KR101135449B1 - 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자 및 그 제조방법 - Google Patents

헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 헤파라나제에 의해 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자 및 양이온성 생체적합성 고분자가 이온 결합되고, 상기 각각의 고분자에 형광체 또는 소광체가 결합된 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 헤파라나제 효소 활성 측정용 나노 입자는 헤파라나제 과다 발현을 억제하는 억제제와 같은 신약을 스크리닝하는 방법에 적용가능하고, 암세포, 암 조직 및 다양한 염증성 질환 조직에서 헤파라나제를 과다 발현하는 다양한 세포 및 조직을 비침습적 방법으로 영상화하는 것을 가능하게 함으로써, 암, 골 관절염, 류마티스 관절염, 치매 등의 다양한 질병 및 난치병 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
헤파라나제, 이온 복합체, 나노 입자

Description

헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자 및 그 제조 방법{Ionic Complex Nanoparticle for Detecting Heparanase Activity and Method for Preparing the Same}
본 발명은 헤파라나제 (heparanase) 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
세포외 기질 (ECM; extracellular matrix)은 각각의 장기와 조직의 세포외 공간을 채우고 각각 장기내의 세포를 위한 발판을 제공하는 거대분자 (macromolecules)의 복잡한 네트웍을 형성하고 있다. 기저막의 주요 구성성분은 콜라젠 (type IV collagen), 라미닌 (laminin), 헤파란-설페이트 프로테오글리칸(HSPG)이다. HSPG는 ECM 뿐 아니라 세포 표면에서도 존재하며, 단백질 중심의 글리코사미노글리칸 (GAG)과 헤파란 설페이트 (heparan sulfate, HS)로 구성되어 있으며, 아세틸 글루코스아민 (N-acetylglucosamine)과 글루쿠론산 (glucuronic acid)의 이당류의 반복구조를 이루고 있다. HS 사슬은 기저막의 중요한 공간을 채우고 있다. 또한, HS는 여러 종류의 단백질 또는 성장 인자와 결합이 가능하여, 단백질의 기능을 조절하고 성장 인자-성장 인자수용체간의 신호 전달에 관여한다.
전이암 세포나 백혈구 또는 다양한 염증성 질환 부위에 침투하는 세포는 분해 효소를 분비하여 세포외 기질 장벽과 기저막을 통과한다. 대부분의 단백질 분해 효소는 기질 금속단백분해 효소 (MMP), 세린, 시스테인 및 아스파틱 프로테아제(aspartic protease)군에 속하고, 세포외기질 (ECM)을 분해할 수 있다. 이외에도, 헤파라나제는 HS를 분해할 수 있는 엔도글루크로니다제로서 세포의 침입, 전이, 성장에 중요한 역할을 하는 분해 효소이다. 헤파라나제는 세포 침윤 (invasion)에 결정적 역할을 하며, 세포외기질 덩어리로부터 HS-성장 인자를 유리(dissociation)시켜서 신규혈관생성(angiogenesis)에도 관여를 한다.
최근 단백질 분해 효소 및 헤파라나제와 같은 분해 효소는 암과 치매와 같은 다양한 인간 질병에 중추적인 역할을 하며, 원인 제공을 하고 있음이 새로이 밝혀지고 있다. 기질 금속단백분해 효소(matrix metalloprotease, MMP)와 헤파라나제는 세포 및 체내에서 세포외 기질을 분해하는 인자이며, 최근 다양한 연구를 통하여 세포주위 기질(pericellular matrix)의 분해에 따른 세포 운동에 관련 있음이 밝혀졌다. 또한, 상기 분해 효소들은 신규혈관생성 현상, 암세포의 침윤, 전이 등 암 성장에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있음이 밝혀져 단백질 분해 효소 및 헤파라나제를 타겟으로 한 신약 개발이 거대 제약회사를 중심으로 다양하게 이루어지고 있다.
종양 세포 침입이나 전이과정, 류마티스 관절염 등의 다양한 염증성 질환에서의 헤파라나제는 중요한 역할을 하고 있음에도 불구하고, 헤파라나제의 활성 및 발현 양상을 영상화하여 분석하거나, 생체 내에서 헤파라나제의 발현 정도를 비침 습적으로 영상화하는 기법에 대한 연구가 부족하여, 관련 기술 개발이 시급한 실정이다.
기존에 알려진 헤파라나제 효소의 측정 방법은 2-D 젤과 다단계 액체 크로마토그래피 방법 등이 있으나 이러한 방법들은 다단계의 측정 프로토콜이 필요하여 신약개발과 같이 많은 약물을 스크리닝하는데 이용하기에 경제적ㆍ시간적으로 효율적이지 못하다. 최근, 헤파라나제 활성도를 측정하기 위해 HSPG에 Eu (Europium cryptate)와 바이오틴(Biotin)이 결합된 고분자에 스트렙타비딘(Streptavidin)이 결합된 형광체 XL 665를 이용한 센서(K. Enomoto, H. Okamoto, Y. Numata, H. Takemoto, J. Pharm. Biomed, Anal, 2006, 41m 912-917)가 개발되어 플레이트에서 헤파라나제 활성도를 측정할 수 있는 키트로 사용되고 있으나, 세포 및 생체내에서 헤파라나제를 탐지, 발현하는 것, 또는 이를 이용하여 질병을 조기 진단하는 것에는 어려움이 많다.
본 발명의 목적은 세포 및 체내의 조직에서 발현하는 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 나노 입자를 유효 성분으로 포함하는 암, 뇌졸중, 자가면역질환 진단용 조성물 또는 헤파라나제의 정량 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
헤파라나제에 의해 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자 및 양이온성 생체적합성 고분자가 이온 결합되고, 상기 각각의 고분자에 형광체 또는 소광체가 결합된 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 나노 입자는 다음의 화학식 1을 가지는 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자일 수 있다.
Figure 112009014510284-pat00001
여기서, 상기 A는 형광체이고, 상기 B는 헤파라나제에 의하여 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자이며, 상기 C는 상기 형광체의 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타낼 수 있는 소광체이고, 상기 D는 암 및 염증 질환 부위에 특이적으로 축적가능한 양이온성 생체적합성 고분자로 이루어진 나노 입자이며, 상기 A와 C의 위치는 교환 가능하고, 상기 B와 D의 위치는 교환 가능하며, 상기 B와 D는 이온 결합으로 결합된다. 또한 상기 구조식에서 실선은 공유 결합 등의 화학적 결합을 나타내고, 점선은 이온 결합을 나타낸다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자를 포함하는, 세포 및 조직에서 발현하는 헤파라나제 영상화를 위한 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형광체는 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODIPY), 테트라메틸로드아민(Trtramethylrhodamine), 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine) 형광체 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형광체는 적색 또는 근적외선의 형광을 발광하는 시아닌 또는 알렉사 형광체인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 소광체는 블랙홀 소광체(blackhole quencher, BHQ), 블랙베리 소광체(blackberry quencher, BBQ) 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 헤파라나제에 의해 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자는 헤파란 설페이트(HS), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (HSPG), 헤파린, 콘드로이틴-4-설페이트(C4S), 콘드로이틴-6-설페이트 (C6S), 더마 탄 설페이트 (DS), 케라탄 설페이트 (KS) 및 히알루론산 (HA)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 생체적합성 고분자는 상기 헤파라나제에 의해 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자와 정전기적 인력에 의해 이온 복합체 나노 입자를 형성할 수 있는 고분자로, 글라이콜 키토산, 키토산, 폴리-L-리신 (PLL), 폴리-베타-아미노 에스터 고분자, 폴리 에틸렌이민 (PEI), 폴리(아미도아민) (PAMAM) 덴드리머 및 이들의 유도체로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 음이온성 기질 고분자 또는 양이온성 생체적합성 고분자의 분자량은 2,000 내지 500,000 Da인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 음이온성 기질 고분자 또는 양이온성 생체적합성 고분자 1 몰에 대하여 결합할 수 있는 형광체 또는 소광체는 1 내지 30몰일 수 있다. 이 범위 외에서는 상기 형광체 또는 소광체로 인하여 구조 변화 또는 전하 변화 등의 고분자의 특성을 변화시킬 수 있는 가능성이 있어서, 형광 또는 소광 효과가 발휘되지 않을 수 있기 때문에, 상기 범위가 좋다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형광체는 상기 음이온성 기질 고분자와 결합되고, 상기 소광체는 상기 양이온성 생체적합성 고분자와 결합될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형광체가 결합된 음이온성 기질 고분자에 대하여 상기 소광체가 결합된 양이온성 생체적합성 고분자는 1:0.1 내지 1:10의 비율로 결합할 수 있다. 상기 음이온성 고분자와 상기 양이온성 고분자는 정전기적 인력에 의하여 결합되는 것으로서, 여러 가지 사용되는 고분자에 따라 결합 비율을 달리할 수 있는 것이지만, 상기 명시한 범위 이외의 비율에서는 상기 두 가지 고분자간의 결합이 발생하지 않을 수도 있기 때문에 이 범위가 좋다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 이온 복합체 나노 입자의 크기는 50 내지 800 nm인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 이온 복합체 나노 입자에서, 상기 형광체와 소광체의 거리는 20 nm 이내인 것일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자를 유효 성분으로 함유하는, 세포 및 조직에서 발현되는 상기 헤파라나제 효소를 정량분석하기 위한 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자를 유효 성분으로 함유하는, 세포 및 조직에서 발현되는 상기 헤파라나제의 과다발현을 억제하는 약물 또는 약물의 효능을 스크리닝하기 위한 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암, 골관절염, 류마티스 관절염, 전신성 경피증 (progressive systemic sclerosis), 만성 갑상선 염, 궤양성 대장염 또는 다발성 경화증 (multiple sclerosis) 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 상기 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자를 사용하여 헤파라나제를 영상화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경 부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 헤파라나제에 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자에 형광체를 결합시키고, 소광체와 양이온성 생체적합성 고분자를 각각 결합시키는 단계와, 상기 형광체에 결합된 음이온성 기질 고분자와 소광체에 결합된 양이온성 생체적합성 고분자를 이온 결합시켜 이온 복합체 나노 입자를 형성하는 단계를 포함하는 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자의 제조 방법을 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 헤파라나제 효소 활성 측정용 나노 입자는 형광 물질에 대한 높은 소광 능력으로 인해 형광이 발광하지 않은 상태로 있다가, 헤파라나제에 의하여 기질 고분자가 분해가 되어야만 강한 형광을 특이적으로 발광하는 특징을 가짐으로써, 헤파라나제 과다 발현을 억제하는 억제제와 같은 신약을 스크리닝하는 방법에 적용 가능하다. 또한 암세포, 암 조직 및 다양한 염증성 질환 조직에서 헤파라나제를 과다 발현하는 다양한 세포 및 조직을 비침습적 방법으로 영상화하는 것을 가능하게 함으로써, 암, 골 관절염, 류마티스 관절염, 치매 등 자가면역질환 등의 다양한 질병 및 난치병의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
전술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 헤파라나제를 생체 내에서 분자적 수준으로 실시간 및 비침습적으로 영상화하기 위한, 헤파라나제 활성 측정용 나노 입자 및 그 제조 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 세포 및 체내에서 발현되는 형광체가 결합된 음이온을 띄는 기질 고분자와 소광체가 결합된 양전하 고분자의 정전기적 인력으로 인하여 제조된 이온성 복합체 나노 입자 및 그 제조 방법에 관한 것이며, 특히, 헤파라나제 효소에 특이적으로 반응하여, 표적으로 하는 특정 헤파라나제에만 형광이 발생하는 나노 입자 및 질병 진단을 위한 조영제 조성물에 관한 것이다.
소광체가 화학적으로 결합된 양이온성 생체적합성 고분자와, 형광체가 화학적으로 결합된 헤파라나제의 기질인 음이온성 기질 고분자로 제조된 본 발명에 따른 나노 입자는, 헤파라나제 효소가 존재하지 않을 경우, 상기 양이온성 생체적합성 고분자에 결합된 소광체가, 상기 형광체가 발산하는 파장의 빛을 흡수하여 소광 효과 (quenching effect)를 나타낸다. 하지만, 도 1에 나타난 바와 같이, 헤파라나제 효소가 존재하는 경우, 상기 나노 입자 내 헤파라나제의 기질 고분자가 헤파라나제 효소와 반응하여 분해되면, 형광체와 소광체가 서로 분리되어 거리가 멀어지면서 소광 효과가 없어지고, 이에 따라 형광체 고유의 형광을 발광하여 헤파라나제 효소의 정성 및 정량적 분석이 가능하게 되는 것이다. 이를 이용하여, 헤파라나제 효소의 활성 및 억제를 영상화를 통하여 빠르게 스크리닝할 수 있고, 세포 및 조직에 실시간 세포 영상화 및 비침습적 조직 영상화를 할 수 있게 된다.
보다 구체적으로, 본 발명은 다음의 화학식 1로 이루어지는, 세포 또는 생체 조직 내에서 발현되는 헤파라나제 효소의 영상화를 위한 센서에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112009014510284-pat00002
식 중,
- A는 형광체이며,
- B는 상기 헤파라나제 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 음이온성 기질고분자이고,
- C는 상기 형광체의 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타내는 소광체이며,
- D는 양이온성 생체적합성 고분자를 의미하며,
- 상기 형광체(A)와 소광체(C)는 서로 위치가 바뀌어도 무방하고,
- 상기 음이온성 기질 고분자(B)와 양이온성 생체적합성 고분자(D)는 서로의 위치가 바뀌어도 무방하며, 상기
Figure 112009014510284-pat00003
와
Figure 112009014510284-pat00004
는 각각 음이온성과 양이온성임을 의미하고, 상기
Figure 112009014510284-pat00005
와
Figure 112009014510284-pat00006
는 이온 결합에 의해 결합되어 있으며,
- 상기 형광체(A)와 소광체(C)는 음이온성 기질 고분자(B) 또는 양이온성 생체적합성 고분자 (D)에 화학적으로 결합되어 있다.
- 또한 상기 구조식에서 실선은 공유 결합 등의 화학적 결합을 나타내고, 점선은 이온 결합을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 형광체는 헤파라나제 효소의 기질에 해당하는 고분자에 결합되는 형광체를 말하는데, 그 예로 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODIPY, Invitrogen사 제품), 테트라메틸로드아민(Trtramethylrhodamine), 알렉사(Alexa, Molecular Probes사 제품), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine), 기타의 형광을 발생시키는 형광체 또는 이들의 유도체가 있다. 적용가능한 기타의 형광체로는 Tavi's "FluoroTable": Common fluorophores (출처: Zeiss Corporation 웹사이트 및 http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/FISHdyes2.html)에 기재되어 있는 형광체가 있으며, 상기 문헌은 그 내용 전체가 본 명세서에 참조 통합된다.
상기 형광체는 적색이나 근적외선(near-infrared)의 형광을 발광하며, 양자 수득량(quantum yield)이 높은 형광체를 사용하는 것이 바람직하다. 전술한 형광체 중 특히 시아닌계, 알렉사계는 근적외선 빛을 방출 및 흡수하므로 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭 또는 흡수가 최소화되므로 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, 헤파라나제에 의해 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자는, 헤파란 설페이트, 헤파란설페이트 프로테오글리칸 (HSPG), 헤파린, 콘드로이틴-4-설페이트 (C4S), 콘드로이틴-4-설페이트 (C6S), 더마탄 설페이트 (DS), 케라탄 설페이트 (KS), 히알루론산 (HA) 등이다.
상기 소광체는 음이온성 펩타이드 기질 고분자에 화학적으로 결합된 형광체가 발산하는 파장의 빛을 흡수하여 강한 소광 효과(quenching effect)를 이룸으로써, 펩타이드 기질 고분자가 헤파라나제 효소에 의해 분해되지 않으면 형광이 발광 되지 않으며, 이러한 소광 효과는 형광체와 소광체의 거리가 수십 nm 이내에 있을 경우에 나타난다. 다시 말해, 헤파라나제 효소와 반응하여 펩타이드 기질이 분해되면 펩타이드에 결합된 형광체와 소광체가 서로 분리되어 멀어지면서 소광 효과가 없어지고, 이에 따라 형광체 고유의 형광을 발광하여 헤파라나제 효소의 정성 및 정량적 분석이 가능하게 된다.
또한, 형광체의 발광 파장의 범위에 따라 사용되는 소광체의 종류가 달라지며, 이는 형광체의 발광파장과 같거나 거의 유사한 파장대의 소광체를 사용하여야만 소광 효과를 극대화할 수 있다. 본 발명에 있어서 소광체는, 여기된(excited) 형광체의 에너지를 흡수하지만, 형광 에너지를 밖으로 방출하지 않으므로 형광체의 형광을 소광시킬 수 있는 물질인 'dark quencher'로서, 상업적으로 널리 상용화되어 있는 블랙홀 소광체 (Black Hole QuencherTM Dyes, Biosearch Technologies사 제품; BHQ), 블랙베리 소광체 (BlackBerryTM Quencher 650, BERRY&ASSOCIATES사 제품; BBQ) 및 이들의 유도체 등이 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 형광체와 소광체의 짝을 표 1로 정리하면 다음과 같다.
Figure 112009014510284-pat00007
본 발명에서, 양이온성 생체적합성 고분자는 음이온성 기질 고분자와 정전기적 인력에 의해 이온 복합체 나노 입자를 형성할 수 있는 생체 적합성 고분자를 말하는데, 예컨대 글라이콜 키토산, 키토산, 폴리-L-라이신 (PLL), 폴리-베타-아미노에스터 고분자 및 그의 합성 유도체, 폴리 에틸렌이민 (PEI) 및 그의 유도체, 폴리(아미도아민) (PAMAM) 덴드리머 및 그의 유도체가 사용될 수 있다.
상기 형광체가 결합된 음이온성 기질 고분자와 소광체가 결합된 양이온성 생체적합성 고분자를 이용하여 수용액 상에서 정전기적 인력에 의해 이온 복합체 나노 입자를 형성한다. 이온 복합체 나노 입자를 형성할 때 사용되는 고분자인 형광체-음이온성 기질 고분자 대 소광체-양이온성 생체적합성 고분자의 혼합 비율은 1:0.1 내지 1:10인 것이 바람직하며, 이 때 형성되는 나노 입자는 50~800 nm의 크기를 나타내는 것이 바람직하다.
상기 형광체-음이온성 기질 고분자 대 소광체-양이온성 생체적합성 고분자의 혼합 비율은, 전술한 바와 같이 두 가지 고분자간의 결합을 발생시키기 위한 최적의 비율을 말한다. 상기 비율 이외의 비율에서는, 예를 들어 형광체-음이온성 기질 고분자에 비해 소광체-양이온성 생체적합성 고분자의 비율이 지나치게 높은 경우 소광 효과가 뛰어난 것은 차치하고, 상기 기질 고분자가 분해된 후 소광체 농도가 현저히 높아 형광이 복원되지 않을 가능성이 있기 때문에 본 발명이 이루고자 하는 목적을 달성할 수 없어서 바람직하지 않다.
나노 입자의 크기와 관련하여, 예를 들어서 헤파라나제 측정을 위하여 암 모델에서 생체내 실험을 수행할 경우 혈관 주사를 용이하게 수행할 수 있는 입자 크기 범위어야 하는데, 이 크기가 1 ㎛ 이상인 경우 목적하는 질환의 병소에 전달하기 어려울 수 있다. 따라서 나노 입자 크기가 50 내지 800 nm인 것이 바람직하다.
형성된 이온 복합체 나노 입자에서 형광체와 소광체 사이의 거리는 소광 효과를 최대화 할 수 있도록 조절이 되어야 하기 때문에, 발생하는 소광 효과에 의해서 형광체의 형광 세기가 최소가 될 수 있도록, 좋기로는 이 거리를 20 nm 이내로 유지시키면서 제조하는 것이 바람직하다.
상기 음이온성 기질 고분자 또는 양이온성 생체적합성 고분자로는 분자량이 2,000 ~ 500,000 Da 범위인 고분자가 사용될 수 있으며, 음이온성 기질 고분자 또는 양이온성 생체적합성 고분자 1 몰에 형광체 또는 소광체가 화학적으로 결합되는 수는 1 ~ 30몰 이내인 것이 바람직하다. 이는 전술한 바와 같이, 이 범위 외에서는 상기 형광체 또는 소광체로 인하여 구조 변화 또는 전하 변화 등의 고분자의 특성을 변화시킬 수 있는 가능성이 있기 때문이다.
상기 음이온성 기질 고분자는 암, 류마티스 관절염, 골관절염, 동맥경화 등의 다양한 염증성 조직 부위에서 과다 발현되는, 헤파라나제에 의해 분해되는 헤파란 설페이트 (HS)이며, 형광체는 상기 기질고분자에 화학적으로 결합되어 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5이며, 양이온성 생체적합성 고분자는 음이온성 기질 고분자와 정전기적 인력을 통하여 나노 입자를 이룰 수 있는 글라이콜 키토산 (GC)이며, 소광체는 양이온성 생체적합성 고분자에 화학적으로 결합되어 상기 형광체의 형광을 흡수하여 소광 효과를 극대화시킬 수 있는 BHQ-3(black hole quencher-3)이나, 이러한 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자는, 헤파라나제 효소 특이적 기질 고분자에 형광체를 결합한 물질과, 양이온성 생체적합성 고분자에 소광체가 결합된 물질을 서로 혼합하여 정전기적 인력을 통하여 제조할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자 제조 방법에 관한 것이다.
- 헤파라나제에 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자 기질에 형광체를 결합시키는 단계와,
- 상기 양이온성 생체적합성 고분자에 소광체를 결합시키는 단계와,
- 상기 형광체에 결합된 음이온성 기질 고분자와 소광체가 결합된 양이온성 생체적합성 고분자를 이온 결합시켜 이온 복합체 나노 입자를 형성하는 단계.
상기 형광체는 음이온성 기질 고분자 뿐만 아니라 양이온성 생체적합성 고분자에 화학적으로 결합될 수 있으며, 마찬가지로 소광체 역시 양이온성 생체적합성 고분자 뿐만 아니라 음이온성 기질 고분자에 "화학적으로 결합"될 수도 있다.
상기 화학적 결합의 예로, i) 공유결합을 통하여 형광체 또는 소광체가 양이온성 생체적합성 고분자 또는 음이온성 기질 고분자에 결합될 수 있으며, ii) 링커(Linker)를 이용하여 형광체 또는 소광체가 양이온성 또는 음이온성 기질 고분자에 공유 결합할 수 있다.
구체적으로 말해, 예를 들어 상기 고분자에 아민기가 존재하고, 형광체 및 소광체에 N-하이드록시숙신이미드 (NHS 형태) 작용기가 존재하는 경우, 상기 두 분자 간의 공유 결합이 가능하다. 다른 예로서, 상기 고분자에 COOH기가 존재하고, 형광체 및 소광체에 아민기가 존재하는 경우에, 상기 두 잔기가 직접적으로 결합하는 것이 불가능하기 때문에 크로스링커 (예컨대, 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드, 하이드로클로라이드 (EDAC))를 이용하여 두 개를 화학적으로 결합시키는 것이 가능하다.
또한, 필요에 따라, 상기 방법으로 제조된 형광체-고분자, 또는 소광체-고분자를 정제 또는 확인하는 단계를 추가할 수 있다. 음이온 고분자 또는 양이온 고분자에 소광체 또는 형광체를 결합시키는 방법은 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술을 사용할 수 있다.
상기 형광체-음이온 고분자/소광체-양이온 고분자로 이루어진 이온 복합체 나노 입자는, 형광체가 발하는 빛을 소광체가 흡수하여 일어나는 소광 효과에 의해 형광이 최소화된 상태로 제조한다. 상기 표 1에 기재된 바와 같이, 다양한 파장의 형광체와 이에 상응하는 다양한 종류의 소광체가 있으며, 헤파라나제의 기질 고분자인 음이온성 기질 고분자로서는 헤파란 설페이트, 헤파란설페이트 프로테오글리칸 (HSPG), 헤파린, 콘드로이틴-4-설페이트 (C4S), 콘드로이틴-4-설페이트 (C6S), 더마탄 설페이트 (DS), 케라탄 설페이트 (KS), 히알루론산 (HA)등이 있으며, 양이온성 생체적합성 고분자로서는 글라이콜 키토산, 키토산, 폴리-L-라이신 (PLL), 폴리-베타-아미노에스터 고분자 및 그의 합성 유도체, 폴리 에틸렌이민 (PEI) 및 그의 유도체, 폴리(아미도아민) (PAMAM) 덴드리머 및 그의 유도체 등이 있다. 따라서, 상기에 기재된 음이온 기질고분자 및 양이온 고분자의 종류를 바꾸어서 다양한 이온 복합체 나노 입자를 제조할 수 있으며, 쉽게 제어가 가능하고, 원하는 파장대에서 형광체 및 소광체를 선택할 수 있기 때문에 다양한 헤파라나제 효소를 검출할 수 있는 다양한 이온 복합체 나노 입자의 설계가 가능하다.
또한, 상기 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자는 생체 내 특정 조직 또는 세포에 존재하는 헤파라나제의 존재 유무, 활성, 및 활성 억제 등을 쉽게 판별해 낼 수 있어서 세포 영상, 특정 조직 영상, 약물전달체 등에 응용될 수 있다. 상기 나노 입자를 포함하는 조영제 조성물은 생체 내(in vivo) 및 시험관내(in vitro) 모두 적용이 가능한데, 신약 개발에 필요한 고성능 스크리닝(high-throughput screening) 방법에 사용하는 것이 가능하고, 생체내에서 실시간으로 헤파라나제 효소의 존재 유무 측정, 활성도 측정 및 조기 질병 진단을 하는 등의 다양한 용도로 사용이 가능하다. 더 구체적으로, 세포 및 생체 조직에서, 암, 골 관절염, 류마티스 관절염 및 그 외 자가 면역질환 질병 등에서 발현되는 헤파라나제 효소를 영상화하는 방법, 헤파라나제 효소 과다발현을 억제하는 약물의 효능을 스크리닝하는 방법 등에 이용될 수 있다.
일 예로써, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암 등을 포함하는 암에서의 헤파라나제 효소를 영상화하는 방법에 이용될 수 있고, 또 다른 예로, 치매, 뇌졸중 등을 포함하는 난치성 질환에서의 헤파라나제 효소를 영상화하는 방법에 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명의 범위가 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명에 따른 이온 복합체 나노 입자 센서의 제조
1-1. 헤파란설페이트-Cy5.5 (HS-Cy5.5) 및 글라이콜키토산-BHQ3 (GC-BHQ3) 합성
형광체-음이온성 기질 고분자의 일 예로, 헤파란설페이트-Cy5.5를 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이 합성하였다. 50 mg의 헤파란설페이트와 9 mg의 Cy5.5-NHS를 0.1M의 NaHPO4 (5 ml, pH 9.0)에 녹인 후, 실온에서 빛을 차단한 조건에서 6 시간동안 반응시켰다. 반응 후 용액은 2일 동안 증류수에서 투석 한 뒤, 동결건조하였다. 헤파란설페이트 1몰에 약 2몰의 Cy5.5가 결합이 되었음을 UV를 통하여 확인하였다.
양이온성 생체적합성 고분자-소광체의 일 예로써, 글라이콜 키토산-BHQ3를 하기 반응식 1과 같이 합성하였다. 100 mg의 글라이콜 키토산과 11.5 mg의 BHQ3-NHS를 10 ml의 DMSO에 녹인 후 4시간동안 반응시켰다. 반응 혼합물은 1일 동안 물:메탄올 (1v:1v) 공용매에서 투석한 후, 다시 1일 동안 물에서 투석한 뒤 동결건조하였다. 글라이콜 키토산 1몰에 약 4몰의 BHQ3가 결합되었음을 UV를 통하여 확인하였다.
Figure 112009014510284-pat00008
1-2. HS-Cy5.5와 GC-BHQ3가 결합된 이온 복합체 나노 입자의 크기 및 광학 특성 변화
HS-Cy5.5와 GC-BHQ3가 수용액 상태에서 이온 복합체 나노 입자를 형성하는지 여부 및 나노 입자 형성시에 소광 효과가 나타나는지에 관한 실험을 수행하였다.
HS-Cy5.5의 농도는 0.2 mg/ml로 고정하고, GC-BHQ3 농도를 0에서 0.6 mg/ml의 농도로 변화시키면서 형성된 이온 복합체 나노 입자의 특성을 분석하였다.
도 2a에서와 같이 HS-Cy5.5에 GC-BHQ3의 비율을 증가시키면서 형성된 나노 입자의 형광 세기는 점차적으로 감소하였으며, 도 2b에서와 같이 HS-Cy5.5:GC-BHQ3 의 비율이 0.2:0.6일 때 소광 효과가 가장 높았으며, HS-Cy5.5 단독의 형광 세기와 비교할 때, 약 80%이상의 형광 세기가 감소하였다. 이 결과로부터, HS-Cy5.5와 GC-BHQ3에 의해 형성된 이온 복합체 나노 입자는 소광 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
도 2c에서와 같이, 소광 효과가 가장 큰 HS-Cy5.5:GC-BHQ3의 비율은 0.2:0.6이고, 이 때 형성된 나노 입자의 크기 결과를 보면, 도 2d에서와 같이, 수용액 상태에서 입자크기가 약 330 nm인 나노 입자를 형성함을 알 수 있었다.
실험예 1. HS-Cy5.5/GC-BHQ3 이온 복합체 나노 입자를 이용한 헤파라나제 억제제의 헤파라나제 활성도 억제 효능 평가
실시예 1에서 제조된 HS-Cy5.5/GC-BHQ3 이온 복합체 나노 입자를 이용하여 헤파라나제를 영상화하고, 헤파라나제 억제제를 처리하였을 때 헤파라나제 활성도를 영상화하였다.
실시예 1에서 제조된 HS-Cy5.5/GC-BHQ3 이온 복합체 나노 입자에 헤파라나제, 및 헤파라나제+억제제와 함께 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 효소 분해반응에 의한 형광 발현을 관찰하였다. 1 시간 후 CCD (Charge Coupled Device) 카메라가 장착된 Kodak Image Station 4000MM Digital Imaging System으로 형광을 관찰한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 헤파라나제를 처리하였을 때 형광의 세기가 증가하였으며, 헤파라나제 억제제를 처리한 경우는 형광의 세기가 감소하였다. 이러한 결과로부터, HS-Cy5.5/GC-BHQ3 이온 복합체 나노 입자는 헤파라나제 효소를 영상화 할 수 있으며, 헤파라나제 억제제 약물의 약물 효과 및 스크리닝에 응용 가능 함을 알 수 있었다.
실험예 2. HS-Cy5.5/GC-BHQ3 이온 복합체 나노 입자를 이용한 암 모델에서 헤파라나제 발현 영상화
누드마우스에 암 모델 생성을 위하여 SCC7 암세포(1×106개) [SCC7은 상피암 세포로서 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 구입가능하다]를 이식한 뒤, 암 크기가 약 5~8 mm 정도 되었을 때, HS-Cy5.5/GC-BHQ3 이온 복합체 나노 입자를 꼬리 정맥으로 투여한 뒤 eXplore Optix 영상기기를 이용하여 헤파라나제 발현을 영상화하였다.
또한, SCC7 암조직은 다량의 헤파라나제를 발현하는 것으로 알려져 있는데, 이러한 사실에 기초해, 헤파라나제 억제제 약물의 헤파라나제 억제 효능을 알아보기 위하여 암 조직에 헤파린을 20 mg/kg를 투여한 뒤 20분 뒤에 HS-Cy5.5/GC-BHQ3 이온 복합체 나노 입자를 꼬리 정맥으로 투여한 뒤 eXplore Optix 영상기기를 이용하여 헤파라나제 활성도 감소를 영상화 하였다.
도 4a, 4b 및 4c에 나타낸 바와 같이, HS-Cy5.5/GC-BHQ3 이온 복합체 나노 입자를 투여한 경우, 나노 입자는 암 조직에서 강한 형광을 발광하였으며, 헤파라나제 억제제를 투여한 그룹에서는 형광의 세기가 감소함을 알 수 있었다.
그러므로, HS-Cy5.5/GC-BHQ3 이온 복합체 나노 입자를 이용하여 생체내 (in vivo)에서 헤파라나제 발현을 영상화 할 수 있으며, 헤파라나제 억제제의 약물 효 능을 생체내 (in vivo)에서 측정할 수 있음을 확인하였다.
도 1은 본 발명에 따른, 형광체가 결합된 음이온성 기질 고분자와 소광체가 결합된 양이온성 생체적합성 고분자가 이온 복합체 나노 입자를 형성하며, 헤파라나제가 존재할 경우 기질 고분자가 헤파라나제에 의해 분해되어 형광이 복원되는 모식도를 도시한 것이다.
도 2a는 형광체 Cy5.5가 결합된 헤파란설페이트 (HS-Cy5.5)와 소광체 BHQ3가 결합된 글라이콜키토산 (GC-BHQ3)의 다양한 농도비에 따른 광학 특성 변화의 이미지를 도시한 것이며, 도 2b는 형광체 Cy5.5가 결합된 헤파란설페이트 (HS-Cy5.5)와 소광체 BHQ3가 결합된 글라이콜키토산의 다양한 농도비에 따른 광학 특성 변화를 형광분석기로 측정한 그림을 도시한 것이며, 도 2c는 HS-Cy5.5의 형광 세기에 대하여 각각의 농도비율에 따라 형성된 HS-Cy5.5/GC-BHQ3의 나노 입자의 형광 세기와의 비율로 소광 효과를 도시한 것이며, 도 2d는 HS-Cy5.5/GC-BHQ3의 비율이 0.2:0.6 일 때 형성되는 나노 입자의 크기를 도시한 것이다.
도 3은 HS-Cy5.5/GC-BHQ3로 이루어진 나노 입자를 헤파라나제 또는 헤파라나제와 헤파라나제 억제제와 동시에 처리하였을 때, 형광 변화를 이미징한 것을 도시한 것이다.
도 4a는, 암 모델에 HS-Cy5.5/GC-BHQ3로 이루어진 나노 입자를 투여하고 광학 영상 장비를 통하여 헤파라나제의 발현 유무를 이미징한 것이며, 또한 헤파라나제 억제제를 종양에 직접 투여하고 20분 후에 HS-Cy5.5/GC-BHQ3로 이루어진 나노 입자를 투여한 뒤 광학 영상 장비를 통하여 헤파라나제 억제제의 헤파라나제 활성 억제 효능을 영상화한 것이며, 도 4b는 상기 두 그룹의 암 조직에서 시간에 따른 형광 세기를 정량화한 것이고, 도 4c는 마우스로부터 암 조직을 적출한 뒤 광학영상장비를 통하여 암 조직에서의 형광 세기 차이의 이미지를 도시한 것이다.

Claims (21)

  1. 헤파라나제(heparanase)에 의하여 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자 및 양이온성 생체적합성 고분자가 이온 결합되고, 상기 각각의 고분자에 형광체 또는 소광체가 결합된 것이고,
    상기 음이온성 기질 고분자는 헤파란 설페이트(HS), 헤파란설페이트 프로테오글리칸 (HSPG), 헤파린, 콘드로이틴-4-설페이트(C4S), 콘드로이틴-6-설페이트 (C6S), 더마탄 설페이트 (DS), 케라탄 설페이트 (KS) 및 히알루론산 (HA)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
    상기 양이온성 생체적합성 고분자는 상기 헤파라나제에 의해 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자와 정전기적 인력에 의해 이온 복합체 나노 입자를 형성할 수 있는 고분자로, 글라이콜 키토산 (GC), 키토산, 폴리-L-리신 (PLL), 폴리-베타-아미노 에스터 고분자, 폴리 에틸렌이민 (PEI), 폴리(아미도아민) (PAMAM) 덴드리머로 구성된 군에서 선택된 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  2. 제1항에 있어서, 다음의 화학식 1을 가지는 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
    [화학식 1]
    Figure 112011003839087-pat00009
    여기서, 상기 A는 형광체이고, 상기 B는 헤파라나제에 의하여 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자이며, 상기 C는 상기 형광체의 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타낼 수 있는 소광체이고, 상기 D는 암 및 염증 질환 부위에 특이적으로 축적가능한 양이온성 생체적합성 고분자이며, 상기 A와 C의 위치는 교환 가능하고, 상기 B와 D의 위치는 교환 가능하며, 상기 B와 D는 이온 결합으로 결합되는 것이고, 상기 실선은 공유 결합 등의 화학적 결합을 나타내고, 점선은 이온 결합을 나타낸다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 형광체는 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODIPY), 테트라메틸로드아민(Trtramethylrhodamine), 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine) 형광체로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 형광체는 적색 또는 근적외선의 형광을 발광하는 시아닌 또는 알렉사 형광체인 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 소광체는 블랙홀 소광체(blackhole quencher, BHQ), 블랙베리 소광체(blackberry quencher, BBQ)로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  6. 제3항에 있어서, 상기 소광체는 블랙홀 소광체(blackhole quencher, BHQ), 블랙베리 소광체(blackberry quencher, BBQ)로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 기질 고분자는 헤파란 설페이트 (HS)이고, 상기 양이온성 생체적합성 고분자는 글라이콜 키토산 (GC)이며, 상기 형광체는 시아닌 형광체인 Cy5.5이며, 상기 소광체는 블랙홀 소광체 BHQ-3인 헤파라나제(heparanase) 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  10. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 기질 고분자 또는 양이온성 생체적합성 고분자의 분자량은 2,000 내지 500,000 Da인 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  11. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 기질 고분자 또는 양이온성 생체적합성 고분자 1 몰에 대하여 결합할 수 있는 형광체 또는 소광체는 1 내지 30 몰인 것인 헤파 라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 형광체는 상기 음이온성 기질 고분자와 결합되고, 상기 소광체는 상기 양이온성 생체적합성 고분자와 결합되는 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 형광체가 결합된 음이온성 기질 고분자 대 상기 소광체가 결합된 양이온성 생체적합성 고분자는 1:0.1 내지 1:10의 비율로 결합되는 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  14. 제12항에 있어서, 상기 이온 복합체 나노 입자의 크기는 50 내지 800 nm인 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  15. 제12항에 있어서, 상기 이온 복합체 나노 입자에서, 상기 형광체와 소광체의 거리는 20 nm 이내인 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자.
  16. 제1항 내지 제6항 및 제9항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 기재된 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자를 포함하는, 세포 및 조직에서 발현하는 헤파라나제 영상화를 위한 조영제 조성물.
  17. 제1항 내지 제6항 및 제9항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 기재된 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자를 유효 성분으로 함유하는, 세포 및 조직에서 발현되는 헤파라나제 효소를 정량 분석하기 위한 조성물.
  18. 제1항 내지 제6항 및 제9항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 기재된 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자를 유효 성분으로 함유하는, 세포 및 조직에서 발현되는 헤파라나제의 과다 발현을 억제하는 약물 또는 약물의 효능을 스크리닝하기 위한 조성물.
  19. 암, 골관절염, 류마티스 관절염, 전신성 경피증 (progressive systemic sclerosis), 만성 갑상선 염, 궤양성 대장염 또는 다발성 경화증 (multiple sclerosis) 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 제1항 내지 제6항 및 제9항 내지 제15항 중에서 선택된 어느 한 항에 따른 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자를 사용하여 헤파라나제를 영상화하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 구성된 군에서 선택된 것인 헤파라나제를 영상화하는 방법.
  21. 헤파라나제에 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자에 형광체를 결합시키고, 소광체와 양이온성 생체적합성 고분자를 각각 결합시키는 단계와,
    상기 형광체에 결합된 음이온성 기질 고분자와 소광체에 결합된 양이온성 생체적합성 고분자를 이온 결합시켜 이온 복합체 나노 입자를 형성하는 단계
    를 포함하고,
    상기 음이온성 기질 고분자는 헤파란 설페이트(HS), 헤파란설페이트 프로테오글리칸 (HSPG), 헤파린, 콘드로이틴-4-설페이트(C4S), 콘드로이틴-6-설페이트 (C6S), 더마탄 설페이트 (DS), 케라탄 설페이트 (KS) 및 히알루론산 (HA)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고,
    상기 양이온성 생체적합성 고분자는 상기 헤파라나제에 의해 특이적으로 분해되는 음이온성 기질 고분자와 정전기적 인력에 의해 이온 복합체 나노 입자를 형성할 수 있는 고분자로, 글라이콜 키토산 (GC), 키토산, 폴리-L-리신 (PLL), 폴리-베타-아미노 에스터 고분자, 폴리 에틸렌이민 (PEI), 폴리(아미도아민) (PAMAM) 덴드리머로 구성된 군에서 선택된 것인 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자의 제조 방법.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5259710B2 (ja) * 2007-07-10 2013-08-07 メディ‐トックス、インク． ボツリヌス毒素の安定性が改善された薬学的液状組成物
KR101103548B1 (ko) * 2008-08-29 2012-01-09 한국과학기술연구원 단백질분해효소 활성 측정용 나노입자 센서 및 그 제조방법
EP3241547B1 (en) * 2011-03-31 2020-05-20 Medy-Tox Inc. Lyophilized preparation of botulinum toxin
CN102435571B (zh) * 2011-09-16 2014-07-23 东华大学 利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法
JP6300380B2 (ja) 2012-12-26 2018-03-28 ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール ストークスシフトが大きいアミノ−トリアゾリル−ボディパイ化合物ならびに生ニューロン染色およびヒト血清アルブミンｆａ１薬剤部位プロービングへの応用
WO2015035279A1 (en) * 2013-09-09 2015-03-12 Virginia Commonwealth University Nanosensor for detecting the activity of glycosaminoglycan-cleaving enzymes and uses thereof
US11143659B2 (en) 2015-01-27 2021-10-12 Arterez, Inc. Biomarkers of vascular disease
US11696959B2 (en) 2015-12-31 2023-07-11 City Of Hope Nanoparticle-cell construct with platinum anti-cancer agent
WO2017117274A1 (en) * 2015-12-31 2017-07-06 City Of Hope Nanoparticles for cancer detection

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100740891B1 (ko) 2006-02-27 2007-07-19 한국과학기술원 금나노-펩타이드칩 및 이의 이차이온 질량분석법을 이용한효소 활성 및 효소 활성 저해효과 분석 방법
JP2007187531A (ja) 2006-01-12 2007-07-26 Kyushu Institute Of Technology マイクロ流体酵素センサ

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007187531A (ja) 2006-01-12 2007-07-26 Kyushu Institute Of Technology マイクロ流体酵素センサ
KR100740891B1 (ko) 2006-02-27 2007-07-19 한국과학기술원 금나노-펩타이드칩 및 이의 이차이온 질량분석법을 이용한효소 활성 및 효소 활성 저해효과 분석 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioconjug. Chem., Vol. 19, No. 9, pp. 1743~1747 *
실시간 분자영상 기술개발에 관한 연구보고서, 한국과학기술연구원 교육과학기술부 2008.02 *
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