KR101106020B1 - 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법 및 분화용 배지 - Google Patents

인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법 및 분화용 배지 Download PDF

Info

Publication number
KR101106020B1
KR101106020B1 KR1020100055832A KR20100055832A KR101106020B1 KR 101106020 B1 KR101106020 B1 KR 101106020B1 KR 1020100055832 A KR1020100055832 A KR 1020100055832A KR 20100055832 A KR20100055832 A KR 20100055832A KR 101106020 B1 KR101106020 B1 KR 101106020B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
differentiation
medium
camp
acid
forskolin
Prior art date
Application number
KR1020100055832A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110136061A (ko
Inventor
문지숙
Original Assignee
차의과학대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020100055832A priority Critical patent/KR101106020B1/ko
Application filed by 차의과학대학교 산학협력단 filed Critical 차의과학대학교 산학협력단
Priority to PCT/KR2011/004118 priority patent/WO2011159050A2/ko
Priority to JP2013515258A priority patent/JP5776101B2/ja
Priority to US13/704,030 priority patent/US8921107B2/en
Priority to AU2011265956A priority patent/AU2011265956B2/en
Priority to CN201180029604.3A priority patent/CN102985535B/zh
Priority to CA2802661A priority patent/CA2802661C/en
Priority to ES11795916.3T priority patent/ES2532928T3/es
Priority to EP11795916.3A priority patent/EP2581443B1/en
Publication of KR20110136061A publication Critical patent/KR20110136061A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101106020B1 publication Critical patent/KR101106020B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/80—Neurotransmitters; Neurohormones
    • C12N2501/815—Dopamine

Abstract

본 발명은 인간 신경전구세포를 푸사린산(fusaric acid)을 포함하는 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는, 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화용 배지를 제공한다.

Description

인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법 및 분화용 배지{Process for differentiation of human neural progenitor cells to dopaminergic neurons and medium for differentiation thereof}
본 발명은 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간 신경전구세포를 푸사린산(fusaric acid)을 포함하는 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화용 배지에 관한 것이다.
파킨슨 질환은 중뇌의 흑색질(substantia nigra) 부위의 도파민 뉴우런(dopaminergic neurons)의 선택적인 퇴화를 특징으로 한다. 태아 중뇌 조직(fetal midbrain tissue)의 이식을 통하여 파킨슨 질환 환자의 도파민 뉴우런을 치환하는 치료법이 다양하게 연구되고 있다(비특허문헌 1 참조). 이식된 태아 중뇌 조직은 인간의 뇌에서 장기간 동안 생존하면서 환자의 선조체(striatum)에 도파민 신경분포를 복구하며, 파킨슨 질환에 따른 운동 증상(motor symptoms)을 감소시킨다(비특허문헌 2 참조).
파킨슨 질환의 치료를 위하여 상기와 같은 이식이 효과적일 수 있으나, 인간의 낙태 태아 조직(abortion fetal tissues)을 다량으로 얻기가 곤란하기 때문에, 그 임상적인 적용은 극소수의 경우로 한정되어 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 다양한 세포들이 파킨슨 질환의 이식 치료를 위한 공여 세포 후보로서 연구되어 왔다(비특허문헌 3 참조).
한편, 태아 중뇌 조직으로부터 유래된 인간 신경전구세포(human neural progenitor cells, hNPCs)는, 장기간 동안의 증식 활성을 가짐으로써 자가-증식능력이 우수하고 또한 도파민 뉴우런으로 분화할 수 있기 때문에 이식을 위한 세포원(cell source)으로서의 활용가능성이 기대되고 있다(비특허문헌 4 및 5 참조). 따라서, 도파민 뉴우런 치환(즉, 이식)을 통한 파킨슨 질환의 치료를 위하여는, hNPCs를 효율적으로 증식(proliferation 또는 expansion)시킬 수 있는 방법과 함께 hNPCs를 도파민 뉴우런으로 효과적으로 분화시킬 수 있는 방법을 확립하는 것은 매우 중요하다.
hNPCs를 도파민 뉴우런으로 분화시킬 수 있는 방법으로는, 아스코르브산과 디부티릴 시클릭 아데노신 모노포스페이트(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, db-cAMP)를 배지에 첨가하여 3일간 분화시키는 방법(비특허문헌 6 참조); BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), 도파민, 포스콜린(Forskolin)을 배지에 첨가하여 3주간 분화시키는 방법(비특허문헌 7 참조); 및 SHH(Sonic hedgehog), FGF-8(fibroblast growth facter-8), BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), 아스코르브산을 첨가한 배지로 3주 동안 분화시키는 방법(비특허문헌 8 참조)등이 알려져 있다.
그러나, 종래의 분화방법은 아직 분화효율이 만족스럽지 못할 뿐만 아니라, 분화에 오랜 시간이 필요하고, SHH이나 FGF-8 등 고가의 첨가제가 다량 들어가는 배지의 사용 때문에 경제적으로 어려움이 있고, 파킨슨 질병을 앓고 있는 환자를 치료할 때 필요한 많은 수의 세포를 증식시킬 기술력이 부족하여 임상적으로 사용하기에 많은 한계를 가지고 있다.
비특허문헌 1: Bjorklund, A. et al. Reconstruction of the nigro-striatal dopamine pathway by intra-cerebral nigral transplants, Brain Res. 1979;177:555-560 비특허문헌 2: Perlow, M., et al . Brain grafts reduce motor abnormalities produced by destruction of nigrostriatal dopamine system. Science 1979;204:643-647 비특허문헌 3: Brain J. Snyder. et al. Stem cell treatment for parkinson's disease: an update for 2005. Current Opinion in Neurology . 2005;18:376-385 비특허문헌 4: Storch A. et al Midbrain-derives neural stem cells : from basic science to therapeutic approaches. Cell tissue Res. 2004;318:15-22 비특허문헌 5: Yang M. et al. Neural stem cells spontaneously express dopaminergic traits after transplantation into the intact or 6-hydrodopamine lesioned rat. Exp Neural, 2002;177:50-60 비특허문헌 6: Sanchez-Pernaute, R. et al. In vitro generation and transplantation of precursor-derived human dopamine neurons. J. Neurosic. Res. 2001;65(4). 284-288 비특허문헌 7: Riaz, S.S. et al. The differentiation potential of human foetal neuronal progenitor cells in vitro. Brain Res. Dev. Brain Res. 2004;153(1), 39-51 비특허문헌 8: Jaroslaw Maciaczyk et al. Combined use of BDNF, ascorbic acid, low oxygen, and prolonged differentiation time generates tyrosine hydroxylase-expressing neurons after long-term in vitro expansion of human fetal midbrain precursor cells. Experimental Neurology. 2008;213:354-362
본 발명은 인간 신경전구세포(hNPCs)를 도파민 뉴우런으로 높은 분화효율로 분화시킬 수 있는 방법 및 상기 분화에 유용하게 사용될 수 있는 분화용 배지를 제공한다. 특히, 본 발명은 새로운 분화유도제로서 푸사린산(fusaric acid)를 사용하여 hNPCs를 도파민 뉴우런으로 효과적으로 분화시킬 수 있는 방법 및 상기 분화에 유용하게 사용될 수 있는 분화용 배지를 제공한다.
따라서, 본 발명은 새로운 분화유도제를 포함하는 배지 중에서 인간 신경전구세포를 도파민 뉴우런으로 분화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 인간 신경전구세포를 도파민 뉴우런으로 분화시키는데 유용한 분화용 배지를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 인간 신경전구세포를 푸사린산(fusaric acid)을 포함하는 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는, 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법이 제공된다.
본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 배지는 디부티릴 시클릭 아데노신 모노포스페이트(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, db-cAMP), 포스콜린(forskolin), B27, SHH(sonic hedgehog) 및 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 포함하는 도파민 뉴우런 분화용 배지에 푸사린산을 가하여 구성될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 배지는 푸사린산, db-cAMP, 포스콜린, 및 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있으며, 바람직하게는 50uM ∼ 4mM의 푸사린산, 50uM ∼ 4mM의 db-cAMP, 5∼20 uM의 포스콜린, 및 0.5∼5 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있다. 특히 바람직하게는, 상기 배지는 100uM의 푸사린산, 100uM의 db-cAMP, 10uM의 포스콜린, 2 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있다.
본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 배양은 산소분압 2∼10 %의 저산소 분압 조건에서 바람직하게 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화용 배지로서, 상기 배지가 푸사린산, db-cAMP, 포스콜린, 및 B27을 포함하는 NB 배지인 분화용 배지가 제공된다.
상기 분화용 배지는 50uM ∼ 4mM의 푸사린산, 50uM ∼ 4mM의 db-cAMP, 5∼20 uM의 포스콜린, 및 0.5∼5 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있으며, 바람직하게는 100uM의 푸사린산, 100uM의 db-cAMP, 10uM의 포스콜린, 2 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있다.
본 발명에 따라, 푸사린산 존재하에서 인간 신경전구세포를 배양할 경우 도파민 뉴우런으로의 분화를 현저하게 증가시킨다는 것이 발견되었다. 따라서, 특히, 고가의 분화유도제로서 사용이 제한되는 SHH 및 FGF8의 대체 물질로서 저렴한 푸산린산을 사용하여 인간 신경전구세포를 도파민 뉴우런으로 분화시킬 수 있으므로, 경제적으로 분화 공정을 수행할 수 있을 뿐만 아니라 종래의 분화방법에 따른 만족스럽지 못한 분화효율을 크게 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명의 분화방법은 파킨슨 질환을 포함한 신경손상 질환의 치료를 위한 도파민 뉴우런의 제조에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 다양한 배지 조성에서 도파민 뉴우런으로 분화를 유도한 후, TH 및 Tuji를 DAPI 염색을 통하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 hNPCs를 증식시키고, 배지 중에 푸사린산 100uM를 가하거나 가하지 않고, 뉴우런으로 분화를 유도시킨 후, TH 및 Tuji의 발현량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 hNPCs를 증식시키고, 배지 중에 푸사린산 100uM를 가하거나 가하지 않고, 뉴우런으로 분화를 유도시킨 후, 면역염색화학 분석 및 RT-PCR 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 분화유도제의 종류를 달리한 배지 중에서 도파민 뉴우런으로 분화를 유도한 후, 분화된 세포의 TH 발현을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 저산소조건(Hypoxia 조건) 및 정상산소조건(Normoxia 조건)에 따른 분화효율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 MPP 존재하에서 분화를 유도하였을 때, 푸사린산의 영향을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 hNPCs를 증식 및 계대배양하여, 초기(제 7계대), 중간(제 11계대), 후기(제 17계대)에서 얻어진 각각의 hNPCs로부터 분화를 유도한 후, TH 발현량 및 Tuji 발현량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 hNPCs를 증식 및 계대배양하여, 초기(제 7계대), 중간(제 11계대), 후기(제 17계대)에서 얻어진 각각의 hNPCs로부터 분화를 유도한 후, 각각의 세포에 대한 면역염색을 통하여 TH를 발현을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 hNPCs를 증식 및 계대배양하여, 초기(제 7계대), 중간(제 11계대), 후기(제 17계대)에서 얻어진 각각의 hNPCs로부터 분화를 유도한 후, 신경 줄기세포 마커인 nestin, 증식성 세포 마커인 Ki67, 및 성숙 신경세포 마커인 Tuj1에 대한 발현을 면역염색을 통하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 증식시킨 초기 (제 7계대) hNPCs로부터 분화를 유도하기 전과 분화를 유도한 후 일주일이 지난 후 유세포 분석(FACS analysis)을 수행한 결과를 나타낸다.
도 11은 hNPCs를 증식 및 계대배양하여, 초기(제 7계대), 중간(제 11계대), 후기(제 17계대)에서 얻어진 각각의 hNPCs로부터 분화를 유도한 후, 얻어진 세포에 대하여 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 분화방법에 따라 분화를 유도하여 얻어진 세포의 특성을 면역염색을 통하여 평가한 결과를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 분화방법에 따라 분화를 유도하여 얻어진 세포의 특성을RT-PCR, 웨스턴 블롯 분석, 및 면역염색을 통하여 평가한 결과를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 분화방법에 따라 분화를 유도하였을 때, 다른 서브타입(subtype)의 뉴우런 즉, 글루타메이트(Glutamate), GABA, ChAT 및 세로토닌(Serotonine)의 발현 여부를 면역염색을 통해 측정한 결과를 나타낸다.
본 발명은 인간 신경전구세포를 푸사린산(fusaric acid)을 포함하는 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는, 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법을 제공한다.
상기 인간 신경전구세포는 이전에 보고된 방법, 예를 들어 Storch et al. 2001; Milosevic et al. 2006, 2007 등에 보고된 방법에 따라 얻을 수 있다. 본 명세서에서 "인간 신경전구세포"라 할 경우, 인체에서 분리된 즉 체외로 분리되어 통상의 세포배양에 의해 증식되는 인간 신경전구세포를 의미한다. 상기 인간 신경전구세포는 줄기세포 특성을 가짐과 동시에 뉴우런, 별아교세포(astrocyte), 희돌기아교세포(oligodendrocyte) 등으로 분화할 수 있다.
본 발명에 따른 분화방법은 분화유도제로서 푸사린산(fusaric acid)을 포함한 배지를 사용하여 수행된다.
상기 푸사린산은 5-부틸피콜린산(5-butylpicolinic acid)으로서 하기 화학식 1의 구조를 갖는다. 푸사린산은 공지의 물질로서, 공지의 방법으로 제조하거나 혹은 상업적으로 구입할 수 있다(예를 들어, Sigma-Aldrich 등).
Figure 112010037866397-pat00001
본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 배지는 종래의 도파민 뉴우런 분화용 배지에 푸사린산을 가하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 종래의 디부티릴 시클릭 아데노신 모노포스페이트(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, db-cAMP), 포스콜린(forskolin), B27, SHH(sonic hedgehog) 및 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 포함하는 도파민 뉴우런 분화용 배지에 푸사린산을 가하여 구성될 수 있다. 이때, 첨가되는 푸사린산의 함량은 50uM ∼ 4mM의 농도로 가해질 수 있다. 상기 db-cAMP, 포스콜린, B27, SHH, FGF8 등은 모두 통상적으로 사용되는 물질로서, 상업적으로 구입할 수 있으며, 예를 들어 db-cAMP 및 포스콜린은 Sigma 사로부터 구입할 수 있으며, B27은 GIBCO 사로부터 구입할 수 있으며(상품명: B-27 minus-AO supplement), SHH 및 FGF8은 각각 R&D system 및 PeproTech 사로부터 구입할 수 있다. 일 구현예에서, 종래의 도파민 뉴우런 분화용 배지에 푸사린산을 가하여 구성된 배지는 50uM ∼ 4mM의 db-cAMP, 5uM ∼ 20uM의 포스콜린, 0.5% ∼ 5%의 B27, 25ng/ml ∼ 500ng/ml의 SHH, 10ng/ml ∼ 200ng/ml의 FGF8, 및 50uM ∼ 4mM의 푸사린산을 포함하는 NB 배지(Neurobasal media)일 수 있으며, 상기 기본 배지인 NB 배지는 Invtorgen 사 등으로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 분화방법에 사용되는 배지는 고가로서 사용이 제한된 SHH 및 FGF8을 배제한 배지일 수 있다. 놀랍게도, SHH 및 FGF8이 없이 푸사린산만을 가한 배지가 SHH , FGF8, 및 푸사린산을 모두 포함하는 배지에 비하여 더욱 높은 도파민 뉴우런의 분화효율을 나타낸다는 것이 발견되었다.
따라서, 본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 배지는 푸사린산, db-cAMP, 포스콜린, 및 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있으며, 바람직하게는 50uM ∼ 4mM의 푸사린산, 50uM ∼ 4mM의 db-cAMP, 5∼20 uM의 포스콜린, 및 0.5∼5 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 배지는 50uM ∼ 1mM의 푸사린산, 50uM ∼ 1mM의 db-cAMP, 5∼15 uM의 포스콜린, 및 0.5∼3 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 배지는 약 100uM의 푸사린산, 약 100uM의 db-cAMP, 약 10uM의 포스콜린, 약 2 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있다. 또한, 상기 배지는, 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생제 혹은 L-글루타민 등의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 물론, 상기 항생제 및 아미노산은 다른 물질로 적절히 대체될 수 있다.
본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 배양은 종래의 분화방법에서 사용한 배양조건을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 배양은 약 37℃에서 7∼14 일, 바람직하게는 약 7 일 동안 수행될 수 있다. 본 발명에 의해, 상기 배양을 저산소 분압 조건(즉, hypoxia condition)에서 배양할 경우, 더욱 높은 분화효율을 달성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 배양은 산소분압 2∼10 %의 저산소 분압 조건에서 바람직하게 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 분화방법에 의해 얻어진 도파민 뉴우런은 통상의 방법으로 수확할 수 있으며, 예를 들어 Accutase(PAA사) 등의 효소를 사용하여 세포를 분리한 후, 얻어진 세포를 1000rpm에서 약 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하여, 분화된 신경전구세포를 수확할 수 있다.
본 발명은 또한, 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화용 배지로서, 상기 배지가 푸사린산, db-cAMP, 포스콜린, 및 B27을 포함하는 NB 배지인 분화용 배지를 제공한다.
상기 분화용 배지는 상기한 바와 같이, 종래의 도파민 뉴우런 분화용 배지에 푸사린산을 가하여 구성될 수 있다.
바람직하게는 상기 분화용 배지는 상기한 바와 같이, 50uM ∼ 4mM의 푸사린산, 50uM ∼ 4mM의 db-cAMP, 5∼20 uM의 포스콜린, 및 0.5∼5 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50uM ∼ 1mM의 푸사린산, 50uM ∼ 1mM의 db-cAMP, 5∼15 uM의 포스콜린, 및 0.5∼3 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있다. 특히 바람직하게는, 상기 배지는 약 100uM의 푸사린산, 약 100uM의 db-cAMP, 약 10uM의 포스콜린, 약 2 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지일 수 있다. 또한, 상기 배지는, 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생제 혹은 L-글루타민 등의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 물론, 상기 항생제 및 아미노산은 다른 물질로 적절히 대체될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예.
1. 재료 및 시험방법
(1) 인간 신경전구세포(hNPSs)의 분리
산모의 자궁근 무력증에 의한 조산으로 얻어진 14-주령의 태아로부터 인간 신경전구세포를 분리하였다. 상기 태아 샘플을 얻기 전에, 태아의 부모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받았으며, 또한 차병원 기관연구윤리위원회로부터, 샘플의 수집 및 연구 목적을 위한 이들의 사용에 관하여 승인을 받았다.
Storch et al. 2001; Milosevic et al. 2006, 2007 등에 개시된 방법에 따라 인간 신경전구세포를 분리하였다. 즉, 14-주령의 태아의 뇌 조직 중 중뇌 조직(ventral midbrain tissue)을 분리하여 0.1mg/ml의 파페인(papain) 및 100ug/ml DNase를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 약 30분간 처리하여 단일 세포 현탁액으로 분리하였다. 이를 인산완충식염수(PBS)세척하고, 50ug/ml의 안티페인(antipain) 중에서 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 15ug/ml의 폴리-L-오르니틴 및 4ug/ml의 피브로넥틴으로 코팅한 배양 접시에 30,000 cells/cm2 의 밀도로 상기에서 얻어진 인간 신경전구세포(hNPSs)를 단일층으로 접종하여 배양하였다.
(2) 분화 및 분리
도파민 뉴우런으로의 분화를 위하여, hNPSs를 15ug/ml의 폴리-L-오르니틴 및 4ug/ml의 피브로넥틴으로 코팅한 배양 접시에 30,000 cells/cm2의 밀도로 접종한 후, 2일-3일 후에 별도로 표기하지 않는 한 2%의 B-27 minus-AO supplement(GIBCO 사), 10uM의 포스콜린, 1mM의 db-cAMP 및 1mM의 푸사린산 등의 분화유도제를 포함하는 NB 배지 중에서 37℃에서 7일 동안 배양하였다.
분화된 세포 즉 도파민 뉴우런은 다음과 같이 수확하였다: 배양용기로부터 배양액을 제거한 후 완충액으로 세척한 후, Accutase(PAA사)를 이용하여 30분간 처리하여 배양접시로부터 세포를 분리한 후, 다시 완충액으로 세척하였다. 얻어진 세포를 1000rpm에서 약 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 분화가 유도된 도파민 뉴우런을 수확하였다.
(3) RNA 추출, 역전사 및 정량 실시간 PCR(Reverse Transcription and Quntitative real-time PCR)
총 세포 RNA는 트리아졸 및 클로로포름을 사용하여 hNPCs로부터 추출하였다. 또한, 500ng의 총 RNA로부터 Superscript II RTase, Oligo-d(T)프라이머, DTT 및 dNTPs를 사용하여 제조사 지침에 따라 cDNA를 합성하였다. PCR 반응은 1μl의 cDNA 및 1ul의 10pM 프라이머를 함유하는 최종 용적 20μl 중에서, SYBR-Green SYBR-Green mixture를 사용하여 수행하였다. 내부 콘트롤로서 RPL22를 사용하여 TH, DAT, GFAP, Nurr1, Tuj1, 및 Lmx1a의 발현을 분석하였다. 정량 실-시간 PCR은 LightCycler System을 사용하여 수행하였고, 형광 염색제인 SYBR Green이 2중 가닥 DNA와 결합하는 것을 측정함으로써 증폭를 모니터하고 분석하였다. 표적 DNA는 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 20초의 조건으로 총 40 사이클을 수행하여 증폭하였고, 최종 연장(extension)은 72℃에서 10분 동안 수행하였다. 결과는 comparative Ct method로 유전자 RPL22에 대하여 상대적으로 나타냈다. 상기 중합효소연쇄반응에 사용한 프라이머는 다음 표 1과 같다.
유전자명 프라이머 서열 서열번호 product size
TH 센스 프라이머 5'-agccctaccaagaccagacg-3' 1 132bp
안티센스 프라이머 5'-gcgtgtacgggtcgaactt-3' 2
Tuj1 센스 프라이머 5'-gggcctttggacatctcttc-3' 3 90bp
안티센스 프라이머 5'-cctccgtgtagtgacccttg -3' 4
Nestin 센스 프라이머 5'-cagctggcgcacctcaagatg-3' 5 208bp
안티센스 프라이머 5'-agggaagttgggctcaggactgg-3' 6
Sox2 센스 프라이머 5'-gccgagtggaaacttttgtc-3' 7 264bp
안티센스 프라이머 5'-gttcatgtgcgcgtaactgt-3' 8
Musashi1 센스 프라이머 5'-acagcccaagatggtgactc-3' 9 191bp
안티센스 프라이머 5'-ccacgatgtcctcactctca-3' 10
Lmx1a 센스 프라이머 5'-tgcttagcccaggactttca-3' 11 136bp
안티센스 프라이머 5'-tgaagatggagggagagctg-3' 12
PAX6 센스 프라이머 5'-ccaaagtggtggacaagattgcc-3' 13 419bp
안티센스 프라이머 5'-taactccgcccattcactgacg-3' 14
VMAT2 센스 프라이머 5'-atccagaccaccagaccagag-3' 15 616bp
안티센스 프라이머 5'-ccccatccaagagcaccaagg-3' 16
Pitx3 센스 프라이머 5'-tgtcattctcagatgcaggcac-3' 17 400bp
안티센스 프라이머 5'-tgaccgagttaaggcgaac-3' 18
DAT 센스 프라이머 5'-tgcgtgccacatcaataaca-3' 19 170bp
안티센스 프라이머 5'-aacatccttcactcagtattgctaa-3' 20
Nurr1 센스 프라이머 5'-cgaccaagacctgctttttg-3' 21 125bp
안티센스 프라이머 5'-attgcaacctgtgcaagacc-3' 22
GIRK2 센스 프라이머 5'-gggcaaacccttctcttctc-3' 23 212bp
안티센스 프라이머 5'-ggcactttgcactttcatca-3' 24
Lmx1a 센스 프라이머 5'-tgcttagcccaggactttca-3' 25 136bp
안티센스 프라이머 5'-tgaagatggagggagagctg-3' 26
RPL22 센스 프라이머 5'-cacgaaggaggagtgactgg-3' 27 116bp
안티센스 프라이머 5'-tgtggcacaccactgacatt-3' 28
(4) 면역염색화학(Immuncytochemistry)
hNPCs를 PBS로 세 번 세척하고, 4% 파라포름알데히드를 함유한 PBS로 10분간 고정하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 3% Normal goat serum, 0.2% 트리톤 X-100 및 1% BSA를 함유하는 PBS로 상온에서 한시간 동안 반응시켜 블록킹하였다. 항-TH(rabbit-anti-TH, Pelfreez), Tuj1(mouse anti-Tuj1 Millipore, CA. USA), nestin(rabbit anti-nestin, COVANCE, CA, USA), GFAP(mouse-anti-GFAP Millipore, CA. USA), Ki67(mouse anti-Ki67, Leica), O4(mouse-anti-O4, Millipore), Sox2(rabbit- anti-Sox2, Abcam), VMAT2(rabbit anti-VMAT2, Abcam), Pitx3(rabbit anti-Pitx3, Millipore), DAT(rabbit anti-DAT, Santa cruze), Nurr1(rabbit anti-Nurr1, Santa cruze), NeuN(mouse-anti-NeuN, Millipore), GIRK2(rabbit-anti-GIRK2, Alomone lab), Cal28K(mouse-anti-Cal28K, Sigma), Glutamate(rabbit-anti-Glutamate, Sigma), GABA(rabbit-anti-GABA, Sigma), ChAT(mouse-anti-ChAT, Millipore) 및 5-HT(rabbit-anti-5-HT, ImmunoStar) 1차 항체를 4에서 밤새 인큐베이션한 후, PBS로 3회 세척하고, 얻어진 세포를 실온에서 60분 동안 2차 항체 anti-mouse(Alexa FluorTM 488), anti-mouse(Alexa FluorTM 594), anti-rabbit(Alexa FluorTM 488), anti-rabbit(Alexa FluorTM 594) 와 함께 인큐베이션하고, DAPI(4'-6-Diamidino-2-phenylindole)로 염색(counterstaining)하였다.
(5) 면역블롯팅(Immunoblotting)
단백질은 Proteinase inhibiter(PI)(Roche Molecular Biochemicals)가 포함된 RIPA 완충액[10mM HEPES-KOH (pH 7.9), 10mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.1% NP-40]으로 추출하였다. BCA 방법(Pierce)을 사용하여 단백질 농도를 측정하고, 단백질을 SDS-10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리한 후 PVDF 막에 전사하였다. 상기 막을 TBS-T 완충액 중의 5% 스킴 밀크(skim milk)로 2시간 동안 실온에서 블록킹한 후, 항-TH(rabbit-anti-TH, Pelfreez, 1:1000), Tuj1(rabbit anti-Tuj1 COVANCE, 1:5000), Nestin(rabbit anti-Nestin, Abcam, 1:1000), Sox2(rabbit- anti-Sox2, Abcam, 1:1000), Bcl2(mouse anti-Bcl2, Santa cruze, 1:200), PCNA(mouse anti-PCNA, Santa cruze, 1:1000), VMAT2(rabbit anti-VMAT2, Abcam, 1:1000), Pitx3(rabbit anti-Pitx3, Millipore, 1:2000), DAT(rabbit anti-DAT, Santa cruze, 1:200), Nurr1(rabbit anti-Nurr1, Santa cruze, 1:250), Actin(rabbit anti-Actin, Santa cruze, 1:5000) 1차 항체와 함께 4에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 막은 HRP(horse radish peroxidase)가 컨쥬게이션(conjugation)된 anti-mouse 와 anti-rabbit 2차 항체와 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 상기 막을 화학발광 웨스턴 블롯 검출시약(chemiluminescence western blot detection reagents)에 노출시켰다.
2. 시험결과 및 고찰
(1) 분화 조건(배지 조건) 평가
Neurobasal 배지 [Differentiation medium(DM) control]에 인터루킨 1 베타, db-cAMP, 및 푸사린산(Fus)을 다양한 농도 및 조합으로 가하여 얻어진 배지 중에 hNPCs를 가하여 도파민 뉴우런으로 분화를 유도하였다. 도파민 뉴우런의 마커로 알려져 있는 TH 및 신경세포 마커(neural marker) Tuji를 DAPI 염색을 통하여 측정한 결과는 도 1과 같다. 도 1의 결과로부터, db-cAMP 및 푸사린산을 함께 첨가한 배지를 사용한 경우 TH 및 Tuji의 발현량이 가장 높아 분화율이 가장 높은 것을 알 수 있으며, db-cAMP 및 푸사린산이 각각 100uM일 경우 높은 분화율을 달성할 수 있음을 알 수 있다.
DMEM/F12 (1:1) Glutamax 배지 중에 hNPCs를 가하여 hNPCs를 증식시키고, 다시 Neurobasal(NB) 배지에 2%의 B-27 minus-AO supplement(GIBCO 사), 10uM의 포스콜린, 1mM의 db-cAMP을 첨가한 후, 푸사린산 100uM를 가하거나 가하지 않고, 뉴우런으로 분화를 유도시켰다. 분화 유도 후, TH 및 Tuj1의 발현량을 측정한 결과는 도 2와 같고, 면역염색화학 분석 결과 및 RT-PCR 결과는 도 3과 같다. 도 2 및 도 3의 결과로부터, 푸사린산(FA)를 첨가하였을 때 도파민 뉴우런의 마커인 TH가 훨씬 많이 발현되었으며, 신경세포 마커인 Tuj1 도 증가되는 것을 확인할 수 있다.
고가의 분화유도제로서 사용이 제한되어 있는 SHH와 FGF8의 대체가능성을 평가하기 위하여, DMEM/F12 (1:1) Glutamax 배지 중에 hNPCs를 가하여 hNPCs를 증식시키고, 2%의 B27, 200ng/ml의 SHH, 25ng/ml의 FGF8, 10uM의 포스콜린, 100uM의 푸사린산, 및 100uM의 db-cAMP를 사용하여, Neurobasal (NB) 배지(Invitrogen 사) 중에서 분화를 유도하여, TH 발현을 측정한 결과는 도 4와 같다. 도 4의 결과로부터, SHH와 FGF8 대신 푸사린산을 처리한 경우가 가장 효과적으로 도파민 뉴우런으로 분화되었음을 알 수 있다. 또한, SHH와 FGF8에 추가하여 푸사린산을 가한 경우에도 도파민 뉴우런으로의 분화가 더욱 증가되었다.
따라서, 상기 도 1 내지 도 4의 결과로부터, 푸사린산을 함유하는 배지 중에서 hNPCs에 대한 분화를 유도할 경우, 높은 분화효율로 도파민 뉴우런으로의 분화효율을 달성할 수 있음을 알 수 있다.
(2) 분화 조건(배양 조건) 평가
DMEM/F12 (1:1) Glutamax 배지 중에 hNPCs를 가하여 hNPCs를 증식시키고, 2%의 B27, 10uM의 포스콜린, 100uM의 푸사린산, 및 100uM의 db-cAMP를 포함한 Neurobasal (NB) 배지(Invitrogen 사) 중에 hNPCs를 가한 다음, 3%의 산소분압조건(Hypoxia 조건) 및 21%의 산소분압조건(Normoxia 조건)에서 분화를 유도하여, TH 발현을 측정한 결과는 도 5와 같다. 도 5의 결과로부터, 저산소조건(Hypoxia 조건)에서 분화를 유도한 경우 정상산소조건(Normoxia 조건)에서 분화를 유도한 경우에 비하여, 도파민 뉴우런으로의 분화가 더욱 효율적임을 알 수 있다.
(3) 푸사린산(Fusaric acid)의 신경보호(Neuroprotection) 효과 분석
1-메틸-4-페닐피디움(1-methyl-4-phenylpyridium, MPP)는 도파민성 신경에서 세포독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서, MPP 존재하에서 분화를 유도함으로써, 푸사린산이 분화과정에서 어떠한 기능을 수행하는지를 평가하였으며, 그 결과는 도 6과 같다.
도 6의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 푸사린산이 첨가된 배지에서 분화를 유도한 경우에는 MPP를 처리하더라도 TH를 발현하는 세포가 더 많이 살아남아 있음을 알 수 있다. 또한 신경세포 마커(neural marker)인 Tuj1도 상대적으로 더 많이 발현되었다. 이는 푸사린산이 신경보호(neuroprotection) 활성을 가짐으로써 TH를 발현하는 세포의 생존에 영향을 미치는 것을 시사하며, 이에 따라 도파민 뉴우런이 상대적으로 다른 조건보다 많이 생존하도록 하는 것으로 추정된다.
(4) 분화/증식 평가
DMEM/F12 (1:1) Glutamax 배지 중에 hNPCs를 가하여 hNPCs를 증식시키고, 2일에 한번 씩 배양액을 갈아주며 3%의 산소분압조건에서 지속적으로 계대 배양하였다. 초기(제 7계대), 중간(제 11계대), 후기(제 17계대)에서 얻어진 각각의 hNPCs를 2%의 B27, 10uM의 포스콜린, 100uM의 푸사린산, 및 100uM의 db-cAMP를 포함한 NB 배지(Invitrogen 사) 중에 hNPCs를 가한 다음, 3%의 산소분압조건에서 7일 동안 배양하여 분화를 유도하였다.
초기(제 7계대), 중간(제 11계대), 후기(제 17계대)에서 얻어진 각각의 세포(증식세포 및 분화유도 세포)를 취하여, TH 발현량 및 Tuji 발현량을 측정한 결과는 도 7과 같고, 각각의 세포에 대한 면역염색을 통하여 TH를 발현을 측정한 결과는 도 8과 같다. 또한, 신경 줄기세포 마커인 nestin, 증식성 세포 마커인 Ki67, 및 성숙 신경세포 마커인 Tuj1에 대한 발현을 면역염색을 통하여 측정한 결과는 도 9와 같다. 본 발명에 따라 분화를 유도하여 얻어지니 세포는 TH 양성 세포의 수가, 분화를 유도하지 않은 세포(즉, 증식시킨 세포)에 비하여 20% 이상 증가하였으며, 분화 효율은 계대가 증가할 수록 최대 약 30%까지 더욱 증가하였다(도 7의 A 참조). 또한, 분화 전 Tuj1 양성인 세포도 약 10% 정도에서 분화 후 40∼45% 까지 증가하였으며, 후기 계대에서도 변화가 없었다(도 7의 B 참조). 상기 결과는 TH 양성인 세포에 대한 면역염색분색 결과에서도 동일하였으며, 분화효율은 후기 계대로 갈수록 더욱 증가하였다(도 8 참조). 분화 후 nestin 및 ki67의 발현은 감소한 반면, Tuj1 발현이 증가하였다(도 9 참조). 이는 줄기세포 특성이 분화가 진행됨에 따라 줄어듬과 동시에 증시되던 세포들이 점차 분화되어 성숙한 뉴우런이 증가된다는 것을 나타낸다.
또한, 초기 (제 7계대)의 hNPC에 대하여 유세포 분석(FACS analysis)을 수행한 결과, 신경 줄기세포의 표면 마커인 CD15, 184, 133이 분화전에 비해 유의성 있게 감소하였음을 확인하였다(도 10 참조). 이는 줄기세포의 특성이 감소하고 세포가 분화되는 상태로 변화하고 있음을 나타낸다. 또한, RT-PCR을 통하여 측정한 결과, 도파민 뉴우런의 마커인 TH 발현이 계대가 지나더라도 정상적으로 유지되었으며, 신경세포 마커인 Tuj1이 증가한 반면 신경 줄기세포 마커인 nestin, sox2, musashi1이 감소하였다(도 11의 A 참조). 웨스턴 블롯 분석에서도 RT-PCR 분석 결과와 마찬가지로, 계대가 지나더라도 TH 발현이 정상적으로 유지되엇으며, Tuj1이 증가한 반면, nestin, sox2가 감소하였다(도 11의 B 참조). 또한, anti apototic marker인 Bcl2 및 증식 마커(Proliferation marker)인 PCNA 또한 감소하였다(도 11의 B 참조)
따라서, 상기 도 7 내지 도 11의 결과로부터, 후기 계대까지 세포를 배양하고, 배양된 세포를 상기 분화 배지로 분화를 유도하였을 때 초기의 세포에서 나타난 분화 효율과 변함없는 수준으로 분화가 이루어졌음을 알 수 있다.
(5) 분화된 도파민 뉴우런의 특성 평가
hNPCs를 2%의 B27, 10uM의 포스콜린, 100uM의 푸사린산, 및 100uM의 db-cAMP를 포함한 NB 배지(Invitrogen 사) 중에 hNPCs를 가한 다음, 3%의 산소분압조건에서 14일 동안 배양하여 분화를 유도하였다.
얻어진 세포로부터 TH가 발현됨과 동시에 성숙 도파민 뉴우런 마커인 NeuN, VMAT2, Nurr1, Pitx3가 발현되는지 여부를 면역염색을 통해 측정한 결과는 도 12의 A와 같고, 발현되는 TH가 상기 A9 형인지 혹은 A10 형인지 평가하기 위하여 Girk2 및 cal28K의 발현 여부를 면역염색을 통해 측정한 결과는 도 12의 B와 같다. Girk2가 발현되는 세포에서 TH가 동시에 발현될 경우 A9 형이며, cal28K가 발현되는 세포에서 TH가 동시에 발현될 경우 A10 형으로 간주할 수 있다. 도 12의 결과로부터, 본 발명의 분화방법에 따라 얻어진 도파민 뉴우런은 성숙한(mature) 도파민 뉴우런으로서 A9형 뉴우런임을 알 수 있다.
또한, RT-PCR을 통하여 확인한 결과, TH의 증가와 함께 VMAT2, Pitx3, DAT, Nurr1과 같은 성숙 도파민 뉴우런 마커들이 분화전(-)에 비해 분화 후(+)에 현저하게 증가하였으며(도 13의 A), 웨스턴 블롯 분석과 또한 TH의 증가와 함께 VMAT2, Pitx3, DAT, Nurr1과 같은 성숙 도파민 뉴우런 마커들이 분화전(-)에 비해 분화 후(+)에 현저하게 증가하였다(도 13의 B). 이러한 결과는 면역염색을 통하여 얻어진 결과와 일치하였다(도 13의 C). 면역 염색을 통해 성숙 도파민 뉴우런 마커들은 분화 후 7일에서 14일 동안 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 다른 서브타입(subtype)의 뉴우런으로 얼마나 분화되었는지 확인하기 위하여 글루타메이트(Glutamate), GABA, ChAT 및 세로토닌(Serotonine)의 발현 여부를 면역염색을 통해 측정하였으며, 그 결과는 도 14와 같다. 도 14의 결과로부터 도파민 뉴우런 보다 적은양의 서브타입의 뉴우런이 발현되는 것을 알 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 인간 신경전구세포를 푸사린산(fusaric acid)을 포함하는 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는, 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지가 디부티릴 시클릭 아데노신 모노포스페이트(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, db-cAMP), 포스콜린(forskolin), B27, SHH(sonic hedgehog) 및 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 포함하는 도파민 뉴우런 분화용 배지에 푸사린산을 가하여 이루어진 것임을 특징으로 하는 분화방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배지가 푸사린산, db-cAMP, 포스콜린, 및 B27을 포함하는 NB 배지인 것을 특징으로 하는 분화방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배지가 50uM ∼ 4mM의 푸사린산, 50uM ∼ 4mM의 db-cAMP, 5∼20 uM의 포스콜린, 및 0.5∼5 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지인 것을 특징으로 하는 분화방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 배지가 100uM의 푸사린산, 100uM의 db-cAMP, 10uM의 포스콜린, 2 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지인 것을 특징으로 하는 분화방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 산소분압 2∼10 %의 저산소 분압 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  7. 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화용 배지로서, 상기 배지가 푸사린산, db-cAMP, 포스콜린, 및 B27을 포함하는 NB 배지인 분화용 배지.
  8. 제7항에 있어서, 상기 배지가 50uM ∼ 4mM의 푸사린산, 50uM ∼ 4mM의 db-cAMP, 5∼20 uM의 포스콜린, 및 0.5∼5 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지인 것을 특징으로 하는 분화용 배지.
  9. 제8항에 있어서, 상기 배지가 100uM의 푸사린산, 100uM의 db-cAMP, 10uM의 포스콜린, 2 중량%의 B27을 포함하는 NB 배지인 것을 특징으로 하는 분화용 배지.
KR1020100055832A 2010-06-14 2010-06-14 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법 및 분화용 배지 KR101106020B1 (ko)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100055832A KR101106020B1 (ko) 2010-06-14 2010-06-14 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법 및 분화용 배지
JP2013515258A JP5776101B2 (ja) 2010-06-14 2011-06-07 ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化方法及び分化用培地
US13/704,030 US8921107B2 (en) 2010-06-14 2011-06-07 Method for differentiating human neural progenitor cells into dopaminergic neurons, and medium for differentiation thereof
AU2011265956A AU2011265956B2 (en) 2010-06-14 2011-06-07 Method for differentiating human neural progenitor cells into dopaminergic neurons, and medium for differentiation thereof
PCT/KR2011/004118 WO2011159050A2 (ko) 2010-06-14 2011-06-07 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법 및 분화용 배지
CN201180029604.3A CN102985535B (zh) 2010-06-14 2011-06-07 人类神经前体细胞向多巴胺神经元的分化方法及用于分化的培养基
CA2802661A CA2802661C (en) 2010-06-14 2011-06-07 Method for differentiating human neural progenitor cells into dopaminergic neurons, and medium for differentiation thereof
ES11795916.3T ES2532928T3 (es) 2010-06-14 2011-06-07 Método para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas, y medio para la diferenciación de las mismas
EP11795916.3A EP2581443B1 (en) 2010-06-14 2011-06-07 Method for differentiating human neural progenitor cells into dopaminergic neurons, and medium for differentiation thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100055832A KR101106020B1 (ko) 2010-06-14 2010-06-14 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법 및 분화용 배지

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110136061A KR20110136061A (ko) 2011-12-21
KR101106020B1 true KR101106020B1 (ko) 2012-01-17

Family

ID=45348710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100055832A KR101106020B1 (ko) 2010-06-14 2010-06-14 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법 및 분화용 배지

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8921107B2 (ko)
EP (1) EP2581443B1 (ko)
JP (1) JP5776101B2 (ko)
KR (1) KR101106020B1 (ko)
CN (1) CN102985535B (ko)
AU (1) AU2011265956B2 (ko)
CA (1) CA2802661C (ko)
ES (1) ES2532928T3 (ko)
WO (1) WO2011159050A2 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10017734B2 (en) * 2013-08-06 2018-07-10 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for producing dopaminergic neurons
CN104031882B (zh) * 2014-06-20 2017-03-01 上海安集协康生物技术股份有限公司 人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法
CN105483175A (zh) * 2016-01-21 2016-04-13 西北农林科技大学 一种禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的诱导物及方法
KR101783977B1 (ko) * 2016-12-30 2017-10-10 제일약품주식회사 기형종 형성이 억제된 전분화능 줄기세포 유래 신경 전구체구의 제조 방법
WO2022045723A1 (ko) * 2020-08-24 2022-03-03 차의과학대학교 산학협력단 신경줄기세포의 도파민 신경세포로의 분화 촉진용 조성물
US20220409855A1 (en) 2021-06-29 2022-12-29 Staffan Holmin Methods of delivering cells and therapeutic agents to organs and extravascular sites

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101029302B (zh) * 2001-06-21 2011-03-30 杰龙公司 用于治疗帕金森病的多巴胺能神经元和具有增殖能力的前体细胞
GB2407821B (en) * 2002-06-05 2007-03-21 Es Cell Int Pte Ltd Stem Cells
CN100506975C (zh) * 2003-04-09 2009-07-01 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 神经干细胞体外扩增和定向诱导分化为多巴胺能神经细胞的方法
CN1752208A (zh) * 2004-09-21 2006-03-29 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种提高人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞分化效率的新方法
US20080070303A1 (en) * 2005-11-21 2008-03-20 West Michael D Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby
US8058243B2 (en) * 2006-10-13 2011-11-15 Hsc Research And Development Limited Partnership Method for treating a brain cancer with ifenprodil

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Neurosci. Res. 2001;65(4) 284-288 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011159050A3 (ko) 2012-05-03
CN102985535A (zh) 2013-03-20
US20130089926A1 (en) 2013-04-11
WO2011159050A2 (ko) 2011-12-22
CA2802661C (en) 2018-09-04
US8921107B2 (en) 2014-12-30
EP2581443B1 (en) 2015-01-07
ES2532928T3 (es) 2015-04-06
EP2581443A4 (en) 2013-10-23
AU2011265956A1 (en) 2013-01-10
CA2802661A1 (en) 2011-12-22
AU2011265956B2 (en) 2015-12-03
KR20110136061A (ko) 2011-12-21
EP2581443A2 (en) 2013-04-17
CN102985535B (zh) 2014-11-05
JP2013528396A (ja) 2013-07-11
JP5776101B2 (ja) 2015-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kim et al. Schwann cell precursors from human pluripotent stem cells as a potential therapeutic target for myelin repair
Chang et al. Neurogenic differentiation of dental pulp stem cells to neuron-like cells in dopaminergic and motor neuronal inductive media
US8153422B2 (en) Dopaminergic neurons differentiated from embryonic cells for treating neurodegenerative diseases
WO2017005136A1 (en) Compositions and methods for reprograming non-neuronal cells into neuron-like cells
US20160160177A1 (en) Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells
AU2018222997A1 (en) Midbrain dopamine (DA) neurons for engraftment
JP6316938B2 (ja) Ｈｍｇａ２を用いて非神経細胞からリプログラミングされた誘導神経幹細胞を調製する方法
KR20160086933A (ko) 인간 다능성 줄기 세포로부터 기능적 두개 기원판 유도체의 전문화
CN111849899B (zh) 定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的诱导培养基
KR101106020B1 (ko) 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법 및 분화용 배지
WO2014153230A1 (en) In vitro production of medial ganglionic eminence precursor cells
US20240009248A1 (en) Methods for generating neural progenitor cells with a spinal cord identity
WO2011130675A2 (en) Dopaminergic neurons differentiated from pluripotent stem cells and uses of thereof
IL165772A (en) Method for producing a neural cell
KR20160033703A (ko) 체세포로부터 신경 능선 세포로의 소분자 기반 전환
CN115968401A (zh) 将干细胞分化为多巴胺能祖细胞的方法
Meyer et al. Fetal mouse mesencephalic NPCs generate dopaminergic neurons from post-mitotic precursors and maintain long-term neural but not dopaminergic potential in vitro
Bianco et al. Rapid serum-free isolation of oligodendrocyte progenitor cells from adult rat spinal cord
KR20230165846A (ko) 도파민성 전구세포 및 사용 방법
WO2024003349A1 (en) Enhancing neuronal differentiation of ventral midbrain neural progenitor cells
Xia Novel molecular and pharmacological regulators of Neural Stem Cells in physiological and disease mechanisms
WO2023010209A1 (en) Neural progenitor cells and therapeutic uses of same
고지윤 Efficient derivation of neural precursors and dopamine neurons from human embryonic stem cells and their application to a Parkinsonian rat model

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150106

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160108

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161226

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171226

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190103

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200108

Year of fee payment: 9