KR101142730B1 - 상자성-이노시톨 포스페이트 복합체를 이용한 자기공명영상용 조영제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 자기공명영상 조영제에 관한 것으로서, 구체적으로 적어도 하나의 상자성 물질과 결합된 적어도 두 개의 인산기를 가진 킬레이트 화합물을 포함하는 자기공명영상 조영제 및 이를 이용한 영상화 방법에 관한 것이다.
자기공명, 조영제, 상자성 물질, 파이테이트, 이노시톨 포스페이트, 간질환, 암 전이
Description
본 발명은 신규한 자기공명영상 조영제에 관한 것으로서, 구체적으로 적어도 하나의 상자성 물질과 결합된 적어도 두 개의 인산기를 가진 킬레이트 화합물을 포함하는 자기공명영상 조영제 및 이를 이용한 영상화 방법에 관한 것이다.
파이테이트(phytate)는 자연계에 존재하는 수 많은 식물 종자에서 인의 주 저장형태로서 쌀, 밀 옥수수 콩류와 같은 곡물에 존재하며, 총 곡물함량의 1-5%를 차지하며, 함유된 총 인 함량 중 약 70-80%를 차지한다.
파이테이트는 파이틱 에시드 (phytic acid)의 염으로서, 이노시톨 (myo-inositol)에 최대 6개의 인산군들이 결합하여 만들어진 물질로 여기에 Ca2+, Mg2+, Fe2+, 및 Zn2+등과 같은 무기질 이온들이 함께 결합되어 영양적으로 불용성인 형태로 존재한다 (Reddy et al 1982). 즉, 사람, 닭, 돼지, 마우스와 같은 단위동물의 소화기관에는 이러한 2가 양이온 파이테이트 불용성 인을 소화하는 효소가 존재하지 않아 파이테이트의 이용률이 극히 낮고, 소화되지 못한 파이테이트는 단위동물의 체내의 Ca2+, Mg2+, Fe2+, 및 Zn2+등과 같은 무기질 이온들의 체내흡수를 방해하는 항 영양요소(anti-nutritional factor)로 작용한다. 그러므로, 많은 양의 파이테이트가 함유된 곡물을 섭취하는 사람들은 파이테이트가 생체활성에 중요한 2가 양이온 결핍증을 유발하는 것으로 알려져 있다(Torre et al 1991).
최근 연구결과에 따르면, 식물 종자로부터 분리 정제된 파이테이트는 항암효능(Kennedy 1995; Kennedy & Manzone 1995), 항산화 기능(Graf & Eaton 1990), 그리고 심장병을 예방(Thompson 1994)한다는 효능도 보고되었다. 또한 낮은 농도의 파이테이트는 신장의 칼슘 염이 축적되는 신장결석과 같은 신장병의 예방하는 효능도 보고되었다(Grases et al 2000a). 그러나, 높은 농도의 파이테이트는 신장결석을 유발하는 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Grases et al 2000b). 또한 최근 연구결과들에 따르면, 파이테이트가 손상된 DNA의 복구(repair)(Hanakahi et al 2000), 칼슘 채널(TJ et al 1997), mRNA export (TJ et al 1997)를 담당하는 효소들의 활성화를 유도하고 조절하는데 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다.
핵의학에서는, 1973년 이후부터, 테크네티움 99 (technetium 99, 99mTc)와 같은 핵종을 결합시킨 파이테이트, 즉 Tc-phytate는 이를 이용한 양전자 방사 단층 촬영(Positron Emission Tomography, PET)에 활용되어 간 및 비장의 기능검사에 활용되고 있다. 간, 비장, 골수에 흡수되는 티시 파이테이트 (Tc-phytate)의 양 및 분포는 만성 간질환의 진행 단계, 진단, 간기능의 정도를 판단에 중요한 척도로 이용되고 있다. 즉, 정상인과 만성 간부전을 가진 환자에게 티시 파이테이트(Tc-phytate)를 투여시 만성 간부전 환자에서 티시 파이테이트(Tc-phytate)가 흡수되는 양이 현저히 감소되었다. 이는 간기능 이상시 티시 파이테이트(Tc-phytate)를 흡수하는 간에 존재하는 쿠퍼셀 (Kupffer cell)의 기능저하로 인한 것으로 추정하고 있다(Hoefs et al 1995a; Hoefs et al 1997; Hoefs et al 1995b; Huet et al 1980).
티시 파이테이트를 이용한 간기능 검사 이외에, 티시 파이테이트는 유방암(breast cancer) (Hino et al 2008; Ichihara et al 2003; Ikeda et al 2004; Kinoshita 2007; Koizumi et al 2006; Koizumi et al 2004a; Koizumi et al 2004b; Masiero et al 2005; Morota et al 2006; Noguchi 2001; Ohta et al 2004; Ohtake et al 2005; Takei et al 2006; Takei et al 2002; Tavares et al 2001; Tozaki et al 2003; Tsunoda et al 2002; Wada et al 2007; Yoshida et al 2002), 악성흑색종 (malignant melanoma, Tavares et al 2001), 외음부암(vulvar cancer) (Tavares et al 2001), 두경부편평상피세포암(squamous cell carcinoma(SCC) of the head and neck) (Kosuda et al 2003; Ohno et al 2005), 자궁내막암(endometrial cancer) (Nakayama et al 2004; Niikura et al 2004b; Niikura & Yaegashi 2004), 자궁경부 암(cervical cancer) (Nakayama et al 2004; Niikura et al 2004a; Silva et al 2005), 인두암(pharyngeal carcinoma) (Ohno et al 2005), 전립선 암(prostate cancer) (Nakayama et al 2004; Niikura et al 2004a; Silva et al 2005)등과 같은 다양한 종류의 종양의 전이를 측정하는 센티넬 림프절(sentinel lymph node) 진단에 주로 사용되고 있다. 즉 티시 파이테이트를 이용한 방법은 종양 부위에 근접한 림프절의 암전이 유 무를 진단이 가능하다. 또한 수많은 림프절 중에서 Tc-phytate가 특이적으로 흡수/축적된 림프절을 확인이 가능하며 생검을 통하여 암 전이 (cancer metastasis)를 진단하고 있다. 이러한 방법의 최대 장점은 암 전이를 진단과 동시에 수많은 정상 림프절을 절개하지 않고, 암 전이가 일어난 림프절만 특이적으로 제거하여 부작용을 최소화 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 관점에서, 티시 파이테이트를 이용한 PET에서 암환자의 암 전이를 확인하는 방법으로 이용되고 있다. 그러나 핵종을 이용하는 양전자 방사 단층 촬영(PET)의 단점은 암환자에게 핵종을 여러 번 투여하기가 어렵다. 또한 양전자 방사 단층 촬영 (PET)의 낮은 해상도로 인하여 암전이 유무는 판단이 가능하나 암이 전이된 림프절의 정확한 위치 확인이 어려운 단점을 가지고 있다.
자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)은 시료에 낮은 전자기 에너지를 조사(irradiate) 후에 물 분자로부터 나온 자기공명영상 신호를 검출하는 최근 급속히 발전하는 진단 영상분야이다. 자기공명영상은 고해상도의 조직 해부 능(PET과 비교 시 10배 이상의 높은 해상도)과 짧은 시간에 여러 번 반복이 가능한 비침습적인(non-invasive) 자기공명 영상획득이 가능하여 환자의 질병 진단 및 약물 처리를 관찰에 가장 적합한 방법으로 알려져 있다. 자기공명영상 신호는 두 개의 시간 매개변수인, T1과 T2 이완 시간 (T1 and T2 relaxation time)과 스핀 밀도 (spin density)로 부터 나오는 물 분자의 양성자 양에 의해서 결정된다. 자기공명 영상의 대비도(contrast)는 자기공명영상에서 시료의 영상이 조영제에 의해서 조절된다.
자기공명영상용 조영제는 자장에 미치는 영향에 따라서 상자성(paramagnetic), 초상자성(super-paramagnetic) 제제로 구분된다. 상자성 MRI조영제는 조직의 T1 이완속도를 짧게 변화시켜 조직/기관이 밝은 영상을 나타내며, 초상자성 MRI조영제는 조직의 T2 이완 시간을 짧게 변화시켜 조직/기관이 어두운 영상을 나타내게 한다. T2 조영제로 사용되는 초상자성 제제로는 산화철 입자(superparamagnetic iron oxide, SPIO)가 대표적이다 (Low 1997). 이 T2 조영제는 거식세포(macrophage)에 의해서 장기에 흡수되는 것으로 알려져 있으며(Stoll et al 2004), 조영제가 흡수된 장기의 조영을 높여 주는 것으로 알려져 있지만 장기의 조영이 어둡게 변하는 단점을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 조영제의 개발은 일반적으로 T2 조영제(dark imaging; negative contrast agent) 보다는 T1 조영제(bright imaging; positive contrast agent)가 조직의 조영에 효과적인 것으로 알려져 있으며, 자기공명 영상 촬영 시간을 단축시키는 장점을 가져 T1 조영제 개발이 더욱 중요한 것으로 알려져 있다.
T1 조영제로 사용되는 상자성 제제로의 대표적인 일 예는 현재 임상적으로 널리 사용되고 있는 가돌리늄(Gd) 제제를 들 수 있다. 그러나, 가돌리늄(Gd) 자체는 독성이 높기 때문에 현재 사용중인 제제들은 리간드(legand)와 결합시킨 착화합물(chelates)형태로 하여 안정성을 개선했으며, 대표적으로 Gd 를 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (DTPA)과 결합시킨 자기공명영상 조영제 (Gd-DTAP) 가 많이 사용되고 있다. 그 외에도 자성을 지닌 상자성 물질인 Mn2 + 와 Gd3 + 이온이 강하게 결합하는 킬레이터 (chelator)를 이용한 자기공명영상용 T1 조영제 개발이 각광을 받고 있다. 이러한 노력은 다양한 형태의 혈관에서 조영효과를 나타내는 세포 외 조영제 (extracellular MRI contrast agent)들의 개발이 가능하게 하였다(Modo & BulteAime J.W.M. 2007).
그러나, 현재까지 개발된 대부분의 T1 조영제들은 장기, 조직, 특정 세포에 특이적인 조영제가 아니라, 각 조직의 혈관의 영상을 조영하는 조영제들이 대부분을 차지하고 있다. 이에, 조직 특이 및 세포특이 MRI 조영제의 개발은 조직 및 세포 특이적 항체를 조영제에 결합시켜 개발하고자 하는 시도가 있어 왔다. 예를 들어, Gd-DTAP로 모노클로날 항체를 표지하여 조직 특이적인 조영제를 개발하고자 하는 시도가 있었으나 (Unger et a 1985. Investigative Radiol 20(7):693-700), Gd 로딩 수준은 매우 낮았으며 (항체 분자 1개 당 1.5개 Gd3+ 이온), 생체내 모델에서는 영상의 항체-DTPA-Gd 증진을 전혀 확인할 수 없었다. 이와 같이, 조영제를 항체와 같은 표적화제에 직접 접합시키는 것을 비롯한 접근법에 공통적인 문제점은 조 영제의 로딩이 낮은 수준으로 유지되어야 한다는 점인데, 그렇지 않을 경우에는 항체의 면역반응성이 부정적인 영향을 받을 수 있기 때문이다. 따라서, 조영제의 로딩량은 원하는 수준보다 낮을 수 있어서, 대조도 효과가 원하는 것보다 낮을 수 있다.
또한, 기존의 조영제의 체류 시간을 증가시키기 위해, 조영제를 위한 담체로서 중합체성 분자를 사용해 왔다. 예를 들어, 인간 알부민 및 폴리리신 등과 같은 담체를 DTPA로 표지하여 MRI 조용제용 금속을 담지하는데 이용하거나 (예를 들어 폴리리신에 결합된 Gd-DTAP (Gerhard et al (1994), MRM 32:622-628), 소 혈청 알부민 및 소 이뮤노글로불린을 DTPA 및 Gd로 표지하고 (Lauffer et al (1985). Magnetic Resonance Imaging 3(1):11-16), 폴리-L-리신 주쇄 기재의 폴리펩티드를 DTPAa와 반응시켜 영상화 목적을 위해 111In을 킬레이팅시키는데 이용하였다 (Pimm et al (1992), Eur J Nucl Med 19:449-452). 이러한 연구에서, 담체와 결합된 조영제는 혈액 풀 중에서의 체류 시간이 다소 증가된 것으로 밝혀졌으나, 별도의 담체를 조영제에 중합시켜 사용해야 하므로 번거롭고 비용이 많이 드는 문제가 있다.
따라서, 열역학적, 생물학적으로 안정하며, 조직 및 세포 특이성이 있고, 생체 내 체류시간이 길며, 선명한 T1 조영효과 (bright contrast)를 나타내는 자기공명영상용 조영제 개발이 절실히 요구되고 있다. 이에, 본 발명자들은 상기 조건을 모두 충족하는 효과적인 자기공명영상용 조영제를 개발하기 위하여 노력한 결과, 상자성 물질을 적어도 두 개의 인산기를 가진 킬레이트 화합물과 결합시킨 새로운 자기공명영상용 조영제를 고안하였고, 상기 조영제가 현재 널리 이용되는 가도리니움(Gd) 복합체 보다 안정하며 T1 조영효과를 나타내고 세포에 특이적인 조영제이므로 수많은 질병의 진단과 다양한 임상적용에 매우 실용적으로 적용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 적어도 하나의 상자성 물질과 결합된 적어도 두 개의 인산기를 가진 킬레이트 화합물을 포함하는 자기공명영상 조영제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 자기공명영상 조영제를 환자에 투여함으로서 자기공명영상으로 환자의 기관 또는 조직을 영상화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 자기공명영상 조영제를 필요에 따라 환자에 투여함으로서, 자기공명영상을 통하여 환자의 장기 또는 조직의 감염(infection) 과 염증(inflammation)을 진단하는데 있어서 거식세포(macrophage)의 활성을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 자기공명영상 조영제를 필요에 따라 환자에 투여함으로서, 자기공명영상을 통하여 환자의 장기 또는 조직의 염증 부위로 거식세포의 이동(macrophage infiltration)을 비침습적으로 측정하는 방법을 제공하는 것 이다.
본 발명의 다른 목적은 자기공명영상 조영제를, 세포(cells)에 첨가하거나, 환자의 기관 또는 조직에 세포를 이식하거나, 또는 생체에서 이식한 세포(transplanted cells)의 존재를 영상으로 확인할 때, 자기공명영상을 통하여 생체에서 이식한 세포(transplanted cells)의 존재를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 거식세포(macrophage)에 의해 흡수되는 세포특이적 조영제로서 강한 T1 이완시간을 가지며 질병진단이 필요한 타깃 부위의 조직의 특징을 조영하는 조영제를 제공한다. 또한 본 발명의 조영제는 생체 내에 쉽게 투여가능하며, 비교적 오랜 시간 동안 조직/세포 내에 머무르며(즉 이상적인 반감기를 가진 생분해 가능한), 세포 독성이 없는 이상적인 조영제를 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 적어도 하나의 상자성 물질과 결합된 적어도 두 개의 인산기를 가진 킬레이트 화합물을 포함하는 자기공명영상 조영제에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "자기공명영상" 이란 시료에 낮은 전자기 에너지를 조 사(irradiate) 후에 물 분자로부터 나온 자기공명영상 신호를 검출하는 의학 영상화 방법으로서, 혈류역학을 기반으로 하며 자기공명신호의 변화를 이용한다는 점에서, 분자과학에 기반을 두며 방사성 동위원소를 이용하는 양전자 방사 단층 촬영(PET) 과 차이가 있다.
본 발명에서 용어, "조영제"란 기관, 진단을 목적으로 하여 혈관 및/또는 조직이 보다 잘 보이도록 인위적으로 대조도의 차를 만들어 영상으로 나타내기 위해서 사용되는 제제를 말한다. 조영제는 연구 대상 표면의 가시도 및 대조도를 증가시킴으로써, 질환 및/또는 손상의 존재 여부 및 그 정도를 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "상자성 물질" 이란 내부에 존재하고 있던 Unpaired Spin들이 평소 때는 열운동에 의한 불규칙적 스핀배열을 보이고 있다가 외부자기장이 걸리면 그 영향으로 인하여 일정방향으로 스핀정렬이 일어나게 되는 결과, 평소에는 자성을 띄지 않다가 외부자기장을 걸어 주었을 경우 자기장 방향으로 자화되는 특성을 가지는 물질을 말한다. 상자성 물질은 물분자의 자기이완 시간을 단축시키는 성질이 있기 때문에 이러한 상자성 물질의 특성을 이용하여 자기공명영상의 조영제로 사용이 가능하다.
본 발명에서, 상기 상자성 물질은 전이원소(transition element)인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 전이원소는 Cr3 +, Co2 +, Mn2 +, Ni2 +, Fe2 +, Fe3 +, Cu2 + 또는 Cu3 + 이고, 특히 Fe2 +, Fe3 + 또는 Mn2 + 인 것이 바람직하다.
또한, 상기 상자성 물질은 란탄계열 원소(lanthanide element)인 것이 바람 직하다. 보다 바람직하게는, 상기 란탄계열 원소는 La3 +, Gd3 +, Ce3 +, Tb3 +, Pr3 +, Dy3+, Nd3 +, Ho3 +, Pm3 +, Er3 +, Sm3 +, Tm3 +, Eu3 +, Yb3 + 또는 Lu3 + 이고, 특히 Gd3 + 인 것이 바람직하다.
또한, 상기 상자성 물질은 방사성 동위원소도 이용될 수 있다. 예를 들어, 방사성 동위원소는 방사성 동위원소가 11C, 13N, 18F, 123I, 124I, 125I, 99mTc, 95Tc, 111In, 76Br, 62Cu,64Cu, 67Ga 또는 68Ga 이며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 자기공명영상 조영제는, 생체의 장기 진단 시 체내의 조직 근처에서 T1 또는 T2 이완 시간(relaxation time)을 줄여서 조영 효과를 높여주는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "킬레이트 화합물" 또는 "킬레이터" 란 하나 이상의 공여체 원자를 통해 금속 이온에 결합될 수 있는 화합물 또는 시약 상의 잔기를 말한다. 상자성 복합체가 물분자의 T1 자기이완시간을 단축시키는 정도 및 상자성 물질의 안정화 정도는 상자성 물질에 결합되는 킬레이트 화합물의 화학적 구조가 매우 중요한 역할을 한다.
이러한 관점에서, 본 발명에서의 킬레이트 화합물은 적어도 두 개 이상의 인산기를 가진 킬레이트 화합물을 말하며, 구체적으로 파이테이트, 이노시톨 포스페이트 또는 포스파티딜 이노시톨 포스페이트인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 파이테이트는 이노시톨-1,2,3,4,5,6,-육인산(d-myo-inositol- 1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate)이고, 상기 이노시톨 포스페이트는 이노시톨-1,2,3,4,5-오인산(d-myo-inositol-1,2,3,4,5-pentaphosphate), 이노시톨-1,3,4,5-사인산(d-myo-inositol-1,3,4,5-tetraphosphate), 이노시톨-1,4,5-삼인산(d-myo-inositol-1,4,5-trisphosphate) 또는 이노시톨-1,3,4-삼인산(d-myo-inositol-1,3,4-trisphosphate)이고, 상기 포스파티딜 이노시톨 포스페이트는 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate)인 것이 바람직하다.
또한, 상기 킬레이트 화합물의 pH는 4 내지 9의 범위가 생리적 환경에 적합하며, 가장 적합한 pH는 6 내지 8의 범위이다.
또한, 상기 상자성 물질과 상기 킬레이트 화합물의 몰 비(molar ratio) 범위가 0.5 내지 3.0의 범위에서 만들어진 자기공명영상 조영제이며, 역으로 상기 킬레이트 화합물과 상기 상자성 물질의 몰 비 범위가 0.5 내지 3.0의 범위에서 제조된 자기공명영상 조영제인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조영제가 진단환경에서 사용될 때, 킬레이트 화합물에 혈중 칼슘이 결합하는 것은 바람직하지 않다. 따라서, 상기 자기공명영상 조영제가 혈 중 칼슘과 결합하는 것을 최소화 하기 위하여, 조영제 제조 시 칼슘(Ca2+)이 첨가되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 첨가되는 칼슘의 몰 비는 조영제로 사용되는 킬레이트 화합물과 동일한(equimolar) 몰 비로 첨가되는 것이 바람직하다. 그러나, 양전자 방사 단층 촬영(PET) 또는 자기공명영상 (MRI) 진단 시, 조영제에 첨가하는 칼 슘의 양은 혈 중 칼슘을 결합해서 생체에 해롭지 않은 양이면 제한되지 않는다.
본 발명의 조영제의 제조방법으로는, 당업계에서 일반적으로 알려진 상자성 물질과 킬레이트 화합물의 결합에 의한 제조방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 두 개 이상의 인산기를 가지는 킬레이트 화합물을 멸균수에 가용화시키고 pH 적정을 한 후, 이를 상자성 이온 용액과 혼합하여 제조할 수 있다.
또는, 상자성 파이테이트 복합체 용액을 칼슘이온과 함께 저온 건조하여 용기로 보관할 수도 있다. 또 다른 한 방법은 상자성 파이테이트 복합체 용액 또는 저온 건조된 용기와 따로 칼슘 용액을 제조하여 건조하여 함께 사용이 가능하며, 또는 상자성 파이테이트 복합체를 함유하는 용기와 완전히 분리된 용기 형태로 제조가 가능하다. 또 다른 방법은 파이테이트 용액을 용기에 먼저 넣고, 상자성 이온을 넣어서 혼합도 가능하다. 상기의 제조 과정 중에 분말 형태 또는 상자성 파이테이트 혼합용액 형태로도 제조가 가능하다. 마지막으로 상기 발명의 조영제인 상자성 파이테이트는 다양한 종양 치료에 사용되는 단일 항체(monoclonal antibodies)와 결합시켜 함께 제조하여 사용 할 수도 있다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 자기공명영상 조영제를 환자에 투여함으로서 자기공명영상으로 환자의 기관 또는 조직을 영상화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질 을 도입하는 것을 의미하며, 유용한 투여량 및 특정 투여 방식은 연령, 체중 및 치료될 특정 부위 뿐만 아니라 사용되는 특정 조영제, 고려되는 진단 용도 및 제제의 형태 (예를 들어, 현탁액, 에멀젼, 마이크로스피어, 리포좀 등)와 같은 인자에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자에게 이미 명백할 것이다. 전형적으로, 투여량은 낮은 수준으로 투여하고, 원하는 진단 효과가 달성될 때까지 증가시킨다. 영상화는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 수행한다. 일반적으로, 조영제의 멸균 수용액은 1 kg(체중) 당 약 0.01 내지 약 1.0 mmole의 투여량 범위 (투여량 범위의 모든 조합 및 하위 조합, 및 이에 포함되는 특정 투여량 포함)로 환자에게 정맥내 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 조영제는 티시 파이테이트(Tc-phytate)와 상자성 양이온 복합체와의 조합을 통하여 양전자 방사 단층 촬영(PET)과 함께 자기공명 영상 조영에 사용이 가능하다.
바람직하게는, 상기 영상화 방법은, 지방간, 간경화 또는 동맥경화 진단시 상기 자기공명영상 조영제를 정맥 투여(intravenous)하는 것이 바람직하다.
또한 바람직하게는, 상기 영상화 방법은, 다양한 종류의 종양에서 암전이 유무를 판단하는 센티널 림프절(sentinel lymph node) 진단시, 상기 자기공명영상 조영제는 피하(subcutaneous)로 투여하는 것이 바람직하다.
또한 바람직하게는, 상기 영상화 방법은, 종양 진단시, 상기 자기공명영상 조영제는 피하(subcutaneous)로 투여하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 종양은 유방암, 악성흑색종(malignant melanoma), 외음부암(vulvar cancer), 두 경부편평상피세포암(squamous cell carcinoma (SCC) of the head and neck), 자궁경부암, 인두암(pharyngeal carcinoma), 또는 전립선암인 것이 바람직하다.
본 발명의 자기공명영상용 조영제는 기존의 조영제들보다 열역학적, 생물학적으로 안정하며, 선명한 T1 조영효과 (bright contrast)를 나타내며, 생체 내 잔류시간이 길고, 조직 및 세포 특이적이라는 특징이 있다.
첫째로, 본 발명의 조영제는 상자성 물질과 킬레이트 화합물의 친화력이 매우 높으므로 기존의 조영제들보다 안정한 특징을 가진다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 ITC 열역학적 분석을 통해 파이테이트 또는 이노시톨 포스페이트와 상자성 이온 결합 친화력 정도를 측정하였다. 그 결과, 파아테이트의 두 개의 인산기에 Gd 이온이 결합하는 이좌배위자 형태로 강한 친화력으로 결합하였고, 마찬가지로 망간이온 또한 파아테이트에 강하게 결합하였고, 또한 이노시톨 포스페이트 유도체들 또한 Gd 이온과 강하게 결합하였으므로, 상자성 물질과 파아테이트가 결합한 조영제가 매우 안정하여 조영제로 적합함을 알 수 있다 (표 1 내지 표 4 참조).
또한, 본 발명의 조영제는 이미 조영제로 사용되고 있는 Gd-EDTA 보다 약 10배 이상 강한 결합력을 가지며, Gd-DTPA 보다 약 10-100배 이상 강한 결합력을 나타내었으므로, 기존에 사용되던 조영제보다 훨씬 안정성이 높은 조영제임을 알 수 있다 (표 5 참조).
둘째로, 본 발명의 조영제는 자기공명영상에서 특정 부위의 대비도를 효율적으로 향상시키는 특징이 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 망간-파이테이 트(Mn-phytate) 및 가도리니움-파이테이트(Gd-phytate)의 이완율(R1 = 1/T1)을 각각의 다른 농도에서 측정하여, 기존의 조영제인 망간(Mn2+) 및 가도리니움 디티피에이(Gd-DTPA)의 이완율과 서로 비교한 결과, 거의 모든 농도에서 기존 조영제보다 조영 효과가 우수함을 입증하였다 (도 11). 이와 같이 높은 T1 자기이완 효율을 갖는 상자성 조영제는, 상대적으로 적은 양을 투여해도 기존의 조영제와 같은 정도의 조영증강 효과를 나타내며, 상자성 원소로 흔히 사용되는 중금속인 가돌리니움(Gd)의 양을 줄임으로서 결과적으로 인체에 미치는 잠재적인 안전성 문제에서 유리하며, 작은 양으로도 충분한 조영증강을 얻을 수 있기 때문에 자기공명영상에서 매우 중요한 의미를 갖는다.
셋째로, 본 발명의 조영제는 생체 내 체류시간이 기존의 조영제보다 길며 훨씬 빨리 체내에서 제거되는 특징이 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 조영제인 망간 파이테이트(Mn-phytate)는 주입 후 대략 40분만에 조영효과가 최대 (약 32% 향상)에 도달하며, 주입된 망간 파이테이트(Gd-phytate)는 약 24시간 후에 거의 제거되는 것으로 확인되었다. 이것은 또한 세포내(intracellular) 조영제로 알려진 SPIO보다는 훨씬 빨리 체내에서 제거된다는 사실을 확인하였다. 따라서, 생체 내 체류시간을 증가시키기 위하여 별도의 담체를 사용해야 하는 기존의 조영제에 비하여 효과적임을 알 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 조영제는 조직 또는 세포 특이적으로 영상화가 가능한 특징이 있다. 본 발명의 실시예에서는 본 발명의 조영제인 Gd-파이테이트가 거 식세포에 의하여 포식작용이 일어난다는 사실을 증명하였으므로, 이러한 특징을 이용하여 생체 진단시 관심 있는 장기 조직을 영상화하는 것이 가능하다.
즉, 거식세포는 간, 림프절(lymph node) 과 비장(spleen) 등에 상당히 많은 수가 존재하는 것으로 알려져 있으며, 간에 존재하는 쿠퍼셀과 근육 조직에 존재하는 히스티오사이트(histiocytes) 등과 같은 거식세포가 조영제의 흡수를 담당하는 것으로 알려져 있는데, 본 발명의 조영제는 조영제 투여 시 혈류를 통하여 쿠퍼셀(Kupffer cell)과 같은 거식세포에 의해서 흡수되어 자기공명영상신호를 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 조영제는 거식세포에 의한 생체 내 포식작용에 의하여, 동맥경화, 장기이식, 다양한 경화증, 및 다양한 암 전이를 판별하는 센티널 림프절과 같은 다양한 질명을 진단하는데 응용될 수 있다.
따라서, 바람직한 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 자기공명영상 조영제를 필요에 따라 환자에 투여함으로서, 자기공명영상을 통하여 환자의 장기 또는 조직의 감염(infection)과 염증(inflammation)을 진단하는데 있어서 거식세포(macrophage)의 활성을 측정하는 방법을 제공한다.
또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 자기공명영상 조영제를 필요에 따라 환자에 투여함으로서, 자기공명영상을 통하여 환자의 장기 또는 조직의 염증 부위로 거식세포의 이동(macrophage infiltration)을 비침습적으로 측정하는 방법을 제공한다.
또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 자기공명영상 조영제를, 세포(cells)에 첨가하거나, 환자의 기관 또는 조직에 세포를 이식하거나, 또는 생체에서 이식한 세포(transplanted cells)의 존재를 영상으로 확인할 때, 자기공명영상을 통하여 생체에서 이식한 세포(transplanted cells)의 존재를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 자기공명영상 조영제 및 이를 이용한 영상화 방법은 자기공명영상 조영제를 쉽게 주입 가능한 콜로이드 현탁물(colloid suspension)로 제조할 수 있고, 자기공명영상 조영제의 흡수시 간, 비장, 허파와 같은 조직특이성이 있고, 계면활성제를 사용하지 않아 잠재적으로 엘러지 반응을 일으키지 않으며, 열역학적으로 안정한 자기공명영상 조영제(예컨대, EDTA와 DTPA보다 안정함)로서 자성 물질의 체내 유리를 억제하며, 자기공명영상 조영제가 기관 및 조직에 흡수/축적되기 때문에 비교적 소량의 조영제(1-4 mmol/kg)로 좋은 질의 자기공명 영상 획득이 가능하다.
또한, 투여 방법에 따라 본 발명의 자기공명영상 조영제는 다양한 기관 및 조직의 질병 진단이 가능하다. 즉, 혈관 주입시 (intravenous or intra-arterial), 조영제는 간, 비장, 림프절, 골수 및 폐에서 선택적인 조영효과를 나타낸다. 또한, 경구 투여시 본 발명의 자기공명영상 조영제는 소화기관의 자기공명영상 조영이 가 능하다. 나아가, 유방암, 전립선 암, 자궁경부암과 같은 다양한 종류의 종양부위에 피하 주입시(subcutaneous) 본 발명의 조영제가 전이된 림프절에 특이적으로 축적되는 성질로 인하여 암전이 유/무를 확인하는 센티널 림프 절(sentinel lymph node) 확인에 적용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 도면 및 표와 함께 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
파이테이트
또는 이노시톨
포스페이트와
상자성 이온의 결합에 대한 열역학적 분석
파이테이트 용액 또는 이노시톨 포스페이트 용액에 대한 가도리니움(Gd3 +) ,망간 (Mn2 +), 칼슘(Ca2 +) 및 마그네슘(Mg2 +) 이온과 같은 상자성 이온들의 결합시 발생하는 열 에너지를 측정하기 위하여, 마이트로칼 200(Microcal 200 calorimeter, Northhampton, MA. USA)를 사용하여 ITC 실험을 수행하였다. 자료 수집, 분석 및 그래프 작성은 마이크로칼사에서 제공하는 오리진(Origin, version 7.0) 컴퓨터 프로그램을 이용하여 수행하였다. 마이크로 칼로리미터 적정은 상자성 물질이 샘플 셀에 간헐적으로 주입시 발생하는 열에너지 변화를 대조군 시료와의 열에너지 차이 로 수행한다. 대조군은 물을 이용하였다. 전형적인 열에너지 차이를 측정하는 적정 방법은 각각의 다른 pH로 된 파이테이트 용액에 5-10 Mm의 상자성 물질을 2분 간격으로 약 1-5ml씩 간헐적으로 주입하면서 결합 에너지 차이를 측정하였다. 이 때 시료 즉 파이테이트 시료와 상자성 물질과의 안정적인 결합을 위하여 1000 rpm 속도로 혼합하면서 수행하였다. 상자성 물질이 시료에 주입될 때 흡열 또는 발열되는 에너지를 마이크로 칼로리미터로 측정하였다. 이러한 각각의 적정 열에너지는 엔탈피(enthalpy change) 변화로 통합하였다. 적정된 열에너지는 수학적으로 두 세트의 다른 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 것으로 분석되었다. 이러한 열역학적 분석을 통하여 결합상수 (Ka), 엔탈피 변화 (ΔH), 결합개수(N)와 같은 파라미터를 계산하였다. 자유에너지(free energy) 변화 (ΔG)와 무질서도(entropy) 변화(ΔS)를 다음과 같은 수식(ΔG = -RTln Ka = ΔH -TΔS )을 통하여 계산하였다. R은 기체상수이며, T는 절대온도이다.
실시예 1.1: 파이테이트와 가도리니움(Gd
3+
) 이온 결합에 대한 ITC분석
가도리니움 이온(10 mM)을 이용한 파이테이트(0.5 mM)의 결합에 대한 열역학적 적정반응은 37℃에서 pH 3.0-8.0 범위에서 각각의 pH에서 측정하였다. 가도리니움/파이테이트 몰 비로 나타낸 도면에 해당하는 결합 열에너지는 도 1B에 나타내었다. 도 1B에서, 실선은 파이테이트 분자에 가도리니움 이온이 수학적으로 두 세트의 다른 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 분석 결과이며, 이 도면은 가도리니 움 이온이 3개의 독립적으로 파이테이트 분자에 결합한다는 것을 보여준다. 이러한 분석을 통하여 해리상수(Kd), 파이테이트 분자당 가도리니움 이온의 결합 개수(n), 엔탈피 변화(ΔH)를 계산하였다. 파이테이트 분자에 가도리니움 이온의 결합에 해당하는 열역학적 변수들은 하기 표 1에 나타내었다. 본 실시예를 통하여 파이테이트의 두 개의 인산기에 가도리니움 이온이 결합하는 이좌배위자(bidentate) 형태(도 1A)로 강한 친화력(kd=10-9-10-7 M)으로 결합한다는 사실을 확인하였다.
(상기 실험은 0.1 N HCl로 적용된 각 pH에서, 0.5 mM의 파이테이트 용액으로 310 K에서 수행되었다. n 값은 파이테이트 1몰당 결합된 Gd3+의 수를 나타낸다. 상기 열역한 변수들은 결합반응의 분석을 위하여 제공되었다.)
실시예
1.2:
파이테이트와
망간(
Mn
2
+
) 이온 결합에 대한
ITC
분석
망간 이온(10 mM)을 이용한 파이테이트(0.5 mM)의 결합에 대한 열역학적 적정반응은 37℃에서 pH 7.0에서 측정하였다. 망간/파이테이트 몰 비로 나타낸 도면에 해당하는 결합 열에너지는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 실선은 파이테이트 분자에 망간 이온이 수학적으로 연속적인 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 분석 결과이며, 이 도면은 망간 이온이 4개의 독립적으로 파이테이트 분자에 결합한다는 것을 보여준다. 이러한 분석을 통하여 해리상수(Kd), 파이테이트 분자당 망간 이온의 결합 개수(n), 엔탈피 변화(ΔH)를 계산하였다. 이러한 분석을 통하여 파이테이트 일몰당 4몰의 망간이온이 결합하는 것으로 확인되었으며, 그 결합력(Kd)은 9.52×10-6 M, 1.1×10-6 M, 2.21×10-5 M, 그리고 1.2×10-4 M으로 확인되었다. 본 실시예를 통하여 망간이온 또한 파이테이트에 강하게 결합한다는 실시예를 제시 하였다.
실시예
1.3:
파이테이트와
칼슘(
Ca
2
+
) 및 마그네슘(
Mg
2
+
) 이온 결합에 대한
ITC
분석
칼슘 및 마그네슘 이온들은 혈중에 존재하는 가장 풍부한 무기질 이온이기 때문에 파이테이트에 대한 다양한 상자성 물질과의 상대적인 결합력을 비교하는 것이 매우 중요하여, 칼슘(15 mM) 및 마그네슘(30 mM)을 이용한 파이테이트(0.5 mM)의 결합에 대한 열역학적 적정반응은 37℃에서 pH 3.0-8.0 범위에서 각각의 pH에서 측정하였다. 칼슘/파이테이트 몰 비로 나타낸 도면에 해당하는 결합 열에너지는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 실선은 파이테이트 분자에 칼슘 이온이 수학적으로 두 세트의 다른 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 분석 결과이며, 이 도면은 칼슘 이온이 3개의 독립적으로 파이테이트 분자에 결합한다는 것을 보여준다. 이러한 분석을 통하여 해리상수(Kd), 파이테이트 분자당 칼슘 이온의 결합 개수(n), 엔탈피 변화(ΔH)를 계산하였다. 파이테이트 분자에 칼슘 이온의 결합에 해당하는 열역학적 변수들은 하기 표 2에 나타내었다.
(상기 실험은 0.1 N HCl로 적용된 각 pH에서, 0.5 mM의 파이테이트 용액으로 310 K에서 수행되었다. n 값은 파이테이트 1몰당 결합된 Ca2+의 수를 나타낸다. 상기 열역한 변수들은 결합반응의 분석을 위하여 제공되었다.)
그네슘/파이테이트 몰 비로 나타낸 도면에 해당하는 결합 열에너지는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 실선은 파이테이트 분자에 마그네슘 이온이 수학적으로 한 세트의 독립적인 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 분석 결과이며, 이 도면은 마그네슘 이온이 하나 또는 두 개가 독립적으로 파이테이트 분자에 결합한다는 것을 보여준다. 이러한 분석을 통하여 해리상수(Kd), 파이테이트 분자당 마그네슘 이온의 결합 개수(n), 엔탈피 변화(ΔH)를 계산하였다. 파이테이트 분자에 마그네슘 이온의 결합에 해당하는 열역학적 변수들은 하기 표 3에 나타내었다. 이러한 결과는 파이테이트에 대한 칼슘 이온의 결합력이 마그네슘 이온과 비교 시 약 100배 이상 높은 것으로 확인되었다.
(상기 실험은 0.1 N HCl로 적용된 각 pH에서, 0.5 mM의 파이테이트 용액으로 310 K에서 수행되었다. n 값은 파이테이트 1몰당 결합된 Mg2+의 수를 나타낸다. 상기 열역한 변수들은 결합반응의 분석을 위하여 제공되었다.)
파이테이트에 대한 여러 메탈이온과의 결합에 대한 ITC 분석결과는 가도리니움 이온이 파이테이트에 가장 강하게 결합한다는 사실을 확인하였다. 이러한 사실은 가도리니움 파이테이트가 열역학적으로 가장 안정한 화합물이며 심지어는 산성 pH에서도 안정한 것으로 확인되었다. 이는 가도리니움 파이테이트를 조영제로 사용 시, 조영제로서의 가장 중요한 성질인 독성 문제가 아주 낮을 것으로 사료된다.
실시예 1.4: 이노시톨
포스페이트
와
가도리니움
(
Gd
3
+
) 이온 결합에 대한
ITC
분석
가도리니움(5 mM)을 이용한 이노시톨 포스페이트(inositol-1,3,4-trisphosphate, inositol-1,4,5-trisphosphate, 또는 inositol-1,3,4,5-tetrakisphosphate) 유도체들(0.2 mM)의 결합에 대한 열역학적 적정반응은 25℃에서 10 mM HEPES, pH 7.0에서 측정하였다. 가도리니움/이노시톨 포스페이트 몰 비로 나타낸 도면에 해당하는 결합 열에너지는 도 5, 도 6, 도 7에 나타내었다. 이러한 분석을 통하여 각 이노시톨 포스페이트 일몰당 가도리니움 이온이 결합하는 열역학적 파라미터들은 하기 표 4에 나타내었다. 본 실시예를 통하여 이노시톨 포스페이트 유도체들 또한 가도리니움 이온과 강하게 결합한다는 실시예를 제시 하였다.
(상기 실험은 10 mM HEPES pH 7.0에서, 0.2 mM의 이노시톨 파이테이트 용액으로 298 K에서 수행되었다. n 값은 이노시톨 파이테이트 1몰당 결합된 Gd2+의 수를 나타낸다. 상기 열역한 변수들은 결합반응의 분석을 위하여 제공되었다.)
실시예 2: EDTA와 가도리니움(Gd
3+
) 이온 결합에 대한 ITC분석
가도리니움 이온 (5 mM)을 이용한 EDTA(0.4 mM)의 결합에 대한 열역학적 적정반응은 25℃에서 10 mM MES pH 5.6에서 측정하였다. 가도리니움/EDTA 몰 비로 나타낸 도면에 해당하는 결합 열에너지는 도 8에 나타내었다. 도 8에서 실선은 EDTA 분자에 가도리니움 이온이 수학적으로 한 세트의 최적의 결합력을 나타내는 분석 결과이며, 이 도면은 일몰의 가도리니움 이온이 독립적으로 일몰의 EDTA 분자에 결합한다는 것을 보여준다. 이러한 분석을 통하여 해리상수(Kd), EDTA 분자당 가도리니움 이온의 결합 개수(n), 엔탈피 변화(ΔH)를 계산하였다. 이러한 분석을 통하여 EDTA 일몰당 일몰의 가도리니움 이온이 결합하는 것으로 확인되었으며, 그 결합력(Kd)은 1.47×10-7 M 으로 확인되었다. 본 실시예는 이미 잘 알려진 킬레이터인 EDTA와 본 발명에서 개발된 조영제와의 상대적인 안정성을 비교하는데 매우 중요한 실험 결과이다. 또한 본 실험 결과는 본 발명의 가도리니움 파이테이트가 가도리니움 EDTA보다 약 10배 이상의 강한 결합력을 가지고 있다는 사실을 말하며 이는 본 발명의 조영제(가도리니움 파이테이트)가 가도리니움 EDTA보다 약 10배 이상 안정한 조영제임을 나타내는 실험적 결과이다.
실시예
3:
다이에틸렌
트리아민
펜타아세틱산(
diethylene
triamine
pentaacetic
acid,
DTPA
)과
가도리니움
(
Gd
3
+
) 이온 결합에 대한
ITC
분석
가도리니움 파이테이트와 상대적인 안정성을 비교하기 위하여, 가도리니움 이온(5 mM)을 이용한 DTPA(0.2 mM)의 결합에 대한 열역학적 적정반응은 25℃에서 10 mM sodium acetate pH 4.8, 또는 10 mM HEPES pH 7.0에서 측정하였다. 가도리니움/DTAP 몰 비로 나타낸 도면에 해당하는 결합 열에너지는 도 9(pH 4.8), 도 10(pH 7.0)에 나타내었다. 도 9와 도 10에서 실선은 DTPA 분자에 가도리니움 이온이 수학적으로 두 세트로 최적의 결합력을 나타내는 분석 결과이며, 이는 이 몰의 가도리니움 이온이 독립적으로 일몰의 DTPA 분자에 결합한다는 것을 보여준다. 이러한 분석을 통하여 해리상수(Kd), DTPA 분자당 가도리니움 이온의 결합 개수(n), 엔탈피 변화(ΔH)를 계산하였다. 이러한 분석을 통하여 DTPA 일몰당 이 몰의 가도리니움 이온이 결합하는 것으로 확인되었으며, DTPA 분자에 가도리니움 이온의 결합에 해당하는 열역학적 변수들은 하기 표 5에 나타내었다. 본 실험결과로부터 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)가 Gd-DTPA보다 약 10-100배의 강한 결합력을 나타내었으며, 이는 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)가 Gd-DTPA보다 훨씬 안정한 조영제임을 증명한 실험 결과이다.
(상기 실험은 10 mM sodium acetate pH 4.8에서 또는 10 mM HEPES pH 7.8에서, 0.2 mM의 DTPA 용액으로 298 K에서 수행되었다. n 값은 이노시톨 파이테이트 1몰당 결합된 Gd2+의 수를 나타낸다. 상기 열역한 변수들은 결합반응의 분석을 위하여 제공되었다.)
실시예
4: 상자성
파이테이트
복합체(
paramagnetic
-
phytate
complexes
)의 제조
상자성 파이테이트 복합체 제조를 위해서, 상자성 물질은 어떠한 상자성 원소, 분자 또는 물질이 될 수 있으며, 상자성 물질은 적어도 다음과 같은 원소들 중에 하나가 조영제로 사용될 수 있다. 전이원소 중에는 Cr3+, Co2+, Mn2+, Ni2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, 또는 Cu3+ 등과 같은 물질이 조영제의 성분으로 사용될 수 있다. 한편, 상자성 물질은 란탄계열원소 (lanthanide element)가 될 수 있다. 특히, 란탄계열원소는 La3+, Gd3+, Ce3+, Tb3+, Pr3+, Dy3+, Nd3+, Ho3+, Pm3+, Er3+, Sm3+, Tm3+, Eu3+, Yb3+, 또는 Lu3+ 중 하나가 사용될 수 있다. 선호하는 이온들은 Fe2+, Fe3+, Mn2+ 또는 Gd3+중 하나가 사용될 수 있다. 특히, 가장강한 상자성을 가진 Gd3 + 이온이 가장 선호하는 물질이다. 즉, 가도리니움 이온은 매우 비싸며, 생체환경에서 자유 이온(free ion)으로 존재 시에는 매우 독성이 강하기 때문에, 강력한 킬레이터(chelator)인 파이테이트가 가도리니움 이온을 강하게 결합하여, 생리적으로 안정하게 격리시켜 독성을 감소시켜 안전하게 유지할 수 있는 작용이 가능하여 조영제 조성물질로 이용하고자 한다.
실시예
4.1:
가도리니움
파이테이트
복합체(
Gd
-
phytate
complexes
)의 제조
ITC 분석결과 파이테이트 분자에 대한 가도리니움 이온의 결합력은 파이테이트 분자와 가도리니움 이온이 동일 몰 농도(equimolar concentration)일 때 가장 강한 것으로 나타났다. 이러한 분석 결과(도 1 과 표 1)를 토대로, 가도리니움 파이테이트 용액(20 mM Gd-phytate) 제조는 멸균수 300 ml에 7.24 g의 파이테이트(sodium phytate, Sigma chemical Co., USA)를 가용화 시킨 후, 1 N의 염산용액을 사용하여 파이테이트 용액의 pH를 7.0으로 적정하였다. 200 mM 가도리니움 이온 (Sigma chemical Co., USA) 용액 100 ml를 상기 제조된 파이테이트 용액과 혼합 후, 최종적으로 1,000ml의 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate) 용액을 제조하였다. 제조된 용액은 15 ml용기에 10 ml씩 분주하여 사용하였다. 한편으로 상기 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate) 용액 제조시 pH 범위는 4-8사이가 될 수 있으며, 생리적 환경에서 상기 조영제를 진단용으로 사용시 가장 선호하는 pH범위는 6-8범위가 될 수 있다. 또한 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate) 용액 제조시, 가도리니움 이온과 파이테이트와의 몰 비가 0.5에서 3.0범위에서 가능하며, 반대로는 파이테이트와 가도리니움 이온과 몰 비가 0.5에서 3.0범위에서 가능하다. 가장 선호하는 농도비는 동일 농도의 가도리니움 이온과 파이테이트로 제조되는 것이 바람직하다. 또한 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate) 조영제를 진단용으로 사용시 혈 중 칼슘 이온과 결합하는 것을 최소화하기 위하여, 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate) 용액에 칼슘이온을 첨가 할 수도 있다. 가장 선호하는 칼슘이온 농도는 가도리니움 및 파이테이트와 동일 농도(equimolar concentration)를 사용하는 것이 바람직하다.
실시예
4.2: 망간
파이테이트
복합체(
Mn
-
phytate
complexes
)의 제조
ITC 분석결과 파이테이트 분자에 대한 망간 이온의 결합력은 파이테이트 분자와 망간 이온이 동일 몰 농도(equimolar concentration)일 때 가장 강한 것으로 나타났다. 이러한 분석 결과(도 2)를 토대로, 망간 파이테이트 용액(20 mM Mn-phytate) 제조는 멸균수 300 ml에 7.24g의 파이테이트(sodium phytate, Sigma chemical Co., USA)를 가용화 시킨 후, 1 N의 염산용액을 사용하여 파이테이트 용액의 pH를 7.0으로 적정하였다. 200 mM 망간 이온 (Sigma chemical Co., USA) 용액 100 ml를 상기 제조된 파이테이트 용액과 혼합 후, 최종적으로 1,000ml의 망간 파이테이트(Mn-phytate) 용액을 제조하였다. 제조된 용액은 15 ml용기에 10 ml씩 분주하여 사용하였다. 한편으로 상기 망간 파이테이트(Mn-phytate) 용액 제조 시 pH범위는 4-8사이가 될 수 있으며, 생리적 환경에서 상기 조영제를 진단용으로 사용시 가장 선호하는 pH범위는 6-8범위가 될 수 있다. 또한 망간 파이테이트(Mn-phytate) 용액 제조 시, 망간 이온과 파이테이트와의 몰비가 0.5에서 4.0범위에서 가능하며, 반대로는 파이테이트와 망간 이온과 몰 비가 0.5에서 4.0범위에서 가능하다. 가장 선호하는 농도비는 동일 농도의 망간 이온과 파이테이트로 제조되는 것이 바람직하다. 또한 망간 파이테이트(Mn-phytate) 조영제를 진단용으로 사용시 혈 중 칼슘 이온과 결합하는 것을 최소화하기 위하여, 망간 파이테이트(Mn-phytate) 용액에 칼슘이온을 첨가 할 수도 있다. 가장 선호하는 칼슘이온 농도는 망간 및 파이테이트와 동일 농도(equimolar concentration)를 사용하는 것이 바람직하다.
실시예
5: 상자성 이노시톨
포스페이트
(
paramagnetic
-
inositol
phosphates
)의 제조
상자성 이노시톨 포스페이트 복합체 제조를 위해서, 상자성 물질은 어떠한 상자성 원소, 분자 또는 물질이 될 수 있으며, 상자성 물질은 적어도 다음과 같은 원소들 중에 하나가 조영제로 사용될 수 있다. 전이원소 중에는 Cr3+, Co2+, Mn2+, Ni2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, 또는 Cu3+ 등과 같은 물질이 조영제의 성분으로 사용될 수 있다. 한편, 상자성 물질은 란탄계열원소 (lanthanide element)가 될 수 있다. 특히, 란탄계열원소는 La3+, Gd3+, Ce3+, Tb3+, Pr3+, Dy3+, Nd3+, Ho3+, Pm3+, Er3+, Sm3+, Tm3+, Eu3+, Yb3+, 또는 Lu3+ 중 하나가 사용될 수 있다. 선호하는 이온들은 Fe2+, Fe3+, Mn2+ 또는 Gd3+중 하나가 사용될 수 있다. 특히, 가장강한 상자성을 가진 Gd3+ 이온이 가장 선호하는 물질이다.
이노시톨 포스페이트를 이용한 조영제는 이노시톨 포스페이트는 이노시톨 5인산 (d-myo-inositol-1,2,3,4,5-pentaphosphate), 이노시톨 4인산(d-myo-inositol-1,3,4,5-tetraphosphate), 이노시톨 3인산 (d-myo-inositol-1,3,4-trisphosphate, 또는 d-myo-inositol-1,4,5-trisphosphate)중 어떠한 것도 사용 될 수 있다.
실시예
5.1:
가도리니움
이노시톨
포스페이트
(
Gd
-
inositol
phosphates
)의 제조
ITC 분석결과 이노시톨 포스페이트 분자에 대한 가도리니움 이온의 결합력은 이노시톨 포스페이트 분자 ((D-myoinositol-1,3,4-trisphosphate, D-myo-inositol-1,4,5-trisphosphate, 또는 D-myo-inositol-1,3,4,5-tetrakisphosphate)와 가도리니움 이온이 동일 몰 농도(equimolar concentration)일 때 가장 강한 것으로 나타났다. 이러한 분석 결과(도 5, 도 6, 도 7 과 표 4)를 토대로, 가도리니움 이노시톨 포스페이트(Gd-inositol phosphate) 제조는 1 N의 염산용액을 사용하여 용액의 pH를 7.0으로 적정한 멸균수 5 ml의 20 mM 이노시톨 포스페이트(Sigma chemical Co., USA), 5 ml의 20 mM 가도리니움 이온(Sigma chemical Co., USA) 용액과 혼합 후 제조하였다. 상기 가도리니움 이노시톨 포스페이트 (Gd-inositol phosphate) 용액 제조 시 pH범위는 4-8사이가 될 수 있으며, 생리적 환경에서 상기 조영제를 진단용으로 사용시 가장 선호하는 pH범위는 6-8범위가 될 수 있다. 또한 가도리니움 이노시톨 포스페이트(Gd-inositol phosphate) 용액 제조시, 가도리니움 이온과 이노시톨 포스페이트 의 몰 비가 0.5에서 4.0범위에서 가능하며, 반대로는 이노시톨 포스페이트 와 가도리니움 이온과의 몰 비가 0.5에서 4.0범위에서 가능하다. 가장 선호하는 농도 비는 동일 농도의 가도리니움 이온과 이노시톨 포스페이트로 제조되는 것이 바람직하다.
실시예 6: 상자성 포스파티딜 이노시톨 포스페이트 리포좀 (paramagnetic-phosphatidylinositol
phosphates
liposomes
)의 제조
상자성 포스파티딜 이노시톨 포스페이트 리포좀 제조를 위해서, 상자성 물질은 어떠한 상자성 원소, 분자 또는 물질이 될 수 있으며, 상자성 물질은 적어도 다음과 같은 원소들 중에 하나가 조영제로 사용될 수 있다. 전이원소 중에는 Cr3+, Co2+, Mn2+, Ni2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, 또는 Cu3+ 등과 같은 물질이 조영제의 성분으로 사용될 수 있다. 한편, 상자성 물질은 란탄계열원소(lanthanide element)가 될 수 있다. 특히, 란탄계열원소는 La3+, Gd3+, Ce3+, Tb3+, Pr3+, Dy3+, Nd3+, Ho3+, Pm3+, Er3+, Sm3+, Tm3 +, Eu3 +, Yb3 +, 또는 Lu3 + 중 하나가 사용될 수 있다. 선호하는 이온들은 Fe2+, Fe3 +, Mn2 + 또는 Gd3 +중 하나가 사용될 수 있다. 특히, 가장강한 상자성을 가진 Gd3+ 이온이 가장 선호하는 물질이다.
포스파티딜 이노시톨 포스페이트 유도체를 이용한 조영제는 포스파티딜 이노시톨 3인산(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate)와 포스파티딜 이노시톨 2인산(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate) 중 어떠한 것도 사용 될 수 있다.
실시예
7: 9.4T
MRI
스캐너에서 다양한 농도의 망간(
Mn
2
+
),
가도리니움
디티피에이(
Gd
-
DTPA
), 망간-
파이테이트
(
Mn
-
phytate
),
가도리니움
-
파이테이트(Gd-phytate)에
대한 이완율(
relaxation
rates
,
R1
) 측정
자기공명영상 조영제를 사용한 강조영상에서, 이완율 (R1 = 1/T1)은 상기 개발된 조영제가 자기공명영상에서 특정부위의 대비도를 얼마나 효율적으로 향상시킬 수 있는가를 나타내는 척도로 사용되고 있다. 본 실시예에서, 망간-파이테이트(Mn-phytate) 및 가도리니움-파이테이트(Gd-phytate)의 이완율을 각각의 다른 농도에서 측정하였고, 자기공명영상용 조영제로 널리 이용되는 기존 조영제인 망간(Mn2+) 및 가도리니움 디티피에이(Gd-DTPA)의 이완율과 서로 비교하였다.
4 개의 각각 다른 화학물질 ((망간(Mn2 +), 가도리니움 디티피에이(Gd-DTPA), 망간-파이테이트(Mn-phytate), 가도리니움-파이테이트(Gd-phytate))에 대한 6개의 다른 농도(0.0125, 0.025, 0.05, 0.1, 0.5 와 1 mM)에서 펜텀 실험을 수행하였다. 전송(transmission) 및 수신(reception)을 위한 볼륨 코일(직경 7cm)이 설치된 9.4T BRUKER biospec MRI 스캐너를 이용하여 각 펜텀에 대한 이완율을 측정하였다. T1은 11개의 반전회복시간(inversion recovery time; TI) 즉 (TI's = 16, 20, 30, 50, 100, 200, 400, 700, 1500, 3000 및 6000 ms)에서 측정하였다. 이 중 T1이 3000ms에서 획득한 영상을 도 11A에 나타내었다. 그 밖의 시퀀스 파라미터(sequence parameters)들은 아래와 같다. (TR/TE = 8000/4.41 ms, flip angle (FA) = 90°, field of (FOV) = 60 × 40 mm, matrix size = 256 × 256, 1 slice with a thickness of 1 mm, 2 signal averages)
도 11 결과에서 보면, 망간-파이테이트(Mn-phytate)와 가도리니움-파이테이트(Gd-phytate) 둘 다 거의 모든 농도에서 기존 조영제로 사용되는 망간(Mn2+)와 가도리니움 디티피에이(Gd-DTPA)보다 조영 효과가 우수한 것으로 나타났다.
실시예
8:
RAW
264.7
거식세포주(macrophage cell line)에서
다양한 농도의 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)를 처리 후 9.4T 자기공명 영상기에서 자기공명 영상신호 변화를 측정
본 실시예에서, 거식세포에 의한 거식작용(phogocytosis)과 본 발명의 조영제인 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)농도에 따른 영상조영 효과를 증명하였다.
RAW 264.7 거식세포주(macrophage cell line)는 미국 세포주은행(Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다. 세포 배양은 37℃, 5% CO2 배양기에서 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1% glutamine 및 1% sodium pyruvate를 함유하는 DMEM 배지를 사용하여 하였다. 자기공명영상 실험을 위하여, 웰당 105의 거식세포를 각각의 6웰 플레이트에 분주하여 24시간 배양 후, 각각의 세포를 PBS로 세척 하였다. 세척한 세포에 0, 0.125, 0.25, 0.375, 0.5 및 0.75 mM 농도의 가도리니움 파이테이트 (Gd-phytate)를 3시간 처리 후, PBS로 3번 세척 후 1 ml PBS로 녹인 후 0.2 ml 용기로 옮긴 후 전송(transmission) 및 수신(reception)을 위한 볼륨 코일(직경 7cm)이 설치된 9.4T BRUKER biospec 자기공명영상기를 이용하여 각 펨텀에 대한 T1 강조영상을 측정하였다. SPGR을 이용하여 획득한 T1 강조영상은 도 12A에 나타내었다. 시퀀스 파라미터 (sequence parameters)들은 아래와 같다. (TR/TE = 12.8/1.4 ms, FA = 90°, 1 slice with a thickness of 1 mm, 32 signal averages).
본 실시예는 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)가 밝은 조영제(positive contrast), 즉 T1 조영제로 작용하는 특징과 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)가 간에 존재하는 거식세포에 의해서 포식작용이 일어 난다는 사실을 증명하였다. 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)의 농도가 증가함에 따라 RAW 264.7 거식세포주(macrophage cell line)의 T1 강조 영상 신호가 증가하였다. 도 12B에서 작용기전을 설명한 상기 발명의 조영제는 잠재적으로 생체 진단 시 관심 있는 장기 조직의 특성을 영상화가 가능할 것으로 사료된다. 즉, 혈관에 조영제를 투여시, 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate) 와 망간 파이테이트(Mn-phytate)는 간, 비장, 골수 또는 림프절에 존재하는 거식세포가 존재하는 장기에 특이적으로 섭취 된다. 이러한 실험결과는 간에 존재하는 쿠퍼셀(Kupffer cell)이 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)를 직접적으로 흡수하는 것으로 밝혀졌다. 간에 존재하는 쿠퍼셀(Kupffer cell)에 섭취된 후 상기 발명의 조영제는 강한 T1 및 T2 이완율을 나타내어 자기공명영상 신호 증대 효과를 극대화 하는 것으로 생각된다.
실시예
9:
9.4T 자기공명
영상기에서
망간
파이테이트(Mn-phytate)를
정맥주사 후
렛드의
간에서 시간변화에 따른 자기공명영상
T1
강조영상 신호변화
본 실시예는 생체에서 망간 파이테이트(Mn-phytate)가 밝은 조영제(positive contrast), 즉 T1 조영제로 작용하는 특징과 망간 파이테이트(Mn-phytate)가 간에 존재하는 거식세포인 쿠퍼셀(Kupffer cell)에 의해서 포식작용이 일어 난다는 사실을 증명하였다.
망간 및 파이테이트 농도가 동일 몰 비인 20 mM 망간 파이테이트(Mn-phytate) 용액을 이소플루란(isoflurane)으로 마취한 SD 렛드(wt = 300g)의 꼬리의 정맥에 5 mmol/kg를 투여하였다. 랫드는 전송(transmission) 및 수신(reception)을 위한 볼륨 코일(직경 7cm)이 설치된 자기공명영상기(9.4T BRUKER biospec)의 정중앙에 위치하도록 하였으며, 렛드의 호흡률에 따라 자기공명영상 신호를 획득하는 호흡동기화 SPGR을 이용하여 T1 강조영상을 측정하였다. 시퀀스 파라미터(sequence parameters)들은 아래와 같은 (TR/TE = 3.52/1.56 ms, FA = 90°, FOV = 70 matrix size = 256×256, 3 slices with a thickness of 1 mm, 32 signal averages)으로 실험을 수행하였다.
T1 강조 자기공명 영상은 도 13A에 나타내었다. 본 실험 결과로부터, 망간 파이테이트(Mn-phytate)가 밝은 조영제(positive contrast), 즉 T1 조영제로 작용하는 것을 증명하였다. 일반적으로, 현재 임상에서 널리 사용되는 세포외(extracellular) 자기공명영상 조영제인 Gd-DTAP는 주입 후 간에서 불과 수분 후에 그 농도가 크게 감소하는 것으로 알려져 있다. 즉 조영 효과가 짧은 시간에만 일어난다. 반면에, 본 발명의 조영제인 망간 파이테이트(Mn-phytate)는 주입 후 대략 40분만에 조영효과가 최대 (약 32% 향상)에 도달하며, 주입된 망간 파이테이트(Gd-phytate)는 약 24시간 후에 거의 제거되는 것으로 확인되었다. 이것은 또한 세포내(intracellular) 조영제로 알려진 SPIO보다는 훨씬 빨리 체내에서 제거된다는 사실을 확인하였다.
실시예 10:
9.4T 자기공명 영상기에서 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)를 정맥주사 후 렛드의 간에서 시간변화에 따른 자기공명영상 T1강조영상 신호변화
본 실시예는 생체에서 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)가 밝은 조영제(positive contrast), 즉 T1 조영제로 작용하는 특징과 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)가 간에 존재하는 거식세포인 쿠퍼셀(Kupffer cell)에 의해서 포식작용이 일어 난다는 사실을 증명하였다.
가도리니움 및 파이테이트 농도가 동일 몰 비인 20 mM 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate) 용액을 이소플루란(isoflurane)으로 마취한 SD 렛드(wt = 300g)의 꼬리의 정맥에 4 mmol/kg를 투여하였다. 랫드는 전송(transmission) 및 수신(reception)을 위한 볼륨 코일(직경 7cm)이 설치된 자기공명영상기(9.4T BRUKER biospec)기의 정중앙에 위치하도록 하였으며, 렛드의 호흡률에 따라 자기공명영상 신호를 획득하는 호흡동기화 fast spin echo (FSE)을 이용하여 T2 강조영상을 측정하였다. 예비 실험을 통하여, 고자장인 9.4T에서 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)의 R2(transverse relaxivity)가 R1보다 훨씬 강하였다. 그래서 본 실험에서는 T1대신, FSE를 이용하여 T2 강조영상을 측정하였다. 본 발명의 조영제인 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)가 T1 조영제, 즉 밝은(positive) 조영제로 작용하는 실험적 증거는 하기의 저 자장(1.5 T와 4.7 T) 자기공명영상기에서 증명하였다.
시퀀스 파라미터(sequence parameters)들은 아래와 같은 (TR/TE = 6000/12.8 ms, FA = 90°/180°, FOV = 65×65, matrix size = 256×192, 3 slices with a thickness of 1 mm, 2 signal averages)으로 실험을 수행하였다.
T2 강조 자기공명 영상은 도 14에 나타내었다. 본 실시예에서, 본 발명의 조영제인 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)는 주입 후 대략 24시간 후에 조영효과가 최대 (4 mmol/kg에서 약 26% 향상)에 도달하며(도 14C), 주입된 4 mmol/kg 는 약 5일 후에 초기의 간 영상으로 회복되었다(도 14D). 이것은 또한 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)가 간에 존재하는 거식세포인 쿠퍼셀(Kupffer cell)에 의해서 포식작용이 일어난다는 사실을 증명하였다. 즉 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate) 조영제를 생체에 주입 시 비교적 오랜 시간 동안 간에 서서히 축적되어서 T2 강조영상이 증가되었다는 것을 나타내었다. 또한 정맥 투여 또는 피하 투여 시 정상 기관에 섭취되는 자기공명영상 조영제로서 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)는 임상적으로 매우 유용할 것으로 사료된다. 거식세포에 의한 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)의 생체 내 포식작용은 관찰할 수 있는 조영제는 동맥경화, 장기이식, 다양한 경화증, 그리고 다양한 암 전이를 판별하는 센티널 림프(sentinel lymph node)과 같은 다양한 질병을 진단하는데 응용될 수 있다.
실시예
11: 1.5 T와 4.7 T 자기공명
영상기에서
T1
조영제로서의
가도리니움
파이테이트(
Gd-phytate)를
정맥주사 후
렛드의
간에서 시간변화에 따른 자기공명영상 T1강조영상 신호변화
가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)가 낮은 자장에서 밝은 조영제(positive contrast agent)로 작용하는 조영제 효과를 증명하기 위하여, 낮은 자장의 자기공명영상기(Siemens Avanto system 1.5T 와 Bruker Biospec system 4.7T)에서 SPGR을 이용하여 T1 강조영상을 분석하였다.
시퀀스 파라미터(sequence parameters)들은 아래와 같은 (TR/TE = 400/8 ms, FA = 90°, FOV = 70×70, matrix size = 256×256, 11 slices with a thickness of 3 mm, 3 signal averages for 1.5 T, and TR/TE =3.3/1.2 ms, FA = 90°, FOV = 70×70, matrix size = 192×128, 3 slices with a thickness of 1 mm, 32 signal averages for 4.7 T)으로 실험을 수행하였다.
T1 강조 자기공명 영상은 도 15에 나타내었다. 본 실험 결과로부터, 1.5 T와 4.7 T 자기공명 영상기에서 4 mmol/kg의 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)를 주입 함으로서 렛드의 정상 간에서 T1을 짧게 하였으며, 자기공명영상 신호를 증가시키는 T1 조영제로 작용한다는 사실을 증명하였다. 이러한 사실은 정맥 투여한 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)가 간에 존재하는 거식세포인 쿠퍼셀(Kupffer cell)에 의해서 혈중에서 직접적으로 포식작용에 의해서 흡수 된다는 사실을 증명 하였다. 쿠퍼셀(Kupffer cell) 내에서 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)는 높은 T1 이완성을 가지며, 이러한 낮은 자장에서 국소적으로 강한 조영효과를 나타낸다는 것을 나타내었다.
본 발명에 인용된 참조문헌은 하기와 같다.
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도 1A와 1B는 파이테이트와 가도리니움(Gd3+) 이온에 대한 결합력, 결합 개수, 결합 형태를 열역학적으로 분석하는 'isothermal titration calorimetry (ITC)' 분석 결과이다. 도 1A는 가도리니움(Gd3+) 이온이 파이테이트의 두 개의 인산그룹의 산소분자 사이에 결합하여 가도리니움 파이테이트 복합체(Gd-phytate complexes)를 설명하는 모식도이다. 도 1B는 가도리니움(Gd3+) 이온이 파이테이트에 결합하는 ITC 분석결과이며, 도 1B의 상단은 0.5 mM 파이테이트 용액(pH 7.0, 37℃)에 10 mM 가도리니움(Gd3+) 이온을 1 ml씩 간헐적으로 주입하여 열역학적 적정(calorimetric titration)을 나타내며, 도 1B의 하단은 총 파이테이트 용액당 가도리니움(Gd3+) 이온이 몇 몰 비(molar ratio)로 결합하는지에 대한 열역학적 변화를 나타내는 결과이다. 붉은색 실선은 파이테이트 분자에 가도리니움 이온이 수학적으로 두 세트의 다른 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 결과이다.
도 2는 파이테이트와 망간(Mn2+) 이온에 대한 결합력, 결합 개수, 결합 형태를 열역학적으로 분석하는 'isothermal titration calorimetry (ITC)' 분석 결과이다. 도 2는 망간(Mn2+) 이온이 파이테이트에 결합하는 ITC 분석결과이며, 도 2의 상단은 0.5 mM 파이테이트 용액(pH 7.0, 37℃)에 15 mM 망간(Mn2+) 이온을 1.5 ml씩 간헐적으로 주입하여 열역학적 적정(calorimetric titration)을 나타내며, 도 2의 하단은 총 파이테이트 용액당 망간(Mn2+) 이온이 몇 몰 비 (molar ratio)로 결합하는지에 대한 열역학적 변화를 나타내는 결과이다. 붉은색 실선은 파이테이트 분자에 망간(Mn2+) 이온이 수학적으로 연속적인(sequential) 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 결과이다.
도 3는 파이테이트와 칼슘(Ca2+) 이온에 대한 결합력, 결합 개수, 결합 형태를 열역학적으로 분석하는 'isothermal titration calorimetry (ITC)' 분석 결과이다. 도3의 상단은 0.5 mM 파이테이트 용액(pH 7.0, 37℃)에 15 mM 칼슘(Ca2+) 이온을 1.5 ml씩 간헐적으로 주입하여 열역학적 적정(calorimetric titration)을 나타내며, 도 3의 하단은 총 파이테이트 용액당 칼슘(Ca2+) 이온이 몇 몰 비(molar ratio)로 결합하는지에 대한 열역학적 변화를 나타내는 결과이다. 붉은색 실선은 파이테이트 분자에 칼슘(Ca2+) 이온이 수학적으로 두 세트의 다른 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 결과이다.
도 4는 파이테이트와 마그네슘(Mg2+) 이온에 대한 결합력, 결합 개수, 결합 형태를 열역학적으로 분석하는 'isothermal titration calorimetry (ITC)' 분석 결과이다. 도 4의 상단은 0.5 mM 파이테이트 용액(pH 7.0, 37℃)에 30 mM 마그네슘(Mg2+)이온을 1.5 ml씩 간헐적으로 주입하여 열역학적 적정(calorimetric titration)을 나타내며, 도 4의 하단은 총 파이테이트 용액당 마그네슘(Mg2+)이온이 몇 몰 비(molar ratio)로 결합하는지에 대한 열역학적 변화를 나타내는 결과이다. 붉은색 실선은 파이테이트 분자에 마그네슘(Mg2+) 이온이 수학적으로 한 세트의 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 결과이다.
도 5는 이노시톨 포스페이트-1,3,4-삼인산(inositol-1,3,4-trisphosphate)과 가도리니움(Gd3+) 이온에 대한 결합력, 결합 개수, 결합 형태를 열역학적으로 분석하는 'isothermal titration calorimetry (ITC)' 분석 결과이다. 도 5의 상단은 0.2 mM 이노시톨 포스페이트-1,3,4-삼인산(inositol-1,3,4-trisphosphate) 용액(10 mM HEPES pH 7.0, 25℃)에 5 mM 가도리니움(Gd3+) 이온을 1.5 ml씩 간헐적으로 주입하여 열역학적 적정(calorimetric titration)을 나타내며, 도 5의 하단은 총 이노시톨 포스페이트-1,3,4-삼인산 용액당 가도리니움(Gd3+) 이온이 몇 몰 비(molar ratio)로 결합하는지에 대한 열역학적 변화를 나타내는 결과이다. 붉은색 실선은 이노시톨 포스페이트-1,3,4-삼인산 분자에 가도리니움(Gd3+) 이온이 수학적으로 두 세트의 다른 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 결과이다.
도 6는 이노시톨 포스페이트-1,4,5-삼인산(inositol-1,4,5-trisphosphate)과 가도리니움(Gd3+) 이온에 대한 결합력, 결합 개수, 결합 형태를 열역학적으로 분석하는 'isothermal titration calorimetry (ITC)' 분석 결과이다. 도 6의 상단은 0.2 mM 이노시톨 포스페이트-1,4,5-삼인산(inositol-1,4,5-trisphosphate) 용액(10 mM HEPES pH 7.0, 25℃)에 5 mM 가도리니움(Gd3+) 이온을 1.5 ml씩 간헐적으로 주입하여 열역학적 적정(calorimetric titration)을 나타내며, 도 6의 하단은 총 이노시톨 포스페이트-1,4,5-삼인산 용액당 가도리니움(Gd3+) 이온이 몇 몰 비(molar ratio)로 결합하는지에 대한 열역학적 변화를 나타내는 결과이다. 붉은색 실선은 이노시톨 포스페이트-1,4,5-삼인산 분자에 가도리니움(Gd3+) 이온이 수학적으로 두 세트의 다른 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 결과이다.
도 7는 이노시톨 포스페이트-1,3,4,5-사인산(inositol-1,3,4,5-tetraphosphate)과 가도리니움(Gd3+) 이온에 대한 결합력, 결합 개수, 결합 형태를 열역학적으로 분석하는 'isothermal titration calorimetry (ITC)' 분석 결과이다. 도 7의 상단은 0.2 mM 이노시톨 포스페이트-1,3,4,5-사인산(inositol-1,3,4,5-tetraphosphate) 용액(10 mM HEPES pH 7.0, 25℃)에 5 mM 가도리니움(Gd3+) 이온을 1.5 ml씩 간헐적으로 주입하여 열역학적 적정(calorimetric titration)을 나타내며, 도 7의 하단은 총 이노시톨 포스페이트-1,3,4,5-사인산 용액당 가도리니움(Gd3+) 이온이 몇 몰 비(molar ratio)로 결합하는지에 대한 열역학적 변화를 나타내는 결과이다. 붉은색 실선은 이노시톨 포스페이트-1,4,5-삼인산 분자에 가도리니움(Gd3+) 이온이 수학적으로 두 세트의 다른 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 결과이다.
도 8은 EDTA와 가도리니움(Gd3+) 이온에 대한 결합력, 결합 개수, 결합 형태를 열역학적으로 분석하는 'isothermal titration calorimetry (ITC)' 분석 결과이다. 도 8의 상단은 0.4 mM EDTA 용액(10 mM MES pH 5.6, 25℃)에 5 mM 가도리니움(Gd3+) 이온을 1.5 ml씩 간헐적으로 주입하여 열역학적 적정(calorimetric titration)을 나타내며, 도 8의 하단은 총 EDTA 용액당 가도리니움(Gd3+) 이온이 몇 몰 비(molar ratio)로 결합하는지에 대한 열역학적 변화를 나타내는 결과이다. 붉은색 실선은 EDTA 분자에 가도리니움(Gd3+) 이온이 수학적으로 한 세트의 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 결과이다.
도 9는 다이에틸렌 트리아민 펜타아세틱산(diethylene triamine pentaacetic acid, DTPA)과 가도리니움(Gd3+) 이온에 대한 결합력, 결합 개수, 결합 형태를 열역학적으로 분석하는 'isothermal titration calorimetry (ITC)' 분석 결과이다. 도 9의 상단은 0.2 mM DTPA 용액(10 mM sodium acetate pH 4.8, 25℃)에 5 mM 가도리니움(Gd3+) 이온을 1.5 ml씩 간헐적으로 주입하여 열역학적 적정(calorimetric titration)을 나타내며, 도 9의 하단은 총 DTPA 용액당 가도리니움(Gd3+) 이온이 몇 몰 비 (molar ratio)로 결합하는지에 대한 열역학적 변화를 나타내는 결과이다. 붉은색 실선은 DTPA 분자에 가도리니움(Gd3+) 이온이 수학적으로 두 세트의 다른 결합 형태로 최적의 결합력을 나타내는 결과이다.
도 10는 다이에틸렌 트리아민 펜타아세틱산(diethylene triamine pentaacetic acid, DTPA)과 가도리니움(Gd3+) 이온에 대한 결합력, 결합 개수, 결합 형태를 열역학적으로 분석하는 'isothermal titration calorimetry (ITC)' 분석 결과이다. 도 10의 상단은 0.2 mM DTPA 용액(10 mM Tris pH 7.8, 25℃)에 5 mM 가도리니움(Gd3+) 이온을 1.5 ml씩 간헐적으로 주입하여 열역학적 적정(calorimetric titration)을 나타내며, 도 10의 하단은 총 DTPA 용액당 가도리니움(Gd3+) 이온이 몇 몰 비(molar ratio)로 결합하는지에 대한 열역학적 변화를 나타내는 결과이다. 붉은색 실선은 DTPA 분자에 가도리니움(Gd3+) 이온이 수학적으로 두 세트의 다른 결합형태로 최적의 결합력을 나타내는 결과이다.
도 11A와 도 11B는 9.4 T 자기공명 영상기에서 다양한 농도의 망간(Mn2+), 가도리니움 디티피에이(Gd-DTPA), 망간-파이테이트(Mn-phytate), 가도리니움-파이테이트(Gd-phytate)에 대한 이완율 (relaxation rates, R1) 측정을 나타낸 결과이다. 도 11A는 24개의 다양한 농도의 망간(Mn2+), 가도리니움 디티피에이(Gd-DTPA), 망간-파이테이트(Mn-phytate), 가도리니움-파이테이트(Gd-phytate)에 대한 펜텀(phantom)들의 3000ms에서 반복회복시간 (inversion recovery time, T1)에서의 자기공명영상 결과이다. 도 11B는 상기의 펜텀(phantom)들에 대한 각각의 이완율 (relaxation rates)을 초(sec)단위로 나타낸 결과이다. 상기 시험 예에서 망간-파이테이트(Mn-phytate), 가도리니움-파이테이트(Gd-phytate)에 대한 이완율 (relaxation rates, R1)은 망간(Mn2+) 또는 가도리니움 디티피에이(Gd-DTPA)보다 훨씬 높게 나타났다.
도 12A와 12B는 RAW 264.7 거식세포주(macrophage cell line)에서 다양한 농도의 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)를 처리 후 9.4 T 자기공명 영상기에서 자기공명 영상 변화를 측정한 결과이다. 도 12A는 RAW 264.7 거식세포주(macrophage cell line)에서 0, 0.125, 0.25, 0.375, 0.5 및 0.75 mM의 가도리니움 파이테이트 (Gd-phytate)를 3시간 처리 후 거식세포를 이용한 펜텀 (phantom)에 대한 T1-강조 자기공명 영상 결과이다. 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate) 농도 증가에 따라 자기공명영상 신호의 밝기가 확연히 증가하였다. 도 12B는 가도리니움 파이테이트 (Gd-phytate)가 생체 내에서 거식세포에 섭취/흡입되는 작용기전을 설명하는 모식도이다.
도 13A, 13B, 13C는 9.4 T 자기공명 영상기에서 망간 파이테이트(Mn-phytate)를 정맥주사 후 렛드의 간에서 시간변화에 따른 자기공명영상 신호변화(T1)를 나타내는 결과이다. 렛드의 꼬리에 5 mmol/kg의 망간 파이테이트(Mn-phytate)를 정맥주사 전 (도 13A), 도 13B는 정맥주사 후 40분, 도 13C는 24시간 후에 렛드 간에서 자기공명영상 신호변화를 나타내는 결과이다. 망간 파이테이트(Mn-phytate) 조영제를 주입 후 약 40분이 경과한 간(도 13B)과 조영제를 주입 전 간(도 13A)을 비교시 자기공명 영상 신호가 약 32% 향상된 것으로 나타났다. 조영제 주입 24시간(도 13C) 후 간은 조영제 주입 전 간과 동일한 신호를 나타내었다. 이는 주입된 조영제가 24시간 내에 렛드 간에서 사라지는 것으로 사료된다.
도 14A, 14B, 14C는 9.4 T 자기공명 영상기에서 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)를 정맥주사 후 렛드의 간에서 시간변화에 따른 T2강조 자기공명영상 신호변화를 나타내는 결과이다. 렛드의 꼬리에 4 mmol/kg의 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)를 정맥주사 전 (도 14A), 도 14B는 정맥주사 후 3시간, 도 14C는 24시간 후, 도 14D는 5일 후에 렛드 간에서 자기공명영상 신호변화를 나타내는 결과이다. 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate) 조영제를 렛드 꼬리에 정맥 주사 후 약 3시간 경과한 간(도 14B)과 약 24시간 경과한 간(도 14C)에서 조영제를 주입 전 간(도 14A)에 비해서 자기공명 영상 신호가 각각 약 14%, 32% 향상된 것으로 나타났다. 그러나, 조영제 주입 5일 후에 간(도 14D)에서 조영제 주입 전 간(도 14A)과 동일한 신호를 나타내었다. 이는 주입된 조영제가 대략 5일 후 렛드 간에서 사라지는 것으로 사료된다.
도 15A, 도 15B, 도 15,C, 도 15D는 1.5 T와 4.7 T 자기공명기에서 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)를 정맥주사 후 렛드의 간에서 시간변화에 따른 T1강조 자기공명영상 신호변화를 나타내는 결과이다. 렛드의 꼬리에 4 mmol/kg의 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)를 정맥주사 전(도 15A, 도 15C)과 정맥주사 후(도 15B, 도 15D)에 렛드 간에서 T1강조 자기공명영상 신호변화를 나타내는 결과이다. 가도리니움 파이테이트(Gd-phytate)가 낮은 자장의 자기공명영상기에서 밝은 조영 제(positive contrast agent)로 작용하는 효과를 나타낸다는 것을 증명한 결과이다.
Claims (26)
- Cr3+, Co2+, Mn2+, Ni2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+，Cu3+，La3+, Gd3+, Ce3+, Tb3+, Pr3+, Dy3+, Nd3+, Ho3+, Pm3+, Er3+, Sm3+, Tm3+, Eu3+, Yb3+, Lu3+, 11C, 13N, 18F, 123I, 124I, 125I, 99mTc, 95Tc, 111In, 76Br, 62Cu, 64Cu, 67Ga 및 68Ga로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 상자성 물질, 및 Ca2+와 결합된 파이테이트, 이노시톨 포스페이트 또는 포스파티딜 이노시톨 포스페이트를 포함하는 자기공명영상 조영제．
- 제1항에 있어서, 상기 상자성 물질은 Fe2+ 또는 Fe3+인 것을 특징으로 하는 자기공명영상 조영제.
- 제1항에 있어서, 상기 파이테이트는 이노시톨-1,2,3,4,5,6-육인산(d-myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate)인 것을 특징으로 하는 자기공명영상 조영제.
- 제1항에 있어서, 상기 이노시톨 포스페이트는 이노시톨-1,2,3,4,5-오인산(d-myo-inositol-1,2,3,4,5-pentaphosphate), 이노시톨-1,3,4,5-사인산(d-myo-inositol-1,3,4,5-tetraphosphate), 이노시톨-1,4,5-삼인산(d-myo-inositol-1,4,5-trisphosphate) 또는 이노시톨-1,3,4-삼인산(d-myo-inositol-1,3,4-trisphosphate)인 것을 특징으로 하는 자기공명영상 조영제.
- 제1항에 있어서, 상기 포스파티딜 이노시톨 포스페이트는 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate)인 것을 특징으로 하는 자기공명영상 조영제.
- 제1항에 있어서, 상기 자기공명영상 조영제는 거식세포(macrophage)에 의해 흡수되는 세포특이적 조영제인 것을 특징으로 하는 자기공명영상 조영제.
- 제1항에 있어서, 상기 자기공명영상 조영제는 티시 파이테이트(Tc-phytate)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자기공명영상 조영제.
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- 제1항에 있어서, 상기 자기공명명상 조영제는 생체의 장기 진단 시 체내의 조직 근처에서 T1 또는 T2 이완 시간(relaxation time)을 줄여서 조영 효과를 높여주는 것을 특징으로 하는 자기공명영상 조영제.
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- 제1항에 있어서, 상기 파이테이트, 이노시톨 포스페이트 또는 포스파티딜 이노시톨 포스페이트의 pH는 4 내지 9인 것을 특징으로 하는 자기공명영상 조영제.
- 제14항에 있어서, 상기 파이테이트, 이노시톨 포스페이트 또는 포스파티딜 이노시톨 포스페이트의 pH는 6 내지 8인 것을 특징으로 하는 자기공명영상 조영제.
- 제1항에 있어서, 상기 상자성 물질과 상기 파이테이트, 이노시톨 포스페이트 또는 포스파티딜 이노시톨 포스페이트의 몰 비는 0.5 내지 3.0인 것을 특징으로 하는 자기공명영상 조영제.
- 제1항에 있어서, 상기 파이테이트, 이노시톨 포스페이트 또는 포스파티딜 이노시톨 포스페이트와 상기 상자성 물질의 몰 비는 0.5 내지 3.0인 것을 특징으로 하는 자기공명영상 조영제.
- 제1항에 있어서, 상기 자기공명영상 조영제는 상자성 물질과 결합된 파이테이트, 이노시톨 포스페이트 또는 포스파티딜 이노시톨 포스페이트와 Ca2+가 동일한 몰 비로 첨가되는 자기공명영상 조영제.
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