KR101137681B1 - 형광 검출 방법 및 형광 검출 장치 - Google Patents

형광 검출 방법 및 형광 검출 장치 Download PDF

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Abstract

레이저 광을 조사함으로써 생체 물질 등의 측정 대상물이 발하는 형광을 검출할 때, 종래에 비해 정확하게 형광 완화 시정수를 산출하는 형광 검출 방법 및 형광 검출 장치를 제공한다. 소정의 주파수의 변조 신호로 광 강도를 변조한 레이저 광의 조사 위치를 측정 대상물이 통과할 때, 수광 수단이 수광하는 형광의 제1의 형광 신호를 수집한다. 또한, 측정 대상물이 레이저 광의 조사 위치를 통과한 후의, 측정 대상물이 레이저 광의 조사 위치에 없는 상태에 있어서, 수광 수단이 수광하는 형광의 제2의 형광 신호를 수집한다. 수집한 제1의 형광 신호와 제2의 형광 신호를 이용하여, 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호의, 레이저 광의 변조 신호에 대한 위상차 정보를 구하고, 이 구한 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호의 위상차 정보로부터 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 완화 시정수를 구한다.

Description

형광 검출 방법 및 형광 검출 장치{FLUORESCENCE DECTING METHOD AND FLUORESCENCE DETECTING DEVICE}
본 발명은, 세포나 세균 등의 측정 대상물을 버퍼액(buffer solution)에 포함시켜 흐르는 유체의 흐름에 대해 레이저 광을 조사함으로써 측정 대상물이 발하는 형광을 검출하는 형광 검출 방법 및 형광 검출 장치에 관한 것이다.
의료, 생물 분야에서 이용되는 플로우 사이토미터(flow cytometer)에는 레이저 광을 조사함으로써 측정 대상물의 형광 색소로부터의 형광을 수광하여 측정 대상물의 종류를 식별하는 형광 검출 장치가 조립되어 넣어져 있다.
구체적으로는, 플로우 사이토미터는, 세포, DNA, RNA, 효소, 단백질 등의 생체 물질을 측정 대상물로서 버퍼액에 포함하여 구성되는 혼탁액을 형광 시약으로 라벨화 하고, 압력을 주어 매초 10m 이내 정도의 속도로 관로 내를 흐르는 시스액(sheath liquid)에 측정 대상물을 흘려 라미나시스 플로우(lamina sheath flow)를 형성한다. 이 플로우 중의 측정 대상물에 레이저 광을 조사함으로써 생체 물질 중의 형광 색소가 발하는 형광을 수광하고, 이 형광을 라벨(label)로서 식별함으로써 생체 물질을 식별하는 것이다.
이 플로우 사이토미터(flow cytometer)에서는, 예를 들면, 세포 내의 DNA, RNA, 효소, 단백질 등의 세포내 상대량을 계측하고, 또 이들의 기능을 단시간에 해석할 수가 있다. 또, 특정의 타입의 세포나 염색체를 형광에 의해 식별하고, 식별한 세포나 염색체만을 산 상태로 단시간에 선별 수집하는 셀?소터(cell sorter) 등이 이용된다.
이것의 사용에 있어서는 보다 많은 측정 대상물을 단시간에 형광의 정보로부터 식별하는 것이 요구되고 있다.
하기 특허 문헌 1에는 형광 검출 장치가 개시되어 있다. 이 형광 검출 장치에서는, 레이저 광원부로부터 출사되는 레이저 광의 강도를 시간 변조시키고, 이 레이저 광을 생체 물질 등에 조사한다. 이 때 시료로부터 발하는 형광을 수신하여, 레이저 광의 변조 신호에 대한 위상차 정보를 이용하여 생체 물질 등이 발하는 형광의 형광 완화 시간을 산출한다. 이에 의해 다수의 형광의 종류를 식별할 수가 있고, 특히 단시간에 효율적으로 형광 신호를 식별할 수가 있게 되어 있다.
<특허 문헌 1> 일본국 특허공개 2006-226698호 공보
상기 특허 문헌 1의 장치는, 생체 물질 등이 발하는 형광의 형광 강도가 강한 경우, 수광한 형광의 종류를 정확하게 식별할 수가 있지만, 생체 물질 등이 발하는 형광의 발광 영역이 한정되고, 게다가 형광 강도가 비교적 약한 경우, 반드시 정확한 식별을 할 수 없다고 하는 문제가 생긴다.
예를 들면, 미리 형광 완화 시간이 기존의 형광 색소가 발하는 형광을 측정했을 경우, 형광 강도가 약할 때, 구해진 형광 완화 시간이 기존의 형광 완화 시간과 어긋남이 생기기 때문에 정확한 식별을 할 수 없다고 하는 문제가 생긴다. 이 외에 생체 물질이 레이저 광의 조사 위치를 통과할 때마다 형광 완화 시정수를 구하고, 구한 복수의 형광 완화 시정수를 가로축에 취하고, 세로축에 그 빈도를 취한 막대그래프에 있어서, 막대그래프를 형성하는 산의 형상이 넓게 되어 복수의 형광을 정확하게 식별할 수가 없다.
현재 생체 물질 중의 지극히 한정된 좁은 국소 영역을 형광의 발광 영역으로 하는 생체 물질을 취급하는 일이 많아지고 있다. 이 경우, 생체 물질이 발하는 형광의 발광 영역이 작아지므로 형광 강도도 약해진다. 이 때문에 상술한 것처럼 형광의 정확한 식별이 더욱 곤란하게 되고 있다.
그래서, 본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해서 레이저 광을 조사함으로써 생체 물질 등의 측정 대상물이 발하는 형광을 검출할 때, 종래에 비해 정확하게 형광 완화 시정수를 산출하는 형광 검출 방법 및 형광 검출 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 측정 대상물을 버퍼액에 포함시켜 흐르는 유체의 흐름에 대해 설정된 주파수의 변조 신호를 이용하여 광 강도를 변조한 레이저 광을 조사함으로써, 통과하는 측정 대상물이 발하는 형광을 수광 수단이 수광하여 형광을 검출할 때, 레이저 광의 조사 위치를 측정 대상물이 통과할 때, 상기 수광 수단이 수광하는 형광의 제1의 형광 신호를 수집하는 제1의 스텝과, 상기 측정 대상물이 상기 레이저 광의 조사 위치를 통과한 후의, 상기 측정 대상물이 레이저 광의 조사 위치에 없는 상태에 있어서, 상기 수광 수단이 수광하는 형광의 제2의 형광 신호를 수집하는 제2의 스텝과, 상기 제1의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제1의 위상차 정보를 상기 제2의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제2의 위상차 정보를 이용하여 조정함으로써, 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제3의 위상차 정보를 구하고, 이 구한 제3의 위상차 정보로부터 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 완화 시정수를 구하는 제3의 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 형광 검출 방법을 제공한다.
이 때, 상기 제1의 위상차 정보 및 제2의 위상차 정보는, 상기 변조 신호와 동상의 신호 성분의 값과, 상기 변조 신호에 대해 90° 위상차가 있는 신호 성분의 값에 의해 구성되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 제3의 위상차 정보는, 상기 제1의 위상차 정보의 데이터로부터 상기 제2의 위상차 정보의 데이터를 각 성분마다 공제한 데이터인 것이 바람직하다.
또, 본 발명은 측정 대상물을 버퍼액에 포함시켜 흐르는 유체의 흐름에 대해 레이저 광을 조사함으로써 측정 대상물이 발하는 형광을 검출하는 형광 검출 장치로서, 설정된 주파수의 변조 신호를 이용하여 광 강도를 변조한 레이저 광을 상기 흐름을 향해 출사하는 레이저 광원부와, 레이저 광의 조사에 의해 발하는 형광의 형광 신호를 출력하는 수광부와, 상기 측정 대상물이 레이저 광의 조사 위치를 통과하는 타이밍을 검지하는 타이밍 검출부와, 상기 검지한 타이밍에 따라서, 상기 수광부가 수광하는 형광의 제1의 형광 신호를 수집하고, 또한 상기 측정 입자가 레이저 광의 조사 위치를 통과 후의 레이저 광의 조사 위치에 없는 상태에 있어서, 상기 수광부가 수광하는 형광의 제2의 형광 신호를 수집하고, 상기 제1의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제1의 위상차 정보를 상기 제2의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제2의 위상차 정보를 이용하여 조정함으로써, 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제3의 위상차 정보를 구하고, 이 구한 제3의 위상차 정보로부터 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 완화 시정수를 구하는 처리?분석 수단을 가지는 것을 특징으로 하는 형광 검출 장치를 제공한다.
이 때, 상기 제1의 위상차 정보 및 제2의 위상차 정보는, 상기 변조 신호와 동상의 신호 성분의 값과, 상기 변조 신호에 대해 90° 위상차가 있는 신호 성분의 값에 의해 구성되는 데이터인 것이 바람직하다. 또한, 상기 처리?분석 수단은, 상기 제1의 위상차 정보의 데이터로부터 상기 제2의 위상차 정보의 데이터를 각 성분마다 공제함으로써 상기 제3의 위상차 정보의 데이터를 구하는 것이 바람직하다.
본 발명의 형광 검출 방법 및 형광 검출 장치는, 측정 대상물이 발하는 형광뿐만 아니라, 측정 대상물이 레이저 광의 조사 위치를 통과한 후의 버퍼액이 발하는 형광에 대해서도 형광 검출의 계측 대상으로 한다. 이것은 측정 대상물의 형광이 비교적 약한 경우, 버퍼액 자체가 발하는 형광을 무시할 수 없기 때문이다. 측정 대상물이 레이저 광의 조사 위치의 통과시에 있어서 계측되는 형광에는, 측정 대상물이 발하는 형광 외에 버퍼액 자체가 발하는 형광이 포함되어 있지만, 본 발명에서는 측정 대상물이 레이저 광의 조사 위치를 통과한 후의 버퍼액이 발하는 형광에 대해서도 형광의 계측을 행하므로, 이 계측 결과를 이용하여 측정 대상물이 발하는 형광의 위상차 정보를 정확하게 구할 수가 있다. 이에 의해 종래에 비해 정확하고 신속히 형광 완화 시정수를 산출할 수가 있다.
도 1은 본 발명의 형광 검출 장치를 이용한 플로우 사이토미터의 개략 구성도이다.
도 2는 본 발명의 형광 검출 장치에 이용되는 레이저 광원부의 일례를 나타내는 개략 구성도이다.
도 3은 본 발명의 형광 검출 장치에 이용되는 수광부의 일례를 나타내는 개략 구성도이다.
도 4는 본 발명의 형광 검출 장치에 이용되는 제어?처리부의 일례를 나타내는 개략 구성도이다.
도 5는 도 4에 나타내는 제어?처리부의 IQ 혼합기를 설명하는 도이다.
도 6은 본 발명의 형광 검출 장치로 행하는 형광 완화 시정수의 산출 방법을 설명하는 도이다.
도 7은 형광 강도의 시간적 변화의 개략의 모습을 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 형광 검출 방법을 실시하는 본 발명의 형광 검출 장치를 매우 적합하게 이용한 플로우 사이토미터를 기초로 하여 상세하게 설명한다.
도 1은 강도 변조한 레이저 광에 의한 형광 검출 장치를 이용한 플로우 사이토미터(10)의 개략 구성도이다. 이하 설명하는 실시 형태에서는, 버퍼액에 현탁한 형광 색소를 가지는 생체 물질 M을 측정 대상물로서 설명하지만, 생체 물질 M 이외에 소정의 형광 색소를 구비하고, 생체 물질 M과 생체 결합을 하는 마이크로 비즈(micro-beads)를 생체 물질 M과 함께 버퍼액에 포함시켜 생체 물질 M 및 마이크로 비즈를 측정 대상물로 할 수도 있다.
플로우 사이토미터(10)는, 레이저 광을 조사함으로써 형광을 발하는 생체 물질 M을 버퍼액에 현탁하여 구성된 시료(12)에 조사하고, 시료(12) 중의 생체 물질 M이 구비하는 형광 색소가 발하는 형광의 형광 신호를 검출하여 신호 처리를 하는 신호 처리 장치(20)와, 신호 처리 장치(20)에서 얻어진 처리 결과로부터 시료(12) 중의 측정 대상물의 분석을 행하는 분석 장치(컴퓨터)(80)를 가진다.
신호 처리 장치(20)는, 레이저 광원부(22)와, 수광부(24, 26)와, 레이저 광원부(22)로부터의 레이저 광을 소정의 변조 주파수로 강도 변조시키는 변조 신호를 생성하기 위해서 제어하는 제어부, 및 시료(12)로부터의 형광 신호를 식별하는 신호 처리부를 포함하는 제어?처리부(28)와, 고속류를 형성하는 시스액에, 생체 물질 M을 포함한 버퍼액으로 이루어지는 시료(12)를 흘려 플로우 셀을 형성하는 관로(30)를 가진다.
관로(30)의 출구에는 회수 용기(32)가 설치되어 있다. 플로우 사이토미터(10)에는 레이저 광의 조사에 의해 단시간 내에 시료(12) 중의 생체 물질 M을 식별하고 분리하기 위한 셀?소터를 배치하여 따로따로 회수 용기에 분리하도록 구성할 수도 있다.
레이저 광원부(22)는, 파장이 다른 3개의 레이저 광, 예를 들면 λ1=405㎚, λ2=533㎚ 및 λ3=650㎚ 등의 레이저 광을 출사하는 부분이다. 레이저 광은, 관로(30) 중의 소정의 위치에 수렴하도록 렌즈계가 설치되고, 이 수렴 위치에서 시료(12)의 측정점을 형성한다. 이 측정점이, 본 발명에 있어서의 레이저 광의 조사 위치에 대응한다.
도 2는 레이저 광원부(22)의 구성의 일례를 나타내는 도이다.
레이저 광원부(22)는, 350㎚~800㎚의 가시광선 대역의 파장을 가지고 강도 변조한 레이저 광을 출사하는 부분이다.
레이저 광원부(22)는, 주로 적색의 레이저 광 R을 CW(연속파) 레이저 광으로서 출사하고, 이 CW 레이저 광의 강도를 소정의 주파수로 변조하는 R광원(22r)과, 녹색의 레이저 광 G를 CW(연속파) 레이저 광으로서 출사하고, 이 CW 레이저 광의 강도를 소정의 주파수로 변조하는 G광원(22g)과, 청색의 레이저 광 B를 CW(연속파) 레이저 광으로서 출사하고, 이 CW 레이저 광의 강도를 소정의 주파수로 변조하는 B광원(22b)을 가진다.
또한, 레이저 광원부(22)는, 특정의 파장 대역의 레이저 광을 투과하고, 다른 파장 대역의 레이저 광을 반사하는 다이크로익 미러(dichroic mirror)(23a1, 23a2)와, 레이저 광 R, G 및 B로 이루어지는 레이저 광을 관로(30) 중의 측정점에 수렴시키는 렌즈계(23c)와, R광원(22r), G광원(22g) 및 B광원(22b)의 각각을 구동하는 레이저 드라이버(laser driver)(34r, 34g, 34b)와, 공급된 신호를 레이저 드라이버(34r, 34g, 34b)에 분배하는 파워 스플리터(power splitter)(35)를 가진다.
이들의 레이저 광을 출사하는 광원으로서 예를 들면 반도체 레이저가 이용된다.
레이저 광은, 예를 들면 5~100㎽정도의 출력이다. 한편, 레이저 광의 강도를 변조하는 주파수(변조 주파수)는, 그 주기가 형광 완화 시정수에 비해 약간 길다, 예를 들면 10~50㎒이다.
다이크로익 미러(dichroic mirror)(23a1)는, 레이저 광 R을 투과하고, 레이저 광 G를 반사하는 미러이고, 다이크로익 미러(23a2)는, 레이저 광 R 및 G를 투과하고, 레이저 광 B를 반사하는 미러(mirror)이다.
이 구성에 의해 레이저 광 R, G 및 B가 합성되어 측정점의 시료(12)를 조사하는 조사 광으로 된다.
R광원(22r), G광원(22g) 및 B광원(22b)은, 레이저 광 R, G 및 B가 형광 색소를 여기하여 특정의 파장 대역의 형광을 발하도록 미리 정해진 파장 대역에서 발진한다. 레이저 광 R, G 및 B에 의해 여기되는 형광 색소는 측정하려고 하는 생체 물질 M에 부착되어 있고, 생체 물질 M이 측정 대상물로서 관로(30)를 통과할 때, 측정점에서 레이저 광 R, G 및 B의 조사를 받아 특정의 파장에서 형광을 발한다. 또한, 생체 물질 M이 측정점을 통과한 후에도, 바람직하게는 통과한 직후에도, 생체 물질 M이 없는 상태로 버퍼액에 대해 일정기간 레이저 광을 조사하고, 버퍼액이 발하는 형광의 검출을 행한다.
수광부(24)는, 관로(30)를 사이에 두고 레이저 광원부(22)와 대향하도록 배치되어 있고, 측정점을 통과하는 생체 물질 M에 의해 레이저 광이 전방 산란함으로써, 생체 물질 M이 측정점을 통과하는 취지의 검출 신호를 출력하는 광전 변환기를 구비한다. 이 수광부(24)로부터 출력되는 신호는, 제어?처리부(28)에 공급되고, 제어?처리부(28)에 있어서 생체 물질 M이 관로(30) 중의 측정점을 통과하는 타이밍(timing)을 알리는 트리거(trigger) 신호로서 이용된다.
또, 생체 물질 M이 측정점을 통과하는 시간을 T로 하고, 생체 물질 M의 평균 직경을 D, 플로우 셀(flow cell)을 흐르는 생체 물질 M의 속도를 V로 하고, 레이저 광의 측정점에 있어서의 스폿(spot) 폭을 W로 했을 때, 시간 T는, T=(D+W)/V가 된다. 이 시간 T는 기존의 값이다. 신호 처리 장치(20)는, 수광부(24)에서 생성되는 트리거(trigger) 신호를 계측 개시의 타이밍으로 하여 형광의 검출을 개시하고, 시간 T의 2배의 시간 2?T의 동안 계측을 속행한다. 계측이라는 것은, 시간 T의 기간 중, 시료(12)가 발하는 형광을 수광하고, 후술하는 제어?처리부(28)에서 신호 처리를 행하고, 분석 장치(80)에 위상차 정보를 공급하는 것을 말한다. 이 계측에 의해, 측정점을 생체 물질 M이 통과할 때, 수광부(26)가 수광하는 형광의 제1의 형광 신호를 수집하고, 생체 물질 M이 측정점을 통과한 후의, 생체 물질 M이 측정점에 없는 버퍼액만의 상태에 있어서, 수광부(26)가 수광하는 형광의 제2의 형광 신호를 수집할 수가 있다.
한편, 수광부(26)는, 레이저 광원부(22)로부터 출사되는 레이저 광의 출사 방향에 대해서 수직 방향이고, 한편 관로(30) 중의 시료(12)의 이동 방향에 대해서 수직 방향으로 배치되어 있고, 측정점에서 조사된 시료(12)로부터 발하는 형광을 수광하는 광전 변환기를 구비한다.
도 3은 수광부(26)의 일례의 개략의 구성을 나타내는 개략 구성도이다.
도 3에 나타내는 수광부(26)는, 시료(12) 중의 생체 물질 M으로부터의 형광 신호를 수렴시키는 렌즈계(26a)와, 다이크로익 미러(26b1, 26b2)와, 밴드패스 필터(26c1~26c3)와, 광전자 배증관 등의 광전 변환기(27a~27c)를 가진다.
렌즈계(26a)는, 수광부(26)에 입사 한 형광을 광전 변환기(27a~27c)의 수광면에 수렴시키도록 구성되어 있다.
다이크로익 미러(26b1, 26b2)는, 소정의 범위의 파장 대역의 형광을 반사시키고, 그 이외는 투과시키는 미러(mirror)이다. 밴드패스(band-pass) 필터(26c1~26c3)로 필터링(filtering)하여 광전 변환기(27a~27c)로 소정의 파장 대역의 형광을 취입하도록, 다이크로익 미러(26b1, 26b2)의 반사파장 대역 및 투과 파장 대역이 설정되어 있다.
밴드패스 필터(26c1~26c3)는, 각 광전 변환기(27a~27c)의 수광면의 전면에 설치되고, 소정의 파장 대역의 형광만이 투과하는 필터이다. 투과하는 형광의 파장 대역은 형광 색소가 발하는 형광의 파장 대역에 대응하여 설정되어 있다.
광전 변환기(27a~27c)는, 예를 들면 광전자 배증관을 구비한 센서를 구비하고, 광전면에서 수광한 광을 전기 신호로 변환하는 센서이다. 여기서, 수광하는 형광은 레이저 광의 변조 신호에 대해서 위상차 정보를 가진 광신호로서 수광되므로, 출력되는 전기 신호는 위상차 정보를 가진 형광 신호가 된다. 이 형광 신호는 증폭기로 증폭되어 제어?처리부(28)에 공급된다.
제어?처리부(28)는, 도 4에 나타내듯이, 신호 생성부(40)와, 신호 처리부(42)와, 콘트롤러(44)를 가지고 구성된다. 신호 생성부(40) 및 콘트롤러(44)는, 소정의 주파수의 변조 신호를 생성하는 광원 제어부를 형성한다. 또, 제어?처리부(28)는, 본 발명에 있어서의 제1의 형광 신호 및 제2의 형광 신호를 수집하는 부분에 대응한다.
신호 생성부(40)는, 레이저 광의 강도를 소정의 주파수로 변조(진폭 변조)하는 변조 신호를 생성하는 부분이다.
구체적으로는, 신호 생성부(40)는, 발진기(46), 파워 스플리터(power splitter)(48) 및 증폭기(50, 52)를 가지고, 생성되는 변조 신호를 레이저 광원부(22)의 파워 스플리터(35)에 공급함과 아울러, 신호 처리부(42)에 공급하는 부분이다. 신호 처리부(42)에 변조 신호를 공급하는 것은, 후술하듯이 광전 변환기(27a~27c)로부터 출력되는 형광 신호(제1의 형광 신호, 제2의 형광 신호)를 검파하기 위한 참조 신호로서 이용하기 때문에 있다. 또, 변조 신호는 소정의 주파수의 정현파 신호이고, 10~50㎒의 범위의 주파수로 설정된다.
신호 처리부(42)는, 광전 변환기(27a~27c)로부터 출력되는 형광 신호를 이용하여, 레이저 광의 조사에 의해 시료(12)가 발하는 형광의 위상차 정보를 포함하는 신호를 처리하는 부분이다. 신호 처리부(42)는, 광전 변환기(27a~27c)로부터 출력되는 형광 신호를 증폭하는 증폭기(54a~54c)와, 증폭된 형광 신호의 각각을 신호 생성부(40)로부터 공급된 정현파 신호인 변조 신호를 분배하는 파워 스플리터(56)와, 이 변조 신호를 참조 신호로서 증폭된 형광 신호와 합성하는 IQ 혼합기(58a~58c)를 가지고 구성된다.
IQ 혼합기(58a~58c)는, 광전 변환기(27a~27c)로부터 공급되는 형광 신호를 신호 생성부(40)로부터 공급되는 변조 신호를 참조 신호로서 합성하는 장치이다. 구체적으로는, IQ 혼합기(58a~58c)의 각각은, 도 5에 나타내듯이, 참조 신호를 형광 신호(RF신호)와 승산하여, 형광 신호의 cos 성분(참조 신호와 동위상의 신호 성분)과 고주파 성분을 포함하는 처리 신호를 산출함과 아울러, 참조 신호의 위상을 90° 쉬프트(shift)시킨 신호를 형광 신호와 승산하여, 형광 신호의 sin 성분(참조 신호에 대해 90°의 위상차가 있는 신호 성분)과 고주파 성분을 포함하는 처리 신호를 산출한다. 이 cos 성분을 포함하는 처리 신호 및 sin 성분을 포함하는 처리 신호는 콘트롤러(controller)(44)에 공급된다.
콘트롤러(44)는, 신호 생성부(40)에 소정의 주파수의 변조 신호(정현파 신호)를 생성하도록 제어하고, 또한 신호 처리부(42)에서 구해진 형광 신호의 cos 성분의 값 및 sin 성분의 값을 포함하는 처리 신호로부터 고주파 성분을 없애어 형광 신호의 cos 성분의 값 및 sin 성분의 값을 구하는 부분이다.
구체적으로는, 콘트롤러(44)는, 신호 처리 장치(20)의 각 부분의 동작 제어를 위한 지시를 줌과 아울러, 플로우 사이토미터(10)의 전체 동작을 관리하는 시스템 제어기(60)와, 신호 처리부(42)에서 연산된 cos 성분, sin 성분에 고주파 성분이 가산된 처리 신호로부터 고주파 성분을 없애는 저역통과 필터(lowpass filter)(62)와, 고주파 성분이 제거된 cos 성분, sin 성분의 처리 신호를 증폭하는 증폭기(64)와, 증폭된 처리 신호를 샘플링(sampling) 하는 A/D변환기(Analog to Digital converter)(66)를 가진다.
시스템 제어기(60)는 레이저 광의 강도 변조를 위해서 발진기(46)의 발진 주파수를 정한다.
콘트롤러(44)는, 저역통과 필터(lowpass filter)(62)에 의해 필터링(filtering) 처리되고, 고주파 신호가 제거된 cos 성분의 값 및 sin 성분의 값을 증폭기(64)로 증폭하고, 또한 A/D변환기(66)에 의해 샘플링함으로써 디지털화된 cos 성분, sin 성분의 처리 신호를 분석 장치(80)에 공급한다.
분석 장치(80)는, 생체 물질 M이 발하는 형광의 형광 완화 시정수(형광 완화 시간)를 구하고, 시료(12) 중의 생체 물질 M의 형광의 종류를 형광 완화 시정수로부터 식별하는 부분이다. 소정의 형광 색소를 부착한 마이크로 비즈를 시료(12)에 포함시키고, 생체 물질 M이 생체 결합하는지 아닌지 등의 생체 물질 M의 특성을 조사할 수도 있다.
또, 분석 장치(80)는, 본 발명에 있어서의 형광 완화 시정수를 산출하는 처리부를 형성하고, 컴퓨터에 의해 구성된다.
생체 물질 M이 발하는 형광의 형광 완화 시정수의 산출은, 버퍼액에 현탁 하는 생체 물질 M이 측정점을 통과할 때 발하는 형광의 제1의 형광 신호의 변조 신호에 대한 위상차 정보와, 생체 물질 M이 측정점을 통과한 직후의 버퍼액이 발하는 형광의 제2의 형광 신호의 위상차 정보를 이용하여 행해진다.
상술한 것처럼, 수광부(24)에서 생성되는 트리거 신호에 기초하여 계측을 개시하고, 생체 물질 M이 측정점을 통과하는 시간 T의 2배의 시간 2?T의 동안 계측을 계속한다. 이 때문에, 계측 개시부터 최초의 시간 T까지는 버퍼액에 현탁하는 생체 물질 M이 측정점을 통과할 때의 형광을 검출하고, 시간 T~시간 2?T에서는 생체 물질 M이 측정점을 통과한 직후의 버퍼액이 발하는 형광을 검출한다. 따라서, 분석 장치(80)에 공급되는 cos 성분, sin 성분의 처리 신호는 계측 개시부터 최초의 시간 T까지의 형광의 위상차 정보, 즉 버퍼액과 생체 물질 M이 발하는 형광의 위상차 정보와 시간 T~시간 2?T까지의 형광의 위상차 정보, 즉 버퍼액이 발하는 형광의 위상차 정보를 포함하고 있다.
생체 물질 M이 발하는 형광의 형광 완화 시정수의 산출은, 구체적으로는, 콘트롤러(controller)(44)로부터 공급된 상술의 cos 성분의 값 및 sin 성분의 값을 벡터 성분으로 하는 계측 벡터를 위상차 정보를 포함한 데이터로서 이용한다. 이 계측 벡터에 대해서 버퍼액에 현탁하는 생체 물질 M이 측정점을 통과할 때의 제1의 형광 신호의 계측 벡터를 Pms로 하고, 생체 물질 M이 측정점을 통과한 직후의 버퍼액이 형광을 발할 때의 제2의 형광 신호의 계측 벡터를 Pmb로 하고, 생체 물질 M이 발하는 형광의 cos 성분의 값 및 sin 성분의 값으로 이루어지는 생체 물질 M의 벡터를 Ps로 했을 때, Ps=Pms-Pmb로 나타내진다. 도 6에는 계측 벡터 Pms, Pmb와, 생체 물질 M의 벡터 Ps와의 관계를 나타내고 있다. 도 6에 나타내는 도는 가로축에 레이저 광의 변조 신호의 cos 성분(실수부)의 값(진폭)을, 세로축에는 sin 성분(허수부)의 값(진폭)을 취하여 나타내고 있다. 즉, 본 발명에 있어서의 위상차 정보는, 변조 신호와 동상의 신호 성분(cos 성분)의 값과, 변조 신호에 대해 90° 위상차가 있는 신호 성분(sin 성분)의 값에 의해 구성되는 데이터로 되어 있다.
실제, 생체 물질 M이 측정점을 통과할 때 시료(12)로부터 발하는 형광은 생체 물질 M이 발하는 형광과 버퍼액이 발하는 형광을 포함한다. 이 때문에, 분석 장치(80)에서는, 이들의 형광이 혼재한 상태로, 수광부(26)에서 형광이 수광된다. 따라서, 분석 장치(80)에서 얻어진 계측 벡터 Pms는, 생체 물질 M이 발하는 형광의 형광 신호의 cos 성분의 값 및 sin 성분의 값과 버퍼액이 발하는 형광의 형광 신호의 cos 성분의 값 및 sin 성분의 값이 포함된다. 이 때문에, 생체 물질 M이 측정점을 통과한 직후의 버퍼액이 발하는 형광의 형광 신호의 cos 성분의 값 및 sin 성분의 값으로 이루어지는 계측 벡터 Pmb를 계측 벡터 Pms로부터 공제함으로써 생체 물질 M이 발하는 형광의 벡터 Ps를 산출할 수가 있다. 즉, 계측 벡터 Pms의 cos 성분의 값, sin 성분의 값으로부터 계측 벡터 Pmb의 cos 성분의 값, sin 성분의 값을 성분마다 공제함으로써 생체 물질 M이 발하는 형광의 벡터 Ps를 산출한다.
생체 물질 M의 형광이 약한 경우, 배경 성분으로 되어 생체 물질 M의 형광의 형광 신호에 포함되는 버퍼액이 발하는 형광은 무시할 수 없다. 본 실시 형태에서는, 생체 물질 M이 측정점을 통과한 직후의 일정기간(시간 T~2?T의 기간), 예를 들면, 생체 물질 M이 측정점을 통과하는 시간 T와 같은 시간의 길이로 버퍼액이 발하는 형광을 계측함으로써, 위에서 설명한 바와 같이, 생체 물질 M이 발하는 형광의 벡터 Ps를 산출한다. 도 7은 시료(12)가 발하는 형광의 형광 강도의 시간 변화를 나타내는 그래프이다. 도 7 중의 영역 R1은 생체 물질 M이 발하는 형광과 버퍼액이 발하는 형광이 혼재하는 영역이다. 한편, 영역 R2는 버퍼액이 발하는 형광만이 존재하는 영역이다. 이와 같이 수광부(24)로부터 출력되는 트리거 신호의 생성을 계측의 개시의 타이밍으로 하여 계측 개시~시간 T의 동안, 영역 R1의 계측을 행하고, 이 직후 영역 R2의 계측을 행한다. 또, 벡터 Ps의 산출은 광전 변환기(27a~27c)에서 얻어진 형광 신호마다 행해진다.
분석 장치(80)는 이렇게 하여 구해진 생체 물질 M이 발하는 형광의 벡터 Ps로부터 형광 완화 시정수(형광 완화 시간)를 구한다. 형광 완화 시정수는 생체 물질 M이 측정점을 통과할 때마다 공급되는 계측 벡터 Pms, Pmb를 이용하여 산출된다. 이 때문에, 분석 장치(80)에서는 산출된 형광 완화 시정수의 빈도를 나타내는 막대그래프를 작성하고, 형광 완화 시정수를 통계적으로 처리하고, 형광 완화 시정수의 평균치 및 분산을 구한다. 이에 의해 생체 물질 M이 발하는 형광을 식별할 수가 있다.
또, 형광 완화 시정수의 산출 방법은 형광 색소가 발하는 형광의 형광 완화 시정수에 의존하고 있어, 예를 들면 형광을 1차 완화 과정에서 나타냈을 경우, 아래 식에 따라서 산출된다.
τ=1/ω?tanθs
여기서, θs는 산출된 벡터 Ps의, cos 성분의 축에 대한 경사 각도(도 6 참조)이고, ω는 레이저 광의 변조 신호의 주파수이고, τ는 형광 완화 시정수이다. 형광 완화 시정수 τ은 레이저 광을 펄스 조사했을 때의 초기 형광 강도를 I0로 하면, 이 시점으로부터 형광 강도가 I0/e(e는 자연 대수의 밑, e≒2.71828)로 되는 시점까지의 시간을 말한다.
플로우 사이토미터(10)는 이상과 같이 구성된다.
이러한 플로우 사이토미터(10)의 신호 처리 장치(20)는, 우선 콘트롤러(44)로부터의 지시에 의해, 소정의 주파수의 변조 신호를 발진기(46)에 발생시키고, 이 신호가 증폭기(50)에 의해 증폭되어 레이저 광원부( 22) 및 신호 처리부(42)에 공급된다.
이 상태로 시료(12)가 관로(30)를 흘러 플로우(flow)가 형성된다. 플로우는, 예를 들면 100μm의 유로 직경에 1~10 m/초의 유속을 가진다.
측정점을 통과하는 생체 물질 M에 레이저 광이 조사되면, 수광부(24)에서 생체 물질 M의 통과를 검출하는 검출 신호가 콘트롤러(44)에 트리거 신호로서 출력된다.
콘트롤러(44)에서는, 이 검출 신호를 트리거 신호로 하고, 계측 개시의 지시 신호를 각 부분에 공급한다.
레이저 광원부(22)로부터 출사한 레이저 광은 측정점에 있어서 시료(12) 중의 형광 색소를 여기시키기 위해서 이용되고, 이 레이저 광의 조사에 의해 형광 색소가 형광을 발하고, 수광부(26)에서 수광된다. 레이저 광은, 소정의 주파수로 강도가 변조하고 있으므로, 형광도 이것에 대응하여 형광 강도가 소정의 주파수로 변조하고 있다.
이러한 레이저 광으로 조사되어 발하는 형광 색소로부터의 형광은 레이저 광의 강도를 변조하는 변조 신호에 대해서 위상차의 정보를 가지고 있다.
이 때, 생체 물질 M이 측정점을 통과하는 수μ~수10μ초의 동안에 소정의 주파수로 진폭 변조하는 레이저 광이 생체 물질 M에 조사된다. 레이저 광의 변조 주파수는, 예를 들면 10~50㎒이다.
생체 물질 M이 측정점을 통과하는 계측 개시~시간 T의 기간 중, 형광의 계측, 즉 도 7에 나타내는 영역 R1의 계측이 행해져 제1의 형광 신호가 얻어지고, 시간 T의 경과 직후, 또한 시간 T의 동안, 형광의 다른 계측, 즉 도 7에 나타내는 영역 R2의 계측이 행해져 제2의 형광 신호가 얻어진다.
수광부(26)의 광전 변환기(27a~27c)에서 수광되어 출력되는 제1, 제2의 형광 신호는, 증폭기(54a~54c)로 증폭되고, IQ 혼합기(58a~58c)에 의해 신호 생성부(40)로부터 공급된 정현파 신호인 변조 신호와 합성된다.
IQ 혼합기(58a~58c)에서는, 정현파 신호인 변조 신호(참조 신호)와, 제1, 제2의 형광 신호를 승산한 합성 신호가 생성됨아 아울러, 정현파 신호인 변조 신호(참조 신호)에 대해서 위상을 90° 쉬프트시킨 신호와 형광 신호를 승산하여 합성한 신호가 생성된다.
다음에, 제1의 형광 신호에 대해서 생성된 2개의 합성 신호는, 콘트롤러(44)의 저역통과 필터(lowpass filter)(62)에 보내어져 고주파 성분이 제거되고, 제1의 형광 신호의 cos 성분 및 sin 성분이 취출된다. 이 제1의 형광 신호의 cos 성분 및 sin 성분의 신호는 증폭되고, A/D변환되어 분석 장치(80)에 보내진다. A/D변환은, 수광부(24)로부터의 트리거 신호의 타이밍에 동기가 취해져 샘플링을 한다.
마찬가지로 제2의 형광 신호에 대해서 생성된 2개의 합성 신호는, 콘트롤러(44)의 저역통과 필터(lowpass filter)(62)에 보내어져 고주파 성분이 제거되고, 제2의 형광 신호의 cos 성분 및 sin 성분이 취출된다. 이 제2의 형광 신호의 cos 성분 및 sin 성분의 신호는 증폭되고, A/D변환되어 분석 장치(80)에 보내어진다.
이러한 신호 처리는, 계측에 의해 얻어지는 제1, 제2의 형광 신호가 광전 변환기(27a~27c)로부터 공급되면 온 타임(on time)으로 행해지고, 분석 장치(80)에 신호 처리 후의 cos 성분의 값 및 sin 성분의 값이 순차 공급된다.
분석 장치(80)에서는, 공급된 cos 성분의 값 및 sin 성분의 값을 순차 수집한 후, 이 cos 성분의 값 및 sin 성분의 값을 이용하여 산출되는 영역 R1의 계측 벡터 Pms의 평균치와, 영역 R2의 계측 벡터 Pmb의 평균치의 차분이 구해지고, 생체 물질 M의 벡터 Pm이 구해진다. 분석 장치(80)에서는, 또한 이 벡터 Pm을 이용하여 τ=1/ω?tanθs의 식에 따라서 형광 완화 시정수 τ가 구해진다.
이와 같이 본 실시 형태에서는, 생체 물질 M이 측정점을 통과할 때의 형광을 계측한 직후에, 버퍼액이 발하는 형광도 계측하고, 이들의 계측 결과의 정보를 이용하여 형광 완화 시정수를 산출한다. 이에 의해 생체 물질 M이 발하는 형광의 형광 완화 시정수를 정확하게, 한편 효율적으로 산출할 수가 있다.
또, 생체 물질 M이 측정점을 통과할 때마다 버퍼액으로부터 발하여지는 형광의 계측을 행하지 않고 , 버퍼액으로부터 발하여지는 형광의 형광 완화 시간을 미리 계측하여 분석 장치(80)에 기억 보존해 두고, 생체 물질 M이 측정점을 통과할 때의 형광의 계측 결과와 분석 장치(80)에 기억된 버퍼액으로부터 발하여지는 형광의 형광 완화 시간에 기초하여 생체 물질 M의 형광의 형광 완화 시간을 연산하는 방법도 있다.
그러나, 일정한 기간에 계측해야할 시료(12)가 복수 종류 한편 다량으로 있고 거기에다 버퍼액의 종류가 다른 경우, 상기 방법에서는 신속히 대응할 수 없다. 또, 형광 단백질을 도입한 세포 등이 배양기 속에 존재하고, 이것을 희석하여 시료(12)로 하는 경우, 희석의 정도에 의해 시료(12) 중에 포함되는 배양지의 양이 변화하여 버퍼액이 발하는 형광 완화 시간도 변화하기 때문에 상기 방법에서는 대응할 수 없다. 또한, 생체 물질 M이 그 생체 활동에 의해 버퍼액의 성분도 변화하여 버퍼액이 발하는 형광 완화 시간도 변화하기 때문에 상기 방법에서는 대응할 수 없다.
이러한 부적당을 본 실시 형태는 해소하여 신속하게 한편 정확하게 형광 완화 시정수를 산출할 수가 있다.
또, 본 실시 형태에 대해서는, 계측 벡터 Pms 및 Pmb를 구하는 방법은 신호 처리부(42) 및 콘트롤러(44)에 있어서의 상술한 처리 방법의 대신에 레이저 광의 변조 신호를 입력 신호로 하고, IQ 혼합기(58a~58c)로부터 출력되는 처리 신호를 응답 신호로 하는 전달 함수의 주파수 스펙트럼을 주파수 분석기를 이용하여 구하고, 이 주파수 스펙트럼에 있어서의 실수부의 값 및 허수부의 값을 구하고, 이 때의 DC성분의 실수부의 값 및 허수부의 값을 계측 벡터 Pms, Pmb의 벡터 성분으로 하고, 생체 물질 M이 발하는 형광의 벡터 Ps=Pms-Pmb를 구함으로써 형광 완화 시정수의 산출할 수도 있다.
이상, 본 발명의 형광 검출 방법 및 형광 검출 장치에 대해서 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 형태로 한정되지 않고, 본 발명의 주지를 일탈하지 않는 범위에 있어서 여러 가지의 개량이나 변경을 해도 좋은 것은 물론이다.
10 플로우 사이토미터(flow cytometer)
12 시료
20 신호 처리 장치
22 레이저 광원부
22r R광원 22g G광원 22b B광원
23a1, 23a2, 26b1, 26b2 다이크로익 미러(dichroic mirror)
23c. 26a 렌즈계
24, 26 수광부
26c1, 26c2, 26c3 밴드패스 필터(band-pass filter)
27a~27c 광전 센서
28 제어?처리부
30 관로
32 회수 용기
34r, 34g, 34b 레이저 드라이버(laser driver)
35,48,56 파워 스플리터(power splitter)
40 신호 생성부 42 신호 처리부
44 콘트롤러(controller) 46 발진기
50, 52, 54a, 54b, 54c, 64 증폭기(AMP:Amplifier)
58a, 58b, 58c IQ 혼합기
62 저역통과 필터(lowpass filter)
66 A/D변환기(Analog to Digital converter)
80 분석 장치

Claims (6)

  1. 측정 대상물을 버퍼액에 포함시켜 흐르는 유체의 흐름에 대해 설정된 주파수의 변조 신호를 이용하여 광 강도를 변조한 레이저 광을 조사함으로써, 통과하는 측정 대상물이 발하는 형광을 수광 수단이 수광하여 형광을 검출할 때,
    레이저 광의 조사 위치를 측정 대상물이 통과할 때, 상기 수광 수단이 수광하는 형광의 제1의 형광 신호를 수집하는 제1의 스텝과,
    상기 측정 대상물이 상기 레이저 광의 조사 위치를 통과한 후의, 상기 측정 대상물이 레이저 광의 조사 위치에 없는 상태에 있어서, 상기 수광 수단이 수광하는 형광의 제2의 형광 신호를 수집하는 제2의 스텝과,
    상기 제1의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제1의 위상차 정보를 상기 제2의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제2의 위상차 정보를 이용하여 조정함으로써, 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제3의 위상차 정보를 구하고, 이 구한 제3의 위상차 정보로부터 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 완화 시정수를 구하는 제3의 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 형광 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1의 위상차 정보 및 제2의 위상차 정보는, 상기 변조 신호와 동상의 신호 성분의 값과, 상기 변조 신호에 대해 90° 위상차가 있는 신호 성분의 값에 의해 구성되는 데이터인 형광 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제3의 위상차 정보는, 상기 제1의 위상차 정보의 데이터로부터 상기 제2의 위상차 정보의 데이터를 각 성분마다 공제한 데이터인 형광 검출 방법.
  4. 측정 대상물을 버퍼액에 포함시켜 흐르는 유체의 흐름에 대해 레이저 광을 조사함으로써 측정 대상물이 발하는 형광을 검출하는 형광 검출 장치로서,
    설정된 주파수의 변조 신호를 이용하여 광 강도를 변조한 레이저 광을 상기 흐름을 향해 출사하는 레이저 광원부와,
    레이저 광의 조사에 의해 발하는 형광의 형광 신호를 출력하는 수광부와,
    상기 측정 대상물이 레이저 광의 조사 위치를 통과하는 타이밍을 검지하는 타이밍 검출부와,
    상기 검지한 타이밍에 따라서, 상기 수광부가 수광하는 형광의 제1의 형광 신호를 수집하고, 또한 상기 측정 입자가 레이저 광의 조사 위치를 통과 후의 레이저 광의 조사 위치에 없는 상태에 있어서, 상기 수광부가 수광하는 형광의 제2의 형광 신호를 수집하고, 상기 제1의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제1의 위상차 정보를 상기 제2의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제2의 위상차 정보를 이용하여 조정함으로써, 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호의 상기 변조 신호에 대한 제3의 위상차 정보를 구하고, 이 구한 제3의 위상차 정보로부터 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 완화 시정수를 구하는 처리?분석 수단을 가지는 것을 특징으로 하는 형광 검출 장치.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1의 위상차 정보 및 제2의 위상차 정보는, 상기 변조 신호와 동상의 신호 성분의 값과, 상기 변조 신호에 대해 90° 위상차가 있는 신호 성분의 값에 의해 구성되는 데이터인 형광 검출 장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 처리?분석 수단은, 상기 제1의 위상차 정보의 데이터로부터 상기 제2의 위상차 정보의 데이터를 각 성분마다 공제함으로써 상기 제3의 위상차 정보의 데이터를 구하는 형광 검출 장치.
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