KR101123654B1 - 대기오염물질에 의한 피부 손상 방지용의 항산화성 화장료 - Google Patents

Abstract

대기오염물질에 의한 피부 손상 방지용의 항산화성 화장료가 개시된다. 특히, 오존과 이산화질소에 의한 피부 손상 방지용의 항산화성 화장료로서의 천연추출물의 용도가 개시된다.

항산화, 피부손상, 항산화성 화장료

Description

대기오염물질에 의한 피부 손상 방지용의 항산화성 화장료 {Anti-oxidative cosmetic material for the prevention of skin damage by air-pollutants}

도 1은 DMPO-OOH?의 구조와 EPR 신호를 나타내는 도면이다.

도 2는 DMPO-OH?의 구조와 EPR 신호를 나타내는 도면이다.

도 3은 오존 농도에 따른 리포솜의 지질 산화를 상대적으로 나타내는 그래프이다.

도 4는 항산화제의 오존에 대한 리포솜 지질 산화 방어 효과를 상대적으로 나타내는 그래프이다.

도 5는 이산화질소에 의한 리포솜의 지질 산화를 상대적으로 나타내는 그래프이다.

도 6은 SDS-PAGE를 이용한 오존에 의한 단백질(알부민) 손상 정도를 나타내는 밴드이다.

도 7은 항산화제의 오존에 대한 단백질 손상 방어 효과를 나타내는 밴드이다. 이 도면에서, 레인 1은 대조군에 의한 밴드이고, 레인 2는 대조군+NaOH(시료용매)에 의한 밴드이며, 레인 3-12는 오존에 의해 처리한 밴드로서, 레인 4-6은 각각 아스코르브산을 1, 10, 100㎍/㎖의 양으로 처리한 밴드를 나타내며, 레인 7-9는 각각 카테킨을 1, 10, 100㎍/㎖의 양으로 처리한 밴드를 나타내고, 레인 10-12는 각각 케르세틴을 1, 10, 100㎍/㎖의 양으로 처리한 밴드를 나타낸다.

도 8은 이산화질소 노출 시간에 따른 단백질의 손상 정도를 나타내는 밴드이다.

도 9는 항산화제의 이산화질소에 대한 단백질 손상 방어 효과를 나타내는 도면이다. 이 도면에서, 레인 1은 대조군에 의한 밴드이고, 레인 2는 대조군+NaOH(시료용매)에 의한 밴드이며, 레인 3-12는 이산화질소에 의해 처리한 밴드로서, 레인 4-6은 각각 아스코르브산을 1, 10,100㎍/㎖의 양으로 처리한 밴드를 나타내며, 레인 7-9는 각각 카테킨을 1, 10,100㎍/㎖의 양으로 처리한 밴드를 나타내고, 레인 10-12는 각각 케르세틴을 1, 10,100㎍/㎖의 양으로 처리한 밴드를 나타낸다.

도 10은 오존에 의한 B16F10 세포의 시간에 따른 핵산 손상 정도를 나타내는 도면이다.

도 11은 이산화질소에 의한 B16F10 세포의 시간에 따른 핵산 손상 정도를 나타내는 도면이다.

도 12는 천연추출물의 오존에 대한 단백질 손상 억제 효과를 나타내는 밴드이다. 이 도면에서, 레인 1은 대조군에 의한 밴드이고, 레인 2-26은 오존에 의한 밴드이며, 레인 3-26은 10㎍/㎖, 100㎍/㎖ 천연추출물의 오존에 대한 단백질 손상 억제 효과의 정도를 나타내는 밴드로서, 레인 3-4는 생열귀, 레인 5-6은 녹차, 레인 7-8은 오가피잎, 레인 9-10은 가시나무, 레인 11-12는 더덕, 레인 13-14는 도깨비바늪, 레인 15-16은 도라지, 레인 17-18은 토사자, 레인 19-20은 마, 레인 21-22는 마로니에, 레인 23-24는 딱총나무, 레인 25-26은 신탁나무잎에 의한 오존에 대 한 단백질 손상 억제 정도를 나타내는 밴드이다.

도 13은 천연추출물의 이산화질소에 대한 단백질의 손상 억제 효과를 나타내는 밴드이다. 이 도면에서, 레인 1은 대조군에 의해 처리한 밴드이고, 레인 2-26은 NO₂ 에 의해 처리한 밴드이며, 레인 3-26은 10㎍/㎖, 100㎍/㎖ 천연추출물의 이산화질소에 대한 단백질 손상 억제 정도를 나타내는 밴드로서, 레인 3-4는 생열귀, 레인 5-6은 녹차, 레인 7-8은 오가피잎, 레인 9-10은 가시나무, 레인 11-12는 더억, 레인 13-14는 도깨비바늪, 레인 15-16은 도라지, 레인 17-18은 토사자, 레인 19-20은 마, 레인 21-22는 마로니에, 레인 23-24는 딱총나무, 레인 25-26은 신탁나무잎 추출물의 이산화질소에 대한 단백질 손상 억제 정도를 나타내는 밴드이다.

도 14는 천연추출물의 오존에 대한 핵산 손상 억제 효과의 정도를 나타내는 밴드이다. 이 도면에서, 레인 1은 대조군에 의한 밴드이고, 레인 2-12는 오존에 의한 밴드이며, 레인 3-14는 오존+천연추출물 10, 100㎍/㎖로 처리한 밴드로서, 레인 3-4는 생열귀, 레인 5-6은 녹차, 레인 7-8은 오가피잎, 레인 9-10은 신탁나무잎, 레인 11-12는 도인 추출물의 오존에 대한 핵산 손상 억제 정도를 나타내는 밴드이다.

도 15는 천연추출물의 이산화질소에 대한 핵산 손상 억제 효과의 정도를 나타내는 밴드이다. 이 도면에서, 레인 1은 대조군에 의한 밴드이고, 레인 2-12는 이산화질소에 의한 밴드이며, 레인 3-14는 이산화질소+천연추출물 10, 100㎍/㎖로 처리한 밴드로서, 레인 3-4는 생열귀, 레인 5-6은 녹차, 레인 7-8은 오가피잎, 레 인 9-10은 신탁나무잎, 레인 11-12는 도인 추출물의 이산화질소에 대한 핵산 손상 억제 정도를 나타내는 밴드이다.

도 16은 오존의 노출 시간에 따른 세포 생존율의 변화를 상대적으로 나타내는 그래프이다.

도 17은 항산화제의 오존에 대한 B16F10 세포 보호 효과를 상대적으로 나타내는 그래프이다(11ppm의 오존에 대해 10분간 노출시킴).

도 18은 항산화제의 오존에 대한 HaCaT 세포 보호 효과를 상대적으로 나타내는 그래프이다(11ppm의 오존에 대해 10분간 노출시킴).

도 19는 이산화질소 노출 시간에 따른 세포의 생존율 변화를 상대적으로 나타내는 그래프이다.

도 20은 항산화제의 이산화질소에 대한 B16F10 세포 보호 효과를 상대적으로 나타내는 그래프이다(이산화질소에 10분간 노출시킴).

도 21은 항산화제의 이산화질소에 대한 HaCaT 세포 보호 효과를 상대적으로 나타내는 그래프이다(이산화질소 10분 노출).

도 22는 시간의 경과에 따른 오존(11ppm) 처리에 의한 HaCaT 세포 형태의 변화를 나타내는 현미경 사진이다.

도 23은 시간의 경과에 따른 오존(11ppm)에 의한 B16F10 세포 형태의 변화를 나타내는 현미경 사진이다.

도 24는 이산화질소에 의한 HaCaT 세포의 손상(우측 사진: 이산화질소에 의해 20분 처리)을 나타내는 현미경 사진이다.

도 25는 이산화질소에 의한 B16F10 세포의 손상(우측 사진 : 이산화질소에 의해 20분 처리)을 나타내는 현미경 사진이다.

도 26은 오존 처리에 의한 피부 각질층의 아스코르브산 및 α-토코페롤 농도 변화를 나타내는 그래프이다.

도 27은 천연추출물의 오존에 대한 피부 각질층의 아스코르브산 및 α-토코페롤 손실 방어 효과를 나타내는 그래프이다. 이 그래프에서, C는 오존 0ppm, N-A-H는 오존 10ppm, A는 녹차, B는 생열귀, C는 곰취나물, D는 오이풀, E는 산초잎, F는 고사리, G는 구릿대, H는 생강의 오존에 대한 피부 각질층의 아스코르브산 및 α-토코페롤 손실 방어 효과의 정도를 나타낸다.

도 28은 시간의 경과에 따른 리포솜 형태의 변화를 나타내는 현미경 사진이다.

본 발명은 대기오염물질에 의한 피부 손상 방지용의 항산화성 화장료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 특히, 오존과 이산화질소에 의한 피부 손상 방지용의 항산화성 화장료로서의 천연추출물의 용도에 관한 것이다.

서울을 비롯한 국내외 대도시에는 높은 인구밀도와 급격한 자동차의 증가로 대기 오염물중의 오존(O₃)과 이산화질소(NO₂)의 농도가 지속적으로 증가하고 있다. 예를 들자면 2001년 말 현재 서울의 인구는 1,033만명이 거주하고 있고 대기오염의 주원인이 되는 자동차는 255만대로 1985년 45만대에 비하여 5.7배가 증가하였다. 이러한 여건에서도 1980년대 이후 대기의 질을 개선하기 위하여 청정연료의 보급과 자동차 배기가스의 규제강화 등으로 개발도상국형인 아황산가스는 크게 개선되어 1993년 이후에는 세계보건기구(WHO)의 권고기준치 이내를 유지하고 있다. 그러나 최근 자동차의 급격한 증가로 자동차 배출가스가 대기오염의 85.4%를 차지하면서 이산화질소와 오존오염도가 증가하는 추세로 오존주의보의 발령, 시정장애현상 등의 여러 가지 피해상황이 우리의 건강과 생활을 위협하며, 오염형태가 선진국형으로 변화하고 있다.

대기오염도가 높아질수록 다양한 피부질환이 증가한다는 사실은 대도시에서의 대기오염 관련 피부질환 환자수가 농어촌지역보다 많으며 매년 피부질환으로 병원을 방문하는 전체 환자의 수가 증가함으로 비춰볼 때 알 수 있다. 특히 점차적으로 증가되는 오존과 이산화질소는 다양한 피부질환을 일으킨다는 연구결과가 최근에 와서 보고 되고 있다. 이러한 연구보고에 따르면, 오존은 피부에서의 비타민C와 E의 파괴를 유도하고 지질의 과산화를 일으켜 산화적 스트레스를 초래하여 피부노화를 촉진하고 결국 피부질환을 유발하며, 이산화질소는 피부에서의 질소아민을 발생시켜 결과적으로 아토피성 피부염 등의 피부질환을 유발하고 피부노화를 촉진한다.

경제수준의 향상은 사람의 질병에 관한 인식을 바꾸어 놓고 있으며 이에 따라 노화와 외모관리에 대한 관심이 높아지고 관련비용의 지출이 증가하고 있다. 이러한 비용은 잠재적인 사회비용으로 취급되고 있어 전체적인 의료비용은 급격한 증가추세에 있다. 피부질환은 비록 생명에는 영향을 주지 않지만 발생이 빈번하고 사람의 경제 및 사회활동에는 막대한 지장을 초래하고 있으며, 최근에는 남녀노소를 불문하고 피부 관리 및 피부질환에 대한 관심이 커짐에 따라 피부질환의 예방 및 치료에 대한 연구와 더불어 이를 산업화하기 위한 기술개발이 요구되는 시점이다.

현재의 피부, 미용 관련 산업은 미국과 유럽 등의 선진국이 대부분 독점하고 있는 것이 사실이다. 그러나 향후 피부질환 치료 및 예방 기술의 수요, 기능성 화장품 시장과 피부 미용제품 시장이 급격하게 성장할 것으로 예상됨에 따라 미국, 유럽 등의 관련기업들은 새로운 아시아시장의 확대를 위해 동양인의 피부에 적합한 제품을 개발하기 위한 노력을 지속적으로 확대하고 있다. 그러나 지역, 인종별로 차별화 된 피부의 색과 노화의 형태가 다르고 아름다움에 대한 기준이 다르기 때문에 이미 개발된 기술과 제품을 그대로 적용하기에는 어렵다. 이러한 선진국의 환경에 견주어 국내에서도 새로운 피부 관련 유효활성 및 치료물질을 개발하기 위한 원천기술과 이를 활용한 고기능성의 제품을 창출하기 위한 노력이 절실하다.

현재의 화장품 등의 피부 관련 산업에서 오존과 이산화질소에 대한 피부손상 정도를 실험적으로 확인하고 이러한 손상에 대해 방어할 수 있는 안전한 효능물질을 평가하는 기술을 확보하여 다양한 제품에 적용하는 완전한 기술이 확립되어 있지는 않다. 더구나 사계절이 뚜렷한 국내의 기후에 적합한 자생식물로부터의 유래물질로 소재를 개발하여 제품에 적용하면 미국, 유럽 등지의 관련 선진 업체의 기 술과 소재 모두를 차별화하여 당당하게 경쟁할 수 있는 기술적인 위치를 점하게 되고 제품의 경쟁력과 차별성의 확보도 대단히 용이하다. 이는 아시아시장을 넘어 미국, 유럽 등지의 관련 산업 선진국의 시장에도 접근이 가능하며 더구나 오존과 이산화질소는 선진국형의 대기오염물로 선진국의 대도시일수록 심하여 이러한 제품의 설득력은 더 강하게 작용한다.

국내에서는, 오존과 이산화질소에 대한 피부손상 관련 연구는 거의 진행된 바 없으며 이러한 사정으로 관련 기술이나 제품이 개발되어 있지는 않다. 그러나 화장품 제형과 관련된 제품의 개발과 제조기술은 선진기술에 뒤지지 않고 있고 생산량의 많은 부분이 수출되고 있는 경쟁력 있는 산업부문이다. 그러나 고기능성 소재의 개발과 이를 이용한 제품의 수출은 아직 미진한 상태이다. 최근에는 고기능성의 항산화 소재개발과 선진국형 기술개발이 나노기술과 더불어 활발히 진행되고 있으며 점차 관련기업의 투자와 정부차원의 지원도 증가되고 있다.

해외에서는, 오존과 이산화질소가 피부손상에 미치는 기작은 현시점에서 기초연구 수준의 결과가 정립되어 확인된 학술적인 측면의 결론이기에 아직 이를 응용한 산업화 기술은 전 세계적으로 시작 단계에 불과하다고 할 수 있다. 대부분의 화장품들은 내외부적인 자극 등에 의해서 생긴 피부 층의 자유라디칼에 반응하여 항산화 작용을 하는 기능을 포함한다. 이러한 연유로 화장품회사들은 같은 원리로 대기오염물에 의한 피부손상도 방어한다고 광고하고 있다. 그러나 이러한 주장은 엄밀하게 말하면 근거가 불충분하고, 대기오염에만 초점을 맞추어 개발된 화장품의 종류는 거의 없으며 대기오염물질을 녹이는 클렌징 크림정도만이 개발된 수준이다. 특히, 오존이나 이산화질소의 피부손상 방어를 위한 제품은 아직 개발되어 있지 않은 실정이다.

상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명은 대기오염에 의한 피부 손상 방지용의 항산화성 화장료를 제공하는 데에 있다.

본 발명은 대기오염에 의한 피부 손상 방지용의 항산화성 화장료를 제공한다.

본 발명에 따르면, 유해산소, 특히 수퍼옥사이드 라디칼에 대한 항산화능이 우수한 천연추출물로 녹차, 민생열귀, 곰취, 생열귀, 신탁나무잎, 신탁나무 줄기, 오이풀, 산초잎, 은행잎, 가래나무뿌리, 박쥐나물 줄기, 민삼잎꽃, 매자나무 줄기, 하수오, 고사리, 초피잎, 개두릎, 곤드레, 계피 및 생강나무 뿌리가 제공된다. 특히, 표준 항산화제로서 사용되고 있는 아스코르브산(약 70%의 항산화능)보다 높은 항산화 활성을 나타내는 추출물은 녹차, 민생열귀, 곰취, 생열귀, 신탁나무잎, 신탁나무 줄기, 오이풀, 산초잎, 은행잎, 가래나무뿌리, 박쥐나물 줄기, 민삼잎꽃, 매자나무 줄기, 하수오, 고사리이다.

또한, 본 발명에 따르면, 유해산소, 특히 히드록시 라디칼에 대한 항산화능이 우수한 천연추출물로 곰취, 도인, 도깨비바늪, 더덕, 도라지, 녹차, 딱총나무, 토사자, 가시나무, 가래나무, 생열귀, 마, 마타리, 마뿌리 부채마, 생강, 구기자, 구릿대, 계피, 곤드레 및 밤나무가 제공된다. 특히, 곰취, 녹차, 생열귀, 곤드레, 가래나무 등은 수퍼옥사이드 라디칼과 히드록시 라디칼 모두에 우수한 항산화능이 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 지질산화에 억제 효과가 있는 천연추출물로 초피잎, 향나무, 생열귀, 곤드레 등이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 단백질 손상의 억제에 효과가 있는 천연추출물로 생열귀, 녹차, 오가피잎, 가시나무, 더덕, 도라지, 토사자, 마, 마로니에, 딱총나무, 신탁나무잎 등이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 핵산 손상의 억제에 효과가 있는 천연추출물로는 생열귀, 녹차, 오가피잎, 신탁나무잎, 도인 등이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 이산화질소에 대한 단백질의 손상을 효과적으로 방어해주는 천연추출물로 생열귀, 녹차, 오가피잎, 가시나무, 더덕, 신탁나무잎 등이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 이산화질소에 대한 핵산의 손상을 효과적으로 억제해주는 천연추출물로 녹차, 오가피잎, 도인등이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 유해산소에 대한 항산화 활성, 지질산화, 단백질 및 핵산 손상 억제 효과가 우수한 천연추출물로 녹차, 생열귀, 곰취, 오이풀 산초 등이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 피부 각질층의 손상을 방어해주는 천연추출물로 녹차, 생열귀, 곰취, 오이풀, 산초 등이 제공된다.

본 발명의 하나의 구체예로서, 유효한 천연추출물의 안정성을 확보하기 위한 기술로서 리포솜을 이용한 기술이 이용될 수 있다.

본원에 기재되고 예시된 천연추출물들은 물, 아세톤, 에틸 아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산, 탄소수 1-4의 저급 알코올을 단독으로 또는 물과 혼합하여 용매로서 이용하여 추출될 수 있다. 본 기술분야의 숙련된 당업자라면 천연추출물의 다른 추출방법도 익숙해 있을 것이다.

하나의 구체예로서, 생열귀의 잎, 열매, 뿌리, 줄기 등에 추출용매로서 물, 아세톤, 에틸 아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산, 탄소수 1-4의 저급 알코올을 각각 또는 물과 혼합한 것을 잎, 열매, 뿌리나 줄기껍질의 건조 중량에 대하여 1-15배 가하고, 냉각 콘덴서가 장착되어 유효 성분이 증발하는 것을 방지한 추출기에서 소정의 온도, 특히 50-95℃로, 소정의 시간 동안, 특히 1-20시간 가열하여 추출하거나 5-45℃에서 1-15일 동안 침적시켜 유효성분을 추출할 수 있다. 이러한 과정을 거쳐 수득한 천연추출물을 여과포로 여과한 후 감압 농축하여 해당 천연추출물로서 이용할 수 있다.

또 다른 구체예로서, 생열귀 소정량을 세절하여 건조 중량에 대하여 알코올 소정량(예, 10배 이상)을 가한 후 상온에서 소정의 시간(예, 10시간) 동안 추출한 후, 여과, 감압농축, 건조하여 분말상의 생열귀 추출물을 얻을 수도 있다. 녹차, 곰취 추출물도 이와 같은 방법으로 얻을 수 있다.

이하, 본 발명은 비제한적인 하기의 실시예로 설명된다. 하기 실시예에 인용된 천연추출물은 당업자라면 상기한 방법을 통해 또는 통상의 방법을 통해 제조할 수 있거나, 소정의 구입처를 통해 입수하여 사용할 수 있다. 본 발명에서는, 특히 생열귀는 정선군 농업기술센터에서 구입하여 사용하였으며, 녹차와 곰취는 대광건재약업사에서 구입하여 천연추출물 제조에 사용하였다. 이하에 기재된 천연추출물은 하기 제조예 1에 언급된 방법으로 제조한 것들을 사용하였다.

제조예 1 : 천연추출물의 제조

생열귀 100g을 세절하여 건조 중량에 대하여 알코올 1000㎖를 가한 후 상온에서 10시간 동안 추출하였다. 이것을 여과하고 완전히 감압 농축한 후 건조하여 분말상의 추출물을 얻었다. 녹차와 곰취, 그리고 이하에 언급된 천연추출물(하기에 언급된 420여종중 유효한 것들만 언급) 또한 생열귀 추출물 제조 방법과 동일하게 각각 100g을 세절하여 건조 중량에 대하여 알코올 1000㎖를 가한 후 상온에서 10시간 동안 추출하였다. 이것을 여과하고 완전히 감압 농축시킨 후 건조하여 분말상의 추출물을 얻었다.

실시예 1 : 유해산소에 대한 항산화능 평가

항산화제는 유해산소나 유해질소의 종류에 따라 항산화 능력이 다르므로 본 실시예에서는 각각의 유해산소에 대해 추출물의 항산화효과를 따로 측정하였다. 수퍼옥사이드 라디칼(Superoxide radical)에 대한 항산화 효과는 크산틴/크산틴 옥시다아제 시스템(xanthine/xanthine oxidase system)으로 수퍼옥사이드(superoxide)를 발생시키고 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase ; SOD)에 의한 수퍼옥사이드(superoxide)의 제거 속도를 DMPO 스핀 트랩(spin trap)을 이용한 전자상자성공명법(electron paramagnetic resonance; EPR)으로 측정하였다. 한편, 히드록실 라디칼(Hydroxyl radical)에 대한 항산화 효과는 펜톤(Fenton) 반응으로 히드록실 라디칼(hydroxyl radical)을 발생시킨 후 DMPO 스핀 트랩(spin trap)을 이용한 EPR 방법으로 정량하였다. 시료의 추출물들을 가하고 이들의 히드록실 라디칼(hydroxyl radical) 제거 능력을 EPR 신호의 감소로 측정하였다.

A. 수퍼옥사이드 라디칼(O ₂ ^_ ? )에 대한 항산화능 실험 및 평가

실험

수퍼옥사이드 라디칼은 DMPO와 반응하여 DMPO-OOH? 라는 새로운 라디칼을 만들어내며, 이는 EPR 신호를 가지고 있다. 이를 이용하여 수퍼옥사이드 라디칼 소거에 따른 DMPO-OOH? 의 EPR 신호 세기의 감소를 통해 특정 물질의 수퍼옥사이드 라디칼의 소거활성을 정량적으로 측정할 수 있다.

크산틴/크산틴 옥시다아제 시스템(Xanthine/xanthine oxidase system)으로 수퍼옥사이드를 발생시키고 추출물의 수퍼옥사이드의 제거 속도를 DMPO 스핀 트랩(spin trap)을 이용하여 EPR로 측정하였다. 추출물을 넣지 않은 대조군의 EPR 신호 세기의 값을 기준으로 추출물의 항산화력을 대조군에 대한 상대적인 EPR 신호 세기 감소로 나타내었다.

평가

추출물의 수퍼옥사이드 라디칼에 대한 항산화 활성은 도 1에 도시된 바와 같이 수퍼옥사이드 제거에 의한 DMPO-OOH의 EPR 신호세기의 감소로 나타낼 수 있다. 추출물의 항산화력을 하기 수학식에 의해 추출물을 넣지 않은 대조군의 EPR 신호 세기의 값을 기준으로 대조군에 대한 상대적인 EPR 신호 세기 감소로 나타내었다.

상기 식에서,

E_EPR은 추출물 첨가시 EPR 신호 세기를 나타내고;

C_EPR은 대조군의 EPR 신호 세기를 나타낸다.

본 발명자들이 보유하고 있는 총 420여 가지의 천연 추출물을 대상으로 EPR을 이용한 추출물의 항산화활성 측정 실험 결과 녹차 추출물이 수퍼옥사이드 라디칼에 대해 가장 높은 항산화 활성을 나타냈으며, 총 15 종의 추출물이 70% 이상의 항산화 효과를 나타냈다(하기 표 1 참조). 특히 표준 항산화제로 사용되고 있는 아스코르브산(ascorbic acid) (약 70 %의 항산화능)보다 높은 항산화 활성을 나타낸 추출물은 총 11 종이나 되었다. 하기 표 1에 수퍼옥사이드 라디칼에 대해 상위 20위권의 항산화능을 지닌 추출물을 나타내었다.

천연추출물의 수퍼옥사이드 소거 효과

추출물 (100 ㎍/㎖)	수퍼옥사이드 라디칼에 대한 항산화능	추출물 (100 ㎍/㎖)	수퍼옥사이드 라디칼에 대한 항산화능
녹차	92.2	박쥐나물 줄기	82.7
민생열귀	88.9	만삼잎꽃	76.8
곰취	87.5	매자나무 줄기	76.5
생열귀	87.5	하수오	72.3
신탁나무 잎	87.2	고사리	70.7
신탁나무 줄기	84.3	초피잎	69.7
오이풀	83.7	개두릎	68.9
산초잎	83.4	곤드레	66.9
은행잎	82.9	계피	62.5
가래나무 뿌리	82.7	생강나무 뿌리	57.6

B. 히드록실 라디칼(OH?)에 대한 항산화능 실험 및 평가

과산화수소와 2가의 철염을 첨가하면 OH?가 발생되고, 이는 다시 DMPO와 반응하여 DMPO-OH? 라디칼을 생성한다. 도 2에 도시된 바와 같이 DMPO-OH?의 ESR 신호를 측정함으로써 히드록실 라디칼에 대한 추출물의 항산화 활성을 조사할 수가 있다. 추출물이 첨가된 실험에서 항산화 활성이 있을 경우 히드록실 라디칼을 소거하여 EPR의 신호가 약해진다. 이를 이용하여 특정물질의 히드록실 라디칼 소거 효과를 정량적으로 측정할 수 있다.

펜톤(Fenton) 반응으로 히드록실 라디칼을 발생시킨 후 DMPO 스핀 트랩(spin trap)을 이용한 EPR 방법으로 정량하였다. 추출물들을 가하고 이들의 히드록실 라디칼 제거 능력을 EPR 신호의 감소로 측정하였다. 이때 항산화 활성은 추출물을 넣지 않은 대조군의 EPR 신호를 기준으로 하여 추출물을 넣었을 때의 ESR 신호를 측정하여 상대적인 신호 값으로 나타내었다.

상기 식에서,

E_EPR은 추출물 첨가시 EPR 신호 세기를 나타내고;

C_EPR은 대조군의 EPR 신호 세기를 나타낸다.

본 발명자들이 보유하고 있는 총 420 여 가지의 천연 추출물을 대상으로 EPR을 이용한 추출물의 히드록시 라디칼에 대한 항산화활성 측정 실험 결과 곰취 추출 물이 히드록실 라디칼에 대해 가장 높은 항산화 활성을 나타냈으며, 곰취, 도인, 도깨비바늪 등 총 3종의 추출물이 50% 이상의 항산화 효과를 나타내었다. 더덕, 도라지, 녹차, 딱총나무, 토사자, 가시나무 등 총 6종의 추출물은 40 % 대의 항산화 활성을 지니고 있음이 밝혀졌다. 특히 곰취, 녹차, 생열귀, 곤드레, 가래나무 등은 수퍼옥사이드 라디칼과 히드록시 라디칼 둘 모두에 좋은 황산화능을 지니고 있는 것으로 밝혀졌다. 히드록실 라디칼에 대해 상위 20위권의 항산화능을 가진 추출물을 하기 표 2에 나타내었다.

천연추출물의 히드록실 라디칼 소거 효과

추출물 (100 ㎍/㎖)	히드록실 라디칼에 대한 항산화능	추출물 (100 ㎍/㎖)	히드록실 라디칼에 대한 항산화능
곰취	73.1	생열귀	35.8
도인	62.5	마	35.2
도깨비바늪	54.5	마타리	35.1
더덕	49.1	마뿌리 부채마	31.2
도라지	45.9	생강	30.7
녹차	45.6	구기자	29.6
딱총나무	44.4	구릿대	28.8
토사자	43.6	계피	28.6
가시나무	41.1	곤드레	27.2
가래나무	39.4	밤나무	27.2

실시예 2 : 오존과 이산화질소의 피부 유해성 확인

A. 오존의 제조 및 농도 측정

오존 발생기로는 '오존텍'에서 구입한 AOZ-1을 사용하였고 분광 광도계로는 휴렛 패커드(Hewlett Packard) 제품인 HP 8453 UV-비저블 스펙트로포토미터(visible spectrophotometer)를 이용하였다. 오존은 짧은 반감기를 가지고 있고 pH와 온도가 높은 환경에서는 더 빠른 속도로 분해되는 성질을 가 지고 있다. 장시간 오존 농도를 유지시키기 위해서 오존 발생기로 오존을 발생시키면서 pH와 온도가 낮은 증류수(황산으로 pH 2로 맞춤)에 약 15-20분간 오존을 포화시켰다. 증류수(pH 2)를 블랭크로 잡고 여기에 오존수를 희석시켜 나타난 흡광(ε245nm = 3150 M-1cm-1) 수치를 가지고 오존수의 농도를 결정하였다. 실험에 따라 오존 발생기, AOZ-1을 이용해 오존 가스를 시료에 직접적으로 노출시켰으며, 농도는 오존농도 측정기로 측정하였다.

B. 이산화질소의 제조

이산화질소 가스(NO₂)는 아질산염과 황산의 반응으로 NO 가스를 발생시킨 후 이를 다시 산소와 반응시킴으로써 제조하였다. 구체적으로, 부피가 5 L 인 플라스틱 통 안에 5 g의 NaNO₂ 와 10 g의 FeSO₄를 작은 비커에 잘 혼합한 후 넣어주었다. 그 후 통 안을 산소로 포화시킨 후 증류수 5㎖을 작은 비커 안으로 넣어주었다. 수용액상에서 NaNO₂ 와 FeSO₄의 반응으로 일산화질소(NO) 가스가 발생하여 통 안에 포화되어 있던 산소와 반응케 하여 그림과 같이 갈색의 색을 띄는 이산화질소(NO₂) 가스를 제조하였다. 이를 간단히 요약하면 하기와 같다:

FeSO₄와 NaNO₂를 반응시켜 NO생성

FeSO₄(aq) + 3NaNO₂(aq) → Na₂SO₄(aq) + H₂O(l) + NaNO₃(aq) + 2NO(g)

O₂와 NO를 반응시켜 NO₂생성

2NO(g) + O₂(g) → 2NO₂(g)

C. 오존에 의한 지질산화 확인

오존수에 의한 리포솜(liposome)의 산화를 지질과산화물의 최종 산물인 말론디알데히드(MDA : malondialdehyde)의 검출로 확인하였다. 도 3을 통해 알 수 있는 바와 같이, 오존수의 농도를 50, 100, 200 uM가 되게 리포솜에 처리한 결과 지질산화의 정도가 각각 오존수를 처리하지 않은 대조군(100 %)에 비해서 232.796%, 489.552%, 1749.210 % 로 증가하였으며, 리포솜에 처리한 오존수의 농도가 증가할수록 지질산화가 증가함을 알 수가 있다. 100 uM 이상의 오존수를 처리한 경우에는 오존에 의한 지질산화가 급격히 증가함을 알 수 있다. 이는 높은 농도의 오존에 의해 촉발된 지질의 산화가 급격한 연쇄반응을 통해 더욱 더 많은 지질라디칼(ROO?, RO?)을 생성함으로써 지질산화를 증폭시킨 결과로 해석할 수 있으며, 이를 통해 오존이 지질의 산화를 유발시킴을 알 수 있다.

또한, 이러한 오존에 의한 지질산화를 항산화제가 억제할 수 있는 지를 평가하여 보았다. 도 4를 통해 알 수 있는 바와 같이, 160 uM의 오존에 노출된 리포솜의 지질산화를 100 % 로 잡았을 때 100, 200 ㎍/㎖의 아스코르브산은 오존에 의한 지질산화가 각각 약 57.143 % 와 38.571 % 로 나타났으며, 카테킨의 경우에는 오존만 처리한 대조군의 지질산화에 대해 85.714 % 와 58.571 % 의 지질산화가 측정되었다.

지질산화 억제 효과가 친수성 항산화제인 아스코르브산의 경우 더 높은 것은 아마도 외부의 오존을 소거하여 지질과 반응할 수 있는 오존의 농도를 감소시켜 준 결과로 사료되며, 소수성 항산화제인 카테킨의 경우에도 리포솜 내에 생성된 지질 라디칼을 제거함으로써 오존에 의한 지질산화 반응을 억제한 것으로 판단된다. 오존에 의한 지질산화는 오존이 불포화지방산의 이중결합에 첨가되어 고리 구조의 퍼옥사이드를 형성함으로써 지질라디칼(ROO?, RO?) 형성을 촉진하여 지질산화를 유도하는 것으로 판단되어 지며, 이러한 오존의 지질산화는 라디칼의 연쇄반응으로 일어나는 것이기 때문에 항산화제에 의해 그 산화가 억제된 것으로 판단되어 진다.

D. 이산화질소에 의한 지질산화 확인

오존에 의한 리포솜의 지질산화와는 달리, 도 5의 결과에 같이 이산화질소에 의한 지질의 산화는 그다지 일어나지 않는 젓으로 실험결과 밝혀졌다. 이산화질소에 노출된 시간이 증가할수록 지질산화가 유의적으로 증가함을 볼 수 있으나, 오존에 의한 지질산화에 비해서는 극히 미미한 수준이며, 30분의 노출시간에도 이산화질소를 처리하지 않은 대조군에 비해 약 9.23 %의 지질산화가 증가한 것으로 나타났다.

이산화질소에 의한 지질산화물인 MDA의 생성에 대해서는 아직 학계에서도 이견이 있는 것으로 알려져 있으며, 지질과산화에 의한 MDA의 생성이 아닌 단순히 NO₂가 불포화지방산의 이중결합에 첨가된 반응물이 생성되는 것으로 알려져 있다. 또한 이러한 생성물이 세포막의 기능이나 세포의 생리적 기능에 어떠한 영향을 미치는 지에 대해서는 연구가 거의 이루어지지 않고 있다. 이런 점들을 미루어 볼 때 이산화질소에 의한 지질산화의 영향은 그다지 크지 않는 것으로 판단되어지며, 지질산화에 매우 큰 영향을 미치는 오존에 비해서 이산화질소에 의한 지질산화는 그 영향이 극히 미미한 것으로 판단되어 진다.

E. 오존에 의한 단백질의 손상

오존에 의한 단백질을 손상을 확인하기 위해 일정농도의 오존(11-12 ppm)을 처리한 알부민(albumin)을 SDS-PAGE을 이용하여 단백질의 손상을 확인하였다. 도 6을 통해 알 수 있는 바와 같이, 오존을 처리하지 않은 대조군에 비해 시간이 지날수록 단백질의 밴드가 희미해지는 것을 볼 수가 있으며, 오존에 노출된 지 20 분이 경과될 경우에는 알부민의 밴드가 거의 보이지 않았다. 그러나 원래 알부민 밴드 이외의 밴드가 관찰되지 않은 것으로 보아 가교(cross-linking) 또는 응집(aggregation)에 의한 단백질의 변화는 없는 것으로 보인다. 다만 밴드가 감소하는 현상을 미루어 보아 오존에 의해서 단백질의 조각화(fragmentation)에 의해 단백질의 분자량이 작아져서 트래킹 염료(tracking dye)와 같이 겔을 빠져나간 것으로 판단된다. 이러한 결과를 근거로 오존이 단백질의 조각화를 유도하여 작은 분자량의 펩티드로 분해함을 알 수 있다.

오존에 의한 단백질의 손상을 항산제가 방어할 수 있는 지를 평가하기 위해 아스코르브산(ascorbic acid), 카테킨(catechin) 및 케르세틴(quercetin)이 첨가된 조건에서 오존에 노출시켜 본 결과, 도 7을 통해 알 수 있는 바와 같이, 항산제의 농도가 높아질수록 단백질의 밴드가 증가하였다. 이러한 결과로 미루어보아, 항산제의 단백질 방어효과가 그다지 크지 않으나 유의적으로 오존에 대한 단백질 손상에 대한 방어 효과를 가지고 있음을 알 수 있다. 오존에 대한 단백질 손상에 대한 방어효과는 케르세틴과 카테킨의 효과가 비슷하며, 아스코르브산이 가장 낮았다.

F. 이산화질소에 의한 단백질의 손상

일정농도의 이산질소 가스로 처리한 알부민을 SDS-PAGE를 이용하여 단백질의 손상을 확인하였다. 도 8에 제시된 결과를 보면, 오존에 의한 단배질의 손상 결과와 비슷하게 이산화질소를 처리하지 않은 대조군에 비해 시간이 지날수록 단백질의 밴드가 희미해지는 것을 볼 수가 있으며, 이산화질소에 노출된 지 40 분이 경과될 경우에는 알부민의 밴드가 거의 보이지 않았다. 오존 실험과는 달리 단백질의 조각화가 심하게 일어나지 않아 원래의 분자량보다는 작은 두 개의 밴드가 나타났다.

이산화질소에 의한 단백질의 손상을 항산제가 방어할 수 있는 지를 평가하기 위해 아스코르브산, 카테킨 및 케르세틴이 첨가된 조건에서 이산화질소에 노출시켜 본 결과 도 9(레인 1: 대조군, 2: 대조군+NaOH(시료용매), 3-12: 이산화질소처리, 4-6: 아스코르브산 1, 10, 100㎍/㎖, 7-9: 카테킨 1, 10, 100㎍/㎖, 10-12: 케르세틴 1, 10, 100㎍/㎖) 에서 보는 바와 유의적인 방어효과를 관찰할 수 있었다. 모든 항산제가 낮은 농도(1 ㎍/㎖)에서도 단백질의 조각화를 방지하는 것으로 보인다. 이는 오존에 의한 단백질 손상에 대한 항산화제의 효과 실험 결과와는 차이를 보여주는 데, 아마도 이산화질소보다는 오존에 의한 단백질의 손상이 심하기 때문으로 풀이할 수 있다.

G. 오존에 의한 핵산의 손상

활성 산소종이나 활성 질소종에 의한 핵산의 손상 기작 및 정량적인 손상 판별 기법은 잘 알려져 있으나, 오존이나 이산화질소에 의한 핵산 손상에 대해서는 거의 알려진 것이 없으며 이러한 손상의 정도를 정량적으로 판별하는 기술이 개발 되어 있지 않은 점 등으로 인해 실시예에서는 가장 간단한 실험방법인 DNA의 전기영동을 통해서 손상의 유무를 확인하였다. DNA가 손상을 입게 되면 그 구조상의 변화로 인해 전기영동상의 이동성이나 형광물질과의 상호작용의 손상으로 밴드의 형광 감소 등이 일어나게 된다. 이를 이용하여 오존 및 이산화질소에 의한 핵산의 손상 유무를 판별하였다.

도 10에서 보는 것과 같이 일정 농도(11-12 ppm)의 오존에 흑색종 암세포주인 B16F10 세포로부터 분리한 핵산을 노출시킨 경우, 노출시간이 10분이내의 경우에는 밴드에 아무런 영향이 없는 것으로 보이며 10분이상의 경우에는 밴드가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 대조군과 비교하여 새로운 밴드의 형성이 보이지 않은 것으로 보아 핵산의 단일 가닥 파괴(single strand break)가 발생하지 않는 것으로 생각되어진다. 그러나 10 분 이상 오존에 노출시킬 경우 밴드의 감소가 일어나는 것은 오존이 핵산의 염기 부분에 손상을 주어 핵산내의 염기부분간의 소수성 결합을 끊어줌으로써 형광 물질(ethidium bromide)이 핵산과의 결합을 억제시키기 때문으로 생각되어 진다. 짧은 시간의 오존에 대한 노출이나 낮은 농도의 오존에 대해서는 핵산이 손상이 미미하나, 고농도의 오존이나 장시간에 걸친 오존에 대한 노출은 핵산에 손상을 입힐 수 있음을 알 수 있다.

H. 이산화질소에 의한 핵산의 손상

일정 농도의 이산질소 가스에 흑색종 암세포주인 B16F10 세포로부터 분리한 핵산을 1분간 노출시킨 경우 대조군과 비교하여 새로운 밴드가 관찰되었는데(도 11 참조), 이는 이산화질소가 핵산의 단일 가닥 파괴(single strand break)를 형성하 게 함으로써 핵산의 3차원 구조의 변화가 일어났음을 알 수 있다. 보통의 핵산은 수퍼코일(supercoil)의 형태로 굉장히 압축된 모양을 지녀 전기영동상에서 빠른 이동성을 보이나 단일 가닥 파괴(single strand break)가 유발되면 수퍼코일의 구조가 깨져 밀도가 커지게 된다. 이로 인해 전기영동상에서는 이동성이 떨어지게 된다. 5분이상의 경우에는 밴드가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 아마도 이산화질소가 핵산을 올리고핵산의 형태로 분해한 결과로 해석되어 진다. 짧은 시간의 이산화질소에 대한 노출은 핵산의 단일 가닥 파괴(single strand break)를 유발시키며, 장시간에 걸친 노출은 핵산에 손상을 입힐 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3 : 오존과 이산화질소에 대한 추출물의 효능 평가

본 실시예는 천연추출물의 오존 및 이산화질소에 의한 지질, 단백질 및 핵산 손상 방지 능력을 입증하는 것이다.

A. 리포솜(liposome)의 제조

용매 추출법을 이용하여 리포솜을 제조하였다. 요약하면, 일정량의 아소렉틴(asolectin)을 헥산에 용해시킨 후 헥산을 질소 가스로 제거하였다. 그런 다음, 0.1M 인산완충용액(pH 7.4)으로 지질의 농도가 20mg/㎖이 되게 용해시켜 리포솜으로 사용하였다.

B. 천연추출물의 오존 및 이산화질소에 대한 지질산화 억제 효과 평가

오존과 이산화질소의 농도에 따른 리포솜의 지질산화를 TBARS 방법으로 측정하였다. 인산완충용액에 용해되어 있는 리포솜을 오존수와 NO₂에 노출시켜서 일정 시간 배양한 후 1% TBA , 28% TCA 를 첨가후 끓는 물에 5분간 반응시킨 후 얼음에 보관하였다. 그 후 부탄올을 첨가하여 교반한 후 원심분리를 통해 부탄올층과 수층을 분획한 후 부탄올층에서 소량의 시료를 취해 532 nm에서의 흡광도를 측정하여 지질산화의 정도를 측정하였다. 오존과 이산화질소의 농도에 따른 리포솜의 지질산화를 TBARS 방법으로 측정하고 이를 기존의 항산화제 표준품(아스코르브산, 카테킨)을 활용하여 추출물을 처리한 실험군과 비교하여 지질산화의 정도를 비교 분석하여 오존과 이산화질소에 의한 지질산화 방어 활성을 가진 유효 추출물을 탐색하였다.

오존과 이산화질소에 의한 지질산화를 리포솜의 지질산화를 통해 확인하였으나 오존에 의한 지질산화가 급격히 일어나는 반면 이산화질소의 경우 노출시간이 증가함에 따라 지질산화의 유의적으로 일어남을 확인할 수 있었으나 그 영향이 오존의 경우보다는 미미하였다. 항산화제의 오존에 대한 지질산화의 억제 효과 실험을 통해 아스코르브산과 카테킨 모두 그 효과가 크다는 점을 밝혀내었으며 이를 통해 오존에 의한 지질산화 억제 기능을 가진 유효성분의 탐색 및 효능 평가에 대한 정량적이고 정형화된 기술을 획득할 수 있었다. 이에 추출물의 오존에 대한 지지질산화 억제 활성을 측정하여 유효한 추출물을 탐색하였다.

본 발명자들이 보유하고 있는 420여종의 천연물을 대상으로 오존에 대한 지질산화 억제 효과를 탐색하였다. 160 uM 농도의 오존을 리포솜에 노출시킨 후 그 지질산화를 측정한 결과 초피잎의 경우 대조군 대비 75.64 %의 지질산화를 보여 주었으며, 맹문동, 박쥐나무줄기, 가래나무뿌리 등은 오히려 오존에 의한 지질산화를 미비하나마 촉진시키는 것으로 나타났다.

초피잎, 향나무, 생열귀, 곤드레 등 총 4종의 천연 추출물이 대조군 대비 80 % 이하의 지질산화를 보여주어 오존에 의한 지질산화를 억제하는 것으로 나타났으며, 수퍼옥사이드 및 히드록실 라디칼에 대한 좋은 항산화 활성을 보여준 조릿대, 만삼잎, 개두릎, 녹차 등도 대조군 대비 85 % 이하의 지질산화를 보여주어 활성산소에 대한 항산화능이 높은 추출물이 오존에 의한 지질산화 억제 활성도 좋은 것으로 나타났다.

천연추출물의 지질산화 억제 효과

추출물 (100 ㎍/㎖)	상대적인 지질 산화 (대조군 대비 %1))	추출물 (100 ㎍/㎖)	상대적인 지질 산화 (대조군 대비 %1))
가래나무뿌리	106.55	맹문동	104.73
개두릅	83.27	박쥐나무줄기	105.09
겨우살이	82.18	상황	98.91
계피	91.64	새팥	87.64
곤드레	97.45	생열귀	77.40
곤드레	79.64	섬초동	97.09
곰취	84.36	신탁나무줄기	92.36
구기자	82.55	연자육	89.09
녹차	83.30	오이풀	93.09
느릅나무껍질	82.55	은행잎	93.45
달팽이추출	94.91	인삼잎	90.55
더덕	107.64	조릿대	81.45
도라지	98.55	초피잎	75.64
만삼잎,꽃	82.91	하수오	110.18
매자나무줄기	98.18	향나무	76.00
1) 추출물이 첨가되지 않은 조건에서 160 uM 오존에 의한 지질산화의 정도

C. 천연추출물의 오존 및 이산화질소에 대한 단백질 손상 억제 효과 평가

피부단백질에 대한 영향을 알아보기 위하여 오존과 이산화질소의 농도에 따른 알부민의 티로신 질산화(tyrosine nitration)와 조각화를 각각 웨스턴(Western)과 SDS-PAGE로 측정하고 이를 아스코르브산, 카테킨 및 케르세틴을 활용하여 항산 화제 표준품을 처리하지 않은 대조군과 추출물을 처리한 실험군을 비교하여 오존과 이산화질소에 의한 단백질 손상을 방어하는 유효 추출물을 탐색하였다.

상기한 바와 같은 실험을 통해, 오존과 이산화질소 모두 단백질에 손상을 입혀 단백질의 조각화나 단백질의 분해가 일어남을 알 수 있었다. 또한 항산화제 표준품이 이들에 의한 단백질의 손상을 억제함을 밝혀내었다. 이러한 실험결과를 통해 오존이나 이산화질소에 의한 단백질의 손상 정도를 정량적으로 판별해낼 수 있는 기술을 확립할 수 있었으며 이들에 의한 단백질의 손상을 억제할 수 있는 유효성분의 탐색 및 그 효능을 평가할 수 있는 방법을 획득할 수 있었다. 이에 추출물의 오존 및 이산화질소에 대한 단백질 손상 억제 활성을 측정하여 유효한 추출물을 탐색하였다.

(1) 천연추출물의 오존에 대한 단백질 손상 억제 효능 평가:

알부민을 0.1 M 인산완충용액(pH 7.4)에 최종농도가 80㎍/㎖ 되게 녹인 후 96웰(well)에 100㎕씩 8웰에 넣었다. 오존발생기를 통해 일정량 농도의 오존(11ppm~12ppm)에 시간별로 시료에 노출시켜 준 후 소량의 시료를 취하여 SDS 샘플 완충액에 섞어 준 후 5분간 끓어 준 뒤 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 후 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색법으로 염색을 한 뒤 단백질의 조각화를 통해 단백질의 손상 정도를 측정하였다. 아스코르브산, 카테킨 및 케르세틴을 활용하여 항산화제 표준품을 처리하지 않은 대조군과 추출물을 처리한 실험군을 비교하여 오존에 의한 단백질 손상을 비교 분석하였다.

그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이 오존을 처리한 경우 단백질의 손상을 확 인할 수 있으며, 오존에 대한 항산화 활성을 가지는 유효 추출물의 경우에는 그 단백질의 밴드가 오존을 처리하지 않은 대조군과 유사함을 확인할 수 있었다.

오존에 의한 단백질의 손상을 어느 추출물이 방어할 수 있는 지를 평가한 결과 도깨비바늪을 제외한 생열귀, 녹차, 오가피잎, 가시나무, 더덕, 도라지, 토사자, 마, 마로니에, 딱총나무, 신탁나무잎 등 총 11종이 오존에 대한 단백질의 손상을 효과적으로 방어해 주는 것으로 나타났다. 비록 생열귀 및 더덕의 경우에는 10 ㎍/㎖ 농도에서는 미미한 방어효과를 보여주었으나, 100 ㎍/㎖의 농도에서는 다른 추출물과 유사한 방어효과를 보여주었다.

오존에 대한 단백질 손상을 방어해 주는 유효 추출물의 성격을 살펴보면 활성산소종에 대한 항산화능이 높은 추출물들이 대부분이라는 점을 알 수 있는 데, 이는 아마도 오존이 수용액상에는 높은 산화력을 지니고 있기 때문에 항산화제들이 이를 효과적으로 방어해 주는 것으로 풀이할 수 있다. 또한 오존은 수용액상에서 수많은 화학반응을 유발하여 활성산소를 만들어내는 것으로도 알려져 있다. 이를 미루어보아 활성산소에 대한 높은 항산화력을 지닌 추출물들이 오존에 대한 우수한 보호 효과를 가질 수 있음을 알 수 있다.

(2) 이산화질소에 대한 단백질 손상 억제 효능 평가 :

알부민을 0.1 M 인산완충용액(pH 7.4)에 최종농도가 80㎍/㎖ 되게 녹인 후 96웰에 100㎕씩 8웰에 넣었다. 전항에서 언급한 방법으로 이산화질소를 발생시켜 일정량 농도의 이산화질소 가스에 시간별로 시료를 노출시켜 준 후 소량의 시료를 취하여 SDS 샘플 완충액에 섞어 준 후 5분간 끓어 준 뒤 SDS-PAGE을 실시하였다. 그 후 쿠마시 블루 염색법으로 염색을 한 뒤 단백질의 조각화를 통해 단백질의 손상 정도를 측정하였다. 아스코르브산, 카테킨 및 케르세틴을 활용하여 항산화제 표준품을 처리하지 않은 대조군과 추출물을 처리한 실험군을 비교하여 이산화질소에 의한 단백질 손상을 비교 분석하였다.

그 결과는 도 13에 도시되어 있다. 도 13의 결과를 보면, 오존에 의한 단배질의 손상 결과와 비슷하게 이산화질소를 처리하지 않은 대조군에 비해 이산화질소를 처리한 실험군의 단백질의 밴드가 희미해지는 것을 볼 수가 있으며 이산화질소에 대한 항산화 활성을 가지는 유효 추출물의 경우에는 그 단백질의 밴드가 오존을 처리하지 않은 대조군과 유사함을 확인할 수 있었다.

이산화질소에 의한 단백질의 손상을 어느 추출물이 방어할 수 있는 지를 평가한 결과 생열귀, 녹차, 오가피잎, 가시나무, 더덕, 신탁나무잎 등 총 6종이 이산화질소에 대한 단백질의 손상을 효과적으로 방어해 주는 것으로 나타났다. 비록 녹차 및 더덕의 경우에는 10 ㎍/㎖ 농도에서는 유의적인 방어효과를 보여주지 못했으나, 100 ㎍/㎖ 의 농도에서는 다른 추출물과 유사한 방어효과를 보여주었다. 이산화질소에 의한 단백질 손상을 억제하는 유효 추출물이 오존의 경우보다는 그 수가 적고, 억제 효과를 효과적으로 보이는 농도의 범위는 차이가 있으나, 대부분 오존에 대한 손상 억제 효과를 지닌 유효 추출물의 반 이상이 이산화질소에 의한 단백질 손상을 억제해 주는 것으로 나타났다.

D. 천연추출물의 오존 및 이산화질소에 대한 핵산 손상 방어 효능 평가

오존과 이산화질소가 피부 세포중의 핵산에 노출되었을 때의 영향을 알아보 기 위해 DNA 단일 가닥 파괴를 측정하였으며 항산화 표준품인 아스코르브산, 카테킨을 처리한 시료의 DNA 손상 정도와 추출물을 처리한 실험군을 비교 평가하였다.

(1) 천연추출물의 오존에 대한 핵산 손상 억제 효능의 실험 및 평가

흑색종 암세포 B16F10 세포를 10 % 우태아 혈청(FBS), 페니실린 (100 units/㎖), 스트렙토마이신 (100 units/㎖)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 이용해 37℃, 5 % 탄산가스가 있는 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 떼어낸 후 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척한 후 세포를 원심분리를 통해 모은 후 페놀-클로로포름 추출 방법에 의해 DNA를 분리하여 에탄올 침전시킨 후 DNA 펠릿을 모아 TE 완충액에 녹여 DNA 시료로 사용하였다.

위의 방법으로 얻어진 DNA 용액을 96웰 플레이트에 30㎕씩 넣은 후 일정량의 오존(11 ppm)이나 이산화질소 가스에 시간별로 노출시켰다. 그 후 소량의 시료를 취하여 RNase A 와 DNA 샘플 완충액을 첨가한 후 1% 아가로스 겔을 통해 전기영동을 실시하였다. 이를 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide)로 염색하여 DNA의 손상 정도를 확인하였다. 아스코르브산, 카테킨 및 케르세틴을 활용하여 항산화제 표준품을 처리하지 않은 대조군과 추출물을 처리한 실험군을 비교하여 오존에 의한 핵산 손상을 비교 분석하여 유효 추출물을 선별하였다.

오존에 대한 핵산 손상 억제 효능을 가지는 유효 추출물을 탐색하기 위해 일정농도의 오존(11-12 ppm)에 흑색종 암세포주인 B16F10 세포로부터 분리한 핵산을 노출시킨 후 전기영동을 이용하여 핵산 손상의 정도를 확인하였다.

그 결과는 도 14에 도시되어 있다. 도 14에서 보는 바와 같이, 오존을 처리한 경우 핵산 손상을 확인할 수 있었며, 오존에 대한 항산화 활성을 가지는 유효 추출물의 경우에는 그 핵산의 밴드가 오존을 처리하지 않은 대조군과 유사함을 확인할 수 있었다.

오존에 의한 핵산의 손상을 어느 추출물이 방어할 수 있는 지를 평가한 결과 생열귀, 녹차, 오가피잎, 신탁나무잎, 도인 등 총 5종이 오존에 대한 핵산의 손상을 효과적으로 방어해 주는 것으로 나타났다. 유효 추출물의 농도가 10㎍/㎖ 과 100 ㎍/㎖ 의 경우에 그 핵산 손상 억제 효과가 유사한 것으로 보아 10 ㎍/㎖ 의 저농도에서도 현저한 억제 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.

(2) 천연추출물의 이산화질소에 대한 핵산 손상 억제 효능의 실험 및 평가

흑색종 암세포 B16F10 세포를 10 % 우태아 혈청(FBS), 페니실린 (100 units/㎖), 스트렙토마이신 (100 units/㎖)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 이용해 37℃, 5 % 탄산가스가 있는 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 떼어낸 후 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척한 후 세포를 원심분리를 통해 모은 후 페놀-클로로포름 추출 방법에 의해 DNA를 분리하여 에탄올 침전시킨 후 DNA 펠릿을 모아 TE 완충액에 녹여 DNA 시료로 사용하였다.

위의 방법으로 얻어진 DNA 용액을 96웰 플레이트에 30㎕씩 넣은 후 일정량의 오존(11 ppm)이나 이산화질소 가스에 시간별로 노출시켰다. 그 후 소량의 시료를 취하여 RNase A 와 DNA 샘플 완충액을 첨가한 후 1% 아가로스 겔을 통해 전기 영동을 실시하였다. 이를 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide)로 염색하여 DNA의 손상 정도를 확인하였다. 아스코르브산, 카테킨 및 케르세틴을 활용하여 항산화제 표준품을 처리하지 않은 대조군과 추출물을 처리한 실험군을 비교하여 오존에 의한 핵산 손상을 비교 분석하여 유효 추출물을 선별하였다.

이산화질소에 대한 핵산 손상 억제 효능을 가지는 유효 추출물을 탐색하기 위해 일정농도의 이산화질소에 흑색종 암세포주인 B16F10 세포로부터 분리한 핵산을 노출시킨 후 전기영동을 이용하여 핵산 손상의 정도를 확인하였다. 도 15에서 보는 바와 같이 이산화질소를 처리한 경우 핵산 손상을 확인할 수 있으며, 이산화질소에 대한 항산화 활성을 가지는 유효 추출물의 경우에는 그 핵산의 밴드가 이산화질소를 처리하지 않은 대조군과 유사함을 확인할 수 있었다.

이산화질소에 의한 핵산의 손상을 어느 추출물이 방어할 수 있는 지를 평가한 결과 녹차, 오가피잎, 도인 등 총 3종이 이산화질소에 대한 핵산의 손상을 효과적으로 방어해 주는 것으로 나타났다.

이산화질소에 의한 핵산 손상을 억제하는 유효 추출물이 오존의 경우보다는 그 수가 적고, 억제 효과를 효과적으로 보이는 농도의 범위는 차이가 있으나, 대부분 오존에 대한 손상 억제 효과를 지닌 유효 추출물의 반 이상이 이산화질소에 의한 핵산 손상을 억제해 주는 것으로 나타났다.

실시예 4 : 시료에 대한 피부 생리 활성의 확인

A. 오존의 세포 생존율에 대한 영향

오존이 피부세포에 어느 정도의 독성을 가지고 있는 지를 평가하기 위해 쥐 유래의 흑색종 세포주인 B16F10과 사람 유래의 섬유아세포주 HaCaT를 대상으로 오존의 독성 실험을 실시하였다. 도 16에서 보는 바와 같이 B16F10 세포와 HaCaT 세포 모두 오존에 노출된 시간이 증가할수록 세포의 생존율이 감소함을 알 수 있었다.

특정 물질에 의해서 오존에 대한 세포 손상 억제 효과를 평가하기 위해 항산화제를 첨가한 상태에서 오존에 노출시켜 본 결과 도 17 및 도 18에 나타나듯이 카테킨과 케르세틴 둘 모두 오존에 의한 세포 손상을 효과적으로 막아주는 것으로 나타났다. 특히 케르세틴의 경우, 그 보호효과가 카테킨보다 높은 것으로 나타났다. 이런 결과를 미루어 보아 오존에 의해 세포 손상이 유발되며 이러한 세포손상은 항산화제 처리에 의해 어느 정도 보호될 수 있음을 알 수 있다.

B. 이산화질소의 세포 생존율에 대한 영향

오존에 의한 세포손상과 유사하게 이산화질소의 경우에도 노출시간이 증가할수록 세포손상이 증가함을 볼 수 있다(도 19 참조). 다만 HaCaT 세포의 경우 1, 5분의 노출시간에 대해 B16F10 세포와 비슷한 세포독성을 보여주었으나, 10분의 노출시간에 대해서는 세포의 생존율이 이산화질소에 노출시키지 않은 대조군의 생존율 대비 10 % 정도의 생존율을 보여 주었다. 이는 오존에 대한 세포 손상과는 확연히 다른 차이점을 보여준다.

항산화제를 첨가한 상태에서 이산화질소에 노출시켜 본 결과 도 20 및 도 21에 나타나듯이 카테킨과 케르세틴이 모두 이산화질소에 의한 세포 손상을 효과적으로 막아주는 것으로 나타났다. 그림 20의 결과에서 보는 바와 같이 카테킨과 케르 세틴 모두 B16F10 세포의 손상을 효과적으로 방어해 주는 것으로 나타났으나 케르세틴의 경우 농도가 100 ㎍/㎖ 일 때 약간의 방어효과의 감소를 보여 주었는데, 이는 아마도 이산화질소와 케르세틴의 반응으로 생성된 물질에 의한 세포 독성의 효과로 보여 진다. 이산화질소에 대해 가장 큰 손상을 보인 HaCaT 세포의 경우, 50 ㎍/㎖ 농도의 항산화제 처리로도 세포손상을 효과적으로 막아주는 것으로 나타났다(도 21). 위의 결과를 정리하여 보면 이산화질소에 의해 피부세포가 손상을 입는다고 말할 수 있으며 이러한 세포 손상은 항산화제의 처리로 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

C. 세포의 형태에 미치는 영향

(1) 오존에 의한 세포의 손상

도 22 및 도 23에서 보는 바와 같이, 오존에 노출된 후 시간이 증가할수록 세포 고유의 형태가 없어지며 세포괴사의 전형적인 형태인 원형모습으로 변화되는 것을 관찰할 수 있었다. HaCaT의 경우에는 집단을 이루던 세포들이 시간이 지날수록 하나의세포로 유리되며 세포내에 공포가 생성됨을 볼 수 있으며, B16F10의 경우에는 세포의 크기가 다소 줄어들며 B16F10 세포의 특성인 수지상 돌기(dendrite)도 함께 줄어듬을 볼 수 있다.

(2) 이산화질소에 의한 손상

오존의 경우와 마찬가지로 이산화질소 처리에 의해서 HaCaT 세포(도 24)와 B16F10 세포(도 25) 모두 그 형태가 변화함을 볼 수 있었다. 오존에서처럼 급격한 변화를 감지할 수 없지만 HaCaT 세포의 경우 세포집단이 해리되는 점과 B16F10의 경우에는 수지상 돌기(dendrite)가 상당부분 감소함을 관찰할 수 있었다.

D. 천연추출물의 오존 및 이산화질소에 대한 세포 독성 방어 효과

오존과 이산화질소의 세포독성 영향을 평가하기 위해 MTT 방법을 이용하였다. 각각의 세포를 10 % 우태아 혈청, 페니실린 (100 units/㎖), 스트렙토마이신 (100 units/㎖)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)배지를 이용해 37℃, 5 % 탄산가스가 있는 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 정상적으로 24시간 배양한 뒤 배지를 제거한 후 PBS(phosphate-buffered saline)을 이용해 세포를 세척한 후 일정 농도의 오존수와 이산화질소에 노출시킨 후 6시간 후 오존과 이산화질소에 노출되지 않은 대조군과 세포사 여부를 MTT 방법 (MTT : (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide, disodium salt)는 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소화효소에 의해 formazen 으로 환원되어 파란색의 색을 띄게 된다. 살아있는 세포가 많을수록 푸른색을 많이 띄게 된다.) 으로 비교하여 평가하였다. 또한 항산화제 표준품을 처리한 대조군과 추출물을 처리한 실험군을 비교하여 추출물에 의한 오존과 이산화질소에 대한 세포 독성 방어효과를 비교 분석하였다.

오존과 이산화질소에 의한 직접적인 피부손상의 확인과 평가를 위해 피부세포를 이용하여 오존과 이산화질소의 세포 독성을 평가한 결과 오존 및 이산화질소 모두 피부세포에 현저한 손상을 입힘을 확인할 수 있었으며, 또한 표준 항산제를 이용한 실험을 통해 이 들에 대한 세포 보호 효과가 입증되었다. 이에 추출물의 오존 및 이산화질소에 대한 피부세포 손상 억제 활성을 측정하여 유효한 추출물을 탐 색하였다. 유효 추출물의 오존 및 이산화질소에 대한 세포 보호 효과를 하기 수학식에 의해 산출하였다.

상기 식에서,

E_EPR은 추출물 첨가시 MTT 흡광치를 나타내고;

C_EPR은 대조군 MTT 흡광치를 나타내며;

O_MTT는 오존 및 이산화질소 단독 처리시의 MTT 흡광치를 나타낸다.

(1) 천연추출물의 오존에 대한 세포 독성 방어 효과

오존에 대한 세포 보호 효능을 가지는 유효 추출물을 탐색하기 위해 일정농도의 오존(11-12 ppm)을 처리한 세포(각질화세포, HaCaT)을 이용하여 세포 손상의 정도를 MTT 시험법으로 세포의 생존율로 확인하였다. 오존을 처리한 경우 세포의 손상을 확인할 수 있으며, 오존에 대한 세포 보호능을 가지는 유효 추출물의 경우에는 오존을 처리하지 않은 대조군의 생존율에 가까운 것을 확인할 수 있었다.

본 발명자들이 보유하고 있는 총 420 여 가지의 천연 추출물을 대상으로 오존에 의한 세포의 손상을 어느 추출물이 방어할 수 있는 지를 평가한 결과 녹차 추출물이 가장 높은 세포 보호능을 나타냈으며 총 12 종의 추출물이 70% 이상의 세포 보호능을 나타내었다(표 4). 하기 표 4에 오존에 대해 상위 20위권의 세포 보 호능을 지닌 추출물을 나타내었다.

천연추출물의 오존에 대한 세포 보호능

추출물 (100 ㎍/㎖)	오존에 대한 세포 보호능(%)	추출물 (100 ㎍/㎖)	오존에 대한 세포 보호능(%)
녹차	91.3	박쥐나물 줄기	72.6
민생열귀	88.9	만삼잎꽃	71.8
곰취	86.4	매자나무 줄기	66.5
생열귀	85.3	하수오	64.8
신탁나무 잎	82.1	고사리	60.7
신탁나무 줄기	80.9	초피잎	59.4
오이풀	80.8	개두릎	56.1
산초잎	79.4	곤드레	51.3
은행잎	78.9	계피	50.7
가래나무 뿌리	78.6	생강나무 뿌리	50.2

(2) 천연추출물의 이산화질소에 대한 세포 독성 방어 효과

이산화질소에 대한 세포 보호 효능을 가지는 유효 추출물을 탐색하기 위해 일정농도의 이산화질소를 처리한 세포(각질화세포, HaCaT)을 이용하여 세포 손상의 정도를 MTT 시험법으로 세포의 생존율로 확인하였다. 이산화질소를 처리한 경우 세포의 손상을 확인할 수 있으며, 이산화질소에 대한 세포 보호능을 가지는 유효 추출물의 경우에는 이산화질소를 처리하지 않은 대조군의 생존율에 가까운 것을 확인할 수 있었다.

본 발명자들이 보유하고 있는 총 420 여 가지의 천연 추출물을 대상으로 이산화질소에 의한 세포의 손상을 어느 추출물이 방어할 수 있는 지를 평가한 결과 곰취 추출물이 이산화질소에 대해 가장 높은 세포 보호능을 나타냈으며 총 3 종의 추출물이 50% 이상의 세포 보호능을 나타내었다(하기 표 5 참조). 하기 표 5에 이산화질소에 대해 상위 20위권의 세포 보호능을 지닌 추출물을 나타내었다.

천연추출물의 이산화질소에 대한 세포 보호능

추출물 (100 ㎍/㎖)	이산화질소에 대한 세포 보호능 (%)	추출물 (100 ㎍/㎖)	이산화질소에 대한 세포 보호능 (%)
곰취	76.3	생열귀	35.1
도인	64.5	마	34.2
도깨비바늪	53.6	마타리	32.8
더덕	49.9	마뿌리 부채마	30.2
도라지	43.4	생강	30.1
녹차	42.6	구기자	29.2
딱총나무	41.9	구릿대	28.5
토사자	40.4	계피	27.6
가시나무	40.1	곤드레	27.5
가래나무	39.4	밤나무	27.5

실시예 5 : 확인된 유효 추출물의 피부 영향 평가

유효한 결과의 효능물은 화장품으로서 실제의 기능을 나타내는지를 임상적으로 평가하여야 한다. 이에 따라, 오존이나 이산화질소에 의한 피부손상을 피부내 아스코르브산 및 α-토코페롤의 손실정도를 측정하였고, 이에 대한 유효 추출물의 방어효과를 추출물을 처리한 피부에 대해서 같은 방법으로 측정하여 피부 임상학적 효능을 가진 추출물을 선별하였다.

(1) 피부에 대한 오존 및 이산화탄소의 노출

오존 및 이산화질소 발생기에 연결되어 있는 노즐과 주사기가 말단에 연결되어 있는 5㎝×10㎝×3cm 크기의 플라스틱 챔버를 사람의 앞 팔의 뒤쪽에 고정시킨 후 전항에서 언급한 대로 일정 농도의 오존 및 이산화질소를 발생시킨 후 챔버에 연결되어 있는 빈 주사기로 챔버내의 공기를 빼주어 오존 및 이산화질소를 플라스틱 챔버내로 유입시켜 피부에 오존 및 이산화질소를 1시간 노출시켰다. 추출물의 방어 효과 측정시에는 미리 추출물을 피부에 도말하여 건조시킨 후 오존 및 이산화질소를 처리하였다.

(2) 피부 각질층의 획득

피부 각질층의 시료는 테이프 스트리핑(tape-stripping) 방법을 이용하였다. 오존 및 이산화질소를 처리한 피부에 5㎝×5㎝ 크기의 셀룰로판 테이프을 부착시킨 후 떼어내어 각질층을 획득하였다. 부착되어 나온 각질층은 광학현미경을 이용하여 균질성을 확보한 후 그 질량은 스트리핑(stripping) 전 후의 셀룰로판 테이프의 질량차이로 측정하였다. 테이프 스트립 당 얻어진 각질층의 양은 2.98 ± 0.17 mg (±SD)이었다.

(3) 각질층의 아스코르브산 농도 측정

Tape의 질량을 측정한 후 1 mM EDTA가 함유된 2 ㎖ 의 PBS와 50 ㎕의 부틸화된 히드록시톨루엔(1 mg/㎖), 1 ㎖의 2.9 % (v/v) SDS을 첨가하여 보텍싱(vortexing)을 실시하였다. 전처리가 끝난 시료를 막여과(0.45 um)한 후 HPLC 분석을 실시하여 아스코르브산을 정량하였다. HPLC 분석은 워터(Water)사의 모듈 2690 엘시 시스템(Module2690 LC system)과 동일 회사의 전기화학 검출기(electrochemical detector)를 사용하였고, 컬럼은 알테크(Alltech)사의 에코노실(Econosil) C18(10 um, 250 X 4.6 mm)을 이용하였다. 40 mM 아세트산나트륨 및 0.537 mM EDTA, 5 %의 메탄올을 함유하는 용액을 이동상으로 하였으며 유속은 1.0 ㎖/분으로 하였다.

(4) 각질층의 α-토코페롤의 농도 측정

Tape의 질량을 측정한 후 1 mM EDTA가 함유된 2 ㎖ 의 PBS와 50 ㎕의 부틸화 된 히드록시톨루엔(1 mg/㎖), 1 ㎖의 2.9 % (v/v) SDS를 첨가하여 보텍싱하였다. 전처리 과정이 끝난 시료에 4 ㎖ 의 헥산을 첨가하여 분획한 후 2 ㎖ 의 에탄올을 헥산층에 첨가하여 tape의 접착성분을 침전시켜 제거하였다. 그 후 헥산/에탄올층을 질소가스로 말려 그 건조물을 500㎕의 에탄올:메탄올(1:1)에 녹인 후 HPLC 분석을 실시하여 α-토코페롤을 정량하였다. HPLC 분석은 워터(Water) 사의 모듈 2690 엘시 시스템(Module2690 LC system)과 동일 회사의 전기화학 검출기(electrochemical detector)를 사용하였고, 컬럼은 알테크(Alltech)사의 에코노실(Econosil) C18(10 um, 250 X 4.6 mm)을 이용하였다. 20 mM 리튬 퍼클로레이트(lithium perchlorate)를 함유하는 1:9의 메탄올:에탄올 용액을 이동상으로 하였으며 유속은 1.2 ㎖/분으로 하였다.

(6) 유효 추출물의 오존에 대한 피부 각질층 아스코르브산 및 α-토코페롤 손실 방어 효과

오존에 의한 피부 손상 및 유효 추출물의 방어 효과를 알아보기 위하여 피부 각질층에 함유되어 있는 대표적인 항산화제인 아스코르브산과 α-토코페롤의 함량을 조사하였다. 10 ppm의 오존을 피부에 1시간 처리한 후 테이프-스트리핑 기법을 획득한 각질층에 함유되어 있는 아스코르브산의 함량은 161 ± 29 pmol/mg 으로 오존을 처리하지 않은 피부 각질층의 357 ± 19 pmol/mg 보다 급격히 감소함을 알 수 있었다. 각질층의 α-토코페롤 함량 또한 대조군은 8.4 ± 1.3 pmol/mg 이었으나, 오존을 처리한 경우에는 0.7 ± 0.3 pmol/mg 으로 거의 대부분 손실된 것으로 밝혀졌다. 오존을 처리한 피부 각질층의 항산제인 아스코르브산과 α-토코페롤의 함량 이 급격히 감소한 것으로 미루어 보아 오존이 피부에 심각한 산화적 스트레스를 유발시키며 이로 인해 피부가 손상을 받는다는 것을 확인할 수 있었다(도 26 및 표 6 참조).

오존 처리에 의한 피부 각질층의 아스코르브산 및 α-토코페롤 농도 변화

처리 농도	피부 각질층에서의 농도(pmol/mg)
	아스코르브산	α-토코페롤
0 ppm	357 ± 19	8.4 ± 1.3
10 ppm	161 ± 29	0.7 ± 0.3

오존에 의한 피부손상을 방지하는 유효 추출물을 선별하기 위해 오존 처리전 추출물을 피부에 도말하여 그 영향을 확인하여 보았다. 하기 표 7 및 도 27에서 알 수 있는 바와 같이, 녹차, 생열귀,곰취나물 순으로 아스코르브산의 손실을 방어해주는 것으로 실험결과 밝혀졌으며, α-토코페롤의 경우에는 녹차, 오이풀, 생열귀순으로 그 손실을 방어해 주었다. 오존에 의한 피부 각질층내 아스코르브산의 손실을 방어해 주는 추출물은 대부분 α-토코페롤의 손실도 상당수준 방어해 주는 것으로 나타났다. 이를 미루어 보아 녹차, 생열귀, 곰취나물의 추출물은 오존에 의한 심각한 피부 손상을 방어해줄 수 있는 것으로 판단되며 이를 오존에 의한 피부 손상방지의 화장품 원료로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.

추출물의 오존에 대한 피부 각질층의 아스코르브산 및 α-토코페롤 손실 방어 효과

처리		각질층에서의 농도(pmol/mg)
		아스코르브산	α-토코페롤
0 ppm		357 ± 19	8.4 ± 1.3
10 ppm	-	161 ± 29	0.7 ± 0.3
	녹차	312 ± 18	7.7 ± 0.6
	생열귀	289 ± 22	5.8 ± 0.5
	곰취나물	265 ± 18	5.1 ± 0.3
	오이풀	263 ± 25	6.3 ± 1.1
	산초잎	243 ± 22	4.5 ± 0.7
	고사리	227 ± 17	2.6 ± 0.5
	구릿대	205 ± 26	3.4 ± 0.6
	생강	189 ± 29	1.8 ± 0.4

(7) 유효 추출물의 이산화질소에 대한 피부 각질층의 아스코르브산 및 α-토코페롤 손실 방어 효과

이산화질소에 의한 피부손상을 방지하는 유효 추출물을 선별하기 위해 이산화질소 처리전 추출물을 피부에 도말하여 그 영향을 확인하여 보았다. 하기 표 8을 통해 알 수 있듯이, 추출물을 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군간의 큰 농도의 차이를 발견할 수 없었다. 이는 이산화질소에 의한 지질산화 실험결과와 유사한 결과를 보여 주고 있는데, 아마도 각질층의 주성분이 지질인 점을 감안하여 보면 이산화질소는 심각한 피부 손상을 유발하지 않는 것으로 사료된다.

이산화질소 처리에 의한 피부 각질층의 아스코르브산 및 α-토코페롤 농도 변화

처리 농도	각질층에서의 농도(pmol/mg)
	아스코르브산	α-토코페롤
0 ppm	357 ± 19	8.4 ± 1.3
10 ppm	342 ± 21	7.9 ± 0.7

실시예 6 : 유효 물질의 안정화

유효성분의 안정화 방법으로 마이크로캡슐화 방법을 이용하였으며 이의 안정성 평가를 위해 제조된 마이크로캡슐(리포솜 형태)내 유효물의 지속 여부를 캡슐의 변성 정도로 판단하고자 고성능 광학 현미경을 통해 평가하였다.

A. 유효성분의 캡슐화

일정량의 아소렉틴을 헥산에 녹인 후 질소 가스로 불어서 헥산을 날려버렸다. 그 후, 0.1M 인산완충액(pH 7.4)으로 지질의 농도가 20mg/ml이 되게 녹인 후 일정 농도의 유효 성분을 섞어준 뒤 초음파를 가하여 리포솜의 형태로 유효성분을 캡슐화하였다. 피셔(Fisher)사의 소닉 디스멤브레이터 300 기기를 이용하였다. 인터메디에이터 팁을 비커에 넣고 출력 50%의 강도로 초음파처리하였으며, 초음파처리는 1회에 30초를 넘기지 않았다. 그 과정 사이에 30초 이상 얼음으로 냉각하여 열에 의한 변성을 방지하였다.

B. 캡슐의 안정성 평가

위의 방법으로 제조한 유효성분이 함유된 리포솜 용액을 냉온에서 보관하면서 시간에 따라 슬라이드 글라스 점적한 뒤 올림푸스사의 BX-51 위상차 현미경을 이용하여 그 형상을 관찰하였으며 배율은 400배를 기준으로 하였다. 리포솜의 형태가 변화되거나 관찰되는 원형의 리포솜 수의 감소가 일어날 경우를 캡슐내 유효물의 용출로 보았다.

도 28을 통해 알 수 있는 바와 같이, 보관 시간에 따른 유효물질을 함유하는 리포솜 형태의 변화를 고성능 위상차 현미경을 통해 관찰하였다. 리포솜 제조 1 주일 경과시 리포솜 형태의 변화는 거의 관찰되지 않았으며, 4주일 경과시 원형의 리포솜의 수가 감소하는 것을 볼 수 있으며 그 크기도 상당히 작아졌음을 관찰할 수 있었다. 제조 8주일 경과의 경우에는 손상되지 않은 리포솜은 거의 관찰되지 않았으며 깨진 리포솜 조각들이 대다수를 차지하였다. 12주일이 경과할 경우에는 손상되지 않은 리포솜은 거의 없었으며, 깨진 리포솜 또한 관찰되지 않아 거의 모든 리포솜이 손상되어 현미경으로 관찰되지 않는 작은 구조물을 형성한 것으로 판단되어진다. 이러한 결과를 미루어 리포솜을 통한 유효물질의 안정화는 적어도 제작 4주일까지 안정한 것으로 판단되어지며, 리포솜을 포함하는 용매의 조건이 수용액이라는 점을 미루어 보아도 그 안정성이 어느 정도 확보된 것이라 사료된다. 또한 대부분의 화장품 원료 제조시 사용되는 용매가 부틸렌 글리콜이나 프로필렌 글리콜인 점을 고려할 볼 때 리포솜을 통한 유효성분의 안정화 방법은 화장품 원료 상품화에 필요한 기법이라 판단되어 진다.

이상에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 항산화성 화장료는 오존 뿐만 아니라 이산화질소를 포함한 대기오염물질에 의한 피부 손상을 매우 효과적으로 방어할 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 기술분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (4)

1. 삭제
2. 곰취 추출물을 유효 성분으로 포함하는 오존 및 이산화질소에 의한 피부 손상 방지용의 항산화성 화장료.
3. 제 2항에 있어서, 상기 추출물이 에탄올을 용매로 하여 추출됨을 특징으로 하는 오존 및 이산화질소에 의한 피부 손상 방지용의 항산화성 화장료.
4. 제 2항에 있어서, 상기 추출물이 리포솜에 의해 안정화됨을 특징으로 하는 오존 및 이산화질소에 의한 피부 손상 방지용의 항산화성 화장료.

Images