KR101091849B1 - 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제를 유효성분으로 포함하는 상처 치유 촉진용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제를 유효성분으로 포함하는 상처 치유 촉진용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아데니일닐 시클라아제 억제제를 포함하는 젊은 세포 및 젊은 대상과는 생리적 특징이 구별되는 노화 세포 및 나이든 대상의 상처 치유를 촉진하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제의 유효량을 상처를 가진 대상에 처리하는 상처 치유 촉진 방법에 관한 것이다.

노화, 라이소포스파티드산, cAMP, 아데닐일 시클라아제 억제제, 상처 치유, 약학 조성물

Description

라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제를 유효성분으로 포함하는 상처 치유 촉진용 약학 조성물{A Composition for Promoting Wound Healing Comprising Lysophosphatidic acid and inhibitor of Adenylyl cyclase as Active Ingredient}

본 발명은 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제를 유효성분으로 포함하는 상처 치유 촉진용 약학 조성물 및 상처 치유 촉진 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 젊은 세포 및 젊은 대상과는 생리적 특징이 구별되는 노화 세포 및 나이든 대상의 상처 치유를 촉진하는 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제를 포함하는 약학 조성물 및 상처 치유 촉진 방법에 관한 것이다.

조직이 손상을 입게 되면 우리의 몸은 상처를 치유하려는 반응을 시작한다. 상처 치유는 세포외 매트리스, 혈액세포, 실질세포 및 매개체를 수반하는 복합적 생물학적인 과정에 의하여 이루어지는데, 모든 상처의 치유과정은 염증기, 상피화기, 증식기, 성숙기로 구분될 수 있으며, 상처의 정도에 따라 상당히 긴 시간이 걸릴 수도 있다. 한편, 상처의 치유에 걸리는 시간이 길어질수록 흉터가 생길 확률이 높아지고, 2차 감염의 우려까지 나올 수 있다. 이러한 흉터 방지, 2차 감염 방지 및 신속한 상처 치유를 촉진시키기 위한 물질의 개발은 매우 중요한 의미를 갖고 있다.

섬유아세포는 세포 밖의 연결 조직 매트릭스의 중요한 요소 중에 하나이다. 상처가 생기면, 섬유아세포는 빨리 증식되고, 연결 조직에서 상처 부위로 이동하여 상처 치유에 관여하게 된다. 그러므로, 섬유아세포의 증식과 이동은, 상처 치유 반응을 조절하는 중요한 요소 중에 하나이다.

한편, PDGF나 EGF와 같은 티로신 키나아제 효현제(agonist)가 생체 내의 상처 치유를 촉진할 수 있다는 것을 개시한 바 있다(Jahovic et al., 2004; Wang et al., 1996). 자연적으로 발생하는 포스포리피드 성장인자인 라이소포스파티드산(lysophosphatidic acid ; LPA)도 실험실에서 상처 치유를 촉진한다고 알려져 있다(Balazs et al., 2001). 게다가, 본 발명자들은 노화 세포에서 PDGF와 EGF의 수용체인 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase) 시스템과 LPA 수용체 시스템을 대비하여 개시한 바 있다. PDGF(Yeo et al., 2002)와 EGF(Cho et al., 2003; Park et al., 2000)의 수용체인 수용체 티로신 키나아제 시스템은 노화 세포에서 완전히 감소하여 외부에서 자극을 주어도 신호전달 및 세포증식이 거의 온전히 차단되어 노화 세포에 전달이 되지 않으나, LPA 수용체는 부분적인 감소에 의하여 노화 세포에 어느 정도 존재함으로써 LPA에 의한 신호전달 및 세포의 증식이 일어남을 확인하였다(Jang et al., 2003).

LPA는 혈소판 응고, 부드러운 근육의 수축, 세포의 형태 변화, 주화성, 세포 증식 또는 세포의 분열 같은 다수의 신체적 반응을 유도하는 물질로 잘 알려져 있 다(Fukushima and Chun, 2001; Goetzl and An, 1998; Moolenaar, 2000; Piazza et al., 1995). 이러한 LPA는 특이적인 G-단백질 짝지음 수용체(G-protein-coupled receptors)를 활성화시키고(An et al., 1998; Bandoh et al., 1999; Erickson et al., 2000; Noguchi et al., 2003), 이로 인해 세포질의 칼슘의 증가, 포스포리파아제의 자극 활성, PI3K, 또는 Ras-Raf-MAP 키나아제의 일련의 단계적인 반응을 활성화시키거나, 아데닐일 시클라아제를 억제시키는 등의 역할을 한다(Contos et al., 2000; Fukushima and Chun, 2001; Fukushima et al., 2001; Takuwa et al., 2002).

재미있게도, LPA는 젊은 세포에서 cAMP 수준을 감소시키는 반면, 노화 세포에서는 cAMP 수준을 증가시키며(Jang et al., 2006a; Jang et al., 2003), 순차적으로 PKA의 활성도 증가시킴을 확인한 바 있다(Jang et al., 2006b). cAMP 수준의 증가는 세포의 증식과 이동을 억제시키는 능력이 있다(Liu et al., 1986). cAMP의 유사체인 dbcAMP(dibutyryl cAMP )는 PKA를 매개로 (활성화시킴으로써) 세포의 증식을 감소시킬 때 자주 이용되는 억제제이다(Liu et al., 1986). cAMP-매개로 세포의 증식이 억제되는 것은 PKA의 촉매 서브유니트가 핵으로 이동을 하지 못하게 하는 것과는 관련 없을 수 있다(Seternes et al., 1999). 활성화된 PKA는 ser/thr 인산화 및 뒤이은 ERK 활성 억제에 의하여 Raf를 억제한다(Chuang et al., 1994; Mischak et al., 1996; Wu et al., 1993). 본 발명자들은 이전 연구를 통해, 아데닐일 시클라아제 억제제 SQ22536 (ACI)(Fabbri et al., 1991)이 AMPKα의 인산화를 조절함으로써 AMPKα와 p53의 촉매 활성을 억제하여 노화 세포에서 세포의 증식을 유도함을 보여주었다(Rhim et al., 2008).

노화 세포나, 노화된 동물, 그리고 나이든 사람 등 나이에 따라 상처 치유의 정도가 달라지며 나이가 들면서 상처 치유가 잘 안 된다는 것이 잘 알려져 있다(Agren et al., 1999; Hardman and Ashcroft, 2008; Marcus et al., 2000; Spindler et al., 1995 Jeong et al., 2008). 노화 세포는 젊은 사람에 비해 나이든 사람의 피부에 더 많이 존재하며, 그래뉼 조직을 형성하기 위하여 필요한 세포복제가 감소되고, 이로 인하여 상처 치유의 속도를 감소시키는 결과를 보인다(Pitterman, 2007). 다수의 증거들이 세포의 노화가 상처 치유를 감소시킨다는 근거들을 보여주고 있긴 하지만, 아직 그 매카니즘을 모두 설명하기는 어렵다.

그러므로, 본 발명자들은 세포의 노화 과정에 중점을 맞추어 나이 들었을 때의 지체되거나 감소되는 상처 치유의 이유를 찾기 위해 예의 노력하던 중, 노화 세포에서, 라이소포스파티드산(LPA) 처리에 의해 증가된 cAMP 수준을 아데닐일 시클라아제 억제제(ACI)를 처리하여 세포내 cAMP 수준을 조절함으로써 노화된 동물의 상처 치유를 조절 할 수 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 기술적 과제는 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제를 유효성분으로 포함하는, 젊은 세포 및 젊은 대상과 생리적 특징이 구별되는 노화 세포 및 나이든 대상의 상처 치유를 촉진하는 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명은 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제의 유효량을 상처를 가진 대상에 처리하는 상처 치유 촉진 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 과제 및 이점은 첨부된 청구범위 및 도면과 함께 하기된 상세한 기재에 의해 보다 명확하게 된다.

또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌이 참조되고 그 인용이 표시되 어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명은 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제를 포함하는 상처 치유 촉진용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 젊은 세포 및 젊은 대상과는 생리적 특징이 구별되는 노화 세포 및 나이든 대상의 상처 치유를 촉진하는, 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제의 유효량을 대상에 처리하는 상처 치유 촉진 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르는 조성물은 노화 세포 및 나이든 개체의 상처 치유 효과가 우수하다.

본 발명은 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제 억제제를 포함하는 노화 세포 및 노화된 대상에서의 상처 치유 촉진용 조성물에 관한 것이다.

라이소포스파티드산(lysophosphatidic acid: LPA)은 인간의 이배성 섬유아세 포에서 세포내 Ca₂+의 이동, 액틴 중합 및 포스파티드산의 생성을 포함하는 동일한 신호 전달 현상을 유도하는 주요한 미토겐 효현제로서 구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질(G-단백질)을 통하여 세포외 메신저(extracellular messenger)로 작용한다. 또한 LPA는 LPA 수용체를 통해 세포의 모양, 주화성이나 분화등과 같은 다양한 생물학적 효과를 나타내는 물질로 알려져 있다(Moolenaar, 2000; Moolenaar et al., 1997). LPA 수용체로는 LPA1, LPA2, 그리고 LPA3와 같은 동형체(isotype)가 있으며, 이들은 백일해 독소에 민감한 Giα와 결합하여 (An et al., 1998) 아데닐일 시클라아제의 활성을 억제하며, 그 결과 cAMP을 감소시킨다고 알려져 있다(Taussig et al., 1993). 다만, 전술한 바와 같이, 노화세포에 있어서는 LPArk cAMP를 증가시킨다는 것이 알려져 있다(Jang et al., 2006; Jang et al., 2003)

본 발명의 조성물은 상처 치유, 특히 노화 세포 또는 나이든 개체의 피부 상처를 치유할 목적으로 사용될 수 있으며, 이들 상처의 깊이는 앝거나 깊을 수 있으며, 피부의 진피 및 표피의 손상을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, ACI 및 LPA는 젊은 세포 또는 젊은 개체와 달리 노화 세포 또는 상처난 나이든 개체에 사용하면 세포의 증식을 증가시킬 뿐만 아니라 상처부위로 신속히 세포를 이동시키고, 상처 치유를 촉진한다. 또한, LPA와 ACI를 노화세포에 동시에 처리하게 되면 LPA 및 ACI를 단독으로 처리했을 때 보다 더 효과적으로 세포이동이 유도됨을 발견하였으며, 이러한 현상은 젊은 세포에 처리되었을 때와는 다른 양상으로 나타난다. 또한 나이든 개체의 상처부위에서도 LPA 및 ACI를 동시에 처리하게 되면 LPA 및 ACI를 단독으로 처리했을 때 보다 더 효과적으로 상처 부위가 치유됨을 확인할 수 있다.

본 발명의 노화세포에 대한 상처 치유 촉진용 조성물에 있어서, 상기 LPA 및 ACI는 동시에 또는 LPA 및 ACI를 순서에 상관없이 순차적으로 처리되는 것을 모두 포함한다.

본 발명에서 노화 세포 또는 나이든 개체의 대상은, 동물이며, 바람직하게는 포유동물이며, 가장 바람직하게는 인간이다.

또한, 본 발명에서 ‘나이든’은 평균수명을 기준으로 하여 평균수명× 0.1을 뺀 만큼의 나이 이상을 의미하며, 예로서, 평균수명이 65세인 사람의 경우, 65-(65× 0.1)=58.5세 즉 59세 이상의 개체의 경우 나이든 개체로 해석할 수 있다. 본 명세서에서는 사람의 경우 60세 이상의 경우를 나이든 개체로 인식하였다.

또한 상기 아데닐일 시클라아제 억제제(ACI)는 예를 들어, 2',5'-디데옥시아데노신 (2',5'-dideoxyadenosine), 시스-N-(2-페닐시클로펜틸)아자시클로트리덱-1-엔-2-아민 (cis-N-(2-phenylcyclopentyl)azacyclotridec-1-en-2-amine: MDL12,330A hydrochloride), 및 9-(테트라히드로-2'-푸릴)아데닌 (9-(tetrahydro-2'-furyl) adenine: SQ22536)이 있으며, 가장 바람직하게는 9-(테트라히드로-2'-푸릴)아데닌이나, 이에 특별히 한정하는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “노화(senescene)”는 노화(aging)와 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서에서 사용된 용어, “상처”는 조직이 절단되거나, 찍어지거나, 부서지거나, 타거나, 또는 외상을 입거나, 또는 이러한 손상을 유발하는 장애 또는 질환으로부터 발생된 대상에 대한 손상을 의미한다.

또한 본 명세서에서의 용어, “치유”는 상처가 발생한 때부터 상처가 완전히 수축하기까지의 시간이 촉진되거나 가속되는 것을 의미한다.

본 명세서에서, “조직”은 함께 집단을 이루어 특정 기능을 형성하는 대상 내의 세포 덩어리를 의미하며, 그 예로서, 뼈, 피부, 결합조직 및 신경 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서, “치료”, “치료하는”은 치유적 방법을 의미한다. 또한 “치료적 유효량”은 대상에게 치료적으로 유익함을 부여하기 위해 필요한 최소한의 함량을 의미하며, 예컨대, 상처를 앍고 있는 인간에 대한 “치료 유효량”은 치유와 관련된 병리학적 증상, 치유 진행, 생리학적 상태를 유도, 촉진, 가속 또는 개선시키거나 또는 치유가 지체되는 치유 내성을 완화시키는 함량이다.

본 발명의 약학적 조성물은 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 인간에게 비옥성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제를 포함할 수 있다. 생리학적으로 허용되는 담체는 종종 ph 완충 수용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예로는, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 친수성 중합체; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대, EDTA; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 카운트이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리옥시이틸렌 스르비탄 지방산 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 및 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 약학적 제형으로 제제화 될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 제약학적 조성물에 유용한 것으로 공지되어 있는 적합한 제약 희석제를 사용할 수 있다. 이러한 희석제로는 염수, 완충된 염수, 엑스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합물이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 또한 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량의 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있으며, 유효성분의 생리적 활성을 최대한 유지시키기위해 적정량의 염 또는 pH 조절제가 용해된 완충용액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 유효성분이 효과적으로 작용하게 하기 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함하여 투여할 수있다.

적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Phamaceutical Science(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 조성물은 투여방식에 적합해야 하며, 통상적인 방법, 예컨대 경구 및 비경구의 경로로 투여할 수 있고, 비경구 투여의 경우 직장, 국소적, 정맥내, 복강내, 근내, 관절내, 피하, 비강내, 흡입, 안구내, 피내 경로에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 일반적으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있으며, 일일에 단회 내지 수회에 나누어 투여량을 결정할 수도 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명은 LPA 및 ACI의 유효량을 노화 세포 및 노화된 대상에 처리하는 상처 치유를 촉진하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 구현예에 따르면, 상기 상처 치유의 대상은 동물이며, 바람직하게는 포유동물이며, 가장 바람직하게는 인간의 노화 세포 또는 인간 개체이다.

본 발명의 방법 및 상술한 조성물 가운데, 중복된 내용은 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다. 또한 특별히 정하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 요지가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예>

1. 실험재료

실험에 사용된 시약은 다음과 같다: 세포 배양을 위한 배지로는 DMEM을 사용하였고, dibutyryl-cAMP, 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU), 에오신(eosin), 헤마토자이렌 및 페록시다아제 라벨된 항-마우스 2차 항체( (hematoxylin and peroxidase (HRPO))labeled anti-mouse (goat) secondary antibody (rat serum protein-absorbed)); Sigma, USA); 우태아혈청(fetal bovine serum), 페니실린, 스트렙토마이신 포함 항생제(Gibco/BRL Life Technologies, Inc, USA), 일반적인 ACI SQ22536(Calbiochem, San Diego, CA, USA), cAMP assay kit, [³H]-cAMP, 및 [³H]-thymidine(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK), 메톡시플로란(methoxyflurane (Metophane);Smith Kline Beecham), 트립신 및 자이메드 픽쳐 플러스 키트(Zymed), (항-PCNA (NCL-PCNA) 항체(novocastra), 항체-Brd-U IgG₁, anti-PCNA monoclonal IgG, Protein block serum free, 및 아비딘-바이오틴 퍼옥시다아제 복합체 키트(the avidin-biotin peroxidase complex (LSAB) kit)(Dako; Copenhagen, Denmark); electric diamond bar (Academy Science Korea); 퍼마운트 및 히스토아크릴(Fisher Scientific, Atlanta GA, USA.)를 실험에 재료로 사용하였다.

2. 동물

실험에 사용한 쥐(rat)는 6 개월령과 24 개월령을 샘타코에서 구입하여 사용하였으며, 케이지당 2 마리씩 넣어 온도와 습도를 조절하며 12:12시간으로 밝기를 구별하여 보관하였다. 쥐들은 한국 실험동물 협회의 규정에 따르는 통상적인 방법에 따라 정상의 식이 요법과 물의 섭취를 자유식으로 하여 사육하였다. 동물대상은 각 처리그룹당 9마리로 구성된 군으로 나누어 실험에 이용하였다.

3. 세포배양

사람의 혈관 내피 세포 (HUVEC)는 Whang 등에 의한 방법을 응용하여 사람의 탯줄 내피세포로 부터 획득하였다(Whang et al., 2005). 포피 섬유아세포와 각질형성세포는 태아의 세포로부터 Boyce 및 Ham 등에 의한 방법으로 분리하였다(Boyce and Ham, 1983). 상기 조직은 수여자로부터 동의를 얻어 서울대학교의 윤리위원회의 심의를 통과하여 실험을 수행하였다. 획득 및 분리한 섬유아세포와 혈관 내피 세포는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 항생제가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였으며, 각질형성세포는 항생제가 포함된 KGM(keratinocyte growth medium) 배지에서 배양하였다. 초기부터 배양한 세포를 배양하여 노화 세포를 얻었으며, 이 노화 세포를 이용하여 실험을 수행하였다(섬유아세포의 경우 젊은 세포는 PD25, 노화 세포는 PD 65-70으로 실험을 수행하였으며, 혈관내피세포의 경우에는 젊은 세포가 PD5, 노화 세포는 PD 10-12에서 수행하였다). 노화 세포는 젊은 세포에 비해 그 크기가 커지는 등의 형태적인 변화 및 베타-갈락토시다아제 활성이 증가와 세포증식의 감 소되는 등의 특징이 있다(Yeo et al., 2000). 세포는 LPA나 ACI를 처리한 후 이틀 동안 키웠을 때 60-70% 정도로 성장하게 조절하였으며, 그런 다음, 0.1% BSA가 포함된 무혈청 DMEM 배지(섬유아세포 또는 혈관내피세포의 경우) 또는 KBM 배지(각질형성세포의 경우)에서 이틀간 배양하여 혈청을 고갈시켰다.

4. cAMP의 측정

세포를 12-웰 플레이트에서 배양한 후 도 2의 범례에서 나타낸 바와 같이 다양한 농도의 ACI를 처리하였다. 배지를 제거한 후, 2.5M의 과염소산(perchloric acid)를 플레이트에 처리하였다. 획득된 산 추출물은 사용하기 전까지 20℃ 에서 보관하였으며, 이 추출물을 4.2M KOH로 중화시킨 후 cAMP 결합 단백질인 cAMP-의존 단백질 키나아제의 RIα 에 [³H]-cAMP를 경쟁반응시켜 cAMP 함량을 측정하였다(Jang and Juhnn, 2001). 추출 후 세포들은 0.1N NaOH로 분해한 다음 브래드포드 단백질 검사용액을 이용하여 단백질 함량을 계산하였다. cAMP의 함량은 산-용해성 단백질의 함량에 대비하여 표준화하였다(단백질 농도 당 cAMP의 함량으로 표시).

5. DNA 합성

무혈청 배지를 사용하여 젊은 세포와 노화 세포를 세포 성장이 억제되도록 만든 후에, 비히클(아무것도 처리하지 않은) 또는 dbcAMP 나 ACI를 2시간 동안 처리하였다. 그런 다음, [³H]-thymidine(0.5 mCi/ml) 존재하에서 LPA를 처리하여 36시 간 동안 추가 배양하였다. PBS로 4번 세척하여 라벨링되지 않은 방사성 타이미딘을 제거한 후에, DNA를 10% TCA로 침전시키고, 5N NaOH로 분해하였다. 그런 다음 중화된 분해물에서의 방사활성을 신틸레이선 칵테일을 이용하여 측정하였다. 이렇게 측정된 방사활성을 대조군과 비교하여 단백질의 합성 정도를 확인하였다.

6. 생체 내에서 상처 치유 분석

LPA에 의한 유도된 세포의 이동은 이전에 설명한대로 세포가 없는 부분으로 세포가 움직이는 능력을 평가하였다(Shiraha et al., 2000). 세포를 10cm의 플라스틱 디쉬에 이식 후 10% FBS가 포함된 배지에서 70-80% 정도로 배양하였다. 그런 다음, 이틀간 0.1% BSA가 포함된 무혈청배지에서 세포를 유지시켰다. 그 후에 비히클, ACI(300 μM) 또는 dbcAMP(1 mM)를 처리하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 팁을 사용하여 세포에 긁어내어 일정한 지역의 세포들을 없애고, LPA(30μM)를 처리 또는 무처리하여 배양하였다. 이렇게 처리한 세포를 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 60시간 및 72시간 동안 관찰하면서 사진을 찍어 세포가 없는 부분으로 이동된 세포의 수를 측정하고 계산하였다.

7. 동물의 피부 상처의 발생과 면역조직 화학 염색의 준비

케타민과 자일라진(87/13 mg/kg)을 쥐의 복강에 주입하여 마취하였다. 피부에 상처를 내고 Balazs(Balazs et al., 2001)의 방법을 응용하여 피부 부위를 보호하는 시술을 시행하였다. 이를 서술하면, 도 1A에서처럼 쥐의 등에 면도를 하여 상처 낼 부분의 털을 제거하였다. 그 후에 다이아몬드 바를 사용하여, 피부찰상을 내는 기술을 이용하여 4 군데에 2도 정도의 부분 두께만 제거한 1.0 cm지름의 원을 만들었다. 또한 상처 부위에 1.2cm정도의 지름을 가진 테프론 챔버를 조직접합체인 Histoacryl과 수술용 나이론 실(Ethicon 4-0)을 사용하여 고정하였다(도 1C). 외상의 상처부위를 보호하기 위해 LPA나 ACI 같은 시약을 처리할 때도 유리필터(GF-C Whatman) 를 사용하여 뿌린 후 처리해 주었다. 이러한 실험은 실험의 일관성과 정확성을 위하여 한 명의 성형외과의에 의해 수행되었다. 30 LPA, 300 ACI 및 LPA(30 )+ ACI(300 ) 혼합물을 각각 200 가 되도록 식염수에 용해하여 준비해 두고, 쥐를 흡입 마취시킨 후 이틀에 한 번씩 상처 부위에 처리해 주었다(corresponding to 30 pmol/mm²). 또한 대조군에는 아무 시약도 없이 식염수만을 동량(200 )으로 처리하였다.

각 군의 실험동물은 수술 후 각 2일, 4일 및 6일에 케타민과 자이라진을 이용하여 마취한 다음, 500 의 식염수에 용해한 BrdU 50 mg/kg을 경정맥에 주입하였다. DNA 합성 정도로 세포 증식되는 세포를 구별하기 위해 약 45분의 시간을 둔 후 동물의 조직을 얻기 위해 pH 7.4 의 PBS (인산염생리식염완충액) 에 4%(wt/vol) 파라포름알데하이드를 사용하여 심장 혈관에 주입하여 동물을 희생시켰다. 그 후 상처 조직을 차가운 10% 파라포르말린에 담궈 밤샘 처리한 후 파라핀 포매조직을 만들어 5-mm 두께로 박절하였다.

8. 면역조직화학염색

4μm 두께로 순차적으로 조직을 잘라 H&E 면역조직염색을 수행하였다. 박절된 파라핀 포매조직을 자이렌(xylene)과 알코올(alcohol)로 각각 탈파라핀 및 함수시켰다. 각각의 항체에 따라 10mM citrate buffer(pH 6.0) 에 700W로 10분 동안 전자렌지 오븐에서 700w 로 15분 동안 끓인 후 항원을 얻었다. 그 후 절편을 3% 과산화수소에 담구어 내인성 과산화효소의 작용을 차단시킨 후 TBS 완충용액(0.05 M, pH 7.6)에서 수세하였다. 이렇게 얻어진 슬라이드는 실온의 5% 차단완충용액에서 1시간 동안 비특이성 단백의 염색을 차단하였다. 그 후에 이 슬라이드를 각각의 원하는 항체(1차 항체)가 포함된 차단완충용액에 넣어 4 °C 에서 밤새 반응시켰다. 이때 쓰인 항원으로는 BrdU IgG₁ (1:200); PCNA mIgG(1:2,000)이다. 그 후에 LSAB 키트를 사용하여 아비딘-바이오틴 퍼옥시다아제의 결합반응을 시켰으며, 다른 슬라이드도 헤마톡실린 염색을 통해 형태비교를 하였다. 슬라이드는 순차적으로 에탄올로 탈수 및 자이렌으로 씻어낸 후 퍼마운트로 봉입하였다.

9. 상처 치유의 평가

조직병리학적 분석을 통해 상처 치유 정도를 확인하였다. 일단 H&E 염색을 통해 상피조직의 세포증식 정도를 확인하였다. 세포의 증식을 구별하기 위해 BrdU나 PCNA를 사용하여 면역과산화 효소방법을 통해 염색한 후 옵티마스 이미지 분석 프로그램을 사용하여 그 숫자를 세어 확인하였다(Media cybernetics, version 6.2, Silver Spring, MD, USA). 이렇게 계산된 세포는 상처 부위의 모든 부분에 해당되는 표피 부분에서 상대적으로 양성 염색된 세포의 수(백분율)를 계산하였다.

10. 통계학적 분석방법

통계분석은 Graph-Pad Prism(GraphPad, San Diego, CA) 을 이용하였다. 이때 약물을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹간의 결과는 사후 검증방법으로 t-test을 시행하여 분석하였다. 이 때 자료는 평균± 표준편차로 표시하였으며, 통계적 유의성을 검정하기 위한 유의수준은 0.05, 0.01, 0.01로 각각 *, **, 그리고 *** 로 나타 내었다. 또한, P값이 0.05 이하인 것을 의의 있는 것으로 판독하였다.

<결과>

1. 노화 세포에서 AC억제는 LPA 자극에 의한 세포의 증식을 증가시킴

섬유아세포에 LPA와 ACI를 처리했을 때, cAMP의 정도와 세포의 증식 비율 이 조절됨을 확인한 후(젊은 세포는 LPA를 처리하면 cAMP가 낮아지고, 노화 세포에서는 높아지는 동시에 두 세포에서 모두 세포증식을 유도하며 노화 세포에서 ACI를 처리하면 cAMP가 다시 낮아지며 LPA를 처리했을 때보다 세포증식이 더욱 증가되며 LPA와 ACI를 동시에 처리할 경우 그 효과는 더욱 커진다), 본 발명자들은 노화된 섬유아세포, 나이든 기증자로부터 받은 섬유아세포, 혈관내피세포, 그리고 사람의 각질형성세포에 투과성이 있는 cAMP의 유사물 (dbcAMP- cAMP의 농도를 높이는 효과를 지님)과 ACI (SQ22536- cAMP의 농도를 낮추는 효과를 지님)을 처리하여 LPA에 의한 DNA 합성과 세포증식의 정도가 어떻게 효과를 나타내는지 비교하여 보았다. 젊은 세포와 노화 세포에 ACI를 농도 별로 처리하게 되면 농도 의존적으로 cAMP가 감소됨을 확인하였으며, 그 때 농도는 300 μM의 ACI가 젊은 세포와 노화 세포에서 적정함을 확인하였다(도 2). 젊은 세포와 노화 세포에 다양한 농도의 LPA (1-70 μM) 를 처리하고 dbcAMP나 ACI를 4일간 처리하여 세포의 숫자를 확인하였다(도 3). 그림 3에서 보는 것처럼, LPA는 젊은 세포와 노화 세포 모두에서 농도 의존적으로 세포 증식을 증가시켰다. ACI의 경우에는 젊은 세포와는 다르게 노화 세포에서는 세포의 숫자(세포의 증식을 나타내는 방법인 세포의 숫자를 말함)가 현저하게 증가됨을 확인하였다 (도 3B). LPA를 처리한 후 dbcAMP를 처리하게 되면 젊은 세포와 노화 세포에서 LPA에 의해 증가된 세포의 증식이 감소됨을 확인하였다(즉 cAMP 가 높아지면 세포의 증식이 낮아짐을 의미함). DNA의 합성 정도를 확인하기 위해 [³H]-싸이미딘 인코퍼레이션 ([³H]-thymidine incorporation)을 도 4에서처럼 수행하였다. 노화 세포에서는 기본적인 DNA 합성이나 또 LPA를 처리했을 때 증가되었던 DNA 합성이 dbcAMP을 처리하게 되면, 감소되었지만, ACI를 노화 세포에 처리하게 되면 DNA 합성이 증가됨을 확인하였다 (도 4A-노화 세포). 이러한 ACI의 효과는 젊은 섬유아세포와 노화된 섬유아세포 뿐 아니라 혈관내피세포 (도 4C)와 각질형성 세포 (도 4D)에서도 수행하였다. 그 결과 노화된 각종 세포에의 기본 수준과 LPA에 의해 상태에서 ACI을 처리하게 되면 모두 싸이미딘 인코퍼레이션이 증가됨을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 노화 세포에서, ACI나 LPA에 의해 세포의 숫자 또한 확인 해 보았으며, 이러한 세포의 증가는 세포의 종류에 따라 조금씩 그 정도의 차이를 보였다(도 5). 이러한 결과들은 cAMP의 증가가 미토겐 자극을 억제하는 신진대사의 역할을 하며, ACI는 섬유아세포를 포함한 혈관내피세포와 각질형성 세포 같은, 여러 종류의 노화 세포에서 cAMP의 증가를 낮춤으로써 DNA 합성과 세포의 증식을 증가시킨다는 결론을 얻을 수 있다.

2. ACI는 노화 세포에서 LPA에 의해 증가된 세포의 이동을 더욱 증가시킴

cAMP의 농도와 PKA의 활성은 세포의 이동을 조절함이 알려져 있으며(Chen et al., 2005; Shiraha et al., 2002), 본 발명자들은 dbcAMP와 ACI을 처리하였을 (cAMP의 농도를 조절하였을 때) 때 세포의 증식과 동물에서 상처 치유에 어떤 효과를 나타내는지 확인하였다. 젊은 세포와 노화 세포를 플레이트에 깔아둔 후 정확하게 파이펫 팁을 사용하여 상처를 내어 공간을 만든 후 무혈청 상태로 세포를 배양하였다. 그 후 30 의 LPA를 dbcAMP와 ACI를 미리 처리해 놓은 곳과, 아무것도 처리하지 않은 곳에 처리한 후, 본 발명자들은 72시간 동안 세포의 이동과 세포의 숫자를 세어 확인하였다(도 6A와 6B).

72시간 후 막대 그래프를 그려 LPA와 dbcAMP 혹은ACI를 처리한 세포의 변화를 확인하였다(도 6에C와 D). 도 6에서 보여주는 것처럼, 무혈청에서의 젊은 세포와, LPA를 처리한 젊은 세포의 경우 시간이 지나면서 점차 세포의 이동이 증가됨을 확인할 수 있었다(도 6C) (아무것도 처리하지 않은 것보다는 LPA를 처리했을 때 세포의 이동이 증가됨) 이와 반대로, 노화 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 무혈 청 상태에서는 세포의 이동이 거의 없었지만(도 6B), LPA를 처리하게 되면 72시간 후에 세포의 이동이 현저하게 증가됨을 확인하였다(도 6D). 그러나 젊은 세포와 노화 세포에 dbcAMP을 처리했을 경우에는 세포의 이동을 확인 할 수 없었다. 젊은 세포에 ACI를 처리했을 때는 세포의 이동에 변화가 없는 반면(도 6A와 6C), 노화 세포에서는 ACI만을 처리하여도 세포의 이동이 증가되었으며 LPA와 ACI를 동시에 처리하게 되면 세포의 이동이 ACI만을 처리했을 때 보다 현저하게 증가됨을 확인하였다. (도 6B와 6D). 이러한 결과를 통해 노화 세포의 이동에 LPA 만이 아니라 ACI을 같이 처리했을 때 세포의 이동이 더욱 빠르게 증가됨을 확인하였다.

3. ACI는 늙은 Fisher 344쥐의 상처 치유를 개선시킴.

젊은 쥐와 늙은 쥐에서 LPA와 ACI에 의한 상처 치유 반응을 확인해 보았다. LPA (30 ), ACI (300 ), 그리고 LPA와 ACI를 섞어 이틀에 한 번씩 상처를 낸 동물에 처리하였다. 4일 후 사진을 찍어 확인 해 본 결과 (도 7) 젊은 쥐에 아무것도 처리하지 않는 실험군이 늙은 쥐에 아무것도 실험하지 않는 실험군보다 상처 치유가 빠른 것을 확인 할 수 있었다. LPA와 ACI를 단독이나 혹은 같이 처리한 경우, 아무것도 처리하지 않았을 때 보다 약물을 처리했을 때 상처 치유 속도가 빠르다는 것을 확인하였다. 상처를 내고, 약물을 처리한 후 4일 뒤에, 각각의 상처 난 부위와, 약물 처리한 군을 각각 슬라이드로 만들었으며, 이러한 방법은 실험방법에 기술하였다. 상처 치유 과정의 상피세포의 생성과 세포 증식은 헤마톡실린과 에오신 (H&E) 염색과, 증식세포의 핵 항원(PCNA)로 확인하였다. 4일 뒤에 젊은 쥐에 상피 세포 생성 정도는 대조군과 약물 치료 군 모두 비슷한 정도를 나타내었다. 하지만, 노화된 쥐의 4일 후 상처 치유의 정도를 확인 해 본 경우 아무것도 처리하지 않은 군에 비해 LPA, ACI 그리고 LPA와 ACI를 같이 처리하게 되면 상처 치유가 현저하게 증가되어 있음을 확인할 수 있다 (도 9A와 9B). 늙은 쥐에서는 PCNA의 염색이 대조 군에서는 매우 흐린 반면, LPA, ACI 그리고 LPA와 ACI를 처리한 경우에 염색이 현저하게 증가되어 있음을 확인하였다. 또한 PCNA가 염색된 세포의 숫자를 세어 확인해 보아도 LPA, ACI 그리고 LPA와 ACI를 동시에 처리한 그룹에서 증가되어 있으며, 특히 늙은 쥐에서 현저하게 그 수가 증가되어 있었다 (도 9C). 이러한 결과들은 ACI에 의한 cAMP 수준의 감소가 상처 치유에 도움이 된다는 것을 확인시켜 준다.

<토론>

동물의 경우 화상에 의해 피부에 상처가 나게 되면, 상처부위를 핥음으로써, 상처 치유가 잘 된다는 것이 알려져 있다. 이는 침에 포함된 EGF가 상처 부위를 핥음으로써, 상처 부위에 도움이 되는 것으로 알려져 있으며, 이러한 것은 화상을 입은 환자의 경우에도 EGF가 풍부한 인공 침을 사용하였을 때도 상처 치유에 도움이 됨이 알려져 있다(Jahovic et al., 2004). PDGF나 RTK같은 피부 섬유아세포의 미토겐 길항제의 경우 화성에 의한 상처 치유에 도움이 되는 것이 알려져 있다(Wang et al., 1996). 그러나, 이러한 성장인자들의 경우 늙은 동물이나 나이든 사람에게서 성장인자들의 수용체 자체가 감소되어 있어 외부에서 자극을 주어도 세포의 증식에는 도움이 못 된다는 것을 발표한 바 있다(Yeo et al., 2002).

LPA의 경우에는 시험관내에서 실험을 해 보면 상처 치유를 증가시킴이 알려져 있다(Balazs et al., 2001). 또한 이전 연구를 통해 G-protein coupled 수용체에 의해 작용하는 LPA의 경우 노화된 세포에서 모두 감소되지 않고 일정 부분 남아 있음(Jang et al., 2003)으로써 신호전달이나, 세포의 증식이 일어남을 확인한 바 있기 때문에 늙은 동물이나 나이든 사람의 상처 치유에 적절한 것으로 생각된다. 이번 연구를 통해 노화 세포에서 LPA에 의한 DNA 합성 증가(도 4), 세포증식(도 5), 그리고 세포의 이동(도 6)을 확인해 보았다.

또한, EGF와는 다르게 LPA의 경우 늙은 쥐에서 상처 치유를 증가시킴을 확인하였다 (도 7, 8 그리고 9). LPA는 또한 젊은 세포에 비해 노화 세포에서 cAMP의 수준을 증가시킨다. 이러한 증가는 Giα에 의한 AC 2, 4 그리고 6번의 아이소폼에 의해 PKC 의존적으로 일어난다(Jang et al., 2006a). cAMP의 유사체나 cAMP을 증가시키는 시약들의 경우 세포의 증식을 증가시키는데, 본 발명자들은 노화 세포에 LPA를 처리했을 때 증가된 cAMP의 수준이 DNA 합성이나, 세포의 증식을 감소시키는 요인일 것이라 추측하여 노화 세포의 cAMP의 수준을 조절함으로써 노화 세포의 증식을 조절할 수 있을 것이라 생각하였다. 그래서 실제로, 본 발명자들은 노화 세포에 LPA를 처리하여 cAMP의 수준을 높인 후(도 4)에 cAMP 유사체나, dbcAMP 처리에 의해 노화 세포가 증가하는지(도 3 ) 및 ACI를 처리하여 미토겐의 증가현상을 확인하여 보았다(Rhim et al., 2008, in press). 이러한 본 발명자들의 실험을 뒷받침 해주는 것들로는 미토겐 현상을 감소시키는 TIMP-2가 ACI에 의해 증가됨이 알려져 있다(Hoegy et al., 2001). 또한 PKA의 증가 또한 세포 증식을 감소시키는 중요 한 것임이 알려져 있다(Liu et al., 1986).

노화 세포에서 LPA에 의한 cAMP의 증가는 또한 PKA도 활성화시키며(Jang et al., 2006b), 이러한 것은 Raf/ERK 신호전달을 통해 DNA 합성을 감소시키게 된다(Chuang et al., 1994; Mischak et al., 1996; Wu et al., 1993). cAMP 의 수준은 또한 여러 가지 대사 신호들과 호르몬의 자극에 의해서도 조절이 된다. 이러한 cAMP의 역할은 노화 세포의 미토겐 반응을 조절하며 더 나아가 노화의 현상과 관련된 퇴행성 변화에도 영향을 미침을 생각해 볼 수 있다. 이러한 관찰을 통해, 본 발명자들은 식이제한에 의한 생명연장과 노화와 관련된 여러 가지 생리학적 그리고 병리학적 변화와 관련하여cAMP 의 중요성에 대해 재평가 해 봐야 한다는 것을 어림짐작해 볼 수 있다(그만큼 cAMP 의 역할이 중요함).

LPA는 신경세포의 헤테로트라이메릭 GTPases 인 G₁₂/G₁₃ (Kranenburg et al., 1999) Swiss 3T3 (섬유모세포) 세포 및 야생형과 Gαq/Gα11 결핍 생쥐에서 유래된 섬유아세포의 G₁₃ (Gohla et al., 1998) 를 통해 Rho를 활성화시켜 세포의 이동을 유도시킬 수 있다. 우리의 결과는 젊은 세포와 노화 세포에서 LPA에 의해 Rho가 활성화되어 세포의 이동이 증가되었음을 확실히 보여준다 (도 6). dbcAMP, 포스콜린(forskolin), PGE 그리고 이소프로테레놀(isoproterenol) 같은 섬유아세포의 cAMP 수준을 증가시키는 시약들은 PKA(Kohyama et al., 2001)을 활성화시킴으로써 세포의 이동을 억제할 수 있다. 또한 이러한 cAMP/PKA 신호전달은 매끈한 근육 세 포(SMC) 에서도 세포의 이동을 억제한다(Goncharova et al., 2003; Horio et al., 1995; Itoh et al., 2001; Sun et al., 2002; Zhu and Hui, 2003). cAMP 에 의한 세포 이동의 억제에는 RhoA 또한 연관되어 있음이 알려져 있다(Buchan et al., 2002; Chen et al., 2005; Mukai et al., 2000). 젊은 섬유아세포에서, LPA를 처리하게 되면 Rho가 활성화 되어 PKA를 완전히 억제시키는 반면, 노화 세포에서는 Rho가 일부분의 PKA 활성만을 억제시켜, 노화 세포의 이동을 감소시키는 원인일 것이다(Jang et al., 2006b). 그러므로, 노화 세포에 dbcAMP나 ACI에 처리하여 cAMP의 수준을 조절하면 세포의 이동에 영향을 줄 수 있을 것이다. 이번 연구를 통해 LPA에 의해 유도된 세포의 증식이 dbcAMP에 의해 (cAMP 수준을 낮춤으로써) 감소됨을 확인하였다. 우리가 예상한 대로, 노화 세포의 세포이동은 LPA만 처리했을 때 보다 LPA와 ACI를 같이 처리하였을 때 현저하게 증가됨을 확인하였다 (도 6). 쥐에 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 ACI만을 처리하거나, LPA와 ACI를 같이 처리하게 되면 세포의 증식이 현저하게 증가됨을 확인할 수 있다 (그림 7-9). 이러한 LPA나 ACI의 효과는 젊은 쥐보다 늙은 쥐에서 도 효과적으로 나타났다. 이것은 LPA와 ACI를 같이 처리하는 것이 늙은 동물의 피부 상처 치료제로써 더욱 좋은 선택임을 제시해 준다.

dbcAMP, 포스콜린(forskolin), 콜레라 톡신(cholera toxin) 및 3-이소부티릴-1-메틸산틴 같은 cAMP을 증가시키는 시약들은, MM-1 세포 같은 쥐의 복수 간세포에서 LPA에 의해 유도되는 세포의 이동 (생체내의 전이) 을 억제시킨다(Mukai et al., 2000). 알파6베타4 인테그린들은 세포 내 cAMP을 감소시켜, MDA-MB-435 같은 가슴 종양 세포의 화학주성적 이동을 시키는 주요원인이 되기도 한다(O'Connor et al., 1998).

cAMP/PKA 그리고 RhoA 같은 신호전달 계들의 상호작용에 의해 세포의 형태변화나, 세포골격의 변화, 세포이동과 위나 전립선 암 세포들의 고정-독립적인 성장 등 여러 가지 생물학적 특징을 보이게 된다(Chen et al., 2005).

요약하면, 우리의 이번 연구를 통해 cAMP 수준의 감소가 노화 세포의 증식과 이동, 그리고 노화된 동물의 피부 상처 치유를 조절하는 중요한 요소임을 나타내 준다. 더 나아가 동물뿐 아니라 나이든 사람의 상처 치유에도 적용 할 수 있는 중요한 발견이라 하겠다.

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도 1은 쥐의 등 상처 수술을 보여주는 것으로, 쥐는 케타민과 자이렌을 복강 주사하여 마취한다. 쥐의 등을 면도한 후에 (A) 4군데에 직경 1.0 cm의 원 모양의 상처를 낸다 (B). 이렇게 상처 난 부위는 테플론 재질의 챔버 끝을 수술바늘을 통해 고정시킨다(C).

도 2은 ACI에 의한 젊은 세포와 노화 세포의 cAMP수준의 감소를 보여주는 것으로, 세포를 20번 정도 계대배양하여 얻은 젊은 세포와 65번 한 노화 세포에 ACI를 여러 농도로 1시간동안 처리해 준다. 그 후에 cAMP 결합 검사법인 산 추출법을 사용하여 cAMP수준을 측정한다. 그 결과는 통계적으로 유의함을 보여준다.

도 3은 LPA 에 의해 유도된 젊은 세포와 노화 세포의 증식에 cAMP 유도체와 ACI가 미치는 영향을 보여는 것으로, 계대배양하여 얻은 젊은 세포와 (PD 25, A) 노화 세포 (PD 73, B) 를 이틀간 무혈청 상태로 배양하다가 LPA, 1 mM의 dbcAMP 혹은 300 의 ACI(SQ22536)를 4일간 처리하였다. 그 후에 세포의 숫자를 계산하였다. 이 때 얻은 결과는 통계적으로 유의함을 보여준다.

도 4는 젊은 세포와 노화 세포에서 cAMP 유사체와 ACI를 처리했을 때 싸이미딘 인코퍼레이션의 효과를 보여주는 것으로, 계대배양하여 얻은 젊은 세포(PD 25)와 노화 세포(PD 73)(A), 젊은 사람과 나이든 기증자로부터 얻은 섬유아세포 (B), 혈관내피세포(C) 그리고 피부 각질 형성세포(D)를 이틀간 무혈청 상태로 배양하다가 1 mM 의 dbcAMP 혹은 300 의 ACI(SQ22536)를 2시간 처리하였다. 그 후에 이 세포에 30 의 LPA를 처리한 후 0.5 /ml of [³H] 방사선 동의 원소를 처리하여 주었다. 그 후에 동의 원소의 합성 정도를 계산하여 DNA 합성이 어느 정도 되는지 계산하였다. 이 때 얻은 결과는 통계적으로 유의함을 보여준다.

도 5는 젊은 세포와 노화 세포에서 cAMP 유사체와 ACI를 처리했을 때 세포증식 효과를 보여주는 것으로, 계대배양하여 얻은 젊은 세포와(PD 25) 노화 세포 (PD 73)(A), 젊은 사람과 나이든 기증자로부터 얻은 섬유아세포 (B), 혈관내피세포 (C) 그리고 피부 각질 형성세포 (D) 를 이틀간 무혈청 상태로 배양하다가 LPA를 처리한 후 1mM dbcAMP 혹은 300 의 ACI(SQ22536)를 4일간 처리하였다. 그 후에 세포의 숫자를 계산하였다. 이 때 얻은 결과는 통계적으로 유의함을 보여준다.

도 6은 LPA에 의해 유도된 세포의 증식에 cAMP 유사체와 ACI가 미치는 영향을 보여주는 것으로, 계대배양하여 얻은 젊은 세포와 (A, C) 노화 세포 (B, D)를 이틀간 무혈청 상태로 배양하다가 ACI 혹은 1mM dbcAMP를 2시간 37 °C에서 배양하였다. 노란색 팁을 사용하여 일정부분 상처를 낸 후에 30 LPA를 처리하여 배양하였다. 이렇게 배양된 세포를 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 60시간, 그리고 72시간 배양한 후 이동된 세포의 숫자를 계산하여 A와 B의 그 래프를 그렸다. LPA나 ACI 그리고 LPA와 ACI을 동시에 처리한 후 72시간 된 그래프는 유의적으로 세포의 수가 증가되었음을 보여준다. 이 때 얻은 결과는 통계적으로 유의함을 보여준다. 세포 이동 실험은 각각 P값이 0.001 이하인 것을 대조군과 비교하여 의의있는 것으로 판독하였다.

도 7은 LPA나 ACI에 의한 상처 치유의 효과를 보여주는 것으로, 젊은 쥐와 늙은 쥐를 그림 1에서 설명한 것처럼 마취한 후 상처를 냈다. 그 후에 LPA(30 ), ACI(300 ), 그리고 LPA 와 ACI를 섞어 200 로 생리식염수에 녹인 후 멸균 된 유리 필터를 사용하여 이틀에 한번씩 4일간 상처부위에 처리한 후, 상처부위의 사진을 찍었다.

도 8은 H&E 염색을 통한 상처의 상피세포를 시각화하여 보여주는 것으로, 젊은 쥐와 늙은 쥐를 그림 1에서 설명한 것처럼 마취한 후 상처를 냈다. 이러한 상처 부위에 LPA (30 ), ACI (300 ), 그리고 LPA와 ACI를 섞어 그림 2에서처럼 처리하여 주었다. 그 후 4일 뒤에 실험 방법에 기술한 것처럼 마취하여 조직을 얻었다. 상처부위의 조직을 약 5mm 두께로 파라핀 고정을 하여 잘라내었다. 순차적으로 잘라낸 조직은 H&E 염색을 하였다. 이 H&E 염색은 각각의 조직의 꼭대기의 상피세포를 시각화 하여 보여준다.

도 9는 PCNA염색을 통한 상처의 회복상태를 시각화 하여 보여주는 것으로, 젊은 쥐와 늙은 쥐를 그림 1에서 설명한 것처럼 마취한 후 상처를 냈다. 이러한 상처 부위에 LPA (30 ), ACI (300 ), 그리고 LPA 와 ACI를 섞어 그림 2에서처럼 처리하여 주었다. 그 후 2일, 4일 그리고 7일 뒤에 실험 방법에 기술한 것처럼 마취하여 조직을 얻었다. 상처부위의 조직을 약 5mm 두께로 파라핀 고정을 하여 잘라내었다. 순차적으로 잘라낸 조직은 실험 방법에 기술한 것처럼 PCNA로 면역 염색 하였다. 이 PCNA는 아비딘-바이오틴 페록시데이즈 복합체 방법을 사용하여 염색하고 헤마톡실린을 대조군으로 염색하였다. A는 4일 후의 사진을 보여준다. 이렇게PCNA가 염색된 세포들을 계산하여 젊은 쥐 (B), 늙은 쥐 (C)로 그 숫자를 그림으로 그렸다.

Claims (9)

1. 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제의 억제제를 유효성분으로 포함하는 상처 치유 촉진용 약학 조성물로서, 상기 아데닐일 시클라아제의 억제제는 2',5'-디데옥시아데노신 (2',5'-dideoxyadenosine), 시스-N-(2-페닐시클로펜틸)아자시클로트리덱-1-엔-2-아민 (cis-N-(2-phenylcyclopentyl)azacyclotridec-1-en-2-amine), 및 9-(테트라히드로-2'-푸릴)아데닌 (9-(tetrahydro-2'-furyl) adenine)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 아데닐일 시클라아제의 억제제는 9-(테트라히드로-2'-푸릴)아데닌 (9-(tetrahydro-2'-furyl) adenine)인 것인 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 상처 치유의 대상은 나이든 포유동물이고, 상기 나이든 포유동물은 나이가 다음 식에 의하여 얻어진 나이 이상인 포유동물인 것인 상처 치유 촉진용 약학 조성물:

   포유동물의 평균 수명 - (포유동물의 평균 수명 × 0.1).
4. 제 1 항에 있어서, 상기 상처 치유의 대상은 60세 이상의 인간인 것인 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 상처에 국소적으로 적용되는 것인 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여되는 것인 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 비경구 투여되는 것인 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
8. 삭제
9. 삭제

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