KR101094309B1 - Method for the production of particles with targeting ability by enzyme synthesis - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특정 세포에 선택적으로 결합하는 조형제 및 약물전달용 입자의 제조방법에 관한 것으로, 특정 리간드와 융합된 PHA 합성효소를 통해 합성된 생분해성, 생체호환성 PHA는 이를 합성한 PHA 합성효소와 블록공중합체를 형성하고, 이들이 가지는 양친매성 특성에 따라 자기조립 과정을 통해 나노입자를 만들게 되며, 이는 암세포 등의 신체 특정 세포에 선택적으로 결합하는 표적능이 부여된 나노입자를 간단하게 제작하는 방법으로 조형제 및 약물전달용 나노입자를 제조하는데 적용할 수 있다.The present invention relates to a preparation agent for selectively binding to a specific cell and a method for preparing a particle for drug delivery, wherein the biodegradable, biocompatible PHA synthesized through a PHA synthetase fused with a specific ligand, blocks with the PHA synthetase The copolymer is formed and nanoparticles are made through self-assembly according to the amphipathic properties of them, which is a simple method of preparing nanoparticles to which target ability to selectively bind specific cells of the body such as cancer cells. And nanoparticles for drug delivery.

DDS, PHA, PHB, Integrin, RGD4C, 나노, 암세포, 약물전달, 입자, 표적 DDS, PHA, PHB, Integrin, RGD4C, Nano, Cancer Cell, Drug Delivery, Particle, Target

Description

효소합성에 의한 표적지향형 입자의 제조방법 {Method for the production of particles with targeting ability by enzyme synthesis}{Method for the production of particles with targeting ability by enzyme synthesis}

본 발명은 암세포 등의 특정 세포에 선택적으로 결합하여 약물 전달 및 치료의 목적으로 사용할 수 있는 입자의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing particles which can be selectively bound to specific cells such as cancer cells and used for the purpose of drug delivery and treatment.

약물전달시스템(drug delivery system, DDS)은 약리학적으로 활성을 갖는 물질을 다양한 물리화학적 기술을 이용하여 최적의 효력을 발휘하도록 세포, 조직, 장기 및 기관으로의 전달을 제어하는 일련의 기술로 정의된다. Drug delivery system (DDS) is defined as a series of technologies that control the delivery of pharmacologically active substances to cells, tissues, organs and organs for optimal efficacy using various physicochemical techniques. do.

약물전달시스템 기술의 적용 대상 물질은 소분자 합성화합물을 비롯하여 펩타이드, 단백질, 항체, 치료용 DNA, siRNA, 바이러스 및 세포 등의 거대분자 화합물인데, 주로 항암 연구에 많이 활용되고 있으며, 최근에는 유기 또는 무기화합물의 세포 또는 조직으로의 전달을 통한 분자생물학적 기초연구에까지 응용이 확대되고 있다 .Substances to be applied to drug delivery system technology include small molecule synthetic compounds, macromolecular compounds such as peptides, proteins, antibodies, therapeutic DNA, siRNAs, viruses, and cells, and are mainly used for anticancer research. Applications are expanding to basic molecular biology research through the delivery of compounds to cells or tissues.

약물전달시스템에서 전달체로는 폴리에틸렌글리콜(polyetheleneglycol, PEG), 폴리락타이드(polylactide, PLA), 폴리락티드코글리콜리드 (polylactidecoglycolide, PLAG), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide PEO) 등 이 많이 사용되는데, 이들은 단핵구와 대식세포에 의한 면역반응을 일으키지 않기 때문에 장기간 약효를 지속하게 하는 방법으로써 각광받고 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌옥사이드(PEO)와 결합한 폴리카프로락톤(poly-ε-carprolacone, PCL) 이용하여 타목시펜(Tamoxifen)을 유방암 세포에 성공적으로 표적화한 연구와 PEO-PCL를 이용하여 탁솔(Taxol)과 세리미드(cerimide)를 접합시켜 난소암에 효과적으로 표적화한 보고가 있다. In the drug delivery system, polyethylene glycol (polyetheleneglycol (PEG), polylactide (PLA), polylactide coglycolide (PLA), polyethylene oxide (PEO), etc. are frequently used. Since it does not cause an immune response by monocytes and macrophages, it has been in the spotlight as a method of sustaining long-term effects. For example, studies have successfully targeted Tamoxifen to breast cancer cells using poly-ε-carprolacone (PCL) combined with polyethylene oxide (PEO), and Taxol and PEO-PCL. There have been reports of effective targeting of ovarian cancers by conjugating cerimide.

또한, 고분자 나노 물질로 마이셀, 리포좀과 같은 나노 전달체를 생성하여 생체 내에서 농도 차이에 의한 확산과 생체 내에서 고분자의 분해에 따른 약물 방출로 약물이 체내에 지속적으로 전달되게 하는 방식에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다. 대표적으로, 독실(Doxil)은 리포좀과 PEG을 이용하여 비수용성 약물의 용해도를 높이고 천천히 방출되도록 만든 주사제 항암제이며, AIDS 관련 카포시 육종(AIDS-related Kaposi sarcoma)에 처음으로 사용되었고, 현재 난소암과 다양한 골수종에 사용되고 있다. 이는 독소루비신(doxorubicin) 보다 체내에서 순환되는 반감기가 100배 정도 길며, 임상적으로는 독소루비신(doxorubicin)이 가지고 있는 심장 독성을 줄여주는 장점을 가지고 있다.In addition, researches on the method of continuously delivering drugs into the body by producing nano-carriers such as micelles and liposomes with polymer nanomaterials and proliferating due to the difference in concentration in the living body and releasing the drug due to the decomposition of the polymer in vivo. It is actively underway. Representatively, Doxil is an injection anticancer drug that uses liposomes and PEG to increase the solubility and slow release of non-aqueous drugs, and was first used in AIDS-related Kaposi sarcoma. It is used in various myeloma. It has a half-life that circulates in the body 100 times longer than doxorubicin, and clinically has the advantage of reducing the cardiotoxicity of doxorubicin.

한편, 나노전달체를 원하는 부위에만 이동시켜 생체의 다른 부위에 대한 부작용을 최소화하고, 그 효율성을 극대화하기 위해서는 나노 입자의 크기. 나노 입자의 표면의 특성 등을 고려하여 적절하게 변형, 조절하여 이용하는 것이 중요한데, 암 세포에 대한 표적화가 많이 연구되어 있으며, EPR(enhanced permeability and retention effect) 효과에 의한 수동적 약물 전달과 특정 물질을 표적으로 하 여 약물을 전달하는 능동적 약물 전달이 있다. On the other hand, by moving the nanocarrier to only the desired area to minimize side effects on other parts of the body, in order to maximize the efficiency of the size of the nanoparticles. It is important to appropriately modify and control the surface of the nanoparticles in consideration of the characteristics of the surface of the nanoparticles. Targeting of cancer cells has been studied a lot, and passive drug delivery and specific targets by EPR (enhanced permeability and retention effect) are targeted. There is active drug delivery to deliver drugs.

암조직을 표적화하기 위한 표적물질로는 펩타이드, 단백질 항체 등이 있는데, 표적화된 나노 입자가 암세포에 축적되고, 약물의 흡수를 증진시킨다는 결과가 보고된 바 있다.Targets for targeting cancer tissues include peptides, protein antibodies and the like. Targeted nanoparticles accumulate in cancer cells and have been reported to enhance drug absorption.

이상에서 살펴본 바와 같이, 나노 입자는 작은 사이즈로 인한 뛰어난 흡수성과 용해성, 그리고 이동성으로 말미암아 약물 전달체로 응용 가능성이 아주 높으며, 암세포와 결합하는 특정 리간드나 수용체(receptor)와 결합하는 물질을 나노 입자 표면에 도입하여 표적 기능을 부여할 수도 있다. As described above, nanoparticles are highly applicable as drug carriers due to their excellent absorption, solubility, and mobility due to their small size, and the surface of nanoparticles is formed by binding a specific ligand or receptor that binds to cancer cells. It can also be introduced into to impart a target function.

또한, 특정한 환경에서 장착된 물질이나 성분 등을 전달할 수 있는 감응성 스마트 전달체로의 개발도 가능하며, 이 경우 적은 양으로도 높은 효과를 낼 수 있는 장점이 있다. In addition, it is possible to develop a sensitive smart delivery device that can deliver materials or components mounted in a specific environment, in this case, there is an advantage that can produce a high effect in a small amount.

이에 본 발명은 암세포 등의 특정 세포에 선택적으로 결합하는 특정 리간드를 도입한 입자를 제작하여 약물전달 및 치료의 수단을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a means for drug delivery and treatment by preparing particles incorporating specific ligands that selectively bind to specific cells such as cancer cells.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질을 N-말단 또는 C-말단에 융합시킨 폴리히드록시알카노에이트 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase; PHA synthase)를 3-히드록시알카노일 CoA(3-hydroxyalkanoyl CoA)를 함유하는 기질 용액에 첨가하여 반응시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 세포에 특이적으로 결합하는 약물전달용 입자의 제조방법 및 이 방법에 의해 제조된 약물전달용 입자를 제공한다(도 2a~2d 참조). In order to achieve the above object, the present invention is a 3-hydroxy polyhydroxyalkanoate synthase (PHA synthase) in which a peptide or protein that specifically binds to a cell is fused to an N-terminus or a C-terminus. A method for preparing drug delivery particles specifically binding to cells, characterized in that it is prepared by adding and reacting to a substrate solution containing hydroxyalkanoyl CoA (3-hydroxyalkanoyl CoA) and for drug delivery prepared by the method Provide particles (see FIGS. 2A-2D).

본 발명에서 제조되는 약물전달용 입자에 있어 기본 골격(back bone)을 형성하는 구조체는 PHA(Polyhydroxyalkanoate)인데, 이 물질은 3-히드록시부티릴 CoA(3-hydroxyalkanoyl CoA)를 기질로 하고, 폴리히드록시부티레이트 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase; PHA synthase)를 첨가하여 반응시킴으로써 제조된다. In the drug delivery particles prepared in the present invention, the structure forming the back bone is PHA (Polyhydroxyalkanoate), which is 3-hydroxybutyryl CoA (3-hydroxyalkanoyl CoA) as a substrate, It is prepared by adding and reacting hydroxybutyrate synthase (polyhydroxyalkanoate synthase; PHA synthase).

PHA는 미생물이 탄소원과 에너지원으로 세포질 내에 축적하는 물질로서 플라스틱과 비슷한 물성을 가지고 있다. 물성은 합성에 사용된 모노머(monomer)의 사이드 체인(side chain) 길이에 따라 결정되고, 사이드 체인의 길이기 길수록 부드러 운 물성을 나타낸다. 이 물질의 가장 중요한 특성은 플라스틱과 같은 물성을 보이면서도 자연계에 존재하는 효소에 의하여 완전히 분해되는 특성인데, 그로 말미암아 친환경물질로 주목받고 있으며, 우리 몸속에서 특별한 거부반응을 일으키지 않는 생체호환성이 있다. 이러한 생분해성 및 생체 호환성 특성으로 인해 PHA는 의학계에서 많은 관심을 받고 있다. PHA is a material that microorganisms accumulate in the cytoplasm as a carbon and energy source and has properties similar to those of plastics. Physical properties are determined by the length of the side chain of the monomer used in the synthesis, and the longer the length of the side chain, the softer the physical properties. The most important property of this material is its physical properties such as plastics, but it is completely decomposed by enzymes in nature. It is attracting attention as an environmentally friendly material, and it has biocompatibility that does not cause special rejection in our body. Due to these biodegradable and biocompatible properties, PHAs are of great interest in the medical community.

PHA의 일 예로는 PHB(Polyhydroxybutyrate)가 있는데, 이 물질은 PHA 중 가장 많이 연구되고 있는 물질이다. PHB는 랄스토니아 유트로푸스(Ralstonia eutrophus) 또는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)과 같은 미생물에 의해 생산되며, 영양적 스트레스 조건에서 생성된다. PHB는 현재 많이 합성되는 미생물 분해성 중합체 PLA(Poly Lactic Acid)와 PLGA(Poly lactide-co-glycolide)보다 구조가 간단하지만, 훨씬 더 늦은 속도로 분해되며, 이러한 생분해적 특성 때문에 약물 전달체로서 훌륭한 역할을 할 수 있다. One example of PHA is polyhydroxybutyrate (PHB), which is the most studied of PHAs. PHB is Ralstonia eutrophus) MEGATHERIUM or Bacillus (Bacillus megaterium ) Produced by the same microorganism and produced under nutrient stress conditions. PHB is simpler in structure than the currently synthesized biodegradable polymers, Poly Lactic Acid (PLA) and Poly lactide-co-glycolide (PLGA), but degrades at a much slower rate, and because of its biodegradable properties, PHB plays an excellent role as a drug carrier. can do.

또한, PHB의 분해산물인 R-3-히드록시부티레이트(R-3-hydroxybutyrate)는 고등동물의 체내에서 흔히 발견되는 대사중간산물이며, 혈액 내에 0.3~1.3Mm 정도로 존재하며, 세포막에도 존재하는 물질로 알려져 있는데, 이로 말미암아 그 전구체인 PHB의 안전성은 이미 증명되었다고 볼 수 있다. In addition, R-3-hydroxybutyrate, a degradation product of PHB, is a metabolite that is commonly found in the body of higher animals, and is present in the blood membrane and is present in the cell membrane. It is known that the safety of its precursor PHB has already been demonstrated.

본 발명에서 사용되는 폴리히드록시부티레이트 합성효소는 PHB를 합성하는 효소로서, 기질 특이성을 가지고 있고, 기질만 있으면 다른 요소 없이 PHB를 합성하는 특징이 있다. 도 1은 PHB 합성효소가 3-히드록시부티릴 CoA로부터 PHB를 합성하는 반응을 보여준다.The polyhydroxybutyrate synthetase used in the present invention is an enzyme for synthesizing PHB, has a substrate specificity, and has a feature of synthesizing PHB without other elements as long as it has a substrate. 1 shows the reaction of PHB synthase to synthesize PHB from 3-hydroxybutyryl CoA.

본 발명에서는 세포와 결합할 수 있는 리간드로 세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질를 사용하는데, 이 리간드는 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. In the present invention, a peptide or protein that specifically binds to a cell is used as a ligand capable of binding to a cell, and the ligand is fused to the N-terminus or C-terminus of a polyhydroxyalkanoate synthase.

한편, 본 발명에서 세포는 일 예로 암세포일 수 있는데, 본 발명에서 암세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질은, 일 예로 암세포에 특이적으로 결합하는 활성 부위로 RGD(Arg-Gly-Asp)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 암세포에 특이적으로 결합하는 활성 부위로 NGR(Asn-Gly-Arg)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, VEGI(vascular endothelial growth inhibitor), 트롬보스포딘스(Thrombospondins), 안지오스타틴(Angiostatin), 엔도스타틴(Endostatin), 바소스타틴(Vasostatin) 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. Meanwhile, in the present invention, the cell may be, for example, a cancer cell. In the present invention, the peptide or protein that specifically binds to the cancer cell is, for example, an RGD (Arg-Gly-Asp) as an active site that specifically binds to the cancer cell. Peptides comprising amino acid sequence, Peptides containing amino acid sequence of Asn-Gly-Arg (NGR) as an active site that specifically binds to cancer cells, vascular endothelial growth inhibitor (VEGI), Thrombospondins, Angiostatin (Angiostatin), endostatin (Endostatin), Bassostatin (Vasostatin) may be any one selected from.

암세포에 특이적으로 결합하는 활성 부위로 RGD(Arg-Gly-Asp)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 암세포에 특이적으로 결합하는 활성 부위로 NGR(Asn-Gly-Arg)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 암세포에 특이적으로 결합하는 활성 부위의 아미노산 서열이 RGD(Arg-Gly-Asp) 또는 NGR(Asn-Gly-Arg)인 펩타이드로서, 각 아미노산의 N-말단 또는 C-말단에는 다른 아미노산이 추가적으로 연결되어 구성될 수 있다. A peptide containing the amino acid sequence of RGD (Arg-Gly-Asp) as an active site that specifically binds to cancer cells or an amino acid sequence of Asn-Gly-Arg (AGR) as an active site that specifically binds to cancer cells Peptides are peptides in which the amino acid sequence of an active site that specifically binds to cancer cells is RGD (Arg-Gly-Asp) or NGR (Asn-Gly-Arg), and at the N- or C-terminus of each amino acid, It can be further connected.

암세포에 특이적으로 결합하는 활성 부위로 RGD(Arg-Gly-Asp)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 'RGD 모티브(motif) 펩타이드'로 불리기도 하며, 암세포에 특이적으로 결합하는 활성 부위로 NGR(Asn-Gly-Arg)의 아미노산 서열을 포함하 는 펩타이드는 'NGR 모티프(motif) 펩타이드'로 불리기도 한다. Peptides comprising the amino acid sequence of RGD (Arg-Gly-Asp) as an active site that specifically binds to cancer cells are also called 'RGD motif peptides', and NGR as an active site that specifically binds to cancer cells Peptides comprising the amino acid sequence of (Asn-Gly-Arg) are also called 'NGR motif peptides'.

RGD 모티브 펩타이드는 암세포의 신생혈관생성(tumor angiogenesis), 렌탈 신생혈관생성(rental angiogenesis), 골다공증 억제제로서 유망하여 약물 전달 시스템에서 유용하게 사용되고 있는데[Holig, P., Bach, M., Volkel, T., Nahde, T., Hoffmann, S., Muller, R., Kontermann, R. Protein Engineering. 2004, 17(5)], 신생혈관생성에서 종양으로부터 과발현되는 단백질인 인테그린(integrin)과 특이적으로 결합한다. RGD motif peptides are promising as cancer inhibitors in tumor angiogenesis, rental angiogenesis, and osteoporosis inhibitors and are useful in drug delivery systems [Holig, P., Bach, M., Volkel, T. ., Nahde, T., Hoffmann, S., Muller, R., Kontermann, R. Protein Engineering. 2004, 17 (5)], specifically binds to integrin, a protein that is overexpressed from tumors in angiogenesis.

인테그린은 α-서브유닛(140-180Kd)과 β-서브유닛(약 95Kd)으로 구성된 헤테로다이머(heterodimer)이며, 25종의 인테그린이 알려져 있다. Integrins are heterodimers composed of α-subunits (140-180Kd) and β-subunits (about 95Kd), and 25 types of integrins are known.

RGD 펩타이드는 인테그린에 결합하는 이차 구조를 가지고 있으나, RGD 주변의 아미노산 구조에 따라 인테그린에 대한 결합력 차이를 보인다. RGD 핵산서열의 배열은 선형(linear) 형태와 환형(cyclic) 형태가 있으며, 이 중 환형 형태인 RGD4C(서열번호 1에 기재된 아미노산 서열)는 두 개의 이황화 결합(disulfide bonds)에 의해 RGD가 중앙에 위치하여 구조적으로 안정한 형태를 가진다. 또한, RGD4는 인테그린 αvβ3 와 강한 친화력을 가지고 있어 사용에 있어 여타의 RGD 펩타이드보다 바람직하다. The RGD peptide has a secondary structure that binds to integrin, but shows a difference in binding ability to integrin depending on the amino acid structure around RGD. The arrangement of the RGD nucleic acid sequence is linear and cyclic. Among them, the cyclic RGD4C (the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1) has two disulfide bonds in the center of the RGD. It is located and has a structurally stable form. In addition, RGD4 has a strong affinity with integrin αvβ3 and is therefore preferred over other RGD peptides for use.

한편, 본 발명의 암세포를 대상으로 하는 약물전달용 입자의 제조방법에 있어서, 기질 용액은 암 치료용 물질을 추가적으로 포함하는 것이 좋은데, 기질 용액에 암 치료용 물질이 포함됨으로써, 입자가 제조되면서 암 치료용 물질이 본 발명 의 약물전달용 입자의 내부에 포집될 수 있다. 암 치료용 물질로는 소수성 성질을 보유하고 있는 것이라면, 특정의 것에 국한되지 않고 사용될 수 있다. On the other hand, in the method for producing a drug delivery particle for cancer cells of the present invention, it is preferable that the substrate solution additionally contains a substance for treating cancer, by containing the substance for treating cancer in the substrate solution, the particles are produced while the cancer The therapeutic substance may be trapped inside the drug delivery particles of the present invention. The substance for treating cancer may be used as long as it has hydrophobic properties, without being limited to a specific one.

한편, 본 발명의 약물전달용 입자의 제조방법에 있어서, 세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질을 N-말단 또는 C-말단에 융합시킨 폴리히드록시알카노에이트 합성효소는, 세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 핵산서열 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 폴리히드록시알카노에이트 합성효소를 암호화하는 유전자의 5'-말단 또는 3'-말단에 융합시킨 후, 발현시킴으로써 제조되는 것이 좋다. On the other hand, in the method for producing a drug delivery particle of the present invention, the polyhydroxyalkanoate synthase in which a peptide or protein that specifically binds to a cell is fused to an N-terminus or a C-terminus is specific to a cell. The gene encoding the nucleic acid sequence or protein of the peptide to be bound to the 5'-end or 3'-end of the gene encoding the polyhydroxyalkanoate synthase is preferably prepared by expressing.

세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 핵산서열 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 폴리히드록시알카노에이트 합성효소를 암호화하는 유전자의 5'-말단 또는 3'-말단에 융합시키는 방법은, 하기 실시예에서 수행된 것처럼, PCR을 통한 클로닝 및 라이게이션 등의 공지의 유전공학적 방법을 이용하면 용이하게 수행될 수 있기 때문에, 이에 관한 구체적인 설명은 생략하기로 한다. The method of fusing a gene encoding a nucleic acid sequence or a protein of a peptide that specifically binds to a cell to the 5'-end or 3'-end of a gene encoding a polyhydroxyalkanoate synthase, in the following Examples As it has been carried out, since it can be easily performed using known genetic engineering methods such as cloning and ligation through PCR, a detailed description thereof will be omitted.

또한, 세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 핵산서열 또는 단백질을 암호화하는 유전자가 5'-말단 또는 3'-말단에 융합된 상기 재조합 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 '발현'은, 하기 실시예에서 수행된 것처럼, 공지의 벡터 및 공지의 호스트(일 예로서, 대장균)를 이용하여 용이하게 수행될 수 있기 때문에, 이에 관한 구체적인 설명은 생략하기로 한다. Further, 'expression' of the recombinant polyhydroxyalkanoate synthetase in which the nucleic acid sequence of the peptide specifically binding to the cell or the gene encoding the protein is fused at the 5'-end or 3'-end, As it is performed in the example, since it can be easily performed using a known vector and a known host (for example, E. coli), a detailed description thereof will be omitted.

본 발명은 생체 호환성 물질인 PHA를 기본 골격(back bone)으로 하고, 암세 포와 같은 특정 세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질을 단백질 공학을 통해 PHA 합성효소에 융합한 후, PHA 입자의 표면에 리간드로 도입함으로써, 암세포와 같은 특정세포에 대한 표적능이 부여된 나노 수준의 약물전달용 입자를 제조할 수 있다. The present invention uses the biocompatible material PHA as a back bone, and after fusion of a peptide or protein that specifically binds to a specific cell such as cancer cells to PHA synthase through protein engineering, the surface of the PHA particles By introducing into the ligand, it is possible to prepare a nano-level drug delivery particles endowed with the target ability to specific cells, such as cancer cells.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다. Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited to the following examples, and includes modifications of equivalent technical spirits.

실시예Example 1:  One: RGD4CRGD4C 펩타이드가Peptide 융합된  Fused PHBPHB 합성효소를 이용하여 본 발명의  Synthetic enzymes of the present invention PHBPHB 나노 입자의 제조 Preparation of Nanoparticles

본 실시예에서는 RGD4 펩타이드를 나노 입자 표면에 부착시키는 방법이 아닌, 단백질 공학을 통해 PHB 합성효소와 RGD4C 펩타이드를 융합하여 PHB 합성효소를 제조한 후, PHB입자 표면에 RGD4C 리간드가 결합된 나노 입자를 제작하고자 하였다. In the present embodiment, instead of attaching the RGD4 peptide to the surface of the nanoparticles, a PHB synthase was prepared by fusing the PHB synthase and the RGD4C peptide through protein engineering, and then the nanoparticles having the RGD4C ligand bound to the PHB particle surface were prepared. Was intended to produce.

PHB 합성효소와 RGD4C 융합 PHB 합성효소의 발현을 위해 사용된 벡터의 모식도는 도 3a~3c에 나타내었고, 해당 벡터의 제조 및 PHB 합성효소 또는 PGD4C 융합 PHB 합성효소의 발현은 하기에서 상세히 설명하고자 한다. The schematic diagram of the vector used for the expression of PHB synthase and RGD4C fusion PHB synthase is shown in FIG. 3a to 3c, the preparation of the vector and the expression of PHB synthase or PGD4C fusion PHB synthase will be described in detail below.

1) One) PHBPHB 합성효소 및 N-말단 또는 C-말단에  Synthetase and at the N- or C-terminus RGD4CRGD4C 시퀀스가Sequence is 융합된  Fused PHBPHB 합성효소의 제조 Preparation of Synthetic Enzymes

①   ① PHBPHB 합성효소가  Synthetase 클로닝된Cloned pETpET 15b 벡터 및 그로부터  15b vectors and from there PHBPHB 합성효소의 제조  Preparation of Synthetic Enzymes

PHB 합성효소 유전자(phb C)를 랄스토니아 유트로푸스(Ralstonia eutrophus)로부터 PCR을 통해 증폭시켜 pET 15b 벡터(NOVAGEN, Darmstadt, Germany)에 클로닝하여, PHB 합성효소 유전자가 삽입된 pET 15b 벡터를 제조하였다(도 3a). PHB synthase gene ( phb C) was amplified by PCR from Ralstonia eutrophus and cloned into pET 15b vector (NOVAGEN, Darmstadt, Germany) to insert pET 15b vector with PHB synthase gene inserted. Prepared (FIG. 3A).

이때, PHB 합성효소 유전자의 5'과 3' 끝부분에 NdeⅠ 사이트와 XhoⅠ 사이트가 생성되도록 하기 위하여, PCR 수행시 정방향 프라이머는 "5'-GAC AAG CAT ATG ATC GAG AAT CCA ATC"를 사용하였고, 역방향 프라이머는 "5'-CCG CTC GAG TGC CTT GGC TTT GAC GTA T"를 사용하였다.At this time, in order to generate Nde I site and Xho I site at 5 'and 3' ends of PHB synthase gene, "5'-GAC AAG CAT ATG ATC GAG AAT CCA ATC" is used for PCR. Reverse primer was used as "5'-CCG CTC GAG TGC CTT GGC TTT GAC GTA T".

그 후, PHB 합성효소 유전자가 삽입된 pET 15b 벡터로 이 콜라이(E. coli) BL21를 형질전환시킨 후, 발현시키고, Ni-NTA 아가로오스 비드(agarose bead)를 이용하여 정제함으로써, PHB 합성효소를 분리하였다. After that, The E. coli BL21 was transformed with a pET 15b vector inserted with the PHB synthase gene, expressed, and purified using Ni-NTA agarose beads to isolate the PHB synthase. It was.

② C-말단에   ② at C-terminal RGD4CRGD4C 가 위치한 벡터 및 그로부터 C-말단에 At which the vector is located and the C-terminal from it RGD4CRGD4C 핵산 서열이 융합된  Fused nucleic acid sequence PHBPHB 합성효소의 제조 Preparation of Synthetic Enzymes

C-말단에 RGD4C가 위치한 벡터를 제조하고자 하였는데, RGD4C 서열은 뉴클레오타이드 합성을 통해서, 5'방향에 XhoⅠ 사이트, 3'방향에 BamHⅠ 사이트를 붙여줌으로써, PHB 합성효소가 삽입되어 있는 pET 15b 벡터에 삽입될 수 있도록 하였다(5'-TC GAG GCG TGC GAT TGC CGT GGC GAT TGC TTC TGC GGC TGA G, 5'-GA TCC TCA GCC GCA GAA GCA ATC GCC ACG GCA ATC GCA CGC C).The RGD4C vector was located at the C-terminus. The RGD4C sequence was inserted into the pET 15b vector containing the PHB synthase by attaching the Xho I site in the 5 'direction and the BamH I site in the 3' direction through nucleotide synthesis. (5'-TC GAG GCG TGC GAT TGC CGT GGC GAT TGC TTC TGC GGC TGA G, 5'-GA TCC TCA GCC GCA GAA GCA ATC GCC ACG GCA ATC GCA CGC C).

이 후, PHB 합성효소 유전자가 삽입된 pET 15b 벡터와 인서트인 RGD4C 시퀀 스를 라이게이션시킨 후, 라이게이션된 벡터로 이 콜라이(E. coli) DH5α 컴피턴트 셀(competent cell)을 형질전환한 후, LB액체 배지(ampicillin 100 μg/㎖)에서 16시간 동안 배양하였다. 그 후, 'Plasmid Miniprep Kit'를 이용하여 C-말단에 RGD4C가 위치한 벡터를 배양된 균주로부터 분리하였다(도 3b).After ligating the pET 15b vector into which the PHB synthase gene was inserted and the RGD4C sequence as an insert, the E. coli DH5α competent cells were transformed with the ligated vector. Incubated for 16 hours in LB liquid medium (ampicillin 100 μg / ㎖). Then, using the 'Plasmid Miniprep Kit' vector RGD4C located at the C-terminal was isolated from the cultured strain (Fig. 3b).

이 후, 분리한 벡터로 이 콜라이(E. coli) BL21를 형질전환한 후, 발현시키고, Ni-NTA 아가로오스 비드(agarose bead)를 이용하여 정제함으로써, C-말단에 RGD4C 펩타이드가 융합된 PHB 합성효소를 분리하였다.after, This E. coli BL21 was transformed with the isolated vector, expressed, and purified using Ni-NTA agarose beads to purify the RGD4C peptide at the C-terminus. Was separated.

③ N-말단에   ③ at N-terminal RGD4CRGD4C 가 위치한 벡터 및 그로부터 N-말단에 At which the vector is located and the N-terminal from it RGD4CRGD4C 핵산 서열이 융합된  Fused nucleic acid sequence PHBPHB 합성효소의 제조 Preparation of Synthetic Enzymes

N-말단에 RGD4C가 위치한 벡터를 다음과 같이 제조하였다. RGD4C 서열은 뉴클레오타이드 합성을 통해서 5'방향에 NdeⅠ 사이트, 3'방향에 XhoⅠ 사이트를 갖도록 제작하였다(5'-G GAA TTC CAT ATG GCG TG C GAT TGC CGT GGC GAT TGC TTC TGC GGC CTC GAG CGG, 5'-CCG CTC GAG GCC GCA GAA GCA ATC GCC ACG GCA ATC GCA CGC CAT ATG GAA TTC C). The vector where RGD4C is located at the N-terminus was prepared as follows. RGD4C sequence was constructed to have NdeI site in 5 'direction and XhoI site in 3' direction through nucleotide synthesis (5'-G GAA TTC CAT ATG GCG TG C GAT TGC CGT GGC GAT TGC TTC TGC GGC CTC GAG CGG, 5 '-CCG CTC GAG GCC GCA GAA GCA ATC GCC ACG GCA ATC GCA CGC CAT ATG GAA TTC C).

이 후, PHB 합성효소 유전자가 삽입된 pET 19b 벡터(도 3c)와 인서트인 RGD4C 시퀀스를 라이게이션시킨 후, 이 라이게이션 된 벡터로 이 콜라이(E. coli) DH5α 컴피턴트 셀(competent cell)을 형질전환시키고, LB액체 배지(ampicillin 100 μg/㎖)에서 16시간 동안 배양하였다. 그 후 'Plasmid Miniprep Kit'를 이용하여 N-말단에 RGD4C가 위치한 벡터를 배양된 균주로부터 분리하였다(도 3d).Subsequently, a ligated pET 19b vector (FIG. 3C) and an insert RGD4C sequence were ligated into the PHB synthase gene, and then the E. coli DH5α competent cell was used as the ligated vector. Transformed and incubated for 16 hours in LB liquid medium (ampicillin 100 μg / ml). Then, using the 'Plasmid Miniprep Kit' vector RGD4C located at the N-terminal was isolated from the cultured strain (Fig. 3d).

이 후, 분리한 벡터로 이 콜라이(E.coli BL21)를 형질전환한 후, 발현시키 고, Ni-NTA 아가로오스 비드(agarose bead)를 이용하여 정제함으로써, N-말단에 RGD4C 펩타이드가 융합된 PHB 합성효소를 분리하였다. after, This E. coli BL21 was transformed with the isolated vector, and then expressed and purified using Ni-NTA agarose beads to synthesize PHB fused with RGD4C peptide at the N-terminus. The enzyme was isolated.

2)  2) PHBPHB 합성효소 및  Synthase and RGD4CRGD4C 펩타이드가Peptide N-말단 또는 C-말단에 융합된  Fused to the N-terminus or C-terminus PHBPHB 합성효소를 이용하여  Using synthetase PHBPHB 나노 입자의 제조 Preparation of Nanoparticles

PHB 합성효소 및 RGD4C 펩타이드가 N-말단 또는 C-말단에 융합된 PHB 합성효소를 이용하여 하기의 방법에 의해 PHB 나노 입자 또는 PHB 입자 표면에 RGD4C 리간드를 가진 나노 입자를 제작하였다. PHB synthase and RGD4C peptides were fused to the N-terminus or C-terminus to prepare nanoparticles having RGD4C ligand on the surface of PHB nanoparticles or PHB particles by the following method.

시험관 내(in vitro) PHB 합성을 위해서 20 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(potassium phosphate buffer, pH 7.0), 200 mM NaCl, 5 mM의 3HB-CoA, 4.8 μM의 PHB 합성효소 또는 RGD4C 펩타이드가 N-말단에 융합된 PHB 합성효소 또는 RGD4C 펩타이드가 C-말단에 융합된 PHB 합성효소를 포함한 용액을 37 ℃에서 도 4에 기재된 각각의 시간 동안 반응시켰다. 이때, 나노입자에 약리성분과 같은 외래물질의 충전(loading) 가능 여부를 확인하기 위해 상기 나노입자 합성 반응액에 나일레드(Nile Red)를 최종농도 0.5mg/mL 로 첨가하였고, 첨가된 나일 레드는 소수성 특성으로 인해 나노입자의 내부에 충전됨을 형광현미경으로 확인할 수 있었다.My (in vitro vitro ) PHB synthase with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 200 mM NaCl, 5 mM 3HB-CoA, 4.8 μM PHB synthase or RGD4C peptide fused to the N-terminus for PHB synthesis Or a solution containing a PHB synthase fused to the C-terminus of the RGD4C peptide at 37 ° C. for each hour described in FIG. 4. At this time, in order to check whether the nanoparticles can be loaded with foreign substances such as pharmacological components (nyle red) was added to the nanoparticle synthesis reaction solution at a final concentration of 0.5mg / mL, the added Nile red Was confirmed by fluorescence microscopy to the inside of the nanoparticles due to hydrophobic properties.

한편, 상기 반응 후, N-말단 또는 C-말단에 RGD4C 펩타이드가 융합된 PHB 합성효소에 의한 3-히드록시부티릴 CoA(3-hydroxybutyryl CoA)의 중합이 기존의 PHB 합성효소의 중합과 효소 역가에서 차이가 있는지 여부를 살펴보기 위해, 반응 후, 방출된 티올(thiol)기의 양을 측정하였다(Ellman's assay). On the other hand, after the reaction, the polymerization of 3-hydroxybutyryl CoA (3-hydroxybutyryl CoA) by the PHB synthase fused with the RGD4C peptide at the N- or C-terminus, the polymerization of the existing PHB synthase and enzyme titer In order to see if there is a difference in the amount of thiol groups released after the reaction was measured (Ellman's assay).

엘만스 어세이(Ellmans's assay)는 다음과 같이 수행하였다. 5 mM 소디움 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH 4.7), 50 mM NaCl, 0.5 mM EDTA가 혼합된 380 ㎕에 각각의 반응 시간에 따라 중합반응시킨 용액을 10 ㎕씩 분주하였다. 그 후 40 mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 7.6), 2 mM EDTA, 100 mM 5,5-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB)가 혼합된 690 ㎕를 각각 첨가한 후 실온에서 2분 동안 반응시켰다. 용액의 흡광도는 스펙트로포토미터(spctrophotometer)를 이용하여 412 nm에서 측정하였다.Elmans' assay was performed as follows. 10 μl of a solution polymerized according to each reaction time was dispensed into 380 μl of 5 mM sodium acetate buffer (pH 4.7), 50 mM NaCl, and 0.5 mM EDTA. Thereafter, 690 μl of 40 mM sodium phosphate buffer (pH 7.6), 2 mM EDTA, and 100 mM 5,5-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) were added, respectively, followed by reaction at room temperature for 2 minutes. The absorbance of the solution was measured at 412 nm using a spectrophotometer.

도 4는 PHB 합성효소와 N-말단에 RGD4C 펩타이드가 융합된 PHB 합성효소, C-말단에 RGD4C 펩타이드가 융합된 PHB 합성효소의 동일한 농도(4.8 μM)에서 3-히드록시부티릴 CoA를 기질로 하는 중합반응을 통해 방출된 티올(thiol)기를 시간에 따라 나타내었다. 비교 결과, 각각의 활성은 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었으며, 이는 RGD4C가 PHB 합성효소에 결합이 되더라도 효소활성에는 영향을 끼치지 않는 사실을 의미한다. FIG. 4 shows 3-hydroxybutyryl CoA as a substrate at the same concentration (4.8 μM) of PHB synthase and PHB synthase fused with RGD4C peptide at the N-terminus, and RGD4C peptide fused with the C-terminus. The thiol group released through the polymerization is shown over time. As a result, each activity was confirmed that there is no big difference, which means that even if RGD4C is bound to PHB synthase does not affect the enzyme activity.

또한, AFM(Atomic Force Microscope)을 이용하여 각각의 나노입자 형태를 살펴보았는데, 형태학상으로 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었다(도 5a~5c). 도 5a~5c는 제조된 PHB 입자의 AFM 사진인데, 도 5a는 PHB 합성효소에 의해 형성된 PHB 나노입자, 도 5b는 C-말단에 RGD4C 펩타이드가 융합된 PHB 합성효소가 형성한 PHB 나노입자, 도 5c는 N-말단에 RGD4C 펩타이드가 융합된 PHB 합성효소가 형성한 PHB 나노입자이다.In addition, using the AFM (Atomic Force Microscope) to examine the shape of each nanoparticles, it was confirmed that there is no significant difference in morphology (Figs. 5a-5c). 5A to 5C are AFM photographs of the prepared PHB particles, FIG. 5A is a PHB nanoparticle formed by PHB synthase, and FIG. 5B is a PHB nanoparticle formed by PHB synthase fused to C-terminal RGD4C peptide, FIG. 5c is a PHB nanoparticle formed by a PHB synthase fused to the N-terminus of RGD4C peptide.

실험예Experimental Example 1: 상기  1: above 실시예Example 1에서 제조한 본 발명의  Of the present invention prepared in 1 RGD4CRGD4C 펩타이드가Peptide 융합된  Fused PHBPHB 나노 입자의 암세포에 대한  Nanoparticles for Cancer Cells 결합능Binding capacity 조사 Research

본 실험예 1에서는 상기에서 제조된 RGD4C 펩타이드가 융합된 PHB 나노입자가 인테그린 αvβ3을 과발현하는 MDA-MB231 유방암 세포주에 결합하는지 여부를 확인하고자 하였다. In Experimental Example 1, we tried to determine whether the PHB nanoparticles fused with the RGD4C peptide prepared above bind to MDA-MB231 breast cancer cell line overexpressing integrin αvβ3.

상기 실시예 1에서 제작된 RGD4C 펩타이드가 융합된 나노 입자 합성반응용액으로부터 버퍼와 남아 있는 나일 레드(Nile red)를 제거하기 위해 13000rpm으로 2분 동안 원심분리하였고, 상층액을 제거한 후, 하기의 유방암 세포의 배양액인 RPMI 1640을 첨가하였으며, 13000rpm에서 2분 동안 원심분리를 통해, 세척하였다(총 10회). The RGD4C peptide prepared in Example 1 was centrifuged at 13000 rpm for 2 minutes to remove the buffer and the remaining nile red from the nanoparticle synthesis reaction solution fused with the supernatant, followed by breast cancer RPMI 1640, a culture of cells, was added and washed by centrifugation at 13000 rpm for 2 minutes (10 times in total).

그 후, RPMI 1640 배양액을 30 μl 첨가하여 10배 농축시킨 후, 울트라-소니피케이션(ultra-sonication, 130 W) 3회(1s) 와 배스 소닉(bath sonic, DH.WUC.A02H, 60Hz, 대학과학, Seoul, Korea)을 10분간 시행함으로써 하기에서 사용할 시료를 준비하였다. Thereafter, 30 μl of RPMI 1640 culture solution was concentrated 10 times, followed by 3 times of ultra-sonication (130 W) and bath sonic (DH.WUC.A02H, 60 Hz, University Science, Seoul, Korea) to prepare a sample for use in the following 10 minutes.

한편, 본 실험예 1에서 사용된 MDA-MB 231 유방암 세포주는 한국 세포주은행으로부터 분양받았다. 세포의 배양액은 RPMI 1640에 10% 페탈 보바인 시럼(fetal bovine serum), 페니실린(penicillin, 100 unit/ml)을 첨가하여 준비하였다. On the other hand, the MDA-MB 231 breast cancer cell line used in Experimental Example 1 was sold from the Korea Cell Line Bank. Cell culture medium was prepared by adding 10% petal bovine serum and penicillin (penicillin, 100 units / ml) to RPMI 1640.

세포주는 상기의 세포 배양액을 사용하여, 37℃, % 습도, 5% CO2의 배양기에서 배양하였다. 통상적으로 3~4일 간격으로 계대 배양을 실시하였으며, 본 실험에 서는 분양받은 후 8계대의 세포를 사용하였다.The cell line was cultured in an incubator at 37 ° C.,% humidity, 5% CO 2 using the cell culture solution described above. Normally, passages were carried out at intervals of 3 to 4 days, and in this experiment, cells were used after 8 passages.

상기에서 준비한 시료의 유방암 세포주에 대한 결합능 실험을 위해, 10% FBS가 포함되어 있지 않은 RPMI 1640 배양액으로 96-웰 플레이트에 웰 당 5.1× 104 / 100 μl 세포를 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고, DPBS 100 μl로 2회 세척하였다. For the binding experiment for a sample of the breast cancer cell line prepared in the above, by dividing the 10% RPMI 1640 culture medium 5.1 × 10 4/100 μl cells per well in a 96-well plate to not contain FBS and cultured for 24 hours. After 24 hours, the culture was removed and washed twice with 100 μl of DPBS.

그 후, 상기에서 준비된 시료를 분주하고 30분 동안 배양한 다음, DPBS 100 μl로 1회 세척한 후, 형광현미경으로 관찰하였다. Thereafter, the sample prepared above was dispensed, incubated for 30 minutes, washed once with 100 μl of DPBS, and then observed with a fluorescence microscope.

도 6은 현미경 관찰 결과를 보여준다. 도 6의 A), B)는 아무것도 처리하지 않은 대조군 세포이고, C), D)는 PHB 입자로 처리된 세포이며, E), F)는 RGD4C 펩타이드를 C-말단에 융합한 PHB 입자로 처리한 세포이고, G), H)는 RGD4C 펩타이드를 N-말단에 융합한 PHB 입자로 처리한 세포의 모습이다. 6 shows the results of microscopic observations. A), B) of Figure 6 is a control cell treated with nothing, C), D) is a cell treated with PHB particles, E), F) is treated with PHB particles fused to the C- terminal RGD4C peptide One cell, G), H) is a cell treated with RGD4C peptide with PHB particles fused to the N-terminus.

대조군 세포의 모습에 비해 RGD4C 펩타이드가 융합된 PHB 입자 처리한 세포의 모습이 붉은빛으로 염색된 모습을 볼 수 있었다. 이는 입자 제작시 충전(loading)한 나일 레드(Nile red)에 의해 세포가 염색이 된 것을 보여주는 것이다. Compared to the control cells, the cells treated with PHB particles fused with RGD4C peptide were stained red. This shows that the cells were stained by Nile red loaded during particle manufacturing.

RGD4C 펩타이드가 융합되지 않은 PHB 입자로 처리했을 경우(도 6의 C), D)) 처리한 세포가 붉은색으로 염색이 되지 않는 것으로 보아, PHB 입자의 표적세포에 대한 비특이적인 결합반응은 일어나지 않았음을 확인 하였다.When the RGD4C peptide was treated with PHB particles without fusion (FIG. 6C), D)), the treated cells did not stain in red color, so that the nonspecific binding reaction of the PHB particles to the target cells did not occur. Well confirmed.

이상의 결과로부터 RGD4C 리간드가 융합된 PHB 합성효소를 이용하여 제작한 나노입자가 암세포에 우수한 특이적 결합력을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. From the above results, it was confirmed that the nanoparticles prepared using PHB synthase fused with RGD4C ligand have excellent specific binding ability to cancer cells.

도 1은 정제된 PHB 합성효소(PHB synthase)와 기질인 3-히드록시부티릴 CoA(3-hydroxybutyryl CoA)로부터 PHB가 합성되는 과정을 보여준다.FIG. 1 shows a process for the synthesis of PHB from purified PHB synthase and 3-hydroxybutyryl CoA.

도 2a는 RGD4C(ACDCRGDCFCG)의 화학식을 보여주고, 도 2b는 정제된 융합단백질(RGD4C가 융합된 PHB 합성효소)을 모식도로 보여주며, 도 2c는 다이머(dimer) 형태의 융합 단백질에 의한 3-히드록시부티릴 CoA(3-hydroxybutyryl CoA)의 중합반응(polymerization)으로 형성된 양친성 블록공중합체를 보여주고, 도 2d는 중합이 일어난 후, 자기조립(self-assembling) 과정에 의해 형성된 본 발명의 RGD4C가 융합된 PHB 나노 입자를 보여준다. Figure 2a shows the chemical formula of RGD4C (ACDCRGDCFCG), Figure 2b shows a schematic diagram of the purified fusion protein (PHB synthase fused with RGD4C), Figure 2c is a 3-dimer by the fusion protein in the form of dimers (dimer) An amphiphilic block copolymer formed by the polymerization of hydroxybutyryl CoA (3-hydroxybutyryl CoA) is shown, Figure 2d is a self-assembling process of the present invention formed after the polymerization takes place It shows PHB nanoparticles fused with RGD4C.

도 3a~3d는 RGD4C가 융합된 PHB 합성효소의 발현을 위해 사용한 벡터의 구조를 보여주는데, 3a는 pET 15b 벡터에 클로닝된 PHB 합성효소 유전자를 보여주고, 3b는 pET 15b 벡터에 클로닝된 PHB 합성효소 유전자 및 그 C-말단에 결합한 RGD4C를 보여주고, 3c는 pET 19b 벡터에 클로닝된 PHB 합성효소 유전자를 보여주고, 3d는 pET 19b 벡터에 클로닝된 PHB 합성효소 유전자 및 그 N-말단에 결합한 RGD4C를 보여준다. Figures 3a to 3d shows the structure of the vector used for the expression of RGD4C fused PHB synthase, 3a shows the PHB synthase gene cloned in the pET 15b vector, 3b is PHB synthase cloned in the pET 15b vector Gene and RGD4C bound to its C-terminus, 3c shows PHB synthase gene cloned to pET 19b vector, 3d shows PHB synthase gene cloned to pET 19b vector and RGD4C bound to its N-terminus Shows.

도 4는 PHB 합성효소에 의한 3-히드록시부티릴 CoA(3-hydroxybutyryl CoA)의 중합반응을 통해 방출된 티올(thiol)기를 시간에 따라 측정한 결과를 보여준다. 흡광도 값은 PHB의 중합반응의 활성을 나타낸다.Figure 4 shows the result of measuring the thiol group released through the polymerization of 3-hydroxybutyryl CoA (3-hydroxybutyryl CoA) by PHB synthase over time. Absorbance values indicate the activity of the polymerization of PHB.

도 5는 제조된 PHB 나노 입자의 AFM 사진이다. 도 5a는 PHB 합성효소가 형성한 PHB 나노 입자, 도 5b는 PHB 합성효소의 C-말단에 결합된 RGD4C가 형성한 PHB 나노 입자, 도 5c는 PHB 합성효소의 N-말단에 결합된 RGD4C가 형성한 PHB 나노 입자이다. 5 is an AFM photograph of the prepared PHB nanoparticles. Figure 5a is a PHB nanoparticles formed by PHB synthase, Figure 5b is a PHB synthase PHB nanoparticles formed by RGD4C bound to C-terminus, FIG. 5C shows PHB nanoparticles formed by RGD4C bound to N-terminus of PHB synthase.

도 6은 MDA-MB231 유방암 세포주에 본 발명의 나노 입자를 처리한 후, 형광현미경으로 관찰한 이미지이다. A)는 아무것도 처리하지 않은 대조군 세포의 이미지(bright filed), B)는 아무것도 처리하지 않은 대조군 세포의 형광이미지, C)는 나일 레드(Nile red)로 충전된 PHB 나노 입자를 처리한 세포의 이미지(bright filed), D)는 나일 레드(Nile red)로 충전된 PHB 나노 입자를 처리한 세포의 형광이미지, E)는 나일 레드(Nile red)로 충전된 RGD4C가 융합된 PHB(C-말단) 나노 입자를 처리한 세포의 이미지(bright filed), F)는 나일 레드(Nile red)로 충전된 RGD4C가 융합된 PHB(C-말단) 나노 입자를 처리한 세포의 형광이미지, G)는 나일 레드(Nile red)로 충전된 RGD4C가 융합된 PHB(N-말단) 나노 입자를 처리한 세포의 이미지(bright filed), H)는 나일 레드(Nile red)로 충전된 RGD4C가 융합된 PHB(N-말단) 나노 입자를 처리한 세포의 형광이미지이다. scale bar = 20 ㎛이다.6 is an image observed with a fluorescence microscope after treatment of the nanoparticles of the present invention to MDA-MB231 breast cancer cell line. A) is a bright filed image of the control cell without any treatment (B) is a fluorescence image of the control cell without any treatment, and C) an image of cells treated with PHB nanoparticles filled with nile red. (bright filed), D) fluorescence image of cells treated with PHB nanoparticles filled with Nile red, E) PHB (C-terminus) fused with RGD4C filled with Nile red Bright filed of cells treated with nanoparticles, F) Fluorescent images of cells treated with PHB (C-terminal) nanoparticles fused with RGD4C filled with Nile red, G) The bright filed, H, of the cells treated with PHB (N-terminal) nanoparticles fused with (Nile red) -filled RGD4C was shown as PHB (N- with RGD4C-filled with Nile red). Terminal) Fluorescence image of cells treated with nanoparticles. scale bar = 20 μm.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Method for production of particle for drug delivery system with affinity to cancer cell <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD4C peptide with a binding affinity to integrin <400> 1 Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly 1 5 10 <110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Method for production of particle for drug delivery system with          affinity to cancer cell <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD4C peptide with a binding affinity to integrin <400> 1 Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly   1 5 10  

Claims (8)

세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질을 N-말단 또는 C-말단에 융합시킨 폴리히드록시알카노에이트 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase; PHA synthase)를 3-히드록시알카노일 CoA(3-hydroxyalkanoyl CoA)를 함유하는 기질 용액에 첨가하여 반응시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 세포에 특이적으로 결합하는 약물전달용 입자의 제조방법.A polyhydroxyalkanoate synthase (PHA synthase) in which a peptide or protein that specifically binds to a cell is fused to an N-terminus or C-terminus is used as a 3-hydroxyalkanoyl CoA. Method for producing a drug delivery particle that specifically binds to a cell, characterized in that it is prepared by adding to the substrate solution containing the reaction. 제1항에 있어서, The method of claim 1, 상기 폴리히드록시알카노에이트 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase; PHA synthase)는, 폴리히드록시부티레이트 합성효소(polyhydroxybutyrate synthase; PHB synthase)이고, The polyhydroxyalkanoate synthase (PHA synthase) is a polyhydroxybutyrate synthase (PHB synthase), 상기 3-히드록시알카노일 CoA(3-hydroxyalkanoyl CoA)는, 3-히드록시부티릴 CoA(3-hydroxybutyryl CoA)인 것을 특징으로 하는 세포에 특이적으로 결합하는 약물전달용 입자의 제조방법 The 3-hydroxyalkanoyl CoA (3-hydroxyalkanoyl CoA) is a 3-hydroxybutyryl CoA (3-hydroxybutyryl CoA) method for producing a drug delivery particle that specifically binds to a cell, characterized in that. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 세포는,The cell, 암세포인 것을 특징으로 하는 세포에 특이적으로 결합하는 약물전달용 입자의 제조방법.Method for producing a drug delivery particle that specifically binds to a cell, characterized in that the cancer cell. 제3항에 있어서, The method of claim 3, 암세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질은,Peptides or proteins that specifically bind to cancer cells, 암세포에 특이적으로 결합하는 활성 부위로 RGD(Arg-Gly-Asp)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 암세포에 특이적으로 결합하는 활성 부위로 NGR(Asn-Gly-Arg)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, VEGI(vascular endothelial growth inhibitor), 트롬보스포딘스(Thrombospondins), 안지오스타틴(Angiostatin), 엔도스타틴(Endostatin), 바소스타틴(Vasostatin) 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포에 특이적으로 결합하는 약물전달용 입자의 제조방법.Peptide comprising an amino acid sequence of RGD (Arg-Gly-Asp) as an active site that specifically binds to cancer cells, Amino acid sequence of Asn-Gly-Arg (NGR) as an active site that specifically binds to cancer cells Peptide, vascular endothelial growth inhibitor (VEGI), Thrombospondins (Thrombospondins), Angiostatin, Endostatin (Endostatin), Vasostatin (Vasostatin) that specifically binds to cells characterized in that any one Method of producing particles for drug delivery. 제4항에 있어서,5. The method of claim 4, 암세포에 특이적으로 결합하는 활성 부위로 RGD(Arg-Gly-Asp)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는,Peptides comprising the amino acid sequence of RGD (Arg-Gly-Asp) as an active site that specifically binds to cancer cells, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 RGD4C인 것을 특징으로 하는 세포에 특이적으로 결합하는 약물전달용 입자의 제조방법.A method for producing a drug delivery particle that specifically binds to a cell, which is RGD4C having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 제3항에 있어서, The method of claim 3, 기질 용액은, Substrate solution, 암 치료용 물질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포에 특이적으로 결합하는 약물전달용 입자의 제조방법Method for producing a drug delivery particle that specifically binds to a cell, characterized in that it further comprises a substance for treating cancer 제1항에 있어서,The method of claim 1, 세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질을 N-말단 또는 C-말단에 융합시킨 폴리히드록시알카노에이트 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase; PHA synthase)는,Polyhydroxyalkanoate synthase (PHA synthase) in which a peptide or protein that specifically binds to a cell is fused to an N-terminus or a C-terminus, 세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 핵산서열 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 폴리히드록시알카노에이트 합성효소를 암호화하는 유전자의 5'-말단 또는 3'-말단에 융합시킨 후, 발현시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 세포에 특이적으로 결합하는 약물전달용 입자의 제조방법Prepared by expressing a nucleic acid sequence of a peptide that specifically binds to a cell or a gene encoding a protein to the 5'-end or 3'-end of a gene encoding a polyhydroxyalkanoate synthase and then expressing Method for producing a drug delivery particle that specifically binds to a cell 삭제delete
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