctat 180 gtctcttcca agaagaaaca tcgggttttc tatgaagatg gtgataaaga gaccttggat 240 ctgaagaagg agagatggga gttgattgaa gaagatgatg ctgaatctga atctgatgag 300 atctccctac aggaggaatc tgctggtgag agttctgaag gcactccaga accgcctaaa 360 gggaaaggga aggcatcttt aaaaggaagg acggatgaag ctatgcccaa aaagaaacag 420 aagatagatt cttcatcaaa gagcaaggcc aaagaggtgg agaagaaggc ctcaaagccc 480 gaaactgaga aaaatggcaa aatgggtgat attggtggga agattgtagc agcggcatca 540 cgcatgagtg aaaggtttcg gagcaagggg aatgtggatc aaaaagagac atcaaaggcc 600 tcgaaaaaac caaagatgtc ttcaaagttg accaagagga aacacactga tgaccaagat 660 gaagatgaag aagctggtga tgatattgat acttctagcg aagaggcgaa gcctaaggtg 720 ttaaaatcct gcaactccaa tgctgatgaa gttgctgaaa attcttctga tgaagatgag 780 cccaaggttc taaaaaccaa caactctaag gctgataaag atgaagatga agaggagaat 840 gaaacatctg atgatgaggc tgagcccaag gccctgaaat tgagcaactc caactctcat 900 aatggtgaaa acaattcatc tgatgatgag aaagagataa caatatcgaa gatcacctca 960 aaaaagatta agagtaatac cgctgatgaa gaaaatggtg acaatgaaga tggggaaaaa 1020 gctgttgatg aaatgtctga tggagagccg ttggtgagct tcttgaagaa gtcaggagag 1080 ggaattgatg cgaagaggaa aaaaatgaag gggaagaagg aggaagagga agaggaagga 1140 gaagaaaatg ctggaaaaga tacgaaagcg gaagaagcgt cgtcgtag 1188 <210> 2 <211> 395 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Val Gly Ser Arg Lys Arg Ser Ser Ala Lys Asn Arg Leu Val Ser 1 5 10 15 Ser Ser Thr Arg Ser Ser Gly Lys Asp Lys Val Ser Asp Ala Arg Lys 20 25 30 Thr Gly Glu Ala Leu Val Gly Ser Arg Ile Arg Val Trp Trp Pro Met 35 40 45 Asp Ser Lys Phe Thr Lys Gly Val Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Lys 50 55 60 Lys Lys His Arg Val Phe Tyr Glu Asp Gly Asp Lys Glu Thr Leu Asp 65 70 75 80 Leu Lys Lys Glu Arg Trp Glu Leu Ile Glu Glu Asp Asp Ala Glu Ser 85 90 95 Glu Ser Asp Glu Ile Ser Leu Gln Glu Glu Ser Ala Gly Glu Ser Ser 100 105 110 Glu Gly Thr Pro Glu Pro Pro Lys Gly Lys Gly Lys Ala Ser Leu Lys 115 120 125 Gly Arg Thr Asp Glu Ala Met Pro Lys Lys Lys Gln Lys Ile Asp Ser 130 135 140 Ser Ser Lys Ser Lys Ala Lys Glu Val Glu Lys Lys Ala Ser Lys Pro 145 150 155 160 Glu Thr Glu Lys Asn Gly Lys Met Gly Asp Ile Gly Gly Lys Ile Val 165 170 175 Ala Ala Ala Ser Arg Met Ser Glu Arg Phe Arg Ser Lys Gly Asn Val 180 185 190 Asp Gln Lys Glu Thr Ser Lys Ala Ser Lys Lys Pro Lys Met Ser Ser 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Arg Lys His Thr Asp Asp Gln Asp Glu Asp Glu Glu 210 215 220 Ala Gly Asp Asp Ile Asp Thr Ser Ser Glu Glu Ala Lys Pro Lys Val 225 230 235 240 Leu Lys Ser Cys Asn Ser Asn Ala Asp Glu Val Ala Glu Asn Ser Ser 245 250 255 Asp Glu Asp Glu Pro Lys Val Leu Lys Thr Asn Asn Ser Lys Ala Asp 260 265 270 Lys Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asn Glu Thr Ser Asp Asp Glu Ala Glu 275 280 285 Pro Lys Ala Leu Lys Leu Ser Asn Ser Asn Ser Asp Asn Gly Glu Asn 290 295 300 Asn Ser Ser Asp Asp Glu Lys Glu Ile Thr Ile Ser Lys Ile Thr Ser 305 310 315 320 Lys Lys Ile Lys Ser Asn Thr Ala Asp Glu Glu Asn Gly Asp Asn Glu 325 330 335 Asp Gly Glu Lys Ala Val Asp Glu Met Ser Asp Gly Glu Pro Leu Val 340 345 350 Ser Phe Leu Lys Lys Ser Pro Glu Gly Ile Asp Ala Lys Arg Lys Lys 355 360 365 Met Lys Gly Lys Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu Asn Ala 370 375 380 Gly Lys Asp Thr Lys Ala Glu Glu Ala Ser Ser 385 390 395 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ntcgastwts gwgtt 15 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ngtccaswga nawgaa 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 wgtgnagwan canaga 16 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ccgagcggcg aactaataac gt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaaagttacg ggcaccattc aa 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaagtgcagg tcaaaccttg ac 22 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gctagcatgg ttggttctag gaagcg 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 actagtgtac gacgacgctt cttccg 26

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(I) 식물체에서 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 과발현시키는 단계, 및

(Ⅱ) 개화 지연 표현형이 유발된 식물체를 선별하는 단계를 포함하여 이루어지는 개화 지연 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
제8항에 있어서,

상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자인 것을 특징으로 하는 개화 지연 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
제8항에 있어서,

상기 단계 (Ⅰ)의 과발현시키는 단계는 상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 식물체로 형질전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 개화 지연 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
제10항에 있어서,

상기 형질전환시키는 단계는 (a) 상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계, 및 (b) 이러한 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 개화 지연 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
제10항에 있어서,

상기 형질전환시키는 단계는, 상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계, 이러한 재조합 발현벡터를 아그로박테리움 박테리아에 형질전환시키는 단계, 및 이러한 형질전환된 아그로박테리움 박테리아로 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 개화 지연 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
제10항에 있어서,

상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자이며,

상기 형질전환시키는 단계는 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 아그로박테리움에 형질전환시키고 그 형질전환된 아그로박테리움을 식물에 형질전환시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 개화 지연 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
(I) 식물체에서 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 과발현시키는 단계, 및

(Ⅱ) 성장 억제 표현형이 유발된 식물체를 선별하는 단계를 포함하여 이루어지는 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
제14항에 있어서,

상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자인 것을 특징으로 하는 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
제14항에 있어서,

상기 단계 (Ⅰ)의 과발현시키는 단계는 상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 식물체로 형질전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
제16항에 있어서,

상기 형질전환시키는 단계는 (a) 상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계, 및 (b) 이러한 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
제16항에 있어서,

상기 형질전환시키는 단계는, 상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계, 이러한 재조합 발현벡터를 아그로박테리움 박테리아에 형질전환시키는 단계, 및 이러한 형질전환된 아그로박테리움 박테리아로 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
제16항에 있어서,

상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자이며,

상기 형질전환시키는 단계는 상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 아그로박테리움에 형질전환시키고 그 형질전환된 아그로박테리움을 식물에 형질전환시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 성장 억제 표현형을 지니는 식물체의 제조 방법.
(Ⅰ) 발현시키고자 하는 목적유전자, 서열번호 2의 아미노산로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 및 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계, 및

(Ⅱ) 개화 지연 또는 성장 억제 표현형이 유발된 식물체를 선별하는 단계를 포함하여 구성되는 형질전환 식물체의 선별 방법.
제20항에 있어서,

상기 (Ⅰ) 발현벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계는 그 발현벡터를 아그로박테리움 박테리아에 형질전환시키는 단계, 및 이러한 형질전환된 아그로박테리움 박테리아로 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 선별 방법.
제20항에 있어서,

상기 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자이며,

상기 (Ⅰ) 발현벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계는 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 아그로박테리움에 형질전환시키고 그 형질전환된 아그로박테리움을 식물에 형질전환시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 선별 방법.
제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의하여 얻어진 개화 지연 표현형을 지니는 식물체.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의하여 얻어진 성장 억제 표현형을 지니는 식물체.