KR101123641B1

KR101123641B1 - 검출 물질에 특이적으로 반응할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법 및 상기 제조 방법으로제조된 박테리오파아지를 미량 검출물을 검출하는데 활용하는 방법 및 상기 박테리오파아지를 이용한 질량 분석장치

Info

Publication number: KR101123641B1
Application number: KR1020080138108A
Authority: KR
Inventors: 남창훈; 황경훈; 박형순; 이수재
Original assignee: 키스트 유럽 에프게엠베하
Priority date: 2008-12-31
Filing date: 2008-12-31
Publication date: 2012-03-20
Also published as: KR20100079579A

Abstract

본 발명은 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법 및 상기 제조 방법으로 제조된 박테리오파아지를 미량 검출물을 검출하는데 활용하는 방법 및 상기 박테리오파아지를 이용한 질량 분석 장치에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 본 발명은 본 발명은 섬사상 박테리오파아지의 몸통에 고신호 출력 펩타이드를 다량으로 진열하고 머리부분에는 검출물질에 특이적으로 반응할 수 있는 분자인지물질을 진열한 섬사상 박테리오파아지를 제조하는 방법, 상기 제조 방법으로 제조된 박테리오파아지 및, 상기 박테리오파아지를 이용하여 극미량의 검출물질이 복잡한 혼합물속에 존재할 때 이를 선택적이고 효율적으로 분석하는데 활용하는 방법 및 상기 박테리오파아지를 이용한 질량 분석 장치에 관한 것이다.

섬사상 박테리오파아지, 분자 인지 물질, 프로테오믹스

Description

검출 물질에 특이적으로 반응할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법 및 상기 제조 방법으로 제조된 박테리오파아지를 미량 검출물을 검출하는데 활용하는 방법 및 상기 박테리오파아지를 이용한 질량 분석 장치{Manufacturing method of bactriophage in which molecular recognition material is arranged and using method of the same for detecting extremely small quantities and mass analysis device using the same}

본 발명은 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법 및 상기 제조 방법으로 제조된 박테리오파아지를 미량 검출물을 검출하는데 활용하는 방법 및 상기 박테리오파아지를 이용한 질량 분석 장치에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 본 발명은 박테리오파아지의 몸통 (p8 표면 단백질)에 고신호 출력 펩타이드를 다량으로 진열하고 머리부분 (p3 표면 단백질)에는 검출물질에 특이적으로 반응할 수 있는 분자인지물질을 진열한 섬사상 박테리오파아지를 제조하는 방법, 상기 제조 방법으로 제조된 박테리오파아지 및, 상기 박테리오파아지를 이용하여 극미량의 검출물질이 복잡한 혼합물속에 존재할 때 이를 선택적이고 효율적으로 분석하는데 활용하는 방법 및 상기 박테리오파아지를 이용한 질량 분석 장치에 관한 것이다.

파아지 진열 기법은 1985년 George Smith 박사가 처음으로 그 아이디어를 제안함으로서 시작되었다 (Smith GR. 1985 Science. 228(4705): 1315-1317). 이는 섬사상 박테리오 파아지가 그 전체 게놈의 길이가 길지 않아 이를 유전자 조합 기법으로 변형시킴으로써 그것의 표면 단백질 외부에 목적하는 펩타이드나 단백질을 진열시킬 수 있다는 원리로부터 시작된 아이디어이다. 섬사상 박테리오파아지는 3, 6, 7, 8, 9번과 같이 모두 5가지 종류의 표면 단백질을 보유하고 있는데 그중 3번과 8번 단백질이 이러한 진열에 널리 활용되고 있다.

우선 파아지 게놈내에 있는 3번이나 8번 유전자의 앞쪽에 해당 응용에 적합한 형태의 물질(단백질이나 펩타이드)에 해당하는 염기서열을 적당한 규모의 임의성을 견지한 채 첨가하고, 이로부터 만들어진 재조합 파아지 유전자군을 박테리아에 주입한 뒤 이를 기르게 되면 첨가된 물질을 3번이나 8번 표면단백질의 표면에 진열한 박테리오파아지군을 얻을 수 있게 된다. 이 군 속에 들어 있는 어떤 개체가 목적하는 타겟물질을 고선택성과 고친화도를 견지한 채 붙잡는지 스크리닝 과정을 통해 선별해내게 된다. 이 기법을 활용하여 특정 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 분자 인지물질의 개발이 이뤄져 왔다.

현재 질환 진단을 위해서 사용하는 방법은 면역반응 기반 진단이 대부분을 차지하고 있다. 일반적으로 항원 항체 반응을 이용한 이 진단방법은 형광이나 발광과 같은 분광학적 신호를 이용하므로 여러 가지 서로 다른 마커를 동시에 측정하는 것이 용이하지 않을 때가 많다. 또한 분광학적 신호는 신호간의 간섭이 많아 정확 한 결과를 얻지 못할 수가 있다. 이러한 단점들을 보완하거나 대체할 수 있는 방법으로 질량분석법을 이용한 진단이 제기되고 있다. 질량분석법은 물질 고유의 질량을 정확하게 측정하는 방법으로 적은 차이까지 정밀하게 측정할 수 있고 여러 가지가 섞여 있는 경우에도 동시에 각각의 물질을 측정할 수 있는 장점을 가지고 있다. 이러한 특징으로 현재 사용되는 분광학적인 진단방법의 단점을 보완할 수 있다.

많은 장점을 가지고 있는 질량분석법의 문제점은 분광학적 방법이 가지고 있는 장점인 민감도에 아직 못 미치고 있다는 점이다. 즉 미량의 물질을 탐지할 수 있는 신호 증폭기술이 필요하고 이를 통해 최소한 분광학적 방법의 민감도와 같은 수준의 민감도를 가질 수 있도록 해야 할 필요성이 있다.

본 발명은 이러한 기술 개발의 필요성을 달성하기 위한 새로운 방향의 접근방식을 도입하여 질량분석법을 이용한 고 민감도 진단방법의 개발을 추진하고자 개발되었다.

본 발명에서는 박테리오파아지의 8번 단백질에 트롬빈 절단서열과 질량분석시 고신호 출력 펩타이드를 서로 연결시킨 채 진열하고 3번 단백질에는 타겟물질을 직간접적으로 인지할 수 있는 분자인지물질을 진열하였다.

본 발명은 전술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법으로 제조된 박테리오파아지를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지를 미량 검출물을 검출하는데 활용하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지를 이용한 질량 분석 장치를 제공하는 것이다.

본 발명은 전술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여, (A) 변형된 p8 파아지미드에 트롬빈 아미노산 절단 서열과 신호증폭용 펩타이드에 해당하는 유전자 스페이서를 삽입함으로써 재조합 파아지미드를 제조하는 단계; (B) 변형된 fd-SN-tet GGGGS linker에 변형된 Z domain 펩타이드에 해당하는 유전자 절편을 삽입함으로써 재조합 파아지를 제조하는 단계; 및 (C) p3에는 변형된 Z domain 이 붙고 p8에는 트롬빈 아미노산 절단 서열과 신호증폭용 펩타이드를 가지고 있는 파이지를 제조하 는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법을 제시한다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지를 제공한다.

상기 박테리오파아지는 상기 몸통에 고신호 출력 펩타이드를 다량 진열하고 머리부분에는 검출물질에 특이적으로 반응할 수 있는 분자인지물질이 진열된 것인 것이 바람직하다.

상기 몸통은 p8 표면 단백질이며, 상기 머리부분은 p3 표면 단백질인 것인 것이 바람직하다.

상기 p8 표면 단백질에는 트롬빈 절단서열과 질량분석시 고신호 출력 펩타이드를 서로 연결시킨 채 진열된 것인 것이 바람직하다.

상기 박테리오파아지는 섬사상 박테리오파아지인 것인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 상기 박테리오파아지를 미량 검출물을 검출하는데 활용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 상기 박테리오파아지를 이용하여 미량 검출물을 검출하는 질량 분석 장치를 제공한다.

본 발명의 박테리오파아지는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열되어 있다. 그러므로, 본 발명의 박테리오파아지는 미량 물질을 특이적으로 탐지할 수 있는 질량 분석 장치에 활용될 수 있다. 하나의 항원에 하나 의 파아지가 붙지만 그 하나의 파아지에는 150개 남짓되는 펩타이드가 치렁치렁 매달려 있기 때문에 신호가 증폭되는 효과가 있다. 그러므로, 미량 물질을 효과적으로 탐지할 수 있게 된다.

본 발명은 크게 세 부분으로 구성되어 있다. 첫째 부분은 트롬빈 절단 아미노산 서열과 신호증폭용 펩타이드 서열을 섬사상 박테리오파아지의 몸통을 이루는 8번 단백질에 유전자 재조합 기법으로 연결시켜 파아지 게놈을 재구성하고 이를 박테리아에 주입하는 과정이다. 둘째 부분은 재구성된 박테리오파아지 게놈을 함유하고 있는 박테리아를 배양함으로써 트롬빈 절단 아미노산 서열과 신호증폭용 펩타이드를 몸통에 진열시킨 박테리오파아지를 다량으로 분리정제하는 과정이다. 셋째 부분은 정제된 재조합 박테리오파아지를 이용하여 단백질 혼합상으로 존재하는 시료 속에 극미량으로 존재하는 검출 물질을 분석하는 과정이다.

이하, 구체적인 실험을 통해서 더욱 상세하게 설명한다.

<실험1> 도 2에 도시된 변형된 p8 파아지미드에 트롬빈 아미노산 절단 서열과 신호증폭용 펩타이드에 해당하는 유전자 스페이서를 삽입함으로써 재조합 파아지미드를 만들었다.

1) NcoI과 NotI으로 절단되고 탈인산효소처리된 파아지미드 절편의 준비

도 2에 도시된 바와 같이, 8㎍의 변형된 pS1607 LVPRGS linker 파아지미드를 100㎕의 전체 반응액에 넣고 2㎕의 제한효소 NcoI과 2㎕의 제한효소 NotI과 잘 혼합한 후 5시간동안 37℃에서 항온 반응한 후 정제를 하고, 이에 2㎕의 탈인산효소을 가한 후 37℃에서 1시간동안 항온 반응한 후 이를 아가젤에 전기 영동하여 가열 추출방식으로 DNA를 분리하였다.

2) 트롬빈 절단자리와 고신호 출력용 펩타이드 염기서열을 보유한 스페이서들의 준비

도 3에 도시된 바와 같이, 스페이서를 이루는 정방향 프라이머(1for, 2for, 3for, 4for, 5for) 와 역방향 프라이머(1back, 2back, 3back, 4back, 5back)를 각각 100㎕ 전체 반응액에 50㎕ 넣고 5㎕의 다중핵산키나제와 섞은 뒤 37℃에 1시간 동안 항온 처리한 뒤, 둘을 서로 동일량(1for와 1back, 2for와 2back, 3for와 3back, 4for와 4back, 5for와 5back)으로 섞어 100℃에서 10분간 수조속에서 가열한 뒤 상온까지 90분에 걸쳐 냉각시키는 방식으로 서로 융합시켜 최종적으로 스페이서(1, 2, 3, 4, 5)를 획득하였다.

3) 스페이서와 절단된 파아지미드 절편의 연결반응

제한효소로 잘려진 파아지미드 절편과 융합된 스페이서를 전체 반응액 20㎕에 각각 2㎕와 1㎕ 씩 가한 후 여기에 1㎕의 연결효소(라이게이즈)를 넣어 잘 섞은 후 16℃에서 18시간동안 항온반응을 하였다.

항온반응 결과물을 정제하고 미리 준비된 DH10베타 박테리아세포에 전기충격 법을 이용하여 주입하였다. 전기충격법의 반응조건은 12.5kV/cm, 200Ω, 25mF였다. 전기충격작업이 끝난 후 암피실린을 함유한 아가 배지 플레이트에 각 스페이서별로 상기한 실험을 거친 박테리아들을 발라준 뒤 그 중 살아남은 클론들을 골라내는 방식을 통하여 전기충격법을 통해 제대로 재조합 파아지미드가 그 안으로 들어간 박테리아들을 선별하였다.

선별된 박테리아들을 암피실린을 함유한 2xTY 배지에 넣어 기른 후 그 속에서 재조합 DNA를 정제하고 이를 pS1607 Seq-Hoon 프라이머 (5'- TGC ACG CAT CCT CGC ATT ATC -3') 를 써서 시퀀싱을 실시하여 제대로 스페이서가 도 4에 도시된 재조합 파아지미드에 들어갔는지 확인하였다.

<실험2> 변형된 fd-SN-tet GGGGS linker에 변형된 Z domain 펩타이드에 해당하는 유전자 절편을 삽입함으로써 재조합 파아지를 만들었다.

1) SfiI과 NotI으로 절단되고 탈인산효소처리된 파아지 절편의 준비

6.5㎍의 변형된 fd-SN-tet GGGGS linker 파아지를 100㎕의 전체 반응액에 넣고 2.5㎕의 제한효소 SfiI과 잘 혼합한 후 16시간 동안 50℃에서 항온 반응한 후 정제를 하고, 이에 2.5㎕의 제한효소 NotI을 가한 후 37℃에서 4시간동안 항온 반응한 후 정제를 하고, 이에 2㎕의 탈인산효소을 가한 후 37℃에서 1시간 동안 항온 반응한 후 이를 아가젤에 전기 영동하여 가열 추출방식으로 DNA를 분리하였다.

2) 변형된 Z domain 펩타이드 염기서열을 보유한 절편의 준비

5.3㎍의 fd-SN-tet GGGGS linker에 도 6에 도시된 바와 같은 변형된 Z domain 펩타이드 염기서열을 삽입하여 재조합된 파아지를 100㎕의 전체 반응액에 넣고 2.5㎕의 제한효소 SfiI과 잘 혼합한 후 16시간 동안 50℃에서 항온 반응한 후 정제를 하고, 이에 2.5㎕의 제한효소 NotI을 가한 후 37℃에서 4시간동안 항온 반응한 후 정제를 후 이를 아가젤에 전기 영동하여 가열 추출방식으로 절편을 분리하였다.

3) 변형된 Z domain 펩타이드 염기서열을 보유한 절편과 절단된 파아지 절편의 연결반응

제한효소로 잘려진 파아지 절편과 융합된 절편을 전체 반응액 20㎕에 각각 2㎕와 0.4㎕ 씩 가한 후 여기에 1㎕의 연결효소(라이게이즈)를 넣어 잘 섞은 후 16℃에서 18시간동안 항온반응을 하였다.

항온반응 결과물을 정제하고 미리 준비된 DH10베타 박테리아세포에 전기충격법을 이용하여 주입하였다. 전기충격법의 반응조건은 12.5kV/cm, 200Ω, 25mF였다.

전기충격작업이 끝난 후 테트라사이클린을 함유한 아가 배지 플레이트에 박테리아들을 발라준 뒤 그 중 살아남은 클론들을 골라내는 방식을 통하여 전기충격법을 통해 제대로 재조합 파아지미드가 그 안으로 들어간 박테리아들을 선별하였다.

도 7에 도시된 바와 같이, 선별된 박테리아들을 테트라사이클린을 함유한 2xTY 배지에 넣어 기른 후 그 속에서 재조합 DNA를 정제하고 이를 fd-tet VIII Hoon 프라이머 (5'- TCT TTA GTC CTC AAA GCC TCC -3')를 써서 시퀀싱을 실시하여 제대로 변형된 Z domain 염기서열이 재조합 파아지에 들어갔는지 확인하였다.

<실험3> 실험2에서 재조합된 파아지를 정제하고, 실험1에서 재조합된 파아지미드는 K91BluKan cell에 넣어 starved cells을 만든다. 실험2에서 정제된 파아지를 starved cells에 감염시켜 16 시간동안 원하는 파아지를 증폭하고 정제하였다.

1) 실험2에서 변형된 Z domain 펩타이드에 해당하는 유전자 절편이 삽입되게 재조합된 파아지가 들어간 것으로 확인된 선별된 박테리아를 1mM 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드(IPTG, Isopropyl-beta-D-Thiogalacto pyranosid)와 테트라사이클린을 함유한 2xTY 배지에 넣어 기른 후, centrifuge에 의해 supernatant는 새로운 튜브에 옮겨 담고 박테리아는 제거한다.

새로운 튜브에 옮겨 담은 supernatant에 1/5 볼륨의 PEG/NaCl을 넣고 잘 혼합한 후 1시간 동안 얼음에 넣어 저온실에 놓아둔다. centrifuge에 의해 supernatant를 제㎛거하고 튜브는 뒤집어서 5분 정도 말린다. 파아지 pellet을 PBS 버퍼에 잘 녹이고 다시 한 번 centrifuge에 의해 파아지가 녹아있는 supernatant를 새로운 튜브에 옮겨 담는다. 이러한 과정을 다시 한 번 반복한 후, PBS 버퍼에서 투석을 실행하고 0.45㎛ 크기의 필터를 사용하여 파이지의 정제를 마무리 한다.

2) 실험1에서 p8 파아지미드에 트롬빈 아미노산 절단 서열과 신호증폭용 펩 타이드에 해당하는 유전자가 삽입되게 재조합된 파아지미드는 미리 준비된 K91BluKan 박테리아세포에 전기충격법을 이용하여 주입하였다. 전기충격법의 반응조건은 12,5kV/cm, 200Ω, 25mF였다.

전기충격작업이 끝난 후 암피실린과 카나마이신을 함유한 아가 배지 플레이트에 박테리아들을 발라준 뒤 그 중 살아남은 클론들을 골라내는 방식을 통하여 전기충격법을 통해 제대로 재조합 파아지미드가 그 안으로 들어간 박테리아들을 선별하였다.

선별된 박테리아를 기른 후, 100㎕ 의 박테리아를 terrific broth에 넣고 기르면서 1/10 희석된 박테리아가 OD₆₀₀에서 0.1에서 0.2 사이의 값이 나올 때까지 길러 파아지미드를 함유하고 있는 starved cells을 만들었다.

3) 이렇게 만들어진 starved cells에 실험2에서 만든 파아지를 감염시켜 16 시간동안 원하는 파아지를 증폭하여 준다. centrifuge에 의해 supernatant는 새로운 튜브에 옮겨 담고 starved cells은 제거한다.

새로운 튜브에 옮겨 담은 supernatant에 1/5 볼륨의 PEG/NaCl을 넣고 잘 혼합한 후 1시간 동안 얼음에 넣어 저온실에 놓아둔다. centrifuge에 의해 supernatant를 제거하고 튜브는 뒤집어서 5분 정도 말린다. phage pellet을 PBS 버퍼에 잘 녹이고 다시 한 번 centrifuge에 의해 phage가 녹아있는 supernatant를 새로운 튜브에 옮겨 담는다. 이러한 과정을 다시 한 번 반복한 후, PBS 버퍼에서 투 석을 실행하고 0.45㎛ 크기의 필터를 사용하여 정제 한다.

최종적으로 p3에는 변형된 Z domain 이 붙고 p8에는 트롬빈 아미노산 절단 서열과 신호증폭용 펩타이드를 가지고 있는 파이지를 얻게 되며 이렇게 얻게된 정제된 재조합 박테리오파아지를 이용하여 단백질 혼합상으로 존재하는 시료속에 극미량으로 존재하는 검출 물질을 분석하는데 사용될 수 있으며, 이러한 방법은 정밀한 질량 분석 장치에 채용될 수 있다.

극미량 물질 검출이 어떤 원리로 이루어지는지에 대하여 설명한다. 프로테오믹스 샘플에는 여러 단백질이 섞여 있다. 그 중 양이 아주 미량인 것을 탐지하고 대조구와 비교하여 차별성이 있는지 알고자 하는 것이 이 특허의 목적이다. 미량인 물질을 인지하는 것은 파아지 표면 3번 단백질 위로 진열된 소형 항체가 직접 그 물질을 붙잡는 경로도 가능하며, 또는 항체를 붙잡는 z-domain 단백질을 파아지 표면 3번 단백질 위에 진열시킨 다음 이것이 항체를 붙잡고 그 항체가 미량 물질을 다시 붙잡는 간접적인 경로도 가능하다. 한편 샘플 내 미량 물질은 고정화 작업을 거쳐야 한다. 가령 그 미량물질과 특이적으로 반응하는 항체를 어떤 기벽에 매달고 그 위에 샘플 혼합물을 처리한 후 인큐베이션시키는 것이 한 예가 될 수 있다. 이렇게 고정화된 미량 물질 위에 앞서 파아지를 처리해주게 되면 3번 단백질에 진열된 인지물질을 통해 다시 그 미량물질에 달라붙게 되며, 결과적으로 미량 물질과 달라붙은 파아지가 고정화된다. 그런 다음 프로테아제를 처리해서 파아지의 몸통 즉 8번 단백질에 진열된 펩타이드(150copy/phage)를 잘라내 주면 미량 물질(항원)이 샘플내에 있을 경우 파아지 8번 단백질 위에 있던 펩타이드들이 잘려 나오게 된 다. 그리고 이 펩타이드를 메스 스펙트로스코피를 측정하면 미량 물질을 검출할 수 있고, 질량 분석을 수행할 수 있다. 하나의 항원에 하나의 파아지가 붙지만 그 하나의 파아지에는 150개 남짓되는 펩타이드가 치렁치렁 매달려 있기 때문에 신호가 증폭되는 효과를 보게 된다.

본 발명이 검출의 대상으로 하는 것은 주로 주로 항체이겠지만 샘플내 미량 물질이 무엇인지에 따라 다른 형태의 수용체일 수도 있다. 예를 들면, 그것이 EGF라면 수용체는 anti-EGF antibody일수도 있지만 EGFR(EGF receptor)일수도 있다. 이것을 진열하는 것은 유전자 재조합 기법을 이용하여 파아지 유전자에 이 수용체 유전자를 첨가시킴으로서 구현한다. 가령 소형 항체(ScFv, VH)나 receptor의 유전자를 파아지 3번 유전자 앞에 집어 넣어주면 이와 같은 것을 구현할 수 있다. 이처럼 직접적으로 수용체를 파아지 3번 단백질 위에 진열하는 것이 아닌 수용체를 붙잡을 수 있는 단백질 (Z-domain: 항체의 Fc domain을 붙잡음, S-tag:Biotin 처럼 streptavidin을 붙잡음)을 3번 단백질에 진열하고 그것이 항체를 붙잡거나 아니면 streptavidin으로 conjugation되어 있는 항체를 붙잡는 방식도 채용될 수 있다.

한편, 검출물질의 함량을 측정하는 방법과 분자인지물질로 처리한다고 할 때 그 함량은 신호의 강도 등을 파악하는 방법은 전술한 바와 같이 잘려져 나온 펩타이드의 정량을 함으로써 검출물질의 함량을 추론한다. 이 때 사용되는 펩타이드는 MALDI-TOF에 민감하게 신호를 보내는 펩타이드들로 구성되어 있다.

본 발명은 생명공학 산업, 의약 산업, 진단 산업, 초정밀 질량 분석 산업 등 다양한 산업 분야에 이용할 수 있다.

도 1은 박테리오파아지 진열 기법을 활용한 질량분석에 활용되는 박테리오파아지의 모식도,

도 2는 본 발명에 의한 변형된 pS1607 LVPRGS linker 뉴클레오타이드 염기서열,

도 3은 본 발명에 의한 스페이서를 위한 정방향 & 역방향 프라이머와 스페이서들,

도 4는 본 발명에 의한 스페이서가 재조합된 부분의 염기서열,

도 5는 본 발명에 의한 fd-SN-tet의 뉴클레오타이드 염기서열,

도 6는 본 발명에 의한 변형된 Z domain 뉴클레오타이드와 펩타이드 염기서열, 그리고,

도 7은 본 발명에 의한 변형된 Z domain이 들어간 부분의 재조합 파아지 염

기서열이다.

<110> KIST-Europe fGMBH <120> Manufacturing method of bactriophage in which molecular recognition material is arranged and using method of the same for detecting extremely small quantities and mass analysis device using the same <130> P2008-1060 <140> 10-2008-0138108 <141> 2008-12-31 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modifiec p8 phagmid <400> 1 ccgacaccat cgaatggtgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga 60 gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg 120 gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa 180 cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac 240 aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc 300 acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg 360 tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc 420 ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca 480 ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga 540 cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc 600 tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg 660 cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag 720 cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga 780 atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa 840 tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg 900 acgataccga agacagctca tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc 960 gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga 1020 agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata 1080 cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 1140 cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 1200 gcacaattct catgtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg 1260 tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg 1320 tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt 1380 ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga 1440 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagccagt ccgtttaggt gttttcacga 1500 gcacttcacc aacaaggacc atagattatg aaaataaaaa caggtgcacg catcctcgca 1560 ttatccgcat taacgacgat gatgttttcc gcctcggctt atgcatcagc catggcactc 1620 gagcatgcgg ccgcactggt cccccggggc agcgcgagct ccagcgccga gggtgacgat 1680 cccgcaaaag cggcctttaa ctccctgcaa gcctcagcga ccgaatatat cggttatgcg 1740 tgggcgatgg ttgttgtcat tgtcggcgca actatcggta tcaagctgtt taagaaattc 1800 acctcgaaag caagctgata aaccgataca attaaaggct ccttttggag cctttttttt 1860 tggagatttt caacgtgaaa aaattattat tcgcaattcc tttagttgtt cctttctatt 1920 ctcactccgc tgaaactgtt gaaagttgtt tagcaaaacc ccatacagaa aattcattta 1980 ctaacgtctg gaaagacgac aaaactttag atcgttacgc taactatgag ggttgtctgt 2040 ggaatgctac aggcgttgta gtttgtactg gtgacgaaac tcagtgtcta gctagagtgg 2100 cggtggctct ggttccggtg attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta ataagggggc 2160 tatgaccgaa aatgccgatg aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc 2220 tgtcgctact gattacggtg ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc 2280 taatggtaat ggtgctactg gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg 2340 tgacggtgat aattcacctt taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ccctccctca 2400 atcggttgaa tgtcgccctt ttgtctttag cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga 2460 ttgtgacaaa ataaacttat tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt 2520 tatgtatgta ttttctacgt ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aatcatgcca 2580 gttcttttgg ctagcgccgc cctatacctt gtctgcctcc ccgcgttgcg tcgcggtgca 2640 tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca cctcgctaac ggattcacca 2700 ctccaagaat tggagccaat caattcttgc ggagaactgt gaatgcgcaa accaaccctt 2760 ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg cacgcggcgc atctcgggca 2820 gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag 2880 gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa 2940 gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc 3000 gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg caccattatg ttccggatct 3060 gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac atctgtatta acgaagcgct 3120 ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac 3180 cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc 3240 tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa ttccccctta cacggaggca 3300 tcaagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac 3360 attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga 3420 atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta ccgcaggatc cggaaattgt aaacgttaat 3480 attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc 3540 gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt 3600 ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa 3660 accgtctatc agggctatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg 3720 tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga 3780 cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct 3840 agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat 3900 gcgccgctac agggcgcgtc cggatcctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 3960 ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 4020 agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 4080 cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 4140 tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 4200 gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 4260 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 4320 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 4380 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 4440 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 4500 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 4560 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 4620 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 4680 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 4740 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 4800 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 4860 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 4920 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 4980 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 5040 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 5100 aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 5160 gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 5220 gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 5280 caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 5340 ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 5400 attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 5460 ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 5520 gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 5580 ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 5640 tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 5700 gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 5760 cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 5820 gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 5880 tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 5940 ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 6000 gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 6060 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 6120 catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct 6180 ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaa 6218 <210> 2 <211> 9234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> filamentous bacteriophage section <400> 2 aacgctacta ccattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60 atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120 cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180 gttgcatatt taaaacatgt tgaactacag caccagattc agcaattaag ctctaagcca 240 tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactgtctaa tcctgacctg 300 ttggaatttg cttccggtct ggttcgcttt gaggctcgaa ttgaaacgcg atatttgaag 360 tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaattcgct ttgcttctga ctataataga 420 cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480 tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540 aaacatttta caattacccc ctctggcaaa acttcctttg caaaagcctc tcgctatttt 600 ggtttctatc gtcgtctggt taatgagggt tatgatagtg ttgctcttac catgcctcgt 660 aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgagtgtg gtattcctaa atctcaattg 720 atgaatcttt ccacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780 tcctcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840 aaatgattaa agttgaaatt aaaccgtctc aagcgcaatt tactacccgt tctggtgttt 900 ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960 aatatccggt gcttgtcaag attactctcg acgaaggtca gccagcgtat gcgcctggtc 1020 tgtacaccgt gcatctgtcc tcgttcaaag ttggtcagtt cggttctctt atgattgacc 1080 gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140 caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200 caaagatgag tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260 gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320 caaagcctcc gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380 cgatcccgca aaagcggcct ttgactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440 tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500 attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560 tttttggaga ttttcaacgt gaaaaaatta ttattcgcaa ttcctttagt tgttccattc 1620 tatgcggccc agccggccat ggcacaggtc caactgcagg agctcgagat caaacgggcg 1680 gccgcagaaa ctgttgaaag ttgtttagca aaacctcata cagaaaattc atttactaac 1740 gtctggaaag acgacaaaac tttagatcgt tacgctaact atgagggctg tctgtggaat 1800 gctacaggcg ttgtggtttg tactggtgac gaaactcagt gttacggtac atgggttcct 1860 attgggcttg ctatccctga aaatgagggt ggtggctctg agggtggcgg ttctgagggt 1920 ggcggttctg agggtggcgg tactaaacct cctgagtacg gtgatacacc tattccgggc 1980 tatacttata tcaaccctct cgacggcact tatccgcctg gtactgagca aaaccccgct 2040 aatcctaatc cttctcttga ggagtctcag cctcttaata ctttcatgtt tcagaataat 2100 aggttccgaa ataggcaggg tgcattaact gtttatacgg gcactgttac tcaaggcact 2160 gaccccgtta aaacttatta ccagtacact cctgtatcat caaaagccat gtatgacgct 2220 tactggaacg gtaaattcag agactgcgct ttccattctg gctttaatga ggatccattc 2280 gtttgtgaat atcaaggcca atcgtctgac ctgcctcaac ctcctgtcaa tgctggcggc 2340 ggctctggtg gtggttctgg tggcggctct gagggtggcg gctctgaggg tggcggttct 2400 gagggtggcg gctctgaggg tggcggttcc ggtggcggct ccggttccgg tgattttgat 2460 tatgaaaaaa tggcaaacgc taataagggg gctatgaccg aaaatgccga tgaaaacgcg 2520 ctacagtctg acgctaaagg caaacttgat tctgtcgcta ctgattacgg tgctgctatc 2580 gatggtttca ttggtgacgt ttccggcctt gctaatggta atggtgctac tggtgatttt 2640 gctggctcta attcccaaat ggctcaagtc ggtgacggtg ataattcacc tttaatgaat 2700 aatttccgtc aatatttacc ttctttgcct cagtcggttg aatgtcgccc ttatgtcttt 2760 ggcgctggta aaccatatga attttctatt gattgtgaca aaataaactt attccgtggt 2820 gtctttgcgt ttcttttata tgttgccacc tttatgtatg tattttcgac gtttgctaac 2880 atactgcgta ataaggagtc ttaatcatgc cagttctttt gggtattccg ttattattgc 2940 gtttcctcgg tttccttctg gtaactttgt tcggctatct gcttactttc cttaaaaagg 3000 gcttcggtaa gatagctatt gctatttcat tgtttcttgc tcttattatt gggcttaact 3060 caattcttgt gggttatctc tctgatatta gcgcacaatt accctctgat tttgttcagg 3120 gcgttcagtt aattctcccg tctaatgcgc ttccctgttt ttatgttatt ctctctgtaa 3180 aggctgctat tttcattttt gacgttaaac aaaaaatcgt ttcttatttg gattgggata 3240 aataaatatg gctgtttatt ttgtaactgg caaattaggc tctggaaaga cgctcgttag 3300 cgttggtaag attcaggata aaattgtagc tgggtgcaaa atagcaacta atcttgattt 3360 aaggcttcaa aacctcccgc aagtcgggag gttcgctaaa acgcctcgcg ttcttagaat 3420 accggataag ccttctattt ctgatttgct tgctattggt cgtggtaatg attcctacga 3480 cgaaaataaa aacggtttgc ttgttcttga tgaatgcggt acttggttta atacccgttc 3540 atggaatgac aaggaaagac agccgattat tgattggttt cttcatgctc gtaaattggg 3600 atgggatatt atttttcttg ttcaggattt atctattgtt gataaacagg cgcgttctgc 3660 attagctgaa cacgttgttt attgtcgccg tctggacaga attactttac cctttgtcgg 3720 cactttatat tctcttgtta ctggctcaaa aatgcctctg cctaaattac atgttggtgt 3780 tgttaaatat ggtgattctc aattaagccc tactgttgag cgttggcttt atactggtaa 3840 gaatttatat aacgcatatg acactaaaca ggctttttcc agtaattatg attcaggtgt 3900 ttattcatat ttaacccctt atttatcaca cggtcggtat ttcaaaccat taaatttagg 3960 tcagaagatg aaattaacta aaatatattt gaaaaagttt tctcgcgttc tttgtcttgc 4020 gataggattt gcatcagcat ttacatatag ttatataacc caacctaagc cggaggttaa 4080 aaaggtagtc tctcagacct atgattttga taaattcact attgactctt ctcagcgtct 4140 taatctaagc tatcgctatg ttttcaagga ttctaaggga aaattaatta atagcgacga 4200 tttacagaag caaggttatt ccatcacata tattgattta tgtactgttt caattaaaaa 4260 aggtaattca aatgaaattg ttaaatgtaa ttaattttgt tttcttgatg tttgtttcat 4320 catcttcttt tgctcaagta attgaaatga ataattcgcc tctgcgcgat ttcgtgactt 4380 ggtattcaaa gcaaacaggt gaatctgtta ttgtctcacc tgatgttaaa ggtacagtga 4440 ctgtatattc ctctgacgtt aagcctgaaa atttacgcaa tttctttatc tctgttttac 4500 gtgctaataa ttttgatatg gttggctcaa ttccttccat aattcagaaa tataacccaa 4560 atagtcagga ttatattgat gaattgccat catctgatat tcaggaatat gatgataatt 4620 ccgctccttc tggtggtttc tttgttccgc aaaatgataa tgttactcaa acatttaaaa 4680 ttaataacgt tcgcgcaaag gatttaataa gggttgtaga attgtttgtt aaatctaata 4740 catctaaatc ctcaaatgta ttatctgttg atggttctaa cttattagta gttagcgccc 4800 ctaaagatat tttagataac cttccgcaat ttctttctac tgttgatttg ccaactgacc 4860 agatattgat tgaaggatta attttcgagg ttcagcaagg tgatgcttta gatttttcct 4920 ttgctgctgg ctctcagcgc ggcactgttg ctggtggtgt taatactgac cgtctaacct 4980 ctgttttatc ttctgcgggt ggttcgttcg gtatttttaa cggcgatgtt ttagggctat 5040 cagttcgcgc attaaagact aatagccatt caaaaatatt gtctgtgcct cgtattctta 5100 cgctttcagg tcagaagggt tctatttctg ttggccagaa tgtccctttt attactggtc 5160 gtgtaactgg tgaatctgcc aatgtaaata atccatttca gacggttgag cgtcaaaatg 5220 ttggtatttc tatgagtgtt tttcccgttg caatggctgg cggtaatatt gttttagata 5280 taaccagtaa ggccgatagt ttgagttctt ctactcaggc aagtgatgtt attactaatc 5340 aaagaagtat tgcgacaacg gttaatttgc gtgatggtca gactcttttg ctcggtggcc 5400 tcactgatta caaaaacact tctcaagatt ctggtgtgcc gttcctgtct aaaatccctt 5460 taatcggcct cctgtttagc tcccgttctg attctaacga ggaaagcacg ttgtacgtgc 5520 tcgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg 5580 gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc 5640 ttcccttcct ttctcgccac gttctccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggatc 5700 tcgggaaaag cgttggtgac caaaggtgcc ttttatcatc actttaaaaa taaaaaacaa 5760 ttactcagtg cctgttataa gcagcaatta attatgattg atgcctacat cacaacaaaa 5820 actgatttaa caaatggttg gtctgcctta gaaagtatat ttgaacatta tcttgattat 5880 attattgata ataataaaaa ccttatccct atccaagaag tgatgcctat cattggttgg 5940 aatgaacttg aaaaaattag ccttgaatac attactggta aggtaaacgc cattgtcagc 6000 aaattgatcc aagagaacca acttaaagct tatgatgatg atgtgcttaa aaacttactc 6060 aatggctggt ttatgcatat cgcaatacat gcgaaaaacc taaaagagct tgccgataaa 6120 aaaggccaat ttattgctat ttaccgcggc tttttattga gcttgaaaga taaataaaat 6180 agataggttt tatttgaagc taaatcttct ttatcgtaaa aaatgccctc ttgggttatc 6240 aagagggtca ttatatttcg cggaataaca tcatttggtg acgaaataac taagcacttg 6300 tctcctgttt actcccctga gcttgagggg ttaacatgaa ggtcatcgat agcaggataa 6360 taatacagta aaacgctaaa ccaataatcc aaatccagcc atcccaaatt ggtagtgaat 6420 gattataaat aacagcaaac agtaatgggc caataacacc ggttgcattg gtaaggctca 6480 ccaataatcc ctgtaaagca ccttgctgat gactctttgt ttggatagac atcactccct 6540 gtaatgcagg taaagcgatc ccaccaccag ccaataaaat taaaacaggg aaaactaacc 6600 aaccttcaga tataaacgct aaaaaggcaa atgcactact atctgcaata aatccgagca 6660 gtactgccgt tttttcgccc catttagtgg ctattcttcc tgccacaaag gcttggaata 6720 ctgagtgtaa aagaccaaga cccgctaatg aaaagccaac catcatgcta ttccatccaa 6780 aacgattttc ggtaaatagc acccacaccg ttgcgggaat ttggcctatc aattgcgctg 6840 aaaaataaat aatcaacaaa atgggcatcg ttttaaataa agtgatgtat accgaattcg 6900 attgcgtctc aacccctact tcggtatctg tattatcacg tgtatttttg gtttcacgga 6960 accaaaacat aaccacaagg aaagtgacaa tatttagcaa cgcagcgata aaaaagggac 7020 tatgcggtga aatctctcct gcaaaaccac caataatagg ccccgctatt aaaccaagcc 7080 caaaacttgc ccctaaccaa ccgaaccact tcacgcgttg agaagctgag gtggtatcgg 7140 caatgaccga tgccgcgaca gccccagtag ctcctgtgat ccctgaaagc aaacggccta 7200 aatacagcat ccaaagcgca cttgaaaaag ccagcaataa gtaatccagc gatgcgccta 7260 ttaatgacaa caacagcact gggcgccgac caaatcggtc agacattttt ccaagccaag 7320 gagcaaagat aacctgcatt aacgcataaa gtgcaagcaa tacgccaaag tggttagcga 7380 tatcttccga agcaataaat tcacgtaata acgttggcaa gactggcatg ataaggccaa 7440 tccccatggc atcgagtaac gtaattacca atgcgatctt tgtcgaacta ttcatttcac 7500 ttttctctat cactgatagg gagtggtaaa ataactctat caatgataga gtgtcaacaa 7560 aaattaggaa ttaatgatgt ctagattaga taaaagtaaa gtgattaaca gcgcattaga 7620 gctgcttaat gaggtcggaa tcgaaggttt aacaacccgt 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aacaacaacg acgattctat gaggccttac atgatcctaa cttaaacgaa 60 gaacaacgaa acgccaaaat caaaagtata cgagatgac 99

Claims

(A) 변형된 p8 파아지미드에 트롬빈 아미노산 절단 서열과 신호증폭용 펩타이드에 해당하는 유전자 스페이서를 삽입함으로써 재조합 파아지미드를 제조하는 단계;

(B) 서열목록2의 변형된 fd-SN-tet GGGGS linker에 서열목록3의 변형된 Z domain의 펩타이드(FNMQQQRRFY EALHDPNLNE EQRNAKIKSI RDD)에 해당하는 유전자 절편을 삽입함으로써 재조합 파아지를 제조하는 단계; 및

(C) p3에는 서열목록 3의 변형된 Z domain이 붙고 p8에는 트롬빈 아미노산 절단 서열과 신호증폭용 펩타이드를 가지고 있는 파아지를 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (A) 단계는

(A-1) 서열목록1의 pS1607 LVPRGS linker 파아지미드에 제한효소 NcoI, 제한효소 NotI을 혼합한 후 기설정된 온도 및 시간 조건으로 항온 반응한 후 정제를 하고, 탈인산효소을 가한 후 기설정된 온도 및 시간 조건으로 항온 반응한 후, 전기 영동하여 DNA를 분리 추출하는 단계;

(A-2) 트롬빈 절단자리와 고신호 출력용 펩타이드 염기서열을 보유한 스페이서들의 준비하는 단계;

(A-3) 상기 (A-1) 단계에서의 획득된 절단된 파아지미드 절편과 상기 (A-2) 단계에서 획득된 융합된 스페이서에 연결효소를 섞은 후 기설정된 온도 및 시간 조건으로 항온 반응하는 단계; 및

(A-4) 연결효소를 투입한 항온 반응 결과물을 박테리아 세포에 전기 충격법으로 주입하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 (B) 단계는

(B-1) 상기 변형된 fd-SN-tet GGGGS linker 파아지에 제한효소 SfiI을 혼합한 후 기설정된 온도 및 시간 조건으로 항온 반응한 후 정제를 하고, 탈인산효소을 가한 후 기설정된 온도 및 시간 조건으로 항온 반응한 후, 전기 영동하여 DNA를 분리 추출하는 단계;

(B-2) 상기 fd-SN-tet GGGGS linker에 상기 변형된 Z domain 펩타이드 염기서열을 삽입하여 재조합된 파아지에 제한효소 SfiI을 혼합한 후 기설정된 온도 및 시간 조건으로 항온 반응한 후 정제를 하고, 제한효소 NotI을 가한 후 기설정된 온도 및 시간 조건으로 항온 반응한 후, 전기 영동하여 DNA를 분리 추출하는 단계;

(B-3) 상기 변형된 Z domain 펩타이드 염기서열을 보유한 절편과 절단된 파아지 절편을 연결효소와 섞은 후 기설정된 온도 및 시간 조건으로 항온 반응하는 단계;

(B-4) 상기 연결효소를 투입한 항온 반응 결과물을 박테리아 세포에 전기 충격법으로 주입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 (C) 단계는,

(C-1) 상기 (B) 단계에서의 상기 변형된 Z domain 펩타이드에 해당하는 유전자 절편이 삽입되게 재조합된 파아지가 들어간 것으로 확인된 선별된 박테리아를 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드(IPTG, Isopropyl-beta-D-Thiogalacto pyranosid)와 테트라사이클린을 함유한 배지에 기른 후 원심분리하고 박테리아를 제거한 다음 박테리오파아지를 정제하는 단계;

(C-2) 상기 (A) 단계에서의 p8 파아지미드에 트롬빈 아미노산 절단 서열과 신호증폭용 펩타이드에 해당하는 유전자가 삽입되게 재조합된 파아지미드를 함유하고 있는 박테리아를 starved cell로 제조하는 단계;

(C-3) 상기 starved cell에 상기 (B) 단계에서 제조된 파아지를 감염시켜 박테리오파아지를 증폭하고 정제하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법.
제 2항에 있어서,

상기 (A-2) 단계는,

스페이서를 이루는 정방향 프라이머 1for(5'-CAT GGC AGA TTT CCA ACT CAA TCA GCT AGA GGG CAA GGC-3'), 2for(5'-CAT GGC AAT TCT CTA CCC AGC TAC TAC AGG CAA GGC-3'), 3for(5'-CAT GGC ACC AGT CGC AGA AGA GTT CAA GGC-3'), 4for(5'-CAT GGC ATC ATT CAC TAC AAC TGC AGA GAA GGC-3') 및 5for(5'-CAT GGC AGT TGA AGC TCT AAA TAG TCT CAC TGG AGA ATT TAA GGC-3')와, 역방향 프라이머 1back(3'-CGT CTA AAG GTT GAG TTA GTC GAT CTC CCG TTC CGC CGG-5'), 2back(3'-CGT TAA GAG ATG GGT CGA TGA TGT CCG TTC CGC CGG-5'), 3back(3'-CGT GGT CAG CGT CTT CTC AAG TTC CGC CGG-5'), 4back(3'-CGT AGT AAG TGA TGT TGA CGT CTC TTC CGC CGG-5') 및 5back(3'-CGT CAA CTT CGA GAT TTA TCA GAG TGA CCT CTT AAA TTC CGC CGG-5')에 다중핵산키나제를 첨가한 뒤 기설정된 온도 및 시간 조건으로 항온 반응하고, 상기 정방향 프라이머와 상기 역방향 프라이머의 (1for, 1back), (2for, 2back), (3for, 3back), (4for, 4back), 및 (5for, 5back) 중 어느 한 쌍의 조합으로 섞은 다음 기설정된 온도 및 시간 조건으로 가열한 다음, 기설정된 온도 및 시간 조건으로 냉각시키는 방식으로 융합시켜 융합된 스페이서를 획득하는 것인 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 제조 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지.
제 6항에 있어서,

몸통에 고신호 출력 펩타이드를 다량 진열하고 머리부분에는 검출물질에 특이적으로 반응할 수 있는 분자인지물질이 진열된 것인 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지.
제 7항에 있어서,

상기 몸통은 p8 표면 단백질이며, 상기 머리부분은 p3 표면 단백질인 것인 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진 열된 박테리오파아지.
제 8항에 있어서,

상기 p8 표면 단백질에는 트롬빈 절단서열과 질량분석시 고신호 출력 펩타이드를 서로 연결시킨 채 진열된 것인 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지.
제 6항에 있어서,

상기 박테리오파아지는

섬사상 박테리오파아지인 것인 것을 특징으로 하는 검출 물질에 특이적으로 반영할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지.
제6항의 박테리오파아지를 미량 검출물을 검출하는데 활용하는 방법.
제6항의 박테리오파아지를 활용하는 질량 분석 장치.