KR101130695B1 - 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 ｏｋ1-6 균주, 상기 균주를 이용하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조한 김치 - Google Patents

오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 ｏｋ1-6 균주, 상기 균주를 이용하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조한 김치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P), 상기 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 이용하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조한 김치 및 상기 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 포함하는 건강기능식품 바람직하게는 항비만 효과를 나타내는 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명은 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주, 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 이용하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법 및 이러한 방법에 의해 제조한 오르니틴을 함유하는 김치, 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 포함하는 건강기능식품, 바람직하게는 항비만 효과를 나타내는 건강기능식품을 제공할 수 있다.

Description

오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 ＯＫ1-6 균주, 상기 균주를 이용하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조한 김치{The strain of Weissella koreensis OK1-6 having ornithine production capacity and the method of Kimchi preparation containing ornithine, and Kimchi prepared by the method}
본 발명은 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P), 상기 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 이용하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조한 김치 및 상기 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 포함하는 건강기능식품 바람직하게는 항비만 효과를 나타내는 건강기능식품에 관한 것이다.
김치는 오랜 역사를 가진 한국의 대표 발효식품으로 2001년 7월 Codex 국제 식품규격을 획득하여 세계 각국의 절임류와는 차별화된 자연발효식품이다. 또한 김치에는 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C 등이 풍부하며 건강에 좋은 박테리아인 젖산균이 많아 소화를 도와줄 뿐만 아니라 암세포의 성장을 막는 성분들을 가지고 있는 것으로 밝혀지고 있어 세계에서 가장 건강한 식품(World's Healthiest Foods) 5가지 중의 하나로 김치를 선정되기도 하였다
김치는 여러 발효생성물과 재료성분인 식이성분, 비타민, 카로틴, 젖산, 젖산균, 아세틸콜린, 덱스트란(dextran), 아세테이트(acetate) 등이 풍부하여 인체 내에서 면역증강, 항산화, 항균, 항콜레스테롤, 발암 및 변이 물질의 생성을 방지하는 기능을 갖는 기능성 식품으로 알려져 있다. 특히 채소에 풍부한 식이섬유는 변비를 예방하며 풍부한 젖산균은 장내의 유해 미생물의 생육을 억제하여 장내 균총을 개선하는 프로바이오틱(probiotic) 효과를 갖는다. 실제로 김치를 하루에 300g/day 쯤 먹으면 안 먹은 사람에 비하여 대장에 젖산균이 100배가량 증가하므로 김치는 장을 튼튼히 하고, 유해한 균의 생육을 저지하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
김치에는 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genera), 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 바이셀라(Weissella) 속 등의 주요 균주가 있고 이들 균주가 김치발효에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이중 김치속의 풍부한 젖산균들은 락테이트(lactate), 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid, GABA), 박테리오신(bacteriocin) 등 다양한 물질들을 생산하여 식품의 보존, 산미와 향미의 부여, 식중독균의 억제 효과 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) 등의 균주는 한국 김치의 맛을 결정하는 우점종으로 알려져 있다. 또한 김치 젖산균 생성물질들은 체내 지질개선, 면역증강, 항 AI(avian influenza) 효능 등의 효과가 있어 의약품이나 화장품의 중간물질로도 이용되고 있다.
L-오르니틴(L-ornithine)은 단백질을 구성하는 아미노산이 아니지만 식품에 통상 함유돠어 있는 아미노산이다. 특히 담수성 쌍각류조개, 재첩중의 L-오르니틴 함량이 비교적 높다. 재첩엑기스 100g중에 유리 오르니틴 함량은 159.9mg이며, 재첩을 저온처리하면 유리 L-오르니틴 함량이 상승한다고 알려져 있다. L-오르니틴은 성장호르몬을 분비시켜 근육의 합성을 증가시키고, 기초대사를 촉진시켜 비만을 예방하는 식품소재로서 미국을 중심으로 많이 이용되고 있다. 최근에는 주름살 개선과 같은 피부미용 효과 등 새로운 기능성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한 L-오르니틴은 L-오르니틴과 알파케토글루타릴산이 2:1의 비율로 함유되어 있는 L-오르니틴-알파케토글루타릴산염(OKG)의 형태로 근육증강, 비만예방 및 면역증강 소재로서 폭넓게 이용되고 있고, 유럽에서는 L-오르니틴-L-아스파라긴산염의 형태로 간장장애를 개선하는 의약품으로 이용되고 있다.
일본에서는 L-오르니틴 염산염의 형태로 식품소재로서 사용가능하며, 미국에서는 식이보조제로서 사용가능하나 국내에서는 아직 식약청에 식품첨가물로 등재되어 있지 않아 사용이 곤란한 실정이다. 이에 발효식품 유래의 오르니틴 고생산성 균주를 이용하여 식품을 발효시키면 보통 식품보다 오르니틴 등의 영양기능성, 젖산균으로 인한 풍미, 향미 등이 증진된 발효식품을 제조할 수 있을 것으로 기대되어 이에 대한 연구 필요성이 제기 되었다.
따라서, 본 발명은 우리나라 고유의 음식의 하나인 김치로부터 오르니틴 생성능력이 있는 젖산균의 분리, 동정 및 특성 등에 대하여 연구함으로써 김치 젖산균의 생리활성물질 생성능력을 파악하고 이를 통해 우리김치의 우수성을 과학적으로 입증하고자 한다. 또한, 본 발명의 결과를 토대로 우리나라 발효식품유래의 오르니틴 생성 미생물에 대한 체계적인 연구를 진행 하고자 한다.
본 발명의 목적은 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 이용하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법 및 이러한 방법에 의해 제조한 오르니틴을 함유하는 김치를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 포함하는 건강기능식품을 제공하고자 한다.
본 발명은 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 제공할 수 있다.
본 발명은 김치의 제조방법에 있어서, 상기의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 첨가하는 단계를 포함하도록 하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법 및 이러한 방법에 의해 제조한 오르니틴을 함유하는 김치를 제공할 수 있다.
본 발명은 건강기능식품에 있어서, 상기의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 포함하는 건강기능식품을 제공할 수 있다.
본 발명은 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 제공할 수 있다.
본 발명은 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 이용하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법 및 이러한 방법에 의해 제조한 오르니틴을 함유하는 김치를 제공할 수 있다.
본 발명은 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 포함하는 건강기능식품, 바람직하게는 항비만 효과를 나타내는 건강기능식품을 제공할 수 있다.
도 1은 김치로부터 오르니틴을 생성하는 후보 균주의 오르니틴 생성가능성을 나타낸 TLC 이다.
도 2a는 오르니틴을 생성하는 선발된 균주 Weissella koreensis OK1-4(○), Weissella koreensis OK1-6(□)가 MRS 배지에서 성장시 pH에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 오르니틴을 생성하는 선발된 균주 Weissella koreensis OK1-4(○), Weissella koreensis OK1-6(□)가 MRS 배지에서 성장시 온도에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 1％ 아르기닌이 첨가된 MRS 배지에서(pH 6.5, 30℃) 배양 시간에 따른 Weissella koreensis OK1-4(○), Weissella koreensis OK1-6(□), Weissella koreensis(KCCM41517)(◇) 및 Lactobacillus hilgardii(KCCM40759) 균주(△)의 성장속도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 1％ 아르기닌이 첨가된 MRS 배지에서(pH 6.5, 30℃) Weissella koreensis OK1-4, Weissella koreensis OK1-6, Weissella koreensis(KCCM41517) 및 Lactobacillus hilgardii(KCCM40759) 균주를 각각 48시간 동안 배양 후 각각의 균주에 대한 오르니틴 함량 분석을 나타낸 TLC이다(도 4에서 Lane 1, spot of standard arginine; Lane 2, spot of standard ornithine; lane 3-6, spots of Weissella koreensis OK1-4, Weissella koreensis OK1-6, Weissella koreensis KCCM41517, L. hilgardii KCCM40759 cultures, respectively. The spots with circles are in the same location as the standard ornithine.)
도 5a는 1％ 아르기닌이 첨가된 MRS 배지에서(pH 6.5, 30℃) Weissella koreensis OK1-6 균주를 배양시 배양초기(0시간)에서의 HPLC를 나타낸 그래프이다.
도 5b는 1％ 아르기닌이 첨가된 MRS 배지에서(pH 6.5, 30℃) Weissella koreensis OK1-6 균주를 48시간 동안 배양시의 HPLC를 나타낸 그래프이다.
도 6은 3T3-L1 세포에 대하여 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌이 배지 전체 중량 대비 1.0％(w/v) 포함된 MRS 배지에 첨가하고 30℃에서 48시간 동안 배양하여 얻은 세포(S1)와 배양액(S2)을 각각 처리한 것, MRS 배지를 처리한 것(Cont)에 대한 지방구 생성을 측정한 그래프이다.
도 7은 도 6에서와 같은 방법으로 얻은 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P) 시료를 첨가한 실험군인 S1, S2과 MRS 배지를 처리한 것(Cont)의 Triglyceride(TG) 함량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 1에서 제조한 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 포함하는 배추김치(●)와 비교예에서 제조한 배추김치(▲)를 30일 동안 4℃의 온도에서 발효시킨 후 오르니틴 함량을 측정한 그래프이다.
본 발명은 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 나타낸다.
본 발명의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)는 김치로부터 분리할 수 있다.
본 발명은 김치의 제조방법에 있어서, 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 첨가하는 단계를 포함하도록 하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 김치의 제조방법에 있어서, 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 0.05～1.0％(w/v) 첨가하는 단계를 포함하도록 하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 김치의 제조방법에 있어서, 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌이 포함된 배지에 첨가하고 배양하여 얻은 배양액을 첨가하는 단계를 포함하도록 하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 김치의 제조방법에 있어서, 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌이 배지 전체 중량 대비 0.05～1.0％(w/v) 포함된 MRS 배지에 첨가하고 25～37℃에서 24～48시간 동안 배양하여 얻은 배양액 0.1～2.0％(w/v)을 첨가하는 단계를 포함하도록 하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법을 나타낸다.
상기에서 김치는 배추, 무, 갓 또는 열무를 주재료로 하는 김치인 배추김치, 무김치(일명 깍두기), 갓김치 또는 열무김치를 나타낸다.
본 발명의 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P) 또는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 배지에서 배양하여 얻은 배양액을 포함하는 김치의 제조방법에 있어서 김치의 재료는 통상적으로 사용하는 재료를 적의 선택하여 실시할 수 있으면 족하므로 김치 재료에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.
본 발명은 상기에서 언급한 김치의 제조방법에 의해 제조한 오르니틴을 함유하는 김치를 포함한다. 이때 김치는 배추, 무, 갓 또는 열무를 주재료로 하는 김치인 배추김치, 무김치(일명 깍두기), 갓김치 또는 열무김치를 나타낸다.
상기에서 언급한 김치의 제조방법에 의해 제조한 본 발명의 오르니틴을 함유하는 김치는 5℃ 이하의 온도에서 저장 및/또는 숙성시킬 수 있다.
상기에서 언급한 김치의 제조방법에 의해 제조한 본 발명의 오르니틴을 함유하는 김치는 -1℃ 내지 5℃의 온도에서 저장 및/또는 숙성시킬 수 있다.
본 발명은 건강기능식품에 있어서, 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 포함하는 건강기능식품을 나타낸다.
본 발명은 건강기능식품에 있어서, 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 건강기능식품 전체 중량 대비 0.05～1.0％(w/v) 포함된 건강기능식품을 나타낸다.
본 발명은 건강기능식품에 있어서, 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌이 포함된 배지에 첨가하고 배양하여 얻은 배양액을 포함하는 건강기능식품을 나타낸다.
본 발명은 건강기능식품에 있어서, 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌이 배지 전체 중량 대비 0.05～1.0％(w/v) 포함된 MRS 배지에 첨가하고 25～37℃에서 24～48시간 동안 배양하여 얻은 배양액 0.1～2.0％(w/v)을 포함하는 건강기능식품을 나타낸다.
상기에서 건강기능식품은 항비만 효과가 있는 건강기능식품을 나타낸다.
본 발명의 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P) 또는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 배지에서 배양하여 얻은 배양액을 포함하는 항비만 효과가 있는 건강기능식품에 있어서 항비만 효과가 있는 건강기능식품의 구성 성분은 종래 항비만 효과가 있는 건강기능식품의 구성 성분을 적의 선택하여 실시할 수 있으면 족하므로 항비만 효과가 있는 건강기능식품의 구성 성분에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.
본 발명의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 이용하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법, 이러한 방법에 의해 제조한 오르니틴을 함유하는 김치 및 상기의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 포함하는 건강기능식품에 대해 다양한 조건으로 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 이용하여 오르니틴을 함유하는 김치의 제조방법, 이러한 방법에 의해 제조한 오르니틴을 함유하는 김치 및 상기의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주를 포함하는 건강기능식품을 제공하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 내용을 실험예, 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실험예>
본 발명은 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)의 분리, 동정에 대해 하기에서 보다 상세히 설명하고자 한다.
[재료 및 방법]
(1)김치로부터 오르니틴 생성능이 있는 Weissella 속 후보 균주의 분리
김치의 맛을 결정하는 중요한 우점종의 하나로 알려진 바이셀라(Weissella) 속 균주의 생리활성물질 생산 능력에 대한 연구의 일환으로 오르니틴 생산능이 있는 젖산균을 김치로부터 분리하였다. 김치 시료료는 펩톤수로 10-1 ～ 10-8 범위로 희석하였고, 희석액을 1mL씩 분주하여 DE MAN, ROGOSA and SHARPE(MRS) 아가 배지(Difco, Detroit, MI, USA)에 배양하였다. 배지에는 0.002％ Bromocresol purple(BCP)(Sigma Chemical Co. St. Louis, USA)이 첨가되었고, 콜로니를 얻기위해 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 콜로니 중에서 환을 형성하지 않으면서 진한 노랑색을 띄는 것을 Weissella 속 후보군으로 분리하였다. 이어 오르니틴 생성가능성은 TLC를 이용하여 조사하였다. TLC는 silica gel F254과 표준 오르니틴(Merck, Damstadt, Germany), 이동상(Butanol: Acetic acid: Dichoromethanol: water= 5:3:3:3)을 이용하여 실시하였다.
(2)오르니틴 생성능이 있는 Weissella 속 균주의 동정
균주 동정을 위해 후보 균주로부터 genomic DNA를 DNeasyㄾ Blood ＆ Tissue kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 분리하였다. DNA의 정제는 제조사의 지침을 따랐다. 16S rDNA의 클로닝을 위해 Primer는 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(Forward)(서열목록 1)와 5'-ACGGGCGGGTGTGTRC-3'(Reverse)(서열목록 2)를 이용하여 PCR 증폭을 시행하였다. PCR 증폭은 100ng 주형 DNA, 0.5μM의 프라이머 DNA, 0.2mM dNTPs, 10X Ex Taq 완충액 및 Taq 중합효소(Takara bio Inc., Shiga, Japan) 0.025U/㎕을 사용하여 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초의 어닐링(annealing), 72℃에서 1분 30초의 신장으로 하는 35cycle을 Biometra thermocycler(Tampa, Florida, USA)로 증폭시켰다. PCR 산물을 1％ 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 확인하였다. 확인된 PCR 산물을 PCR 정제키트(Purification Kit)(Bioneer, Korea)를 이용하여 정제한 후, T4 liagase를 이용하여 pGEM T-easy vector(Promega, Madison, WI, USA)에 ligation 하였으며, 16S rDNA sequencing 통해 OK1-4와 OK1-6의 염기서열 정보를 얻었다. 얻어진 16S rDNA의 서열정보를 이용하여 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 DNA의 상동성 조사에 활용하였으며, Clustal X 프로그램을 통해 공시균주의 염기서열과의 상동성을 비교분석하였다.
(3)김치로부터 분리한 Weissella 속 균주의 특성
분리된 균주의 당 발효패턴과 생화학적인 특성을 조사하기 위하여 API 50 CHL kit (BioMerieux sa, Marcy-L'Etoile, France)를 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 카탈라아제 활성은 3％(v/v) 과산화 수소를 이용한 기포생성 여부로 판단하였고, 글루코오스로부터의 이산화탄소 생성 여부는 Durham 관을 이용하여 판단하였다(Lee, J.S., K.C. Lee, J.S. Ahn, T.I. Mheen, Y.R. Byun and Y.H. Park. 2002. Weissella. koreensis sp. nov., isolated from kimchi. Int'l J. Syst. Evol. Microbial. 52, 1257-1261.). 균주의 성장에 대한 pH의 영향을 측정하기 위해 100mM sodium acetate/100mM acetate 완충액(pH 4.0～6.0)과 100mM Na2HPO4/100mM HCl 완충액(pH 7.0～8.0)으로 MRS 배지를 조제하여 균주를 30℃에서 배양하였다. 온도의 영향을 조사하기 위하여 MRS 배지(Difco, Detroit, MI, USA, pH 6.5)를 이용하여 4～40℃ 범위에서 균주를 배양하였다. 선발된 균주의 오르니틴 생성능을 측정하기 위하여 1％ 아르기닌이 첨가된 MRS 배지(Difco, Detroit, MI, USA, pH 6.5)에 균주를 접종하고 30℃에서 30～48시간 배양하였고, 5,000×g에서 20분간 원심분리 한 후 세포와 배양액을 분리하여 각각 오르니틴을 분석하였다.
(4)오르니틴의 분석
오르니틴 분석은 800㎕의 용매(methanol: chloroform: water = 12:5:3(v/v))를 200㎕의 세포액 및 배양액 시료에 가하여 혼합 하였다. 혼합액을 원심분리(13,000xg, 4℃, 15분)하여 수용액층인 상등액을 1차 회수 하였고, 유기용매층에 클로로포름과 물(1:2(v/v)) 혼합액 600㎕을 가하여 혼합한 후 원심분리하여 상등액을 2차 회수하였다. 1, 2차 회수한 상등액을 합하여 동결건조 하였고, 초순수로 용해하여 0.45㎛ PVDF 막을 통과시켜 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. HPLC(Waters, Milford, MA, USA) 분석을 위해 시료는 6-aminoquioly-N-hydroxysuccinimidyl carbonate (AQC)로 유도체화 하였고, 3.9x150mm AccQㅇTagTM(Nova-PakTMC18, Waters) 칼럼으로 유도체들을 분리하였다(Seok, J.H., K.B. Park KB, Y.H. Kim, M.O. Bae, M.K. Lee and S.H. Oh. 2008 Production and characterization of Kimchi with enhanced levels of γ-aminobutyric acid. Food Sci. Biotechnol. 17, 940-946.). 오르니틴함량은 표준 오르니틴의 HPLC 분석결과를 토대로 작성한 표준곡선을 이용하여 산출 하였다.
[결과]
(1)김치로부터 오르니틴 생성 Weissella 속 후보 균주의 분리
김치로부터 오르니틴을 생성하는 젖산균을 분리하기 위해 브로모페놀블루가 첨가된 MRS 배지에서 자란 콜로니 중 환을 형성하지 않고 진한 노랑색을 띄는 것들을 후보 균주로 선발하였다. 후보 균주의 오르니틴 생성가능성은 TLC를 이용하여 조사하였다. TLC를 통하여 오르니틴 생성능이 우수한 4개의 후보 균주를 선발하였다(도 1 참조). 선발된 균주들 중 OK1-4와 OK1-6의 형태학적 및 생화학적 특성을 조사한 결과 분리된 균주는 그람 양성, 단간균 이었으며, 혐기적 조건에서 이산화탄소를 생성하였다. 분리된 젖산균주는 L-아라비노스, 자일로스, 리보오스, 글루코오스를 분해하여 산을 생성하였고, 셀로비오스(cellobiose), 갈락토오스(galactose), 라피노오스(raffinose), 트레할로스(trehalose)는 분해하지 못하였다(표 1 참조). 선발된 균주는 MRS 배지에서 25～37℃ 범위와 pH 6.0～7.0 범위에서 자랐으며, 성장을 위한 최적 온도와 pH는 각각 30℃와 pH 6.5이었다(도 2a, 도 2b 참조). 이와 같은 선발 균주의 특성들은 Weissella 속 균주와 대체적으로 일치하였으며 본 발명에서 분리한 균주는 김치에서 분리되어 기 보고된 Weissella koreensis S-5623 균주(Lee, J.S., K.C. Lee, J.S. Ahn, T.I. Mheen, Y.R. Byun and Y.H. Park. 2002. Weissella. koreensis sp. nov., isolated from kimchi. Int'l J. Syst. Evol. Microbial. 52, 1257-1261.)와 생화학적인 특성이 매우 유사한 것으로 확인되었다. 다만 성장을 위한 최적 온도와 최적 pH의 경우 본 균주가 30℃와 pH 6.5로 Weissella koreensis S-5623 균주의 25℃와 pH 6.0과는 약간의 차이가 있었다.
특성 OK1-4 OK1-6
Gram stain + +
Catalase - -
Cell shape short rod short rod
CO2 producton + +
Spore formation - -
L-Arabinose + +
Ribose + +
Xylose + +
Glactose - -
Glucose + +
Fructose + +
Manose + +
N-acetylglucosamine + +
Arbutin - -
Esculin - -
Salicin - -
Cellobiose - -
Maltose - -
Lactose - -
Trehalose - -
Tagatose - -
Raffinose - -
Potassium gluconate + +
Glycerol - -
Dulcitol - -
Mannitol - -
Sorbitol - -
Amygdain - -
Inulin - -
Sucrose - -
Glycogen - -
상기 표 1에서 +는 양성(positive), -는 음성(negative)을 의미한다.
(2)16S rDNA 서열분석에 의한 균주의 동정
선발된 균주의 동정을 위해 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다. 선발균주 Weissella sp. OK1-4와 Weissella sp. OK1-6의 16S rDNA 염기서열은 Weissella koreensis S5623(Access No. AY035891)의 16S rDNA 염기서열과 각각 99.6％와 99.7％ 상동성을 보였다(서열목록 3의 Weissella koreensis OK1-4 염기서열 및 서열목록 4의 Weissella koreensis OK1-6 염기서열 참조). 이들 결과를 종합하고, Sharpe 등의 젖산균 동정방법(Sharpe, M.E., T.F. Fryer, and D.G. Smith. 1996. Identification of lactic acid bacteria. p. 65-79. In B.M. Gibbs and F.A. Skinner (ed.). Identification Methods for Microbiologists: part A. Academic Press, Inc., New York, USA.)을 참고로 이들 균주를 Weissella koreensis 균주로 동정하고, Weissella koreensis OK1-4와 Weissella koreensis OK1-6라 명명하였다. Weissella koreensis OK1-4와 Weissella koreensis OK1-6는 16S rDNA 염기서열이 거의 동일한 것으로 밝혀져(99.9％) 같은 종의 부류임을 알 수 있었다. 분리된 균주 Weissella koreensis OK1-6는 2009년 11월 12일 한국미생물보존센터에 KFCC11469P로 기탁하였다.
(3)바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) OK 균주의 오르니틴 생성능
선발된 균주 Weissella koreensis OK1-4와 Weissella koreensis OK1-6의 오르니틴 생성능을 조사하기 위하여 1％ 아르기닌이 첨가된 MRS 배지에서(pH 6.5, 30℃) 균주를 배양하였다. Arginine deaminase(ADI) 경로를 가지고 있어 오르니틴을 생성하는 것으로 알려진 Lactobacillus hilgardii 균주(KCCM40759)와 오르니틴 생성 여부가 아직 알려져 있지 않은 공시균주 Weissella koreensis(KCCM41517)를 대조균주로 사용하였다. Weissella koreensis OK1-4와 Weissella koreensis OK1-6의 성장속도는 매우 유사하였으며, W. koreensis(KCCM41517)와 L. hilgardii(KCCM40759)의 초기 성장속도는 상대적으로 약간 느린 편 이었다. 그러나 이들 균주는 모두 배양 24시간 경과시부터는 정상기에 도달하는 것으로 나타났다(도 3 참조). 이들 균주의 오르니틴 생성정도는 TLC와 HPLC를 이용하여 정성 및 정량분석 하였다. 본 실험에서 사용한 균주들은 모두 오르니틴을 생성하였고(도 4 참조), 오르니틴 생성량은 Weissella koreensis OK1-6, Weissella koreensis KCCM41517, Weissella koreensis OK1-4. L. hilgardii 순이었다(표 2 참조). 1％ arginine이 첨가된 MRS 배지에서 48시간 동안 배양 후 Weissella koreensis OK1-4와 Weissella koreensis OK1-6 균주의 오르니틴 생성능력은 각각 27.01mg/L/hr와 31.41mg/L/hr이었다(표 2 참조). 48시간 배양을 통해서 Weissella koreensis OK1-6 균주는 첨가한 아르기닌을 거의 모두 대사하였고(도 5a, 도 5b 참조), Weissella koreensis KCCM41517, Weissella koreensis OK1-4와 L. hilgardii 균주들도 첨가한 아르기닌을 시간에 따른 차이가 있기는 하지만 거의 대사하는 것으로 조사되었다(data not shown).
균주 오르니틴 생성량
(Ornithine productivity, mg/L/hr)
Weissella koreensis OK1-4 27.01
Weissella koreensis OK1-6 31.41
Weissella koreensis KCCM41517 29.23
Lactobacillus hilgardii KCCM40759 21.27
<시험예 1>
지방세포로 분화하는 세포인 3T3-L1 세포에 대하여 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌이 배지 전체 중량 대비 1.0％(w/v) 포함된 MRS 배지에 첨가하고 30℃에서 48시간 동안 배양하여 얻은 세포(S1)와 배양액(S2)을 각각 처리한 것, MRS 배지를 처리한 것(Cont)에 대한 지방구 생성을 측정하고 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이를위해 분화가 유도된 3T3-L1 cell을 PBS로 2회 세척 후, 10％ buffered neutal formailn 으로 24시간 고정하고, 60％ isopropanol로 30초간 헹구어 낸 다음 oil red O로 1시간 동안 염색하였다. 다시 60％ isopropanol로 5초간 탈색하고 남아있는 물기를 건조시킨 뒤 현미경 (olympus CKX41, JAPAN)으로 염색된 지방구를 확인하였다. 현미경 확인 후 염색되었던 oil red O를 60％ isopropanol로 1시간 동안 재용출 시킨 뒤 500nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 6에서 보면 3T3-L1 세포에 대하여 MRS 배지를 처리한 것(Cont)에 비해 3T3-L1 세포에 대하여 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 첨가한 실험군인 S1, S2에서 지방구 생성이 유의적으로 감소하였음을 알 수 있었다. 특히 S2의 경우 오르니틴 함량이 4.65mg/100g이고, S1의 오르니틴 함량이 120.05mg/100g 인바, 오르니틴 함량이 높을수록 3T3-L1 세포에 대해 낮은 지방구 생성을 보임을 알 수 있었다(표 3 참조).
실험군 균주배양 조건 및 균주시료 분리 오르니틴 함유량 (mg/100g)
S1 Weissella
Kroreensis OK1-6		 MRS+1％Arg 세포 120.05
S2 배양액 4.65
<시험예 2>
지방세포로 분화하는 세포인 3T3-L1 세포에 대하여 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌이 배지 전체 중량 대비 1.0％(w/v) 포함된 MRS 배지에 첨가하고 30℃에서 48시간 동안 배양하여 얻은 세포(S1)와 배양액(S2)을 각각 처리한 것, MRS 배지를 처리한 것(Cont)에 대한 트리글리세라이드(Triglyceride, TG) 생성을 측정하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 이를 위해 분화 배양 4일 후 3T3-L1 cell을 PBS로 2번 세척하고, 세포 스크리퍼를 이용하여 수집하였다. 수집된 세포는 초음파 분쇄 후 4℃에서 500×g, 10분간 원심분리 (Hanil MICRO 17R, KOREA)하여 상층액을 농도 측정에 이용하였다. TG는 시중 판매되는 kit를 사용하여 측정하였다(Asan, KOREA). 도 7에서 보면 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 첨가한 실험군인 S1, S2에서 MRS 배지를 처리한 대조군(Cont)에 비해 Triglyceride(TG) 함량이 유의적으로 감소하였음을 알 수 있었다. 특히 S2의 경우 오르니틴 함량이 4.65mg/100g이고, S1의 오르니틴 함량이 120.05mg/100g 인바, 오르니틴 함량이 높을수록 3T3-L1 세포에 대해 낮은 TG 함량을 보임을 알 수 있었다.
<실시예 1>
절임배추 1.3kg에 대하여 김치 양념 믹스 0.7kg을 혼합하였다.
상가의 절임배추 및 김치 양념 믹스 혼합물에 혼합물 전체 중량 대비 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P) 1.0％(w/v)를 첨가하여 배추김치를 제조하였다.
상기의 김치 양념 믹스는 고춧가루 100중량부에 대하여 생강 15중량부, 마늘 30중량부, 양파 30중량부, 파 10중량부, 조기액젓 40중량부를 혼합한 것을 사용하였다.
<실시예 2>
절임배추 1.3kg에 대하여 김치 양념 믹스 0.7kg을 혼합하였다.
상가의 절임배추 및 김치 양념 믹스 혼합물에 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌(arginine)이 배지 전체 중량 대비 1.0％(w/v) 포함된 MRS 배지에 첨가하고 30℃에서 48시간 동안 배양하여 얻은 배양액 0.1％(w/v)를 첨가하여 배추김치를 제조하였다.
상기의 김치 양념 믹스는 고춧가루 100중량부에 대하여 생강 15중량부, 마늘 30중량부, 양파 30중량부, 파 10중량부, 조기액젓 40중량부를 혼합한 것을 사용하였다.
<비교예>
절임배추 1.3kg에 대하여 김치 양념 믹스 0.7kg을 혼합하여 배추김치를 제조하였다.
상기의 김치 양념 믹스는 고춧가루 100중량부에 대하여 생강 15중량부, 마늘 30중량부, 양파 30중량부, 파 10중량부, 조기액젓 40중량부를 혼합한 것을 사용하였다.
<시험예 3>
상기 실시예 1에서 제조한 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 포함하는 배추김치(●)와 비교예에서 제조한 배추김치(▲)를 30일 동안 4℃의 온도에서 발효시킨 후 오르니틴 함량을 측정하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서처럼 본 발명의 실시예 1에서 제조한 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 포함하는 배추김치(●)는 비교예에서 제조한 배추김치(▲)에 비해 오르니틴 함량이 월등의 높음을 알 수 있었다.
<실시예 3> 건강기능식품 제조
차전자피분말 5kg, 알로에분말 0.5kg, 글루코만난 4.0kg, 폴리덱스트로스 6.0kg, 다시마분말 2.0kg, 식이섬유 2.5kg, 옥수수전분 5.0kg을 혼합하였다.
상기의 혼합물에 혼합물 전체 중량 대비 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P) 1.0％(w/v)를 첨가하여 혼합한 다음 이를 제환기에서 제환하여 환 제형의 건강기능식품을 제조하였다.
<실시예 4> 건강기능식품 제조
차전자피분말 5kg, 알로에분말 0.5kg, 글루코만난 4.0kg, 폴리덱스트로스 6.0kg, 다시마분말 2.0kg, 식이섬유 2.5kg, 옥수수전분 5.0kg을 혼합하였다.
상기의 혼합물에 혼합물 전체 중량 대비 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌(arginine)이 배지 전체 중량 대비 1.0％(w/v) 포함된 MRS 배지에 첨가하고 30℃에서 48시간 동안 배양하여 얻은 배양액 0.1％(w/v)를 첨가하여 혼합한 다음 이를 제환기에서 제환하여 환 제형의 건강기능식품을 제조하였다.
<비교예> 위약 제조
차전자피분말 5kg, 알로에분말 0.5kg, 글루코만난 4.0kg, 폴리덱스트로스 6.0kg, 다시마분말 2.0kg, 식이섬유 2.5kg, 옥수수전분 5.0kg을 혼합하였다. 상기의 혼합물을 제환기에서 제환하여 환 제형의 위약을 제조하였다.
<시험예 4> 건강기능식품의 항비만 효과 검정
실시예 3, 4에서 제조한 건강기능식품과 비교예에서 제조한 위약에 대하여 비만억제 효과에 대한 전임상시험을 실시하였다. C57BL/6J 생쥐(4주령, 수컷) 30마리를 구입하여(Charles River Laboratories, Tokyo, Japan) 1주간 AIN-93 diet를 급여하고 환경에 적응 시킨 후 randomized block design에 의해 3군으로 나누어 12주 동안 사육하였다. 시험군을 대상으로는 실시예 3, 실시예 4에서 제조한 건강기능식품을, 대조군에는 비교예에서 제조한 위약을 고지방식이(AIN-93 diet 60％ fat calorie)에 각각 30％ 혼합하여 고루 섞은 후 재고형화 시켜 12주간 자유롭게 섭취하도록 하였다. 물은 자유롭게 섭취하도록 하였고, 식이섭취량은 격일로 섭취잔량을 측정하여 1일 섭취량으로 환산하였다. 실험 기간 동안 실내온도 23±1℃, 습도 50±2％를 유지하고, 명암은 12시간 (8:00~20:00) 주기로 조명하였다. 각각의 시험군 및 대조군에 대해 초기 및 12주 후의 체중 및 식이섭취량을 측정하고 그 결과를 아래의 표 4에 나타내었다.
항목
 대조구
 시험구
실시예 3 실시예 4
초기체중(g) 20.14 19.55 19.70
12주 후의 체중(g) 40.50 38.97 34.13
식이섭취량(g) 1.96 1.95 1.97
*상기 표 4에서 초기체중은 위약 및 건강기능식품을 섭취하기 직전의 체중을 의미한다.
상기 표 4에서처럼 본 발명의 실시예 3, 4에서 제조한 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P) 또는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 배양한 배양액을 포함하는 건강기능식품은 비만억제 효과가 있음을 알 수 있었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)는 오르니틴을 생성할 수 있어, 이러한 균주를 이용하여 김치를 제조시 오르니틴을 함유하는 우수한 특성의 김치를 제공할 수 있어 김치 소비자에게 건강 증진에 기여할 수 있다.
또한 김치 제조업체로서는 상기의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 이용하여 영양학적으로 우수한 김치를 소비자에게 제공할 수 있어 김치 관련 분야에 산업상 이용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
한국미생물보존센터(국내) KFCC11469 20091112
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Claims (8)

  1. 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)
  2. 김치의 제조방법에 있어서,
    청구항 제1항의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 청구항 제1항의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P) 0.05～1.0％(w/v)를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
  4. 김치의 제조방법에 있어서,
    청구항 제1항의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌이 포함된 배지에 첨가하고 배양하여 얻은 배양액을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 청구항 제1항의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌이 배지 전체 중량 대비 0.05～1.0％(w/v) 포함된 MRS 배지에 첨가하고 25～37℃에서 24～48시간 동안 배양하여 얻은 배양액 0.1～2.0％(w/v)을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
  6. 건강기능식품에 있어서,
    청구항 제1항의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  7. 제6항에 있어서, 청구항 제1항의 오르니틴을 생산하는 능력이 있는 바이셀라 코리엔시스 OK1-6 균주(Weissella koreensis OK1-6)(KFCC11469P)를 아르기닌이 배지 전체 중량 대비 0.05～1.0％(w/v) 포함된 MRS 배지에 첨가하고 25～37℃에서 24～48시간 동안 배양하여 얻은 배양액 0.1～2.0％(w/v)을 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  8. 제6항에 있어서, 건강기능식품은 항비만 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
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