본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 NIa(nuclear inclusion a) 프로테아제 또는 NIa 프로테아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성신경질환(neurodegenrative disorders) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 퇴행성신경질환을 예방 또는 치료하기 위한 치료제의 새로운 타겟을 발굴하고자 노력 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 식물 바이러스인 순무 모자이크바이러스의 NIa 프로테아제가 아밀로이드 β를 효과적으로 분해하는 활성을 지니며, NIa 프로테아제의 발현이 세포 내의 아밀로이드 β로부터 유도되는 세포 사멸뿐 아니라 세포 외부의 아밀로이드 β로부터 유도되는 세포 사멸도 억제시킨다는 것을 발견하였다.
식물 바이러스인 순무 모자이크 바이러스(TuMV)는 십자화과 식물에서 병을 유발하는 포티비리대속 패밀리에 속하는 포티바이러스이다. 이 바이러스는 40-50종의 진딧물을 통해 감염되며, 감염된 식물은 국부적인 백화 병변(chlorotic local lesions), 모자이크, 얼룩(mottling) 또는 주름(puckering or rugosity) 같은 증후를 나타낸다. TuMV는 외피가 없고 나선형의 캡시드로 구성된 파지티브-센스 단일 가닥 RNA 바이러스로 720 nm의 평균 길이를 가진다. TuMV의 게놈은 약 10 kb 정도로 이루어진 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)로 구성되어 있고 그 형태는 선형 모노파티트(linear monopartite)이다.
포티바이러스의 NIa 프로테아제는 바이러스의 복제에 중요한 역할을 하며 다음과 같은 두 개의 기능성 도메인으로 구성되어 있다: (a) N-말단의 VPg 도메인(25 kDa) 및 (b) C-말단의 프로테아제 도메인(27 kDa). 포티바이러스의 NIa 프로테아제는 서열 분석을 통해 키모트립신-유사 세린 프로테아제와 관련된 것으로 보고되어져 왔다. 한편, 다른 연구에 따르면, 담배 에치 바이러스(TEV)의 NIa 프로테아 제의 활성이 TPCK 및 시스테인 프로테아제 억제제에 의해 억제된다고 알려졌다. 이러한 결과는 NIa 프로테아제가 세린 프로테아제와 유사한 활성 부위를 가지는 시스테인 프로테아제라는 것을 의미한다.
식물 바이러스인 TuMV의 NIa 프로테아제는 Val-Xaa-His-Gln↓라는 강한 기질적 특이성을 가지는데, 본 발명자들은 TuMV NIa의 기질적 특이성에 부합하는 아미노산 서열이 아밀로이드 β 위에 존재한다는 것을 처음으로 발견하였다.
본 발명에 따르면, TuMV의 NIa 프로테아제가 아밀로이드 β를 효과적으로 분해하며, NIa 프로테아제에 의한 아밀로이드 β의 분해로 인해 아밀로이드 β에 의해 유도되는 세포사멸이 감소한다.
아밀로이드 β는 알쯔하이머병 환자의 뇌에서 아밀로이드 플락을 형성하는 주요한 성분으로 39-43 아미노산으로 구성된 펩타이드로 루이소체 치매, 봉입체 근염 또는 근육병 환자에서도 관찰된다. 또한, 아밀로이드 β는 소뇌아밀로이드혈관병변(cerebral amyloid angiopathy) 환자에서 뇌 혈관을 코팅하는 응집체를 형성한다. 이러한 아밀로이드 플락은 다른 펩타이드(예: 프라이온)에 의해 공유되는 단백질 폴드로서 아밀로이드 섬유(amyloid fibers)로 불리는 잘 정돈된 소섬유(fibrillar) 응집체 다발로 구성된다. 아밀로이드 β 전구체 단백질(amyloid β precursor protein, APP)로부터 절단(cleavage)되어 형성되는 아밀로이드 β 펩타이드의 수용성 부위는 알쯔하이머병의 진행에 결정적인 요인으로서 작용한다. 이러한 아밀로이드 β의 형성은 β-세크레타제 및 γ-세크레타제에 의한 APP의 분해 과정을 통해 이루어진다. 또한, 종래에 알려진 NEP(neprilysin)나 IDE(insulin degrading enzyme)와 같은 아밀로이드 β 분해 효소에 의한 세포 외부에 존재하는 아밀로이드 β의 분해가 알쯔하이머병의 치료를 위해 중요한 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서 이용되는 NIa 프로테아제가 아밀로이드 β를 효과적으로 분해할 수 있는 활성을 지니는 것은 알쯔하이머병의 치료를 위한 신규한 전략을 제공한다(참조: 인 비트로 실험 및 세포 실험).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 NIa 프로테아제는 아밀로이드 β를 분해하는 활성을 가진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 퇴행성신경질환은 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 경도 인지기능장애(MCI: mild cognitive impairment), 경도 혹은 중등도 인지기능장애(mild-to-moderate cognitive impairment), 혈관성 치매(Vascular dementia), 소뇌아밀로이드혈관병변(cerebral amyloid angiopathy), 선천성 뇌출혈(hereditary cerebral hemorrhage), 노인성 치매(senile dementia), 다운 증후군, 봉입체 근염(inclusion body myositis), 노인성 황반변성(age-related macular degeneration) 또는 알쯔하이머병과 관련된 상태(conditions associated with Alzheimer's disease)이며, 보다 바람직하게는 알쯔하이머병이다.
본 발명에서, 알쯔하이머병은 산발성(후천성) 또는 가족성(선천성) 알쯔하이머병을 포함한다. 또한, 알쯔하이머병은 아밀로이도시스(amyloidosis)로 정의되는 퇴행성신경질환이기 때문에, 본 발명의 조성물은 다른 아밀로이도시스를 포함하는 상태, 예를 들어 비신경병증성 유전성 아밀로이드증(nonneuropathic hereditary amyloid), 매크로글로불린혈증(macroglobulinemia), 이차 가족성 지중해열, 머클- 웰즈 증후군, 다발성 골수종, 췌장- 및 심장-관련 아밀로이도시스, 만성 혈액투석 관절증(chronic hemodialysis arthropathy) 또는 핀니쉬 및 아이오와 아밀로이도시스(Finnish and Iowa amyloidosis)의 치료에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서, 용어 “아밀로이도시스(amyloidosis)”는 아밀로이드 단백질이 기관 및/또는 조직에서 비정상적으로 축적(deposit)되는 다양한 질병, 질환 또는 상태를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 알쯔하이머병과 관련된 상태는 갑상선 저하, 뇌혈관 질환, 심혈관 질환, 기억 상실, 불안, 행동 장애(behavioral dysfunction), 신경학적 상태 또는 심리학적 상태를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 행동 장애는 무관심, 초조/공격성(agitation/aggression), 우울, 과민/불안정, 불안 또는 정신이상을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 신경학적 상태는 헌팅톤병, 근위축성 측삭경화증, 후천성 면역결핍증, 파킨슨병, 실어증, 실행증, 실인증, 픽병, 루이소체 치매(DLB), 근육긴장 이상증(altered muscle tone), 발작, 감각 소실, 시야 결손(visual field deficits), 협응 장애(incoordination), 보행 장애, 일과성 허혈성 발작 또는 뇌졸증, 일과성 기민성, 주의력 결핍, 잦은 낙상(frequent falls), 실신, 신경안정제에 대한 감수성, 정상 뇌압 수두증(NPH), 경막하혈증, 뇌종양, 외상후 뇌손상 또는 저산소증후 손상(posthypoxic damage)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 심리학적 상태는 우울, 망상, 착각, 환각, 성기능 장애, 체중 감소, 정신병, 수면 장애, 불면증, 행동 탈억제(behavioral disinhibition), 시력 감퇴, 자살 충동(suicidal ideation), 우울증, 과민, 안헤도니아(anhedonia), 은둔형 외톨이 또는 과도한 죄책감(excessive guilt)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 NIa 프로테아제 단백질을 유효성분으로써 이용하기 위해 NIa 프로테아제가 효과적으로 세포 내로 침투할 수 있어야 한다.
NIa 프로테아제를 유효성분으로 이용하는 경우, 단백질 운반 도메인(PTD: protein transduction domain)을 NIa 프로테아제에 부착시키는 것이 바람직하다. 즉, 유효성분으로서 본 발명의 NIa 프로테아제를 세포 내로 도입(permeable peptide transduction)하기 위하여 단백질 운반 도메인(PTD: protein transduction domain)을 상기 단백질과 융합하여 융합 단백질을 만든다. 상기 단백질 운반 도메인(PTD)은 라이신/아르기닌 등 기본 아미노산 잔기들을 주로 포함하고 있어서 이와 융합된 단백질들을 세포막을 투과하여 세포내로 침투시키는 역할을 한다. 상기 단백질 운반 도메인(PTD)은 바람직하게는 HIV-1 Tat 단백질, 드로소필라 안테나페디아의 homeodomain, HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유도된 MTS 펩타이드, 페네트라틴, 트랜스포탄 또는 Pep-1 펩타이드에서 유래된 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
NIa 프로테아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달 체를 유효성분으로 이용하는 경우, NIa 프로테아제-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트 (expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, 용어“유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
상기 발현 컨스트럭트에서, NIa 프로테아제 유전자는 프로머터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, NIa 프로테아제 유전자에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포 에서 작동하여 NIa 프로테아제 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM- CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, CMV 프로모터이다.
바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 NIa 프로테아제-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 “프로모터-NIa 프로테아제 인코딩 뉴클레오타이드 서열-폴리 아데닐화 서열”의 구조를 갖는다.
본 발명은 상술한 NIa 프로테아제 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NIa 프로테아제 변이체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
NIa 프로테아제의 활성을 갖도록 하는 변이를 갖는다면, 본 발명의 NIa 프로테아제 변이체는 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열(제1서열, GenBank 접근번호: AAK82884) 또는 뉴클레오타이드 서열(제2서열, GenBank 접근번호: AF394602)에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 NIa 프로테아제 변이체 자체에 변화를 가져올 수도 있다. NIa 프로테아제 변이체의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 NIa 프로테아제 변이체와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.
본 발명의 NIa 프로테아제 변이체 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 NIa 프로테아제 변이체와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여 되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보 다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 NIa 프로테아제 변이체 단백질 또는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992); 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.
NIa 프로테아제 변이체-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 NIa 프로테아제-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드에 적용하여 제조된다.
ⅰ. 플라스미드
플라스미드는 매우 간편하고 용이하게 다룰 수 있는 유전자 전달 시스템으로서 당업계에서 널리 이용되고 있다. 본 발명에 있어서, NIa 프로테아제 변이체-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포 에서 작동하여 NIa 프로테아제 변이체를 발현할 수 있는 것으로서, 당업계에 잘 알려진 발현 벡터들을 포함하며, 예를 들어 pcDNA3, pcDNA3.1 시리즈(예: pcDNA3.1D/V5-His-TOPO, pcDNA3.1/mycHisC(-)), pcDNAI, pTracer-SV40, pCDM8, pCEP4, pRc/CMV, pREP9, pCDM8, pCR2.1, pCR3.1, pCRIII, pSG5, pCMV4, pCMV/Nu/Myc, pGW1, pEGFP-C2, pC1-S65T, YIp5, YCpl9, pMSG, pAV009/A+, pMAMneo-5, pSecTag2B 또는 yT&A 벡터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, pcDNA3 벡터이다.
ⅱ. 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR(inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역(E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서 본 발명의 NIa 프로테아제 변이체 유전자는 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템은 “프로모터-NIa 프로테아제 변이체 유전자-폴리 A 서열”이 연결된 구조를 갖으며, 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역, 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된 것이다.
또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서 아데노바이러스에 삽입되는 NIa 프로테아제 변이체 유전자는 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.
아데노바이러스에 의해 운반되는 NIa 프로테아제 변이체 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다. 따라서 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.
ⅲ. 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, NIa 프로테아제 변이체 유전자는 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하 지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열이 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). NIa 프로테아제 변이체 유전자, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.
ⅳ. AAV 벡터
아데노-관련 바이러스(AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.
유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열(NIa 프로테아제 변이체 유전자)을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))를 동시형질전환시켜 제조된다.
ⅴ. 다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러 스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, NIa 프로테아제 변이체 유전자를 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
ⅵ. 리포좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine(Gibco BRL)이 있다. NIa 프로테아제 변이체 유전자를 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 NIa 프로테아제 변이체 유전자를 운반한다.
한편, 상술한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.
본 발명에서, 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.
본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 NIa 프로테아제의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 NIa 프로테아제의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 NIa 프로테아제는 상술한 본 발명의 플라스미드와 동일한 것이므로, 플라스미드에 대한 상세한 설명은 본 발명의 약제학적 조성물에도 그대로 적용된다. 따라서 본 명세서의 불필요한 반복 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 공통 사항은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형 태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 정제된 NIa 프로테아제가 아밀로이드 β를 효과적으로 분해하였을 뿐만 아니라 세포 내외부의 아밀로이드 β에 의한 세포 사멸의 정도가 세포질에서 발현된 NIa 프로테아제에 의해 억제되었다(참조: 도 4 및 도 5). 이것은 NIa 프로테아제에 의해 아밀로이드 β 독성이 효과적으로 제거된다는 것을 의미하므로, 본 발명의 조성물을 알쯔하이머 환자에게 투여함으로써 알쯔하이머병의 발병과 진행에 결정적인 역할을 하는 인자인 아밀로이드 β를 분해할 수 있다. 따라서 본 발명의 NIa 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 알쯔하이머병 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.