KR101109985B1

KR101109985B1 - 위액촉진 작용을 갖는 신규 미생물 및 그 분비 조성물

Info

Publication number: KR101109985B1
Application number: KR1020097005271A
Authority: KR
Inventors: 요시치카 카메야마
Original assignee: 요시치카 카메야마
Priority date: 2007-08-10
Filing date: 2007-08-10
Publication date: 2012-09-07
Also published as: JPWO2009022399A1; JP4695191B2; KR20090060415A; US20100291052A1; WO2009022399A1; EP2196533B1; US8748158B2; EP2196533A4; EP2196533A1; EP2196533B9

Abstract

위액의 분비를 촉진하고 혈소판 증가 작용을 갖는 신규 미생물 및 그 분비물로 이루어지는 의약품의 제공을 목적으로 한다. 이 신규 미생물은 바실러스푸밀러스(Bachillus pumilus)종에 속하는 국제기탁번호 NITE BP-295로, 구균 및 간균의 모든 형태를 취할 수 있음을 특징으로 하며 8자 운동을 수행한다. 서열번호 1의 유전자를 갖는 신규 미생물이며 또한 그 미생물 및 그 미생물의 분비물로 이루어지는 위액분비 촉진 조성물의 제공을 목적으로 한다.

Description

위액촉진 작용을 갖는 신규 미생물 및 그 분비 조성물{NOVEL MICROORGANISM HAVING GASTRIC JUICE PROMOTING ACTION AND COMPOSITION SECRETED BY THE SAME}

본 발명은, 바실러스푸밀러스(Bacillus pumilus)종에 속하는 신규 미생물에 관한 것으로서, 만성위염에 의한 위산의 감소에 대해 위액의 분비를 촉진하는 작용을 갖는 신규 미생물, 그 분비물 조성물 및 이것들을 사용한 플라스미드에 관한 것이다.

위궤양, 십이지장궤양 등의 소화성 궤양의 경우에는 소화액 등의 내장벽에 대한 공격인자 억제제(위산분비 억제제, 위산 중화제 등)나 방어인자 증강제(점막 보호제 등)가 사용되어 왔다. 그러나 만성위염, 특히 무산성 위염의 환자에게는 위산의 분비 촉진이 효과적인 것으로 여겨지나 생체에 무해한 위액 촉진제에 대해서는 아직 개발되지 않은 상황이다.

위궤양의 원인 중 하나인 헬리코박터 파이로리 세균 감염의 경우에는 만성위염을 발생시켜 결국에는 궤양/암을 유발시킨다. 즉 위의 상태를 악화시키는 균이지만, 같은 미생물이면서 위의 상태를 개선하는 미생물은 아직 발견되지 않은 실정이다.

따라서 파이로리균에 대항할 수 있는 위의 상태를 개선하는 미생물의 발견이 요구되고 있다. 또한 발견된 신규의 미생물 및 그 분비물을 이용한 치료제의 제조를 과제로 하고 있다.

본 발명의 신규 미생물은 발명자의 실험에 따르면 완전히 파이로리균과는 반대인 환경, 즉 만성위염 특히 위산이 감소하는 타입인 만성위염에 대하여 위액의 분비를 촉진시켜 만성위염을 경감시키는 것으로서, 나아가 만성위염으로 인한 암이나 궤양을 방지하는 것으로 추측된다. 따라서 모든 사람의 위나 혈액으로부터 검출되고 만성위염, 궤양, 암 환자의 혈액으로부터도 검출되는 경우도 간혹 있다.

위액 분비 촉진에 유리한 특성을 가질 뿐 아니라 혈소판, 적혈구, 백혈구의 증가 작용도 관찰되므로 다방면에의 응용이 가능해진다.

바실러스푸밀러스종에 속하는 신규 미생물(국제기탁번호 NITE BP-295)의 동물실험 결과 위액분비 촉진 효과가 확인되었고 아울러 LD50 2g이상이므로 무해한 것 또한 판명되었다.

이 미생물의 형태로는 점형, 사슬형 모두 존재하며 크기는 0.5~1㎛×10~20㎛ 양단에 편모를 가지며 운동성이 있어 8자 운동을 한다. 아포를 가지며 호기성이 높은 그램 양성의 간균 및 구균이다. 사슬형일 수도 있다. 분리원은 인간의 위벽 혹은 혈액이다. 혹은 만성위염을 발생시키는 바이러스를 수정란에 이식시키고 이에 대항하여 출현하는 균을 채취할 수도 있다.

배양 조건은 다음과 같다.

배지 1000㎖ (Trypto-Soya 육즙(bouillon) 당

펩톤 17g

대두펩톤 3g

염화나트륨 5g

포도당 2.5g

인산수소칼륨 2.5g

의 영양물을 첨가하고, 카세이 소다 3g을 부가한다. pH를 8.5로 조정한다. 배지의 살균 조건은 121℃ 15분으로 하고 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 2일 내지 7일로 한다.

이상의 조건으로 배양시킨 균의 특성은 편성 호기성이며 생존 확인은 육안 또는 현미경 하에서의 관찰로 한다.

보관 조건은 동결 건조 등, 일반적으로 사용되고 있는 방법으로 할 수 있다.

이와 같이 하여 채취한 신규 미생물은 하기의 특징을 갖는다. 또한 이 특징들은 현미경 관찰 등에 의한 것이다.

1 유전자배 병원세균을 탐식할 때에는 그 항균성이 강해진다.

2 병원세균에 의해 형태를 바꾼다.

3 대사 산물인 분비물질은 갈색이다.

4 신규 미생물은 적혈구를 침범하지 않는다. (적혈구의 경우 보통 항암제를 사용해도 적혈구의 수가 감소하지 않고 Hb 12-16 그대로로 적혈구가 감소되지 않았다. C형 간염이면 6 정도가 된다).

5 신규 미생물은 죽은 조직체를 청정화한다.

6 신규 미생물은 방사선, 자외선, 미음파<微音波>에 약하다.

7 신규 미생물은 내열성이 강하여 수시간 동안 100℃를 견뎌낼 수 있고 파괴되지 않는다. 오토클레이브를 하여도 살아 있다.

8 적혈구, 혈소판, 백혈구의 증가를 촉진시켜 빈혈 개선을 볼 수 있다. (백혈구 6000이었던 환자의 경우 항암제 투여후에도 500이상의 백혈구 수치가 확인되는 점을 통해 이 균에 의한 증가 작용이 인정된다. 혈소판은 200,000이었던 환자에 대해 항암제 투여후에도 3,000 정도로밖에 떨어지지 않은바 이 균에 의한 증가 작용이 인정된다.)

이 서열은 일부 서열 동정을 통해 서열번호 1에 나타낸 유전자 서열을 가짐이 판명되었다. 또한 도 2 내지 도 4에 도시된 바와 같이 99%의 상동성으로 바실러스푸밀러스종인 것으로 판단되었다. 계통수는 도 5에 도시된 바와 같다. 서열의 일부가 특정되어 있음으로 인해 플라스미드 발현 벡터 등에 대한 응용 등이 가능해지고 대량 배양이나 스크리닝, 제약 등에 있어서 큰 효과를 기대할 수 있다.

분비물의 추출 방법에 대해 설명하면 다음과 같다. 우선 33~37℃에서 7일간 육즙 내에서 균을 배양한다. 이어서 순수 부틸알콜을 동량의 배양여액에 부가하여 잘 섞는다. 3시간 방치 혹은 원심분리한 후 투명한 부틸알콜 용액을 분리시킨다. 이 용액에 1 규정 농도의 염산을 첨가하여 pH를 3.0으로 하여 잘 섞고 12시간 방치한다. 이어서 진공 건조하면 밝은 황색의 결정과 유기물질, 무기물질을 얻을 수 있다.

부틸알콜 용액을 이외의 용액을 활성탄과 혼합시켜 잘 섞어 하루 방치한다.

활성탄만을 부틸알콜에 부가하여 12시간후 부틸알콜 용출액을 진공 건조시킨다. 이하 상기 과정을 반복하여 결정을 얻는다.

본 발명은 또한, 상기 분비물의 아미노산 서열을 코드할 수 있는 DNA-서열을 갖는 발현 벡터를 함유하는, 형질 전환된 미생물을 사용하는 본 발명의 분비물의 제법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 형질 전환된 미생물을 상기한 바에 따라 배양시키고 또한 배지로부터 분비물을 단리시킨다.

본 발명의 신규 미생물 및 그 분비물은 위산의 분비를 촉진하는 작용을 가지며 내열성이 있다. 추출물은 만성위염 등의 위산이 감소하는 타입의 만성위염에 대하여 위산의 분비를 촉진시켜 만성위염을 경감시키는 것으로, 위의 상태를 정돈함으로써 나아가서는 만성위염에 기인하는 암이나 궤양을 방지하는 것으로 추측된다. 이 균은 모든 사람의 위나 혈액으로부터 검출되며 만성위염, 궤양, 암 환자의 혈액으로부터도 검출되는 경우도 간혹 있다.

위액분비 촉진에 유리한 특성을 가질 뿐 아니라, 혈소판, 적혈구, 백혈구의 증가 작용도 보이며 아울러 무해하므로 다방면에의 응용이 가능해진다.

도 1은 상동성 검색 설명도이고,

도 2는 상동성 검색 결과를 나타낸 도면(염기 1-60)이고,

도 3은 상동성 검색 결과를 나타낸 도면(염기 61-840)이고,

도 4는 상동성 검색 결과를 나타낸 도면(염기 841-1480)이고,

도 5는 본 발명의 신규 미생물의 계통수를 나타낸 도면이고,

도 6은 본 발명의 신규 미생물 배양 콜로니를 나타낸 도면이고,

도 7은 도 6의 확대도이고,

도 8은 큰 콜로니의 그램 염색을 나타낸 도면이고,

도 9는 작은 콜로니의 그램 염색을 나타낸 도면이고,

도 10은 마우스의 피모에 색소 도포하는 개체 식별법을 나타낸 도면이다.

하기의 예는 예시한 전형적 태양에 있어서 본 발명을 자명하게 하기 위한 것으로, 이 범위 내로 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

본 실시예에 있어서는 먼저 배양 조건이나 결과를 실시예 1로써 나타내고 이어서 분비물의 분리 방법 및 이를 이용한 동물실험에 대해 실시예 2로써 설명하고 또한 항종양실험(실시예 3), 독성시험(실시예 4), 임상실험(만성위염환자/실시예 5)에 대해 설명한다. 또한 염색실험(실시예 6)에 대해 설명한다.

실시예 1

이 미생물은 형태로서는 점형, 사슬형 모두를 가지며 크기는 0.5~1㎛×10~20㎛ 양단에 편모를 가지며 운동성이 있어 8자 운동을 한다. 아포를 가지며 호기성이 높은 그램 양성의 간균 및 구균이다. 사슬형일 수도 있다. 분리원은 위벽 혹은 혈액이다.

배양 조건은 다음과 같다.

배지 1000㎖ (Trypto-Soya 육즙) 당

펩톤 17g

대두펩톤 3g

염화나트륨 5g

포도당 2.5g

인산수소칼륨 2.5g

의 영양물을 첨가하고 카세이 소다 3g을 부가한다. pH를 8.5로 조정한다. 배지의 살균 조건은 121℃ 15분으로 하고 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 2일 내지 7일로 한다.(도 6~9)

이상의 조건으로 배양한 균의 특성은 편성 호기성이며, 생존 확인은 육안 또는 현미경 하에서의 관찰로 한다. 도 6은, 지정 배지에서 1일 배양한 콜로니 화상을 나타낸다.

또한 □로 둘러싸인 오른쪽의 콜로니는 표면이 러프한 큰 콜로니이며 직사각형으로 둘러싸인 좌측의 콜로니는 표면이 스무드한 작은 콜로니이다. 콜로니의 확대를 도 7에 도시하여 그램 염색의 결과를 나타낸다. 전자는 그램 양성 간균(도 8)이며 후자는 그램 양성 구균(도 9)이다.

보관 조건은 동결 건조 등 일반적인 방법을 사용할 수 있다.

실시예 2

분비물을 동물에게 섭취시킨 결과 위액의 변화에 대한 반응을 살펴보았다.

분비물 추출 방법

분비물의 추출 방법에 대해서는, 콜로니를 37℃의 인큐베이터에 넣으면 2~7일 후 표면이 백회색 혹은 밝은 황색이 되며 이것을 30℃ 내지 37℃로 7일간 육즙 내에서 균을 배양한다.

이어서 순수 부틸알콜을 동량으로 배양여액에 가하여 잘 섞는다.

3시간 방치 혹은 원심분리한 후 투명한 부틸알콜 용액을 분리한다.

이 용액에 1 규정의 염산을 가하여 pH 3.0으로 만들고 잘 섞어 12시간 방치한다. 이후 진공 건조시키면 밝은 황색의 결정과 유기물질, 무기물질을 얻을 수 있다.

부틸알콜 용액을 제외한 용액을 활성탄과 혼합하고 잘 섞어 하루 방치한다.

활성탄만을 부틸알콜에 가하여 12시간후 부틸알콜 용출액을 진공 건조시킨다. 이하 상기한 과정을 반복하여 결정을 얻는다.

동물실험

본 발명의 실시예 2에서는 신규 미생물의 분비물에 대해 하이덴하인 포치개(犬)에 있어서의 위산분비량 측정 시험을 수행했다.

실험 방법: 분비물 2.6g에 매체로서는 당액 5%를 사용했다(실온 보존).

사용 동물: 13개월령으로 구입한 수컷 개를 13일간 검역 및 순화 사육하여 일반상태의 관찰과 체중 측정을 실시하여 건강한 동물인 것을 확인한 후 수술일의 체중이 14.2~14.7kg이고 13개월령인 동물을 사용했다.

환경: 온도 20~28℃, 상대습도 30~80%, 환기 회수 12~18회/시간, 조명 시간 12시간(7:00~19:00)인 범위 내에 설정하였다.

사료: 라보D스톡크(등록상표: 일본농산공업주식회사 제품)

음료수: 상하수도의 자동공급 장치를 통한 자유 섭취

투여 방법: 분비물 500mg을 막자사발에 넣어 막자를 사용하여 당액 5%을 가하여 용해시켰다. 여기에 당액 5%을 가하여 50mL로 투여액을 만들었다.

투여 용량: 10mg/kg

투여 액량: 1mL/kg 3가지 예

측정 방법: 투여 후 2시간 동안의 위산분비량을 15분마다 측정하여 위산분비량의 변화에 대해 검토했다.

하이덴하인포치 개의 작제와 관리

수술일 전날로부터 18시간 이상 금식시키고 마취약 도입 30분전에 아트로핀황산염(0.1mg/ｋg)을 근육 내에 투여했다. 전지(前肢) 근막측 피정맥을 통해 티오펜탈나트륨을 투여하여 마취를 도입후 수술대 위에서 38℃로 세트한 체온 컨트롤러의 보온 패드에 등이 닿도록 개를 눕히고 기관 캐뉼러를 장착하여 인공 호흡 및 흡입 마취를 실시했다. 인공 호흡의 1회 환기량은 20~25mL/kg, 11~13회/min으로 하고 흡기시에는 아산화질소 1~4%의 범위로 기화된 것을 공급하여 흡입 마취를 도입하고 유지 마취에는 0.5~2.0%의 것을 사용했다. 복부 및 그 주변의 털을 전기 면도기로 제모한 후 수술 부위 전체를 소독하고 복부 정중심선을 따라 검상돌기의 약간 하부에서 배꼽부 상부까지의 피부 및 근층을 절개한 후, 복강 내에서 위를 끌어내어 복벽 상에 위를 노출시켰다. 절리 예정선을 교차하고 있는 대만부의 혈관을 2중 결찰하여 절단후 절리 예정선을 위장봉합기를 이용하여 절단 봉합하여 포치측으로 위루관을 낸 후 개복부를 봉합하고 포치 내부를 따뜻한 생리식염수로 여러 번 세정했다. 수술후 다음날부터 2일 동안은 금식시키고 그 동안에는 보액(등록상표:락텍(Lactec)D 오츠카제약공업사 제품)을 150mL/day 실시했다. 이후에는 보통 사육으로 하고 탈수증을 막기 위해 식염(약 0.4g/day)을 사료에 섞어 주었다.

위액분비 측정 방법

하이덴하인포치 개는 수술 후 약 3주 경과후부터 사용하였다. 물을 먹이며 18시간 이상 절식시키고 쇠파이프제의 프레임 내에 천으로 만든 복대로 가볍게 매단 상태에서 위액의 채취를 실시했다. 분비물 투여전 30분부터 분비물 투여후 2시간까지 15분 간격으로 위액을 채취하여 그 위액에 대해서는 양(mL)의 측정 및 산도(0.01N NaOH 중화 적정값: mEq/L)를 측정하고 얻어진 위액량 및 산도를 통해 각 측정 시간의 위산분비량 (mEq/15min)를 산출했다.

결과를 표 1 내지 표 4에 나타냈다.

분비물(피험물질) A 투여에 의한 위산분비량의 변화

실험군	투여용량 (mg/kg)	n=3	위산분비량(mEq/15min)
			투여전	투여후의 관찰시간(min)
			투여전	15	30	45	60	75	90	105	120
분비물(피험물질)A	10	평균값	0.82	0.97	0.96	1.18	1.20^*	0.95	0.77	0.88^*	0.72
분비물(피험물질)A	10	표준오차	0.09	0.12	0.16	0.19	0.12	0.16	0.04	0.08	0.05

^*P<0.05: 투여전 값에 대한 유의(有意) 차(Paired t-test)

분비물(피험물질) A 투여에 의한 위산분비량의 변화

실험군	개체번호	위산분비량(mEq/15min)
		투여전	투여후의 관찰시간(min)
		투여전	15	30	45	60	75	90	105	120
분비물 (피험 물질)A	1	0.75	0.80	0.90	1.20	1.00	0.65	0.72	0.80	0.64
	2	1.00	1.20	1.25	1.50	1.40	1.20	0.84	1.05	0.80
	3	0.72	0.90	0.72	0.84	1.20	1.00	0.75	0.80	0.72

고기엑스 투여에 의한 위산분비량의 변화

실험군	투여 용량	n=3	위산분비량(mEq/15min)
			투여전	투여후의 관찰시간(min)
			투여전	15	30	45	60	75	90	105	120
고기엑스	25%	평균값	0.01	0.15	0.53	0.57	0.41	0.25	0.15	0.09	0.07
고기엑스	25%	표준오차	0.0	0.1	0.1	0.0	0.0	0.1	0.0	0.0	0.0

고기엑스 투여에 의한 위산분비량의 변화

실험군	개체번호	위산분비량(mEq/15min)
		투여전	투여후의 관찰시간(min)
		투여전	15	30	45	60	75	90	105	120
고기엑 스	1	0.02	0.27	0.55	0.52	0.42	0.31	0.19	0.12	0.12
	2	0.02	0.16	0.61	0.57	0.32	0.31	0.20	0.11	0.07
	3	0.00	0.02	0.42	0.61	0.48	0.14	0.07	0.03	0.02

분비물을 투여하고 투여후 2시간까지의 위산분비량은 평균값으로 투여전 0.82에서 1.20까지의 수치를 나타내고 투여후 60분에서 가장 위산분비량이 증가하고 증가량은 0.38mEq/15min이었다.

개체 1, 2, 3의 결과를 표 2에 나타냈다.

투여후 60분 및 105분에서의 위산분비량에 투여전과 비교하여 통계학적으로 유의한 증가가 확인되었다. 고기엑스를 투여하고 투여 후 2시간까지의 위산분비량은 평균치로 투여전 0.01에서 0.57까지의 값을 나타냈다.(표 3, 4) 투여후 45분에서 가장 위산분비량이 증가하고 증가량은 0.56mEq/15min이었다.

이상에서 본건 분비물은 투여후 60분과 105분에서 위산 분비의 유의한 차이가 확인되고 통계학적으로 유의한 차이가 확인되지 않은 15, 30, 45 및 75분에서도 위산 분비가 증가하는 경향을 보였다.

고기엑스를 투여한 결과와 비교하면 분비물(피험물질)은 증가량에서 다소 고기엑스보다 적지만 가장 증가한 시간은 고기엑스와 유사하며 거의 동일한 증가 감소를 나타내고 있다. 이상의 결과로, 분비물(피험물질)은 위산분비량을 증가시키는 효과가 있고 그 효과는 고기엑스의 효과와 같다고 볼 수 있다.

실시예 3

본 발명의 실시예 3에서, 분비물질인 Xenograft model에 대한 유효성의 검색을 목적으로, 종양 세포주 MKN-45에 미치는 영향에 대해 검토를 시도했다. 피험물질인 분비물은 4주간 피하투여했다. 평가 항목으로서 체중 측정, 종양 체적의 측정, 혈액학적 검사 및 병리학적 검사를 실시했다.

실험 개요

1. 사용 동물: 4주령으로 구입한 수컷의 BALB/C-nu계 마우스의 체중이 15.2~20.1g인 동물 20마리를 사용했다. 동물은 실험기간 내내 온도 20~26℃, 상대 습도40~70%, 환기 회수 10~20회/시간, 조명 시간 12시간의 범위 내로 설정한 클린 사육실에서 사육했다.

2. 사육 조건: 물, 사료 자유섭취

3. 실험군: 종양 체적의 평균이 약 200~300㎣로 성장한 곳에서 종양 체적의 평균이 동일해지도록 2군으로 할당했다.

4. 신규 미생물의 분비물의 벌크 분말 100mg을 고정도 분석용 윗접시 저울을 이용하여 정확히 재어 10mL의 생리식염액에 용해시켰다. 투여액은 모두 사용전에 조제하였다.

5. 종양 세포의 조제: 세포 배양액은 배지에 페니실린-스트렙토마이신을 100u/mL-100μL 첨가하여 조제했다.

세포는 동결 세포를 약 37℃의 온탕으로 완전히 융해시키고 미리 37℃로 인큐베이트한 배양액이 들어있는 원침관으로 옮겨 담았다. 1000rpm으로 5분 원심분리후 상청액을 버리고 배양액을 넣고 피펫팅으로 잘 현탁시킨 후 배양 플라스크로 옮겨 온도 37℃, 이산화탄소 농도 5%로 설정한 탄산가스 배양기(산요사 제품, MCO-175)로 배양을 시작. 세포의 계대 배양은 세포밀도가 과잉되기 전에 배양 용기로부터 배양액을 제거하고 PBS용액으로 세포 표면을 세정후 0.25% 트립신 1mMEDTA 용액을 가하여 탄산가스 배양기에 넣고 세포를 완전히 박리시켰다. 박리한 세포를 적량의 배양액으로 회수하여 1000rpm으로 5분 원심분리 후에 상청액을 제거하고 배양액을 첨가하여 피펫팅한 후 배양액을 넣은 새로운 배양 플라스크에 세포를 파종하였다. 계대를 2~4일에 1회의 빈도로 실시하고 이식에는 2회 이상 계대한 것을 사용했다.

6. 투여 방법: 피험물질은 1일 1회로 4주간 일회용 주사기 및 27G 주사바늘을 사용하여 배부 피하투여하였다. 투여액량은 주 2회 측정한 체중에 기초하여 개체별로 산출하였다.

7. 종양세포: 종양세포는 이식일에 일회용 주사기 및 27G 주사바늘을 사용하여 배부 피하투여하였다.

이상과 같은 실험에서 1일 1회 일반상태 및 생사확인을 수행하고 주 2회 체중 측정을 하였다. 또한, 디지털 노기스를 이용해서 종양의 장경(A) 및 단경(B)을 주 2회 측정하였다. 측정한 장경 및 단경을 통해 이하의 식에 의해 종양 체적을 구했다.

종양 체적(㎣)=AB²/2

또한 혈액학적 검사를 실시했다. 모든 예에 대하여 복부 대정맥으로부터 혈액을 채취한 후 EDTA-2K 처리한 혈액에 대해, 이하의 항목을 다항목 자동혈구계수측정장치(시스멕스사 제품 E-4000)에 의해 측정했다.

결과를 표 5에 나타냈다.

검사 항목	측정법 또는 측정기기	단위/표시
적혈구수(RBC)	전기저항 검출방식	10⁴/μL
헤마토크리트(Ht)	적혈구 펄스 파고값 검출방식	%
혈색소량(Hb)	SLS-헤모글로빈법	g/dL
혈소판수(Plt)	전기저항 검출방식	10⁴/μL
백혈구수(WBC)	전기저항 검출방식	10²/μL
평균 적혈구 지수:계산법
평균 적혈구 용적(MCV)		fL
평균 적혈구 혈색소량(MCH)		Pg
평균 적혈구 혈색소농도(MCHC)		%

병리학적 검사: 채혈 종료후 종양조직을 적출하여 중량을 측정한 후 10% 중성 완충 포르말린액으로 고정시켰다. 고정후 통상의 방법에 의해 파라핀 절편을 제작후 헤마톡실린 에오진 염색을 실시했다. 그 후 면역조직화학염색(TUNEL)을 실시하여 종양세포 1000개 중 양성세포를 세어 양성 세포/종양 세포비를 산출하였다.

20마리의 마우스를 사용하여 배부 피하에 종양을 이식하였다. 이식후 종양 체적의 평균이 약 200~300mm로 성장한 곳에서 종양 체적의 평균이 같아지도록 2군으로 할당했다. 피험물질을 4주간 연속 피하투여하였다. 피험물질의 투여일부터 4주간 일반상태 및 생사를 1일 1회 관찰하고 주 2회의 빈도로 체중 측정 및 종양 사이즈 측정을 실시했다. 피험물질 투여 4주 후에 에테르 마취하에서 복대정맥으로부터 채혈하여 종양조직을 적출하였다.

이상의 시험의 결과를 상세히 설명하면 다음과 같다.

1) 체중의 추이: 피험물질 투여 4주간의 각 군의 체중 추이를 표 6 및 표 7에 나타냈다. 생리식염액 및 분비물 투여군의 두 군에서 투여 기간 동안 유의한 체중의 감소가 관찰되었다. 체중 감소의 피크는, 생리식염액 투여군에서는 투여 12일째, 분비물 투여군에서는 투여 22일째이며 생리식염액 투여군에서는 투여 첫날에 비해 1.9g, 분비물 투여군에서는 투여 첫날에 비해 1.2g의 감소가 확인되었다.

누드마우스의 항종양시험(MKN-45)에서의 체중에 미치는 분비물(피험물질) A의 4주간 반복 경구투여에 대한 영향

투여물질	예수 (例數)		체중(g)
투여물질	예수 (例數)		1일	5일	8일	12일	15일	19일	22일	26일	29일
생리식염액	10	평균± 표준오차	18.1 0.4	17.2^* 0.4	17.3 0.4	16.2^** 0.4	16.3^** 0.5	16.5^** 0.4	16.3^** 0.4	16.7^** 0.5	17.4 0.5
분비물(피험물질) A	10	평균± 표준오차	19.3 0.5	19.2 0.6	19.1 0.6	18.6^** 0.5	18.2^** 0.5	18.2^** 0.4	18.1^** 0.5	18.6^* 0.5	19.4 0.5

^*,^**: p<0.05, 0.01 투여 1일째에 대한 유의차(paired t test)

투여 물질	동물 번호	체중(g)
투여 물질	동물 번호	1일	5일	8일	12일	15일	19일	22일	26일	29일
생리 식염액	1	17.2	16.8	17.6	17.0	17.0	16.9	17.3	17.4	17.7
	2	17.8	16.3	16.0	14.9	14.9	15.1	14.5	15.0	15.9
	3	18.7	18.6	18.6	17.4	18.0	18.0	17.8	18.8	19.2
	4	18.0	16.4	16.6	15.6	15.6	15.7	15.6	16.4	17.7
	5	17.6	17.0	17.5	16.6	16.9	17.1	16.6	16.2	18.0
	6	17.7	16.4	16.2	15.1	15.1	15.7	15.8	16.2	16.8
	7	19.5	18.7	19.3	17.8	18.1	18.5	18.0	18.7	19.0
	8	16.9	18.3	17.9	16.0	15.9	16.8	16.5	16.8	17.2
	9	18.7	16.5	16.3	15.6	15.6	15.9	15.3	15.6	16.0
	10	18.5	17.4	17.2	15.9	15.8	15.7	15.7	16.0	16.5
분비물(피험물질) A	11	20.8	19.3	19.7	19.1	19.3	18.7	18.9	19.4	20.1
	12	17.7	17.6	17.3	16.7	16.5	16.8	16.3	17.3	17.9
	13	16.5	15.9	16.0	15.9	15.4	15.8	15.5	15.5	16.7
	14	21.3	20.9	20.7	20.2	19.5	19.1	18.7	18.5	18.8
	15	19.6	19.8	19.7	19.6	19.0	18.9	18.8	19.7	20.0
	16	19.6	19.6	19.1	18.7	18.0	18.4	17.8	18.4	19.4
	17	18.9	19.3	19.2	18.3	18.1	18.3	18.3	19.1	20.6
	18	18.5	18.5	18.7	18.0	17.5	17.5	17.7	18.2	19.2
	19	21.0	22.3	22.2	20.9	20.4	20.4	20.6	21.3	22.2
	20	19.1	18.4	18.5	18.3	18.2	18.3	18.2	18.1	19.3

2) 종양 체중의 측정: 피험물질 투여 4주간의 각 군의 종양 체적의 추이를 표 8 및 표 9에 나타냈다. 생리식염액 투여군의 종양 체적은 투여 기간 동안 일일 변화에 따른 증가를 보였다. 분비물 투여군의 종양 체적에 대해서도 생리식염액 투여군과 동일한 증가가 관찰되고 각 측정일에 있어서의 두 군간의 종양 체적에 유의한 변화는 확인되지 않았다.

누드마우스의 항종양시험(MKN-45)에서의 종양 체적에 미치는 분비물(피험물질) A의 4주간 반복 경구투여에 대한 영향

투여 물질	예수		종양 체적(mm³)
투여 물질	예수		1일	5일	8일	12일	15일	19일	22일	26일	29일
생리식염액	10	평균 ±표준오차	255.9 21.9	382.5 22.9	487.5 23.3	584.3 33.8	729.5 42.8	920.1 55.2	1094.6 66.9	1255.9 76.0	1479.9 89.8
분비물(피험물질)A	10	평균 ±표준오차	223.7 21.8	350.3 33.8	433.8 37.2	575.5 49.4	703.9 69.3	884.8 87.0	1014.1 92.8	1189.6 125.3	1412.2 142.8

투여 물질	동물 번호	종양 체적(mm³)
투여 물질	동물 번호	1일	5일	8일	12일	15일	19일	22일	26일	29일
생리 식염액	1	290.1	578.0	760.8	940.8	1136.2	1403.6	1811.6	1963.5	2216.8
	2	292.5	366.7	539.6	602.8	761.3	873.3	1207.1	1488.2	1851.3
	3	137.7	296.5	425.3	457.9	577.6	658.6	754.3	853.9	927.4
	4	193.9	309.0	348.0	524.3	629.3	719.3	901.6	1111.6	1432.1
	5	386.0	423.9	465.5	538.7	789.6	1074.6	1149.3	1362.9	1574.3
	6	252.4	342.4	433.4	593.0	621.9	780.4	899.2	951.7	1081.3
	7	234.5	371.2	465.7	543.3	685.6	875.5	1055.6	1204.0	1458.6
	8	215.1	282.4	377.4	408.9	533.3	792.4	957.2	1099.0	1325.4
	9	252.0	328.1	382.2	469.8	615.3	811.1	795.6	955.9	1207.3
	10	305.2	527.3	586.8	763.1	945.3	1212.3	1414.5	1568.1	1724.7
분비물(피험물질) A	11	305.8	396.1	471.0	684.1	879.3	1050.8	1228.1	1326.9	1526.7
	12	321.4	445.5	536.2	686.7	804.8	958.2	1094.0	1617.4	1779.9
	13	256.0	379.5	405.0	450.6	540.7	821.5	915.1	990.9	1289.7
	14	169.0	306.6	366.1	539.3	652.9	767.3	843.7	941.5	1158.6
	15	113.4	136.1	186.4	252.5	288.8	385.6	489.1	635.1	788.2
	16	245.0	436.4	564.1	766.4	993.7	1350.6	1453.8	1758.2	2002.8
	17	134.5	256.0	489.8	530.5	551.4	773.3	943.2	993.6	1146.9
	18	241.9	392.1	447.5	622.4	676.3	742.6	799.3	899.4	976.8
	19	210.8	326.1	402.7	605.0	819.3	984.6	1196.1	1495.0	1898.7
	20	239.1	428.5	469.3	617.2	831.7	1013.7	1178.6	1237.8	1553.7

3) 혈액학적 검사: 피험물질 투여 4주간의 각 군의 혈액학적 검사 결과를 표 10 및 표 11에 나타냈다. 검사 항목 중 혈소판수에 대해 분비물 투여군에서 생리식염액 투여군에 비해 유의한 증가가 확인되었으나 기타 7항목에 대해서는 생리식염액 투여군 및 분비물 투여군 사이에 유의한 변화는 확인되지 않았다.

누드마우스의 항종양시험(MKN-45)에서의 혈액학적 검사에 미치는 분비물(피험물질) A의 4주간 반복 경구투여에 대한 영향

투여 물질	예수		RBC (10⁴/μL)	Ht (%)	Hb (g/dL)	MCV (fL)	MCH (pg)	MCHC (%)	Plt (10⁴/μL)	WBC (10²/μL)
생리 식염액	10	평균 ±표준오차	1046.6 9.3	46.7 0.4	15.5 0.2	44.7 0.3	14.8 0.2	33.1 0.3	76.0 2.7	16.8 1.8
분비물 (피험물질)A	10	평균 ±표준오차	1040.6 12.5	45.6 0.5	14.9 0.2	43.9 0.3	14.3 0.2	32.7 0.4	94.0## 2.8	23.3 3.8

RBC:적혈구수, Ht:헤마토크리트, Hb:혈색소량, MCV:평균 적혈구 용적, MCH:평균 적혈구 혈색소량, MCHC: 평균 적혈구 혈색소 농도, Plt:혈소판수, WBC:백혈구수

#,##: p<0.05, 0.01 생리식염액에 대한 유의차(Studennt t test)

투여 물질	동물 번호	RBC (10⁴/μL)	Ht (%)	Hb (g/dL)	MCV (fL)	MCH (pg)	MCHC (%)	Plt (10⁴/μL)	WBC (10²/μL)
생리 식염액	1	1030	46.7	15.3	45.3	14.9	32.8	88.0	23
	2	1051	46.1	15.6	43.9	14.8	33.8	59.5	19
	3	1012	46.0	14.9	45.5	14.7	32.4	73.0	12
	4	1019	44.5	14.6	43.7	14.3	32.8	77.8	10
	5	1078	47.6	15.6	44.2	14.5	32.8	82.1	21
	6	1030	45.4	14.7	44.1	14.3	32.4	71.3	10
	7	1101	48.4	15.7	44.0	14.3	32.4	82.4	11
	8	1044	48.4	17.0	46.4	16.3	35.1	69.4	15
	9	1026	45.8	15.7	44.6	15.3	34.3	72.1	23
	10	1075	48.3	15.5	44.9	14.4	32.1	84.0	24
분비물(피험물질) A	11	1061	46.0	14.0	43.4	13.2	30.4	90.7	19
	12	991	44.6	14.9	45.0	15.0	33.4	89.5	53
	13	1021	46.5	14.9	45.5	14.6	32.0	94.1	23
	14	1118	48.0	15.6	42.9	14.0	32.5	90.6	15
	15	998	44.7	14.3	44.8	14.3	32.0	104.6	28
	16	1053	45.3	15.1	43.0	14.3	33.3	100.0	22
	17	1001	43.3	14.3	43.3	14.3	33.0	109.1	10
	18	1074	47.7	15.5	44.4	14.4	32.5	94.1	28
	19	1049	45.1	15.9	43.0	15.2	35.3	89.6	12
	20	1040	45.1	14.7	43.4	14.1	32.6	77.9	23

4) 종양 중량의 측정: 피험물질 투여 4주후에 측정한 각 군의 종양 중량의 추이를 표 12 및 표 13에 나타냈다. 생리식염액 및 분비물 투여군의 종양 중량은 각각 1.093±0.109g 및 1.022±0.016g으로 두 군의 중량에 유의한 변화는 확인되지 않았다.

누드마우스의 항종양시험(MKN-45)에서의 종양 중량에 미치는 분비물(피험물질) A의 4주간 반복 경구투여에 대한 영향

투여물질	예수		종양 중량(g)
생리식염액	10	평균치±표준오차	1.093±0.109
분비물(피험물질)A	10	평균치±표준오차	1.022±0.016

투여물질	동물번호	종양 중량(g)
생리식염액	1	1.665
	2	1.534
	3	0.925
	4	1.006
	5	0.605
	6	0.599
	7	1.141
	8	1.099
	9	1.220
	10	1.140

투여물질	동물번호	(g)
분비물(피험물질) A	11	1.174
	12	0.905
	13	0.937
	14	1.026
	15	0.751
	16	1.613
	17	1.047
	18	0.595
	19	1.658
	20	0.511

5) 병리학적 검사: 피험물질 투여 4주간의 각 군의 병리학적 검사의 평균치를 표 14 및 표 15에 나타냈다. 생리식염액 및 분비물 투여군에 대해 양성 세포/종양 세포비를 구한 결과, 두 군의 수치에 유의한 변화는 확인되지 않았다.

누드마우스의 항종양시험(MKN-45)에서의 병리학적 검사에 미치는 분비물(피험물질) A의 4주간 반복 경구투여에 대한 영향

파라미터	투여물질	생리식염액	분비물(피험물질) A
파라미터	예수	10	10
Histological grade	Grade
No therapeutic effects observed	0	10(100.0)^c	10(100)
Degenerative changes in tumor cells, but no destruction of tumor nests	I	0	0
Destruction and disappearance of tumor nests, but viable cells remain
- viable cells occupy large areas(≥1/3)	IIa	0	0
- viable cells occupy small areas(<1/3)	IIb	0	0
Tumor cells remain but appear non-viable	III	0	0
No tumor cells remain	IV	0	0
TUNEL^d index(%평균±표준오차)		1.17±0.16	1.09±0.08

c: Value in parenthesis indicates the % incidence

d: TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase) mediated dUTP-biotin Nick End Labeling

투여물질	동물 번호	Organs /tissues	Findings	Histological grade	TUNEL index(%)
생리 식염액	1	Tumor	No therapeutic effects observed	0	1.6
	2	Tumor	No therapeutic effects observed	0	1.2
	3	Tumor	No therapeutic effects observed	0	0.7
	4	Tumor	No therapeutic effects observed	0	1.2
	5	Tumor	No therapeutic effects observed	0	2.4
	6	Tumor	No therapeutic effects observed	0	0.9
	7	Tumor	No therapeutic effects observed	0	1.3
	8	Tumor	No therapeutic effects observed	0	0.8
	9	Tumor	No therapeutic effects observed	0	0.9
	10	Tumor	No therapeutic effects observed	0	0.7
	평균				1.17
	표준오차				0.16
분비물(피험물질) A	11	Tumor	No therapeutic effects observed	0	0.9
	12	Tumor	No therapeutic effects observed	0	1.3
	13	Tumor	No therapeutic effects observed	0	1.0
	14	Tumor	No therapeutic effects observed	0	0.8
	15	Tumor	No therapeutic effects observed	0	0.9
	16	Tumor	No therapeutic effects observed	0	1.5
	17	Tumor	No therapeutic effects observed	0	1.2
	18	Tumor	No therapeutic effects observed	0	1.3
	19	Tumor	No therapeutic effects observed	0	1.2
	20	Tumor	No therapeutic effects observed	0	0.8
	평균				1.09
	표준오차				0.08

이상의 결과를 통해 투여 기간 동안의 체중에 대해, 생리식염액 및 분비물 투여군 모두 투여후 2-3일후까지 체중의 감소를 볼 수 있었으나 이후에는 투여 첫날의 값까지 회복하는 경향을 보였다. 이 체중 감소는 생리식염액 투여군에서도 동일하게 확인됨을 통해 피험물질의 영향이 아니라 종양 이식에 의한 영향인 것으로 볼 수 있다. 종양 체적에 대해서는 생리식염액 및 분비물 투여군에서 투여 기간 동안 동일한 종양 체적의 증가가 관찰되었고 분비물 투여에 의한 종양 체적의 감소는 확인되지 않았다. 혈액학적 검사에 있어서는 분비물 투여군의 혈소판수에서 유의한 증가가 확인되었다. 이 결과들을 통해 본 발명의 분비물에는 종양 세포를 증대시키는 작용은 없는 것이 명백해졌다. 따라서 위암 등의 소화기계의 종양을 갖는 환자에게도 위액 항진을 위해 안심하고 투여할 수 있음이 자명하다.

이와 함께 투여후 2-3일후까지 체중 감소를 볼 수 있었으나 유의한 변화는 확인되지 않았다.

종양 체중의 측정: 피험물질 투여 4주간의 각 군의 종양 체적의 추이를 표 8 및 표 9에 나타냈다. 생리식염액 투여군의 종양 체적은 투여 기간 동안 일일변화에 따른 증가를 보였다. 분비물 투여군의 종양 체적에 대해서도 생리식염액 투여군과 동일한 증가가 관찰되었고 각 측정일에 있어서의 두 군간의 종양 체적에 유의한 변화는 확인되지 않았다.

실시예 4

본 발명의 실시예 4(신규 미생물 분비물의 마우스에서의 단회 피하투여 독성시험)를 도 10을 참조하여 설명한다. 이 시험은 신규 미생물 분비물을 마우스에 단회 피하투여했을 경우의 치사량 및 독성학적 양상에 대해 검토한 것이다.

사용한 본 발명 신규 미생물의 분비물

1 성상: 황갈색, 침상 결정

2 용해성: 증류수 및 5% 포도당액에 가용

3 안정성: 가수분해성, 공기산화성, 광분해성 및 열분해성이 없어 안정적임. 단 pH 8 이상에서는 백탁화되는 경우도 있음.

4 보존 조건: 실온 밀봉(건조제 봉입)

5 보관 장소: 실온 보관고

사용한 마우스

1 종, 계통, 성: 마우스 {Slc:ICR}, SPF 동물, 수컷

2 주령: 4주령의 것을 5주령생 군 분리, 6주령부터 실험에 사용하기 시작

3 군 분리시의 체중: 29.4~33.9g

4 사육 환경 조건: 온도 22.2~22.7℃, 습도 48.6~64.2%, RH 명암 주기 12시간, 환기 회수 10회/시간, 시료 음료수 자유섭취

5 개체 식별법: 각 투여군의 5마리 동물에게는 피크린산 포화수용액을 사용하고 도 10에 도시된 마우스의 피모에 색소 도포를 실시하여 개체 식별을 수행했다.

6 투여액 조정방법: 분비물과 용매(증류수)를 평량한 후 막자사발을 이용하여 분비물과 용매를 서서히 혼합 분쇄, 현탁하여 소정량을 만들었다.

7 투여량: 표 5에 나타낸 투여 용량 및 군 구성을 사용했다. 투여 용량으로서는 의약품 비임상시험 가이드라인의 상한치인 2,000mg/kg을 고투여용량으로 하고 그 절반인 1,000mg/kg 및 컨트롤(대조군)을 설정했다.

8 투여 방법: 피하투여로 하고 모든 투여군에 대해 20mL/kg으로 하여 투여 직전의 체중값으로부터 산출한 각 투여액을 26G의 주사바늘을 장착한 주사기로 마우스의 경배부 피하에 투여했다. 투여 기간은 첫째날(Day 1) 1회로 하며 오전중에 투여했다.

9 관찰 기간: 투여일을 첫째날로 하고 15일째까지 관찰했다. 관찰 시간은 첫째날에 한해 투여 직후, 투여 1, 2, 4시간 후 및 투여 약 6시 간후에 생사확인 및 일반상태의 관찰을 실시했다. 투여일 이외에는 오전중에 생사확인 및 일반상태의 관찰을 수행하고 오후에 생사확인만을 실시했다. 일반상태의 관찰은 외관(피모, 눈, 귀, 코, 항문, 외음부 등), 행동, 자세, 호흡, 근긴장 및 분뇨 등에 대해 이상 유무 및 정도에 대해 육안적으로 실시하고 체중 측정을 수행했다.

10 병리해부학적 검사: 도중 사망예가 없었기 때문에 각 투여군의 생존예에 대해서는, 15일째에 펜토바비탈나트륨 마취하(100mg/kg복강내 투여)에서 개복하여 복대동정맥 혈관을 절단하여 혈액 방출에 의해 안락사시킨 뒤 신속하게 병리학적 절차에 따라 해부하여 체표, 개공부, 두개, 흉강, 복강의 기관, 조직을 관찰했다.

이러한 실험의 결과로서 이하의 점이 판명되었다.

1) 사망 동물의 발생 유무

어떠한 투여군에서도 도중 사망 및 빈사상태는 확인되지 않았다.

2) 일반상태

어떠한 투여군에서도 일반상태의 변화는 확인되지 않았다.

3) 체중 추이

1,000mg/kg, 2,000 mg/kg 투여군에서는 투여 다음날의 체중이 용량에 따라 감소(경도(輕度))를 나타내었고 2,000mg/kg 투여군의 경우 대조와 비교하여 유의한 감소였다. 한편, 1,000 및 2,000mg/kg 투여군의 3일째부터 15일째까지의 체중 추이는 대조군과 동등한 증가 추이를 보였다.

4) 병리해부학적 검사

1,000 mg/kg 투여군의 2/5예 및 2,000mg/kg투여군의 5/5예에서 투여 부위(경배부의 피하조직)에 분비물로 보이는 녹갈색의 침착(경도)이 투여용량에 의존하여 나타났다. 또한, 1,000mg/kg 투여군의 1/5예에서는 정소(***) (좌측)에 소형(小型)(경도)의 것이 확인된 것 이외에는 이상 소견은 관찰되지 않았다.

이상을 통해, 분비물을 마우스에 단회 피하투여하고 15일 동안 관찰을 수행했을 경우의 치사용량 및 독성학적 양상에 관한 검토에서는, 2일째의 체중이 투여용량에 의존하여 감소(경도)했으나 3일째 이후에는 대조군과 동일한 체중 증가 추이가 관찰된 바로부터 분비물 투여의 체중 추이에 대한 영향은 경도인 것으로 보여졌다. 병리해부학적 검사에서는 투여 부위에 분비물의 잔존으로 보이는 침착(경도)이 관찰된 바로부터 분비물의 피하 흡수는 나쁨이 시사되었으나 투여 부위에서는 염증성 반응 등의 변화가 관찰이 되지 않은 바, 자극성은 낮은 것으로 예상되었다. 또한 병리해부학적 검사에서는 그 밖의 관찰 부위에 있어서도 이상 소견이 나타나지 않은 바 분비물에 기인한 명확한 독성변화는 확인되지 않았다.

이상을 통해 분비물에 기인한 명확한 독성변화는 없으며 또한 빈사/사망 동물이 관찰되지 않은 바 최소 치사용량은 2,000mg/kg 이상인 것으로 예상되었다.

따라서 본 미생물의 분비물질은 무독이라 할 수 있으며 치료에 사용할 수 있다.

실시예5

본 발명의 실시예 5를 설명한다.

[증례 1]

본 증례는 파이로리균 치료를 행하고 있는 환자 A에 대하여 파이로리균 제거제와 함께 본 발명의 신규 미생물을 피하 주사한 결과에 대해 설명한다.

작성 방법: 실시예 2와 동일하게 하여 추출한 분비물

투여 방법: 생리 식염수에 0.2g 혼합시켜 환자 A에 피하 주사했다(1일 2회). 7일간 투여했다.

결과: 환자 A는 8일후 위의 개선이 관찰되었다. 위벽으로부터 임의로 채취한 절편에서도 현미경으로 살펴본 바 신규 미생물을 확인할 수 있었다. 위가 가볍고 속이 거북한 느낌이 없으며 다음날 아침의 가슴 쓰림도 발생하지 않게 되었다. 위의 상태가 매우 개선되었다.

실시예 6

본 발명의 실시예 6을 설명한다.

상기 실시예 5에서 채취된 절편을 김자 염색한 바 본건 신규 미생물이 8자 운동을 하고 있는 것이 현미경으로 확인되었다.

본 발명에 따르면, 만성위염의 환자에 대하여 위액의 분비를 촉진할 수 있으며 또한 무해함이 실험에 의해 확인되었으므로 산업상 이용가능성을 갖는다.

[서열목록]

서열표 .txt

SEQUENCE LISTING <110> KAMEYAMA Yoshichika <120> A new microbe which accelerate gastric juice and the secretion thereof <130> 07P02 <160> 1 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1480 <212> DNA <213> Bacillus pumilus <400> 1 tcgagcggac agaagggagc ttgctcccgg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt 60 gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggagctaata ccggatagtt? 120 ccttgaaccg catggttcaa ggatgaaaga cggtttcggc tgtcacttac agatggaccc 180 gcggcgcatt agctagttgg tggggtaatg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc 240 tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300 agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa 360 ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtgcgagagt aactgctcgc 420 accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480 cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta 540 agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg ggaaacttga 600 gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 660 acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg 720 gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta 780 gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg 840 gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900 tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga caaccctaga 960 gatagggctt tcccttcggg gacagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1020 tcgtgaqatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat 1080 tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1140 aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg 1200 ctgcaagacc gcaaggttta gccaatccca taaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct 1260 gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1320 tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgca acacccgaag 1380 tcggtgaggt aacctttatg gagccagccg ccgaaggtgg ggcagatgat tggggtgaag 1440 tcgtaacaag gtagccgtat cggaaggtgc ggctggatca 1480

Claims

바실러스푸밀러스종에 속하는 국제기탁번호 NITE BP-295인 신규 미생물.
제 1 항에 있어서,

구균, 간균의 모든 형태를 취할 수 있는, 신규 미생물.
제 1항에 있어서,

하기의 균학적 성질을 갖는 바실러스속에 속하는 신규 미생물.

1. 그램 양성 2. 광분해성 없음 3. 운동성 있음 4. 양단에 편모 있음 5. 산소 요구성 6. 크기 0.5~1㎛×10~20㎛ 7. 발열성 없음
서열번호 1의 유전자를 갖는 바실러스푸밀러스종에 속하는 신규 미생물.
제 1 항 내지 제 4 항의 어느 한 항에 따른 신규 미생물의 분비물로 이루어지는 위액분비 촉진 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항의 어느 한 항에 따른 신규 미생물의 분비물로 이루어지는 혈소판 증가 조성물.
바실러스푸밀러스종에 속하는 국제기탁번호 NITE BP-295인 신규 미생물을 배양함으로써 얻어지는, pH 8.0~11.5의 pH범위에 최적 pH를 가지며 또한 50~60℃의 범위에 최적 온도를 갖는 바실러스 배양물.
삭제
바실러스푸밀러스종에 속하는 국제기탁번호 NITE BP-295인 신규 미생물을 배양함으로써 얻어지는, pH 8.0~11.5의 pH범위에 최적 pH를 가지며 또한 50~60℃의 범위에 최적 온도를 갖는 바실러스 균체.