KR101099627B1 - Diagnostic method for soil infection by Cylindrocarpon destructans and Primer for performing the same - Google Patents

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Abstract

토양에 존재하는 식물뿌리의 뿌리썩음병원균 균사(Cylindrocarpon destructans)를 검출하기위한 토양감염 진단방법, 이를 수행하기 위한 토양감염 진단용 프라이머에 관한 것이다. 이러한 토양감염 진단방법은 식물뿌리에서의 뿌리썩음병원균 균사으로부터 제1 게놈 DNA를 추출하는 단계, 프라이머를 이용하여 상기 제1 게놈 DNA의 단편을 증폭하는 단계, 토양시료에서의 미생물로부터 제2 게놈 DNA의 단편을 추출하는 단계, 상기 프라이머를 이용하여 상기 제2 게놈 DNA의 단편를 증폭하는 단계 및 증폭된 상기 제1 및 제2 게놈 DNA들의 단편들을 서로 비교하여, 상기 토양시료가 상기 뿌리썩음병원균 균사에 감염되었는지 여부를 진단하는 단계를 포함한다. 이와 같이, 진단에 필요한 시간과 비용을 절감하고 감염여부 판단의 정확성을 높일 수 있어 뿌리썩음병으로 인한 위험부담과 경제적 손실을 줄일 수 있다.The present invention relates to a soil infection diagnostic method for detecting Cylindrocarpon destructans of plant roots present in the soil, and a primer for diagnosing soil infection to perform the same. Such a method for diagnosing soil infection includes extracting a first genomic DNA from root rot pathogen mycelia in a plant root, amplifying a fragment of the first genomic DNA using a primer, and a second genomic DNA from a microorganism in a soil sample. Extracting a fragment of the sample, amplifying the fragment of the second genomic DNA using the primers, and comparing the fragments of the amplified first and second genomic DNAs with each other, wherein the soil sample is added to the root rot fungal hyphae. Diagnosing whether it is infected. As such, it is possible to reduce the time and cost required for diagnosis and to increase the accuracy of the determination of infection, thereby reducing the risk and economic loss caused by root rot.

Description

토양감염 진단방법, 이를 수행하기 위한 토양감염 진단용 프라이머{Diagnostic method for soil infection by Cylindrocarpon destructans and Primer for performing the same}Diagnostic method for soil infection by Cylindrocarpon destructans and Primer for performing the same}

본 발명은 토양감염 진단방법 및 이를 수행하기 위한 토양감염 진단용 프라이머에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 토양이 식물의 뿌리썩음병원균 균사, 후벽포자(Cylindrocarpon destructans)에 감염되었는지 진단할 수 있는 토양감염 진단방법 및 이를 수행하기 위한 토양감염 진단용 프라이머에 관한 것이다. The present invention relates to a method for diagnosing soil infection and a primer for diagnosing soil infection for performing the same, and more specifically, a method for diagnosing soil infection capable of diagnosing whether the soil is infected with root rot fungus mycelium or cylindrocarpon destructans. And it relates to a soil infection diagnostic primer for performing this.

식물의 뿌리썩음 증상은 다종의 병원균으로부터 유래한다. 특히 인삼뿌리에서 실린드로카폰 더스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans)는 이중 강한 병원성과 침입력을 가지고 있어 1차 감염이 인삼 연작장해의 가장 중요한 원인으로 알려져 있다.Root rot symptoms in plants come from a variety of pathogens. In particular, Cylindrocarpon destructans have strong pathogenicity and invasiveness in ginseng roots, so the primary infection is known to be the most important cause of ginseng rot.

실린드로카폰 더스트럭턴스는 시간이 경과할수록 병원균 밀도가 증가되어 뿌리썩음병에 의한 피해가 발생이 크다. 따라서 재배농가는 실린드로카폰 더스트럭턴스의 감염을 막기 위해 인삼을 한번도 재배하지 않은 초작지를 선호하게 되나 실린드로카폰 더스트럭턴스의 감염여부를 신속히 진단하기 곤란하여 초작지 선정에 어려움을 겪고 있다.Cylindrocapon dust lumps increase the density of pathogens over time, causing greater damage from root rot. Therefore, growers prefer cropland that has never grown ginseng in order to prevent the infection of Cylindrocarpon Dustpants, but it is difficult to quickly diagnose the infection of Cylindrocarpon Dustpants.

이를 해결하기 위해 종래에는 연속적으로 희석한 재배 예정지의 토양시료를 선택배지에 생성되는 실린드로카폰 더스트럭턴스의 병원균 총수를 측정함으로써 토양내의 실린드로카폰 더스트럭턴스를 검출하는 방법이 사용되었다. In order to solve this problem, conventionally, a method of detecting cylindrocarphone dust lumps in soil was measured by measuring the total number of pathogens of the cylindrocarphone dust ducts produced on a selected medium by continuously diluting the soil sample of a cultivated site.

그러나 토양내에 존재하는 실린드로카폰 더스트럭턴스의 후벽포자는 발아율이 현저히 낮아 병원균의 검출이나 정확한 밀도측정이 곤란하다. 또한 균 배양과 검출에 많은 시간과 인력이 소요되고 감염여부 판단의 정확도가 떨어진다는 문제점이 있다.However, the posterior spores of Cylindrocarpon dust luxants present in the soil have a low germination rate, making it difficult to detect pathogens and to accurately measure density. In addition, the bacteria culture and detection takes a lot of time and manpower, there is a problem that the accuracy of the determination of infection is low.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 보다 신속하게 토양에 존재하는 식물의 뿌리썩음병원균 균사(Cylindrocarpon destructans)를 검출할 수 있는 토양감염 진단방법을 제공하는 것이다.The problem to be solved by the present invention is to provide a soil infection diagnostic method that can more quickly detect the root rot pathogen mycelia (Cylindrocarpon destructans) of plants present in the soil.

또한, 본 발명의 또 다른 과제는 상기 토양감염 진단방법을 수행하는데 적합한 토양감염 진단용 프라이머를 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention is to provide a primer for diagnosing soil infection suitable for performing the soil infection diagnosis method.

본 발명의 예시적인 일 실시예에 의한 토양감염 진단방법은 식물뿌리에서의 뿌리썩음병원균 균사(Cylindrocarpon Destructans)로부터 제1 게놈 DNA를 추출하는 단계, 프라이머를 이용하여 상기 제1 게놈 DNA의 단편을 증폭하는 단계, 토양시료에서의 미생물로부터 제2 게놈 DNA의 단편을 추출하는 단계, 상기 프라이머를 이용하여 상기 제2 게놈 DNA의 단편을 증폭하는 단계 및 증폭된 상기 제1 및 제2 게놈 DNA들의 단편들을 서로 비교하여, 상기 토양시료가 상기 뿌리썩음병원균 균사(Cylindrocarpon Destructans)에 감염되었는지 여부를 진단하는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 식물뿌리는 인삼뿌리를 포함할 수 있다.Soil infection diagnostic method according to an embodiment of the present invention is the step of extracting the first genomic DNA from Cylindrocarpon Destructans in plant roots, amplifying the fragment of the first genomic DNA using a primer Extracting a fragment of the second genomic DNA from the microorganism in the soil sample, amplifying the fragment of the second genomic DNA using the primer, and amplifying the fragments of the first and second genomic DNAs. Comparing with each other, diagnosing whether the soil sample is infected with the Cylindrocarpon Destructans. Here, the plant root may include a ginseng root.

상기 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편들을 증폭하는 단계는 서로 동시에 수행될 수 있다. 상기 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편들의 증폭은 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested polymerase chain reaction, nested PCR)을 통해 이루어질 수 있다.Amplifying the fragments of the first and second genomic DNA may be performed simultaneously with each other. Amplification of the fragments of the first and second genomic DNA may be performed through nested polymerase chain reaction (nested PCR).

상기 프라이머는 상기 제1 및 제2 게놈 DNA에서의 제1 유전자와 대응되는 제 1 서열 및 상기 제1 및 제2 게놈 DNA에서의 제2 유전자와 대응되는 제2 서열을 포함하고, 상기 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편들 각각은 상기 제1 및 제2 유전자들 사이에 배치된 DNA가 될 수 있다. 여기서, 상기 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편들 각각은 상기 제1 유전자와 제3 유전자 사이에 배치된 제1 DNA 단편, 및 상기 제3 유전자와 상기 제2 유전자 사이에 배치된 제2 DNA 단편을 포함할 수 있다.The primer comprises a first sequence corresponding to a first gene in the first and second genomic DNA and a second sequence corresponding to a second gene in the first and second genomic DNA; Each of the fragments of the second genomic DNA may be DNA disposed between the first and second genes. Wherein each of the fragments of the first and second genomic DNA is a first DNA fragment disposed between the first gene and a third gene, and a second DNA fragment disposed between the third gene and the second gene. It may include.

상기 제1 DNA 단편은 ITS-1 영역(Internal transcribed spacer- 1)에 배치되고, 상기 제2 DNA 단편은 ITS-2 영역(Internal transcribed spacer- 2)에 배치될 수 있다.The first DNA fragment may be disposed in an internal transcribed spacer-1 and the second DNA fragment may be disposed in an internal transcribed spacer-2.

상기 제1 유전자는 18S SSU rDNA(small subunit rDNA)을 포함하고, 상기 제2 유전자는 28S LSU rDNA(large subunit rDNA)을 포함하고, 상기 제3 유전자는 5.8S rDNA을 포함할 수 있다.The first gene may include 18S SSU rDNA (small subunit rDNA), the second gene may include 28S LSU rDNA (large subunit rDNA), and the third gene may include 5.8S rDNA.

상기 프라이머의 제1 서열은 5‘-GTGCCTGYTTCGGCAGC-3'을, 상기 제2 서열은 5‘-CTGTTTYCCAGTGCGAGGTGTGC-3'를 포함할 수 있다.The first sequence of the primer may include 5'-GTGCCTGYTTCGGCAGC-3 ', and the second sequence may include 5'-CTGTTTYCCAGTGCGAGGTGTGC-3'.

본 발명의 예시적인 일 실시예에 의한 토양감염 진단용 프라이머는 식물뿌리에서의 뿌리썩음병원균 균사(Cylindrocarpon Destructans) 또는 토양시료로부터 추출된 게놈 DNA의 단편을 한정하기 위한 제1 및 제2 서열들을 포함한다.A primer for diagnosing soil infection according to an exemplary embodiment of the present invention includes first and second sequences for limiting fragments of genomic DNA extracted from Cylindrocarpon Destructans or soil samples in plant roots. .

상기 제1 서열은 상기 게놈 DNA에서의 제1 유전자와 대응되고, 상기 제2 서열은 상기 게놈 DNA에서의 제2 유전자와 대응되며, 상기 게놈 DNA의 단편은 상기 제1 및 제2 유전자들 사이에 배치된 DNA가 될 수 있다.The first sequence corresponds to a first gene in the genomic DNA, the second sequence corresponds to a second gene in the genomic DNA, and a fragment of the genomic DNA is between the first and second genes. It can be placed DNA.

상기 제1 서열은 5‘-GTGCCTGYTTCGGCAGC-3'을 포함하고, 상기 제2 서열은 5 ‘-CTGTTTYCCAGTGCGAGGTGTGC-3'을 포함할 수 있다.The first sequence may include 5′-GTGCCTGYTTCGGCAGC-3 ′, and the second sequence may include 5′-CTGTTTYCCAGTGCGAGGTGTGC-3 ′.

본 발명에 의한 토양감염 진단방법 및 이를 수행하기 위한 토양감염 진단용 프라이머는 토양감염 진단에 필요한 시간과 비용을 절감하고 감염여부 판단의 정확성을 높일 수 있어 뿌리썩음병으로 인한 위험부담과 경제적 손실을 줄일 수 있다.Soil infection diagnosis method according to the present invention and the soil infection diagnosis primer for performing the same can reduce the time and cost required for soil infection diagnosis and increase the accuracy of determination of infection can reduce the risk and economic loss caused by root rot disease have.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.As the inventive concept allows for various changes and numerous embodiments, particular embodiments will be illustrated in the drawings and described in detail in the text. However, this is not intended to limit the present invention to the specific disclosed form, it should be understood to include all modifications, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다. The terms first, second, etc. may be used to describe various elements, but the elements should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another. For example, without departing from the scope of the present invention, the first component may be referred to as a second component, and similarly, the second component may also be referred to as a first component.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting of the invention. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly indicates otherwise. In this application, the terms "comprise" or "having" are intended to indicate that there is a feature, number, step, action, component, part, or combination thereof described in the specification, and that one or more other features It should be understood that it does not exclude in advance the possibility of the presence or addition of numbers, steps, actions, components, parts or combinations thereof.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art.

일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Terms such as those defined in commonly used dictionaries are to be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the relevant art and are to be interpreted as ideal or overly formal in meaning unless explicitly defined in the present application Do not.

이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 일 실시예인 토양감염 진단방법 및 이를 수행하기 위한 토양감염 진단용 프라이머를 자세하게 설명하겠다.Hereinafter, with reference to the accompanying drawings, it will be described in detail a soil infection diagnostic method and a primer for diagnosing soil infection for performing the same in detail an embodiment of the present invention.

제1 단계: 식물뿌리의 뿌리썩음 균사으로부터 제1 게놈 DNA를 추출하는 단계 First step: extracting the first genomic DNA from the root rot mycelia of the plant root

균사는 균류의 몸을 이루는 섬세한 실 모양의 세포를 가리키며 병충해의 원인이 된다. 식물뿌리의 뿌리썩음 균사는 Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Pythium debaryanum, Cylindrocladium scoparium , Cylindrocarpon destructans등 이 있으며 본 발명에는 Cylindrocarpon destructans 균사나 후벽포자가 적용된다. 이하, 식물의 뿌리썩음병원균 균사는 실린드로카폰 더스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans)를 가리킨다.Mycelium refers to the delicate thread-shaped cells that make up the fungus body and cause pests. Root rot mycelium of plant roots include Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Pythium debaryanum, Cylindrocladium scoparium, Cylindrocarpon destructans, and the present invention applies Cylindrocarpon destructans mycelium or posterior spore. Hereinafter, the root rot pathogen mycelium of the plant refers to Cylindrocarpon destructans.

본 단계는 상기 균사의 핵으로 부터 유전자의 본체인 DNA를 뽑아내는 과정이다. 5~6월경 뿌리썩음병에 이병된 식물뿌리를 차아염소산나트륨 (sodium hypochloride), 에탄올등의 살균제에 1분간 표면살균한다. 살균 후, 70% 알코올에 30초정도 담갔다가 멸균수로 세척한다. This step is to extract DNA that is the body of the gene from the nucleus of the hyphae. Plant roots infected with root rot in May ~ June are surface sterilized with disinfectant such as sodium hypochloride and ethanol for 1 minute. After sterilization, soak in 70% alcohol for 30 seconds and wash with sterile water.

표1 . PCNB (pentachloronitrobenzene) 배지 조성 Table 1. PCNB (pentachloronitrobenzene) medium composition

구성성분 (조성물)Ingredients (Composition) 사용량usage bacto peptonebacto peptone 5g5 g agaragar 20g20g MgSO4 MgSO 4 250㎎250mg KH2PO4 KH 2 PO 4 500㎎500mg PCNBPCNB 200㎎200mg penicillin Gpenicillin G 50㎎50 mg 85% lactic acid85% lactic acid 1.3㎖1.3 ml ethanolethanol 20㎖20 ml Na desoxycholateNa desoxycholate 130㎎130mg waterwater 1ℓ1ℓ

(상기 표1과 같이 PCNB 배지조성은 120℃에서 20분 멸균 후 약 70℃로 식힌 다음 lactic acid, penicillin G, ethanol 첨가한다.)(As shown in Table 1 above, PCNB medium composition is sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, cooled to about 70 ° C., and then lactic acid, penicillin G, and ethanol are added.)

살균 및 멸균한 식물뿌리를 5~10mm 크기로 잘라 표 1의 PCNB (pentachloronitrobenzene) 배지 위에 톱니 모양의 돌출부가 형성되도록 한다. 배지위에 식물뿌리를 20℃ 항온기에서 7일간 암배양한 후, 배양용기에 나타난 뿌리썩음병원균 균사를 PDA (potato dextrose agar) 배지에 옮긴다. PDA배지 위에 식물뿌리에서 포자가 형성될 수 있도록 흑색광 (black light, UV)을 이용해서 12시간 주기로 흑색광 명배양한다. 명배양한 실린드로카폰 더스트럭턴스 균사를 현미경으로 관찰하면, 대형분생포자의 모양은 막대기 모양을 하고 있어 반달처럼 구부러져 있는 후자리움(Fusarium)균사 구별된다.Sterilized and sterilized plant roots are cut into 5 ~ 10mm size so that jagged protrusions are formed on PCNB (pentachloronitrobenzene) medium of Table 1. After the plant roots were cultured on the medium for 7 days at 20 ° C. in a thermostat, the root rot pathogen hyphae shown in the culture vessel was transferred to PDA (potato dextrose agar) medium. Black light is incubated every 12 hours using black light (UV) to form spores in plant roots on PDA media. Microscopic observations of brightly-cultivated Cyclodochone dust lumps hyphae show that the shape of the large conidia is distinct from the Fusarium hyphae, which is curved like a half moon.

따라서 실린드로카폰 더스트럭턴스 균사를 후자리움 균사와 분리 가능하다. 배양 및 분리된 실린드로카폰 더스트럭턴스 균사를 5℃에 보관하고 positive 마커로 사용한다.Therefore, the cylinder carcillus dust luch mycelium can be separated from the fusidium mycelium. The incubated and isolated cylinder caractus dustus hyphae is stored at 5 ° C and used as a positive marker.

다음, 배양 및 분리된 실린드로카폰 더스트럭턴스 균사로부터 제1 게놈DNA를 추출하기 위해 배양 및 분리된 실린드로카폰 더스트럭턴스 균사를 PDA(potato dextrose agar) 배지에서 15일간 배양한다.Next, in order to extract the first genomic DNA from the cultured and isolated Cyclocarpon dust luxant mycelium, the cultured and isolated Cyclocarpon dust luxant mycelium is incubated in PDA (potato dextrose agar) medium for 15 days.

배양된 실린드로카폰 더스트럭턴스 균사를 핀셋으로 PDA배지에서 모은 다음 멸균수로 2~3회 세척하여 균사의 배지성분을 제거한 후 냉동건조 한다. 냉동건조된 균사를 액체질소를 이용하여 갈아 부수고 멸균된 50㎖ tube에 넣어 냉동고에 보관한다. 부셔진 균사 0.55g에 lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH 8.0; 50mM EDTA, pH 8.0; 3% sodium dodecyl sulfate; 1% 2-mercaptoethanol) 10㎖(W/V)를 넣고 68℃ 항온수조에서 1시간 동안 반응시킨 다음 3,000rpm으로 10분간 원심분리 한다. Cultivated cylindrocarpon dust luxant mycelium is collected in a PDA medium with tweezers, washed 2-3 times with sterile water to remove the mycelium medium components and freeze-dried. Lyophilized mycelia are crushed with liquid nitrogen and placed in sterile 50ml tubes and stored in the freezer. To 0.55 g of broken hyphae, add 10 ml (W / V) of lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 50 mM EDTA, pH 8.0; 3% sodium dodecyl sulfate; 1% 2-mercaptoethanol) After reacting for an hour, centrifuge for 10 minutes at 3,000 rpm.

원심분리한 균사의 상등액을 취하여 phenol/chloroform/isoamylalchol (25:24:1)과 chloroform/ isoamylalchol (24:1)을 순차적으로 1회씩 처리하는데, 처리할 때 마다 13,000rpm에서 10분간 원심분리 하여 다시 상층액을 취한다. 원심분리한 상등액을 같은량의 isopropanol을 첨가하여 12시간 이상 -20℃에 보관한다.Take the supernatant of the centrifuged hyphae and treat phenol / chloroform / isoamylalchol (25: 24: 1) and chloroform / isoamylalchol (24: 1) one by one, each time, and centrifuge at 13,000 rpm for 10 minutes. Take the supernatant. The supernatant centrifuged is added to the same amount of isopropanol and stored at -20 ℃ for at least 12 hours.

보관된 상층액을 13,000rpm에서 원심분리 하여 제1 게놈 DNA를 침전시킨다. 침전된 DNA는 70% ethanol 500㎕를 넣고 세척한 다음, 실온에서 완전히 건조시키고 RNas(50㎕/㎖)가 첨가된 TE buffer (10mM Tris-Cl, 1mM EDTA, pH 7.4) 1㎖에 충분히 녹인 후 37℃에 1시간 보관한다.The stored supernatant is centrifuged at 13,000 rpm to precipitate the first genomic DNA. Precipitated DNA was washed with 500 µl of 70% ethanol, dried thoroughly at room temperature, and dissolved in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.4) to which RNas (50 µl / ml) was added. Store at 37 ° C for 1 hour.

제2 단계: 토양시료에서 제2 게놈 DNA의 추출 단계Second Step: Extraction of Second Genomic DNA from Soil Sample

표 2의 지역에서 채취한 토양시료를 그늘진 곳에서 건조한 후, 상기 토양시료에서 제2 게놈 DNA를 추출한다. 여기서, 상기 제2 게놈 DNA의 추출은 예를 들어, Mobio Laboratories Inc의 Soil DNA kit 메뉴엘에 따라 수행될 수 있다.After drying the soil samples taken from the area of Table 2 in the shade, the second genomic DNA is extracted from the soil samples. Here, the extraction of the second genomic DNA may be performed according to, for example, Soil DNA kit Menuel of Mobio Laboratories Inc.

표 2. 본 발명에 사용된 토양시료의 채취장소 및 재배작물Table 2. Location and Cultivation of Soil Samples Used in the Present Invention

번호number 시료명Sample Name 균주 또는 채취 장소Strain or Collection Location 1One KF01KF01 Cylindrocarpon destructans 균사체-1 (positive control) Cylindrocarpon destructans mycelium-1 (positive control) 22 KF02KF02 Cylindrocarpon destructans 균사체-2 (positive control) Cylindrocarpon destructans mycelium-2 (positive control) 33 KF03KF03 Cylindrocarpon destructans 균사체-3 (positive control) Cylindrocarpon destructans mycelium-3 (positive control) 44 KF04KF04 Cylindrocarpon destructans 균사체-4 (positive control) Cylindrocarpon destructans mycelium-4 (positive control) 55 KF05KF05 Cylindrocarpon destructans 균사체-5 (positive control) Cylindrocarpon destructans mycelium-5 (positive control) 66 KS00KS00 경기 수원 인삼 재작지 토양-1 Gyeonggi Suwon Ginseng Reclaimed Soil-1 77 US-LUS-L 미국 뉴저지 잔디밭 토양 New Jersey Lawn Soil USA 88 US-MUS-M 미국 뉴저지 습지 토양 New Jersey Wetland Soil 99 KS01KS01 경기 수원 인삼 재작지 토양-2 Gyeonggi Suwon Ginseng Land Soil-2 1010 KS02KS02 경기 수원 인삼 재작지 토양-3 Gyeonggi Suwon Ginseng Reclaimed Soil-3 1111 KS03KS03 충북 음성 벼 재배 논토양(negative control) Negative Control of Eumseong Rice Plants in Chungbuk 1212 KS04KS04 충북 음성 야산 심토 Chungbuk voice yasan subsoil 1313 KS05KS05 충북 음성 인삼 재작지 토양 Chungbuk umseong ginseng land soil 1414 KS06KS06 충북 음성 토양 훈증살균 토양 Chungbuk negative soil fumigated soil 1515 KS07KS07 경기 수원 콩 경작지 토양 Suwon Soybean Cultivated Soil 1616 KS08KS08 경기 수원 옥수수 경작지 토양 Suwon Corn Field Soil 1717 KS09KS09 경기 수원 보리 경작지 토양 Suwon barley arable land soil 1818 KS10KS10 경기 수원 1년생 인삼 재배지 토양-1 Ginseng Planting Area Soil, Suwon, Gyeonggi-do, Korea 1919 KS11KS11 경기 수원 2년생 인삼 재배지 토양 Ginseng Planting Soil, Suwon, Gyeonggi-do 2020 KS12KS12 경기 수원 1년생 인삼 재배지 토양-2 Gyeonggi Suwon Annual Fresh Ginseng Plantation Soil-2 2121 KS13KS13 경기 수원 인삼 재작지 토양-4 Gyeonggi Suwon Ginseng Reclaimed Soil-4 2222 KS14KS14 경기 수원 벼 재배 논토양(negative control) Negative control of rice cultivation in Suwon, Gyeonggi-do

제 3단계: 프라이머를 이용하여 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편들을 증폭하는 단계Step 3: Amplifying fragments of the first and second genomic DNA using primers

DNA단편 증폭은 동일한 DNA 단편을 다수로 만드는 것이다. 여기서 복제 및 증폭하고자 하는 DNA단편을 한정하는 역할을 하는 것이 프라이머이다. DNA의 단편을 증폭하는 방법은 PCR(유전자증폭기술) 또는 '중합 효소 연쇄 반응법'이라고도 하며, 인위적으로 유전자를 증폭하는 방법이다. 예컨대, DNA증폭하는 방법은 ELISA-PCR, IMMUNO-PCR, SANDWICH-PCR, NESTED-PCR 방법등 본 발명에 다양하게 적용될 수 있다.DNA fragmentation amplifies multiple DNA fragments. Herein, primers serve to limit DNA fragments to be replicated and amplified. The method of amplifying a fragment of DNA is also called PCR (gene amplification technology) or 'polymerase chain reaction method', and is an artificial amplification method. For example, the DNA amplification method can be variously applied to the present invention, such as ELISA-PCR, IMMUNO-PCR, SANDWICH-PCR, NESTED-PCR method.

DNA증폭하는 방법은 프라이머 부분이 출발점이 되어 DNA가 복제되기 때문에 토양감염 진단을 수행하기 위해서는 진단용 프라이머가 필요하다. 따라서 토양감염 진단을 수행하기 위한 진단용 프라이머의 개발과정을 설명하고 구체적인 DNA증폭하는 방법을 설명한다.The DNA amplification method requires a primer for diagnosis in order to perform soil infection diagnosis because the primer is a starting point and the DNA is replicated. Therefore, it describes the development process of the diagnostic primer for the soil infection diagnosis and describes the specific DNA amplification method.

도 1은 본 발명의 예시적인 일 실시예에 의한 제1 서열, 제2 서열을 갖는 프라이머 개발 모식도이다.1 is a schematic diagram of a primer having a first sequence and a second sequence according to an exemplary embodiment of the present invention.

도 1를 참조하면, 본 발명의 실시예에 의한 토양감염 진단용 프라이머의 개발과정을 나타낸다. 진핵생물에서 ITS(internal transcribed spacer)는 28S LSU (제2 유전자), 5.8S(제 3유전자), 18S SSU (제1 유전자) ribosomal RNAs에 coding된다. Referring to Figure 1, it shows the development process of the soil infection diagnostic primer according to an embodiment of the present invention. In eukaryotes, the internal transcribed spacer (ITS) is encoded in 28S LSU (second gene), 5.8S (third gene), 18S SSU (first gene) ribosomal RNAs.

non-coding region의 염기서열은 coding된 유전자들을 분리하여 2가지의 ITS를 가진다. 즉, ITS-1은 18S 유전자 (small subunit rDNA)와 5.8S 유전자 사이에서 위치하고 ITS-2는 5.8 유전자와 28S 유전자 (large subunit rDNA) 사이에 위치하고 있다. 본 발명에서는 제1 유전자(18S SSU)와 제 3유전자(5.8S) 사이에 배치된 ITS-1 지역은 제1 DNA 단편을 가리키며 제2 유전자(28S LSU)와 제 3유전자(5.8S) 사이에 배치된 ITS-2 지역은 제2 DNA 단편을 가리킨다.The base sequence of the non-coding region has two ITSs separated from the encoded genes. That is, ITS-1 is located between 18S gene (small subunit rDNA) and 5.8S gene and ITS-2 is located between 5.8 gene and 28S gene (large subunit rDNA). In the present invention, the ITS-1 region disposed between the first gene (18S SSU) and the third gene (5.8S) indicates the first DNA fragment and is located between the second gene (28S LSU) and the third gene (5.8S). The placed ITS-2 region indicates the second DNA fragment.

한편, Fungal ribosomal RNA 유전자의 ITS(internal transcribed spacer) 영역(도 2)이 변이가 매우 크다. 변이가 큰 ITS영역을 이용하여 제1 게놈의 DNA단편 과 제2 게놈의 DNA단편을 선택적으로 증폭하는 프라이머를 개발하기 위해 1차 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested polymerase chain reaction, Nested PCR)을 실시할 수 있다.On the other hand, the variation of the internal transcribed spacer (ITS) region (FIG. 2) of the Fungal ribosomal RNA gene is very large. In order to develop primers that selectively amplify DNA fragments of the first genome and DNA fragments of the second genome using a large ITS region, a first nested polymerase chain reaction (NESTED polymerase chain reaction, Nested PCR) is performed. can do.

Nested PCR방식은 증폭하고자하는 타겟 유전자가 포함된 넓은 범위의 프라이머 세트로 먼저 증폭하고 증폭된 산물과 내부 프라이머를 이용하여 타겟 유전자를 다시 증폭하는 방식으로써 생명공학분야에 널리 사용되고 있다.Nested PCR is widely used in biotechnology as a method of first amplifying a wide range of primer sets containing target genes to be amplified and amplifying the target genes again using amplified products and internal primers.

예컨대, PCR buffer 및 사용량을 증류수 39.7㎕, Sigma 10X buffer(w/o 15mM MgCl2) 5㎕, 25mM MgCl2 3㎕, 25mM dNTP 0.2㎕, Sigma Taq polymerase 0.1㎕, 20μM ITS-1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G- 3′), 20μM ITS-4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3′), Template DNA 1㎕을 첨가하여 총 50㎕로 1차 Nested PCR을 할 수 있다. For example, 39.7 μl of PCR buffer and distilled water, 5 μl of Sigma 10X buffer (w / o 15mM MgCl 2), 3 μl of 25mM MgCl 2, 0.2 μm of 25mM dNTP, 0.1 μl of Sigma Taq polymerase, 20 μM ITS-1 (5′-TCC GTA) First nested PCR can be performed by adding 50 μl of GGT GAA CCT GCG G-3 ′), 20 μM ITS-4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3 ′), and 1 μl of template DNA.

PCR 조건은 PE 2700 PCR machine, USA를 이용하여 Initialization step (94℃, 5분), Denaturation step (94℃, 20초), Annealing step (55℃, 1분), Extension/elongation step (72℃, 1분)을 35 cycles 수행하고 Final elongation (72℃, 7분), Final hold (4℃, ∞)로 할 수 있다. The PCR conditions were PE 2700 PCR machine, USA using Initialization step (94 ℃, 5 minutes), Denaturation step (94 ℃, 20 seconds), Annealing step (55 ℃, 1 minute), Extension / elongation step (72 ℃, 1 cycle), 35 cycles, Final elongation (72 ℃, 7 minutes), Final hold (4 ℃, ∞).

1차 PCR 후 PCR 산물을 다음과 같이 정제할 수 있다. 정제된 PCR산물은 먼저 1.5㎖ tube를 준비하고 50㎕의 PCR 산물에 3M NaOAc (pH 5.2)을 1/10배 volume 즉, 5㎕을 넣고 2배 volume 즉, 100㎕의 차가운 100% EtOH를 넣고 혼합한다. 상기 혼합물을 -20℃에서 10분간 보관한다. After the first PCR, the PCR product can be purified as follows. The purified PCR product is prepared by first preparing a 1.5 ml tube and adding 50 ml of 3M NaOAc (pH 5.2) to 1 / 10-fold volume, that is, 5µl, and adding 2-fold volume, 100µl of cold 100% EtOH. Mix. The mixture is stored at -20 ° C for 10 minutes.

10분후, 혼합물을 4℃, 5분간, 10,000 ×g으로 원심분리하고 상등액은 버린 다. 분리된 혼합물에 70% EtOH를 120㎕ 넣고 혼합한다. 혼합물을 4℃에서 5분간, 10,000 ×g로 원심분리하고 상등액은 버린다. 분리된 혼합물을 공기로 건조시켜 남아있는 용액을 완전히 건조시킨다. 상기 건조된 물질을 20㎕ D.W.에 녹인 후 -20℃에 보관하면 제1 DNA와 제2 DNA 게놈만을 복제하는 토양감염 진단용 프라이머를 얻을 수 있다. 상기에서 얻어진 토양감염 진단용 프라이머의 제1 서열은 5‘-GTGCCTGYTTCGGCAGC-3'를 포함하며, 제2 서열은 5‘-CTGTTTYCCAGTGCGAGGTGTGC-3'을 포함한다.After 10 minutes, the mixture is centrifuged at 10,000 x g for 5 minutes at 4 ° C and the supernatant is discarded. 120 µl of 70% EtOH is added to the separated mixture and mixed. The mixture is centrifuged at 10,000 x g for 5 minutes at 4 ° C and the supernatant is discarded. The separated mixture is dried with air to completely dry the remaining solution. The dried material is dissolved in 20 μl D.W. and stored at −20 ° C. to obtain a primer for diagnosing soil infection that replicates only the first DNA and the second DNA genome. The first sequence of the soil infection diagnostic primers obtained above includes 5′-GTGCCTGYTTCGGCAGC-3 ′ and the second sequence includes 5′-CTGTTTYCCAGTGCGAGGTGTGC-3 ′.

상기 방법으로 개발된 토양감염 진단용 프라이머와 제1 및 제2 게놈 DNA를 포함하는 유전자를 함께 2차 Nested PCR을 수행하여 제1 및 제2 게놈 DNA만을 선택적으로 증폭할 수 있다.Soil infection diagnostic primers developed by the above method and genes including the first and second genomic DNA together may be subjected to a second nested PCR to selectively amplify only the first and second genomic DNA.

예컨대, PCR buffer 및 사용량을 증류수 14.65㎕, Sigma 10X buffer(w/o 15mM MgCl2) 2㎕, 25mM MgCl2 1.2㎕, 25mM dNTP 0.1㎕, Sigma Taq polymerase 0.05㎕, Template DNA 1㎕, 그리고 20μM 제1 서열과 제2 서열을 각각 0.5㎕, 첨가하여 총 50㎕로 2차 Nested PCR을 할 수 있다. For example, 14.65 μl of PCR buffer and distilled water, 2 μl of Sigma 10X buffer (w / o 15 mM MgCl 2), 1.2 μl of 25mM MgCl 2, 0.1 μl of 25mM dNTP, 0.05 μl of Sigma Taq polymerase, 1 μl of Template DNA, and 20 μm of the first sequence The second nested PCR can be performed by adding 50 [mu] l and the second sequence, respectively, and 50 [mu] l in total.

PCR 조건은 PE 2700 PCR machine, USA를 이용하여 Initialization step (94℃, 3분), Denaturation step (94℃, 20초), Annealing step (65℃, 30초), Extension/elongation step (72℃, 30초)을 35 cycles 수행하고 Final elongation (72℃, 7분), Final hold (4℃, ∞)로 할 수 있다. PCR conditions were PE 2700 PCR machine, USA using Initialization step (94 ℃, 3 minutes), Denaturation step (94 ℃, 20 seconds), Annealing step (65 ℃, 30 seconds), Extension / elongation step (72 ℃, 30 cycles), 35 cycles, Final elongation (72 ℃, 7 minutes), Final hold (4 ℃, ∞).

상기 제1 서열과 제2 서열을 포함하는 프라이머를 제1 게놈 DNA와 제2 게놈 DNA를 조합하여 Nested PCR을 수행하면 복제하고자 하는 제1 및 제2 DNA단편을 증 폭할 수 있다. When the primers including the first sequence and the second sequence are combined with the first genomic DNA and the second genomic DNA, nested PCR may amplify the first and second DNA fragments to be replicated.

본 발명의 실시예에서는, 상기 제1 및 제2 게놈DNA의 단편들을 동시에 증폭하는 것으로 설명하였으나, 이와 다르게 상기 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편들을 분리해서 별도로 증폭시킬 수 있다.In the exemplary embodiment of the present invention, the fragments of the first and second genomic DNAs are simultaneously amplified. Alternatively, the fragments of the first and second genomic DNAs may be separated and amplified separately.

제 4단계: 증폭된 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편들을 비교하여 감염여부 진단하는 단계Step 4: Diagnosing Infection by Comparing Fragments of Amplified First and Second Genomic DNAs

도 2는 도 1의 프라이머를 이용하여 제1 및 제2 게놈을 증폭한 후의 전기 영동사진이다.FIG. 2 is an electrophoretic photograph after amplifying the first and second genomes using the primer of FIG. 1.

도 2을 참조하면, 토양감염여부는 식물뿌리의 뿌리썩음병원균 균사로부터 분리된 제1 게놈DNA단편과 토양시료에서 분리된 제2 게놈DNA단편을 증폭후 전기영동 사진으로 비교한다. Referring to FIG. 2, the soil infection is compared with the first genomic DNA fragment separated from the root rot pathogen mycelia of the plant root and the second genomic DNA fragment separated from the soil sample by electrophoresis after amplification.

토양이 감염된 경우, 토양시료에서 추출한 제2 게놈DNA의 전기영동 결과 데이터가 식물뿌리의 뿌리썩음병원균 균사의 제1 게놈DNA의 전기영동 결과와 동일한 367bp의 DNA 단편을 얻을 수 있다.When the soil is infected, a DNA fragment of 367bp with the result of electrophoresis of the second genomic DNA extracted from the soil sample is the same as the result of electrophoresis of the first genomic DNA of the root rot pathogen mycelia of the plant root.

번호 1~5는 식물뿌리의 뿌리썩음병원균 균사로부터 검출된 분자마커(positive control) 사진이다. 번호 6~22는 토양시료이며, 이중 11, 22는 오직 벼만 재배했던 논토양으로써 반드시 분자마커가 검출되지 않은 토양시료(negative control)이다. 번호 6, 9, 10, 13, 17, 19, 21은 식물뿌리의 뿌리썩음병원균 균사로부터 감염된 토양시료의 분자마커이다. Numbers 1 to 5 are photographs of the molecular markers detected from the root rot pathogen mycelia of the plant root. Nos. 6-22 are soil samples, 11 and 22 of which are paddy soils grown only with rice, and which are not necessarily molecular markers. Nos. 6, 9, 10, 13, 17, 19 and 21 are molecular markers of soil samples infected from mycelial root rot fungi mycelia of plant roots.

도 3은 본 발명의 예시적인 일 실시예에 의한 식물뿌리 뿌리썩음병원균 균사, 실린드로카폰 더스트럭턴스(Cylindrocarpon Destructans)의 ITS 부위의 염기서열을 나타내는 도면이다.Figure 3 is a view showing the nucleotide sequence of the plant root root rot pathogen hyphae, Cylindrocarpon Destructans (Cylindrocarpon Destructans) according to an exemplary embodiment of the present invention.

도 3를 참조하면, KS02와 KS09의 뿌리썩음병원균 균사에 감염된 토양시료에서 분석된 ITS 염기서열과 기존에 보고된 Cylindrocarpon. destructans var. Crassum 및 C. destructans f. panacis의 염기서열 분석데이터를 비교해 보면 매우 높은 상동성을 갖는다. 상동성이 높은 경우는 식물의 뿌리썩음병원균 균사중 실린드로카폰 디스트럭턴스의 발병상태가 나타난다. 따라서 본 발명으로 개발된 프라이머의 제1 서열과 제2 서열은 토양시료에서 실린드로카폰 더스트럭턴스를 정확히 검출할 수 있다는 것을 예시적으로 보여준다. Referring to Figure 3, ITS sequences analyzed in soil samples infected with root rot pathogen mycelia of KS02 and KS09 and Cylindrocarpon previously reported. destructans var. Crassum and C. destructans f. Comparing the sequence analysis data of panacis has very high homology. High homology results in the development of cylindrocarpon distractance in the root rot pathogen mycelia of plants. Therefore, the first sequence and the second sequence of the primer developed according to the present invention shows that it is possible to accurately detect the cylinder carbon dust lumps in soil samples.

도 4는 본 발명의 실시예에 의한 식물뿌리의 뿌리썩음병원균 균사 중 실린드로카폰 더스트럭턴스에 감염된 토양시료로 부터 추출된 DNA의 전기영동 사진이다. Figure 4 is an electrophoresis picture of DNA extracted from a soil sample infected with Cylindrocarpon dust lumps among the root rot pathogens mycelia of the plant root according to an embodiment of the present invention.

도 4를 참조하면, 토양시료가 식물뿌리의 뿌리썩음병원균 균사중 실린드로카폰 더스트럭턴스에 감염되었는지 여부는 토양시료에서의 미생물로부터 제2 게놈의 DNA를 추출하여 상기 방법에 따라 증폭 및 전기영동한 실험 결과와 도 4를 비교하여 토양감염 여부를 진단할 수도 있다. Referring to Figure 4, whether or not the soil sample is infected with Cylindro carpon dust in the root rot pathogen mycelia of the plant root whether the amplification and electrophoresis according to the method by extracting the DNA of the second genome from the microorganism in the soil sample It is also possible to diagnose the soil infection by comparing the results of the experiment with FIG.

앞서 설명한 본 발명의 상세한 설명에서는 본 발명의 바람직한 실시예들을 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 숙련된 당업자 또는 해당 기술분야에 통상의 지식을 갖는 자라면 후술될 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 기술 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 설명 및 아래의 도면은 본 발명의 기술사상을 한정하는 것이 아닌 본 발명을 예시하는 것으로 해석되어져야 한다.In the detailed description of the present invention described above with reference to the preferred embodiments of the present invention, those skilled in the art or those skilled in the art having ordinary skill in the art will be described in the claims to be described later And various modifications and variations of the present invention without departing from the scope of the art. Therefore, the above description and the drawings below should be construed as illustrating the present invention, not limiting the technical spirit of the present invention.

도 1은 본 발명의 예시적인 일 실시예에 의한 제1 서열, 제2 서열을 갖는 프라이머 개발 모식도이다.1 is a schematic diagram of a primer having a first sequence and a second sequence according to an exemplary embodiment of the present invention.

도 2는 도 1의 프라이머를 이용하여 제1 및 제2 게놈을 증폭한 후의 전기 영동 사진이다.FIG. 2 is an electrophoretic photograph after amplifying the first and second genomes using the primer of FIG. 1.

도 3은 본 발명의 예시적인 일 실시예에 의한 식물뿌리 뿌리썩음병원균 균사중 실린드로카폰 더스트럭턴스의 ITS 부위의 염기서열을 나타내는 도면이다.Figure 3 is a view showing the nucleotide sequence of the ITS site of the Cyclodochropon dust in the plant root root rot pathogen mycelia according to an exemplary embodiment of the present invention.

도 4는 본 발명의 예시적인 일 실시예에 의한 식물뿌리 뿌리썩음병원균 균사 중 실린드로카폰 더스트럭턴스에 감염된 토양시료로부터 추출된 DNA의 전기영동 사진이다.Figure 4 is an electrophoretic picture of the DNA extracted from the soil samples infected with Cylindro carpon dust lumps of plant root root rot pathogen mycelia according to an exemplary embodiment of the present invention.

Claims (14)

식물뿌리에서의 뿌리썩음병원균 균사(Cylindrocarpon Destructans)로부터 제1 게놈 DNA를 추출하는 단계;Extracting a first genomic DNA from Cylindrocarpon Destructans in plant roots; 토양시료에서의 미생물로부터 제2 게놈 DNA를 추출하는 단계;Extracting a second genomic DNA from the microorganism in the soil sample; ITS-1과 ITS-4 프라이머를 이용하여 상기 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편을 증폭하는 단계;Amplifying the fragments of the first and second genomic DNA using ITS-1 and ITS-4 primers; 상기 제1 및 제2 게놈 DNA에서의 제1 유전자와 대응되는 5‘-GTGCCTGYTTCGGCAGC-3'을 포함하는 제1 서열과, 상기 제1 및 제2 게놈 DNA에서의 제2 유전자와 대응되는 5‘-CTGTTTYCCAGTGCGAGGTGTGC-3'을 포함하는 제2 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 각각 제1 및 제2 유전자들 사이에 배치된 상기 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편을 증폭하는 단계; 및A first sequence comprising 5′-GTGCCTGYTTCGGCAGC-3 ′ corresponding to a first gene in the first and second genomic DNA, and 5′- corresponding to a second gene in the first and second genomic DNA Amplifying a fragment of said first and second genomic DNA disposed between the first and second genes, respectively, using a primer comprising a second sequence comprising CTGTTTYCCAGTGCGAGGTGTGC-3 '; And 증폭된 상기 제1 및 제2 게놈 DNA들의 단편들을 서로 비교하여, 상기 토양시료가 상기 뿌리썩음병원균 균사(Cylindrocarpon Destructans)에 감염되었는지 여부를 진단하는 단계를 포함하는 토양감염 진단방법.Comparing the amplified fragments of the first and second genomic DNAs with each other to diagnose whether the soil sample is infected with the Cylindrocarpon Destructans. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편들을 증폭하는 단계는 The method of claim 1, wherein amplifying the fragments of the first and second genomic DNAs 서로 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 토양감염 진단방법.Soil infection diagnostic method characterized in that performed at the same time with each other. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편들의 증폭은The method of claim 1, wherein the amplification of the fragments of the first and second genomic DNA is 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested polymerase chain reaction, nested PCR)을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 토양감염 진단방법.Soil infection diagnostic method characterized in that through the nested polymerase chain reaction (nested polymerase chain reaction, nested PCR). 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 게놈 DNA의 단편들 각각은The method of claim 1, wherein each of the fragments of the first and second genomic DNA is 상기 제1 유전자와 제3 유전자 사이에 배치된 제1 DNA 단편; 및A first DNA fragment disposed between the first gene and a third gene; And 상기 제3 유전자와 상기 제2 유전자 사이에 배치된 제2 DNA 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 토양감염 진단방법.Soil infection diagnostic method comprising a second DNA fragment disposed between the third gene and the second gene. 제5항에 있어서, 상기 제1 DNA 단편은 ITS-1 영역(Internal transcribed spacer- 1)에 배치되고,The method of claim 5, wherein the first DNA fragment is disposed in the internal transcribed spacer-1, ITS-1 region, 상기 제2 DNA 단편은 ITS-2 영역(Internal transcribed spacer- 2)에 배치된 것을 특징으로 하는 토양감염 진단방법.The second DNA fragment is a soil infection diagnostic method, characterized in that disposed in the ITS-2 region (Internal transcribed spacer-2). 제5항에 있어서, 상기 제1 유전자는 18S SSU rDNA(small subunit rDNA)을 포함하고,The method of claim 5, wherein the first gene comprises 18S SSU rDNA (small subunit rDNA), 상기 제2 유전자는 28S LSU rDNA(large subunit rDNA)을 포함하며,The second gene comprises a 28S LSU rDNA (large subunit rDNA), 상기 제3 유전자는 5.8S rDNA을 포함하는 것을 특징으로 하는 토양감염 진단방법.The third gene is soil infection diagnostic method characterized in that it comprises 5.8S rDNA. 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 식물뿌리는 인삼뿌리를 포함하는 것을 특징으로 하는 토양감염 진단방법.The method of claim 1, wherein the plant root comprises ginseng roots. 식물뿌리에서의 뿌리썩음병원균 균사(Cylindrocarpon Destructans) 또는 토양시료로부터 추출된 게놈 DNA의 단편을 한정하기 위한 상기 게놈 DNA에서의 제1 유전자와 대응되며 5‘-GTGCCTGYTTCGGCAGC-3'을 포함하는 제1 서열과 상기 게놈 DNA에서의 제2 유전자와 대응되며 5‘-CTGTTTYCCAGTGCGAGGTGTGC-3'을 포함하는 제2 서열을 포함하며, 상기 게놈 DNA의 단편은 상기 제1 및 제2 유전자들 사이에 배치된 DNA인 것을 특징으로 하는 토양감염 진단용 프라이머.A first sequence corresponding to a first gene in said genomic DNA for defining fragments of Cylindrocarpon Destructans from plant roots or fragments of genomic DNA extracted from soil samples and comprising 5'-GTGCCTGYTTCGGCAGC-3 ' And a second sequence corresponding to a second gene in the genomic DNA and comprising 5′-CTGTTTYCCAGTGCGAGGTGTGC-3 ′, wherein the fragment of genomic DNA is DNA disposed between the first and second genes. Soil infection diagnostic primers. 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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Applied & Envirommental Microbiol., 제62권, 제11호, 제4026-4031면(1996)*

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