KR101085960B1 - 락테이트­글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트­글라이콜레이트­하이드록시알카노에이트 공중합체 생성능을 가지는 세포 또는 식물을 이용한 락테이트­글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트­글라이콜레이트­하이드록시알카노에이트 공중합체의 제조방법 - Google Patents

락테이트­글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트­글라이콜레이트­하이드록시알카노에이트 공중합체 생성능을 가지는 세포 또는 식물을 이용한 락테이트­글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트­글라이콜레이트­하이드록시알카노에이트 공중합체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환시키는 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제(propionate CoA transferase, Pct) 유전자와 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate, PHA) 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하는 것을 특징으로 하는 락테이트-글라이콜레이트 공중합체 및 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 세포 또는 식물을 이용하여 락테이트-글리콜레이트 공중합체를 제조하는 것이 가능할 뿐만 아니라, 글라이콜레이트, 락테이트 및 다양한 하이드록시알카노에이트를 모노머로 함유하고 있는 다양한 종류의 폴리에스터를 제조하는 것이 가능하다.
락테이트-글라이콜레이트 공중합체, 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 합성효소

Description

락테이트­글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트­글라이콜레이트­하이드록시알카노에이트 공중합체 생성능을 가지는 세포 또는 식물을 이용한 락테이트­글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트­글라이콜레이트­하이드록시알카노에이트 공중합체의 제조방법{Method for Preparing Poly(lactate-co-glycolate) or Poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate) Copolymers Using Cells or Plants Having Producing Ability of Poly(lactate-co-glycolate) or Poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate) Copolymers}
본 발명은 락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환시키는 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제(propionate CoA transferase, Pct) 유전자와 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate, PHA) 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하는 것을 특징으로 하는 락테이트-글라이콜레이트 공중합체 및 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
락테이트-글라이콜레이트 공중합체 [Poly(lactate-co-glycolate), PLGA]는 락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)로부터 유래된 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 높은 고분자이다. 현재 PLGA는 락테이트와 글라이콜레이트의 직접중합반응에 의해 제조될 수 있으나, 상기 반응을 통해서는 주로 낮은 분자량(1000-5000 달톤)의 PLGA만이 생성된다. 100,000 달톤 이상의 높은 분자량의 PLGA는 락타이드(lactide)와 글라이콜라이드(glycolide)의 링 개환축합반응을 통해 합성되어질 수 있다. 락타이드와 글라이콜라이드는 각각 락테이트와 글라이콜레이트의 고리 디에스테르(cyclic diester)로서, 각각 락테이트 올리고머와 글라이콜레이트 올리고머의 열분해에 의해 만들어진다. 링 개환축합반응에는 2-에틸헥사논산 주석(tin(II) 2-ethylhexanoate), 주석 알콕사이드(tin(II) alkoxide), 또는 알루미늄 이소프로폭사이드(aluminum isopropoxide) 등의 촉매의 사용이 요구되어진다. 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 고분자로부터 chain coupling agent를 이용하여 보다 분자량이 높은 고분자로 중합하는 방법이 있으나 chain coupling agent를 이용하기 때문에 고분자량의 PLGA를 제조하는 방법은 유기용제(solvent)나 chain coupling agent의 첨가로 인해 공정이 복잡해지고, 또한 이들을 제거가 쉽지 않다는 단점이 있다. 현재 상용화되고 있는 고분자량의 PLGA 생산공정은 락테이트와 글라이콜레이트를 각각 락타이드와 글라이콜라이드로 전환한 다음, 락타이드와 글라이콜라이드의 링 개환축합반응을 통해 PLGA를 합성하는 방법이 사용되고 있다.
한편, PHA는 과도한 탄소원이 존재하면서 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때, 미생물이 에너지나 탄소원 저장물질로 그 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다.
기존에 알려진 PHA는 대표적으로 짧은 탄소수를 가진 SCL-PHA (short-chain-length PHA)와 긴 탄소수를 가진 MCL-PHA (medium-chain-length PHA)로 나눌 수 있다. PHA를 합성하는 유전자는 Ralstonia eutropha, Pseudomonas 등으로부터 클로닝되었으며 재조합 미생물을 통해 다양한 종류의 모노머로 구성된 PHA가 합성되었다 (Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997; WO 01/55436; US 6,143,952; WO 98/54329; WO 99/61624).
미생물에서 PHA를 생산하기 위해서는 미생물의 대사산물을 PHA 모노머로 전환해 주는 효소와 PHA 모노머를 이용하여 PHA 고분자를 합성하는 PHA 합성효소(synthase)가 필수적이다. PHA 합성효소는 hydroxyacyl-CoA를 기질로 사용하여 PHA를 합성하며, PHA의 기질인 hydroxyacyl-CoA를 제공할 수 있는 효소로는 Ralstonia eutropha 등으로부터 클로닝된 β-ketothiolase (PhaA), acetoacetyl-CoA reductase (PhaB), Pseudomonas로부터 클로닝된 3-hydroxydecanoyl-ACP:CoA transferase (PhaG), Aeromonas caviae와 Pseudomonas aeruginosa로부터 유래된 (R)-specific enoyl-CoA hydratase (PhaJ) (Fukui et al., J. Bacteriol., 180:667, 1998; Tsuge et al., FEMS Microbiol. Lett., 184:193, 2000), 대장균과 Pseudomonas aeruginosa 등으로부터 유래된 3-ketoacyl-ACP reductase (FabG) 등이 알려져 있다 (Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett., 176:183, 1999; Ren et al., J. Bacteriol., 182:2978, 2000; Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214:217, 2002). 이러한 효소들을 이용하여 다양한 탄소위치(주로 3, 4, 5, 6번 위치)가 hydroxylation된 하이드록시알카노에이트를 이용하여 다양한 종류의 PHA를 합성해 왔다.
하지만 2번 위치가 hydroxylation된 하이드록시알카노에이트에 대한 PHA 합성효소의 반응성은 거의 없는 것으로 보고되어 있다 (Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994). In vitro에서 PHA synthase의 glycolyl-CoA에 대해 반응성을 분석한 보고는 있었지만, glycolyl-CoA에 대한 PHA synthase의 반응성은 매우 미약하였다 (Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994). 즉, 2번-탄소위치가 hydroxylation된 글라이콜레이트와 같은 하이드록시알카노에이트는 PHA synthase의 기질특이성에 적합하지 않아, 자연적으로 혹은 재조합 세포나 식물을 이용하여 PHA 및 그 공중합체를 제조한 예는 없다.
2-hydroxy acid 모노머로서 글라이콜레이트를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 공중합체에 대한 특허가 보고되어진 적은 있으나(US 2003/0211131 A1), 이는 다양한 PHA 모노머 중의 하나로 글라이콜레이트를 포함시킨 것에 그 의 미가 있을 뿐, 폴리락테이트(PLA) 또는 폴리글라이콜레이트(PGA)의 공중합체인 락테이트-글라이콜레이트 공중합체(PLGA) 및 이의 다양한 하이드록시알카노에이트와의 공중합체[poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate)]의 생합성과는 차별화된다.
본 발명자들은 락테이트와 글라이콜레이트를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소인 Clostridium propionicum 유래 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제(Pct) 유전자와 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 합성효소 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 포도당(glucose)과 글라이콜레이트 또는 포도당과 글라이콜레이트, 하이드록시알카노에이트가 포함된 생산배지에서 배양하는 경우, poly(lactate-co-glycolate) 공중합체 및 poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate) 공중합체가 생성되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 세포 또는 식물을 이용하여 락테이트-글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체를 제조하기 위한, 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제 유전자와 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 함유하는 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하는 것을 특징으로 하는 락테이트-글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하여, 배양배지에 첨가된 락테이트 및 글라이콜레이트를 이용하거나, 상기 세포 또는 식물 내에서 자체 생산된 락테이트 및 글라이콜레이트를 이용하여, 락테이트-글라이콜레이트 공중합체를 합성한 다음, 상기 배양된 세포 또는 재배된 식물로부터 락테이트-글라이콜레이트 공중합체를 회수하는 것을 특징으로 하는 락테이트-글라이콜레이트 공중합체 [poly(lactate-co-glycolate)]의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 락테이트와 글라이콜레이트롤 모노머로 함유하는 락테이트- 글라이콜레이트 공중합체 [poly(lactate-co-glycolate)]를 제공한다.
또한, 본 발명은 락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하여, 배양배지에 첨가된 락테이트, 글라이콜레이트 및 하이드록시알카노에이트를 이용하거나, 상기 세포 또는 식물 내에서 자체 생산된 락테이트, 글라이콜레이트 및 하이드록시알카노에이트를 이용하여, 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체를 합성한 다음, 상기 배양된 세포 또는 재배된 식물로부터 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체를 회수하는 것을 특징으로 하는 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체 [poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate)]의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 2-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionate), 3-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(hydroxyvalerate), 4-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 탄소수가 6∼14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acids), 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸 산(hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시 도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-펜텐산(pentenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-trans-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-cis-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-trans-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-노넨산(nonenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-데센산(decenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5,8-cis-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸발레르산(methylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸헵 탄산(methylheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸-6-옥텐산(octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산(hydroxysuccinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아디핀산(hydroxyadipinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아젤라인산(hydroxyazelaic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid,)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시피메린산(hydroxypimelic acid)-프로필에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-벤질에스테르, 3-하이드록시(hydroxy)-8-아세톡시옥탄산(acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-아세톡시노난산(acetoxynonanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), para-시아노 페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시(nitrophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-페닐발레르산(phenylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-시클로헥실부탄산(cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시(dihydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4,5-에폭시데칸산(epoxydecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6,7-에폭시도데칸산(epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8,9-에폭시(epoxy)-5,6-cis-테트라데칸산(tetradecanoic acid), 7-시아노(cyano)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 9-시아노(cyano)-3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-플루오로헵탄산(fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-플루오로노난산(fluorononanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-클로로헥산산(chlorohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-클로로옥탄산(chlorooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-브로모헥산산(bromohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-브로모옥탄산(bromooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-11-브로모운데칸산(bromoundecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-부텐산(butenoic acid), 6-하이드록시(hydroxy)-3-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸부탄산(methylbutyric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸발레르산(methylvaleric acid), 및 3-하이드록시(hydroxy)-2,6-디메틸-5-헵텐산(heptenoic acid)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 하이드록시알카노에이트와 락테이트 및 글라이콜레이트를 모노머로 함유하는 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체 [poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate)]를 제공한다.
또한, 본 발명은 2-하이드록시부티레이트(2HB)-락테이트-글라이콜레이트 공중합체 [poly(2HB-co-lactate-co-glycolate)]를 제공한다.
또한, 본 발명은 2-하이드록시부티레이트(2HB)-3-하이드록시부티레이트(3HB)-락테이트-글라이콜레이트 공중합체 [poly(2HB-co-3HB-co-lactate-co-glycolate)]를 제공한다.
본 발명에 따르면, 세포 또는 식물을 이용하여 락테이트-글리콜레이트 공중합체를 제조하는 것이 가능할 뿐만 아니라, 글라이콜레이트, 락테이트 및 다양한 하이드록시알카노에이트를 모노머로 함유하고 있는 다양한 종류의 폴리에스터를 제조하는 것이 가능하다.
일 관점에서, 본 발명은 락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전 자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하여, 배양배지에 첨가된 락테이트 및 글라이콜레이트를 이용하거나, 상기 세포 또는 식물 내에서 자체 생산된 락테이트 및 글라이콜레이트를 이용하여, 락테이트-글라이콜레이트 공중합체를 합성한 다음, 상기 배양된 세포 또는 재배된 식물로부터 락테이트-글라이콜레이트 공중합체를 회수하는 것을 특징으로 하는 락테이트-글라이콜레이트 공중합체 [poly(lactate-co-glycolate)]의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 락테이트와 글라이콜레이트롤 모노머로 함유하는 락테이트-글라이콜레이트 공중합체 [poly(lactate-co-glycolate)]에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서는 포도당 및 글라이콜레이트를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양하여, 세포 내에서 포도당으로부터 생산된 락테이트를 전구체로 이용하였으나, 포도당만을 함유하는 배지를 사용하여, 세포 내에서 생산되는 글라이콜레이트와 락테이트를 이용하여도 락테이트-글라이콜레이트 공중합체를 제조할 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 사항이며, 배지에 락테이트만을 첨가하거나, 락테이트와 글라이콜레이트를 첨가하여도 락테이트-글라이콜레이트 공중합체를 제조할 수 있다는 것 또한, 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 또는 식물은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 함유하는 세포 또는 식물에 락테이트와 글라이콜레이트를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자가 형질전환되어 있거나 염색체 상에 삽입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 PHA 합성효소의 유전자를 가지는 세포로는 다양한 미생물이 알려져 있 다 (KR 10-250830 B1). 예를 들면, Aeromonas 속 미생물, Achromobacter 속 미생물, Acidovorax delafieldii, Acidovax facilis,, Acinetobacter 속 미생물, Actinomyces 속 미생물, Aeromonas 속 미생물, Alcaligenes 속 미생물, Alteromonas 속 미생물, Amoebobacter 속 미생물, Aphanocapa sp., Aphanothece sp. Aquaspirillum autotrophicum, Azorhizobium caulinodans, Azospirillum sp., Azospirillum 속 미생물, Azotobacter 속 미생물, Bacillus 속 미생물, Beggiatoa 속 미생물, Beijerinckia 속 미생물, Beneckea 속 미생물, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Caryophamon latum, Caulobacter 속 미생물, Chlorogloea 속 미생물, Chromatium 속 미생물, Chromobacterium 속 미생물, Clostridium 속 미생물, Comamonas 속 미생물, Corynebacterium 속 미생물, Cyanobacteria 속 미생물, Derxia 속 미생물, Desulfonema 속 미생물, Desulfosacina variabilis, Desulfovibrio sapovorans, Ectothiorhodospira 속 미생물, Ferrobacillus ferroxidans, Flavobacterium sp., Haemophilus influenzae, Halobacterium 속 미생물, Haloferax mediterranei, Hydroclathratus clathratus, Hydrogenomonas facilis, Hydrogenophaga 속 미생물, Hyphomicrobium 속 미생물, Ilyobacter delafieldii, Labrys monachus, Lamprocystis reseopersicina, Lampropedia hyalina, Legionella sp., Leptothrix discophorus, Methylobacterium 속 미생물, Methylosinus 속 미생물, Micrococcus 속 미생물, Mycobacterium 속 미생물, Nitrobacter 속 미생물, Nocardia 속 미생물, Paracoccus dentrificans, Oscillatoria limosa, Penicillium cyclopium, Photobacterium 속 미생물, Physarum ploycephalum, Pseudomonas 속 미생물, Ralstonia 속 미생물, Rhizobium 속 미생물, Rhodobacillus 속 미생물, Rhodobacter 속 미생물, Rhodococcus 속 미생물, Rhodocyclus 속 미생물, Rhodomicrobium vannielii, Rhodopseudomonas 속 미생물, Rhodospirillum 속 미생물, Sphingomonas paucimobilis, Spirillum 속 미생물, Spirulina 속 미생물, Staphylococcus 속 미생물, Stella 속 미생물, Streptomyces 속 미생물, Syntrophomonas wolfei, Thermophilic cyanobacteria, Thermus thermophilus, Thiobacillus A2, Thiobacillus 속 미생물, Thiocapsa 속 미생물, Thiocystis violacea, Vibrio parahaemolyticus, Xanthobacter autotrophicus, Xanthomonas maltophilia, Zoogloea 속 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포 또는 식물은 락테이트와 글라이콜레이트를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자로 형질전환되거나, 락테이트와 글라이콜레이트를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자가 염색체 상에 삽입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 락테이트와 글라이콜레이트를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제 유전자(pct)인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 락테이트와 글라이콜레이트를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 (a) 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G 변이; (b) 서열번호 1의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C; (c) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Gly335Asp 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G 변이; (d) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Ala243Thr 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G; (e) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Gly 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C 변이; (f) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp257Asn 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G 변이; (g) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Asn 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C 변이; 및 (h) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Thr199Ile 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C로 구성된 군에서 선택되는 변이를 함유하는 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제 변이체를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제 변이체는 락테이트와 글라이콜레이트를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소로, Clostridium propionicum 유래 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제 유전자(cp-pct)를 error-prone PCR 방법으로 변이시켜 제조하였다 (한국특허공개 2009-0017252).
본 발명에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자는 phaC1인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열에서, (i) S325T 및 Q481M; (ii) E130D, S325T 및 Q481M; (iii) E130D, S325T, S477R 및 Q481M; 및 (iv) E130D, S477F 및 Q481K로 구성된 군에서 선택되는 변이를 함유하는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하 는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다 (한국특허공개 2008-0047279).
본 발명에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체는 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있으며, Pseudomonas sp. MBEL 6-19 유래 phaC1 의 돌연변이체이다.
다른 관점에서, 본 발명은 락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하여, 배양배지에 첨가된 락테이트, 글라이콜레이트 및 하이드록시알카노에이트를 이용하거나, 상기 세포 또는 식물 내에서 자체 생산된 락테이트, 글라이콜레이트 및 하이드록시알카노에이트를 이용하여, 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체를 합성한 다음, 상기 배양된 세포 또는 재배된 식물로부터 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체를 회수하는 것을 특징으로 하는 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체 [poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate)]의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 하이드록시알카노에이트, 락테이트 및 글라이콜레이트를 모노머로 함유하는 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체 [poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate)]에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서는 포도당, 글라이콜레이트 및 하이드록시알카노에이트 를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양하여, 세포 내에서 포도당으로부터 생산된 락테이트를 전구체로 이용하였으나, 포도당과 하이드록시알카노에이트만을 함유하는 배지를 사용하여, 세포 내에서 생산되는 글라이콜레이트, 락테이트 및 하이드록시알카노에이트를 이용하여도 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체를 제조할 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 사항이며, 배지에 락테이트만을 첨가하거나, 락테이트와 글라이콜레이트, 하이드록시알카노에이트를 첨가하여도 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체를 제조할 수 있다는 것 또한, 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체를 구성하는 하이드록시알카노에이트는 락테이트(lactate), 2-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionate), 3-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(hydroxyvalerate), 4-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 탄소수가 6~14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acids), 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시 도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르 산(hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-펜텐산(pentenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-trans-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-cis-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-trans-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-노넨산(nonenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-데센산(decenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5,8-cis-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸발레르산(methylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸헵탄산(methylheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸옥 탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸-6-옥텐산(octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산(hydroxysuccinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아디핀산(hydroxyadipinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아젤라인산(hydroxyazelaic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid,)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시피메린산(hydroxypimelic acid)-프로필에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-벤질에스테르, 3-하이드록시(hydroxy)-8-아세톡시옥탄산(acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-아세톡시노난산(acetoxynonanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹 시(nitrophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-페닐발레르산(phenylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-시클로헥실부탄산(cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시(dihydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4,5-에폭시데칸산(epoxydecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6,7-에폭시도데칸산(epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8,9-에폭시(epoxy)-5,6-cis-테트라데칸산(tetradecanoic acid), 7-시아노(cyano)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 9-시아노(cyano)-3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-플루오로헵탄산(fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-플루오로노난산(fluorononanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-클로로헥산산(chlorohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-클로로옥탄산(chlorooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-브로모헥산산(bromohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-브로모옥탄산(bromooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-11-브로모운데칸산(bromoundecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-부텐산(butenoic acid), 6-하이드록시(hydroxy)-3-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸부탄산(methylbutyric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸발레르산(methylvaleric acid) 및 3-하이드록시(hydroxy)-2,6-디메틸-5-헵텐산(heptenoic acid)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체는 poly(lactate-co-glycolate), poly(2HB-co-lactate-co-glycolate), poly(2HB-co-3HB-co-lactate-co-glycolate), poly(3HB-co-lactate-co-glycolate), poly(4HB-co-lactate-co-glycolate), poly(3HP-co-lactate-co-glycolate), poly(3HB-co-4HB-co-lactate-co-glycolate) 및 poly(3HP-co-4HB-co-lactate-co-glycolate)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
이 경우, 탄소원으로 글라이콜레이트 또는 하이드록시알카노에이트와 글라이콜레이트를 사용하면, 락테이트-글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체 [poly(hydroxyalkanoate-co-glycolate)]의 제조가 가능하다. 이 경우, 탄소원으로 지방산(fatty acid)과 글라이콜레이트를 사용하면, 탄소수 3~12의 3HA와 글라이콜레이트의 공중합체 [poly(3HA-co-glycolate)]를 제조하는 것이 가능하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 2-하이드록시부티레이트(2HB)-락테이트-글라이콜레이트 공중합체 [poly(2HB-co-lactate-co-glycolate)]에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 2-하이드록시부티레이트-3-하이드록시부티레이트-락테이트-글라이콜레이트 공중합체 [poly(2HB-co-3HB-co-lactate-co-glycolate)]에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 본 발명에서, 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 등이 사용될 수 있 다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 바람직한 숙주세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵세포는 전술한 PHA 합성효소의 유전자를 가지는 미생물뿐만 아니라, 대장균과 같이 PHA 합성효소의 유전자를 가지지 않는 미생물이 모두 사용가능하다. 또한, 상기 PHA 합성효소의 유전자를 가지는 미생물로써 PHA 합성효소의 유전자로 형질전환된 대장균을 사용할 수도 있다. 바람직한 대장균은 E.coli DH5a, E.coli JM101, E.coli K12, E.coli W3110, E.coli X1776, E.coli XL1-Blue(Stratagene) 및 E.coli B 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera) 등도 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli 및 PHA 합성효소의 유전자를 가지는 미생물에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리 움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 등이 숙주세포로서 이용될 수 있다. 효모와 곰팡이 같은 주지의 진핵숙주세포, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포, CHO 및 생쥐 세포와 같은 동물세포, 조직배양된 인간세포 및 식물세포도 사용될 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명에 적합한 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
한편, 식물체의 형질전환은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 유전자를 함유하는 재조합벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질전환 식물을 수득할 수 있다. 예를 들면, 형질전환된 식물을 이용하여 PHA를 제조하는 것에 관한 선행특허(WO 94/11519; US 6,103,956)와 동일 내지 유사한 방법으로 본 발명에 적합한 형질전환 식물을 수득할 수 있다.
본 발명에서 이용가능한 형질전환 대상 식물로는 담배, 토마토, 고추, 콩, 벼, 옥수수 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 형질전환에 사 용되는 식물이 유성번식 식물이라 할지라도, 조직배양 등에 의해 무성적으로 반복생식 시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히 하기 실시예에서는 PHA 합성효소의 기질인 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 제공하기 위하여, 락테이트와 글라이콜레이트를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자로 Clostridium propionicum 유래 propionate CoA transferase (pct)를 사용하였지만, 다른 미생물 유래의 transferase 유전자를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명하다 할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 PHA 합성효소의 유전자로 Pseudomonas sp. MBEL 6-19 유래 phaC1 만을 예시하였지만, Wautersia eutropha, Alcaligenes latus, Sinorhizobium meliloti, Bacillus megaterium, Chromatium vinosum 등 다양한 종류의 미생물로부터 유래된 기질특이성이 비슷한 PHA 합성효소 등을 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명하다 할 것이다.
또한 하기 실시예에서는 PHA 합성효소 유전자를 가지지 않는 미생물 및 PHA 합성효소 유전자를 가지는 미생물로 각각 대장균만을 예시하였지만, 다른 종류의 세포(박테리아, 효모, 곰팡이, 동식물 세포) 및 식물을 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것 역시 본 발명이 속하는 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명하다 할 것이다.
실시예1: Poly(lactate-co-glycolate) 및 Poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate) 제조용 재조합벡터의 제작
1-1. pPs619C1300-CPPCT 재조합 벡터의 제작
lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 효소로서 Pseudomonas sp. MBEL 6-19(KCTC 11027BP) 유래의 PHA 합성효소의 변이체를 사용하였다(한국공개특허 2008-0047279).
Pseudomonas sp. MBEL 6-19(KCTC 11027BP) 유래의 PHA 합성효소(phaC1Ps6-19)유전자를 분리하기 위하여, Pseudomonas sp. MBEL 6-19의 전체 DNA를 추출하고, phaC1Ps6-19유전자 서열(송애진, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004)에 기반하여, 서열번호 3 및 4의 염기서열을 가지는 프라이머를 제작하고, 상기 추출한 전체 DNA를 주형으로 하여, PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물을 전기영동하여, phaC1Ps6-19유전자에 해당하는 1.7 kb 크기의 유전자 절편을 확인하고, phaC1Ps6-19유전자를 수득하였다.
서열번호 3: 5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG -3
서열번호 4 : 5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC -3
phaC1Ps6-19합성효소를 발현시키기 위하여 단량체공급효소와 합성효소가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현 시스템을 하기와 같은 방법으로 제작하였다.
pSYL105 벡터(Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347)에서 Ralstonia eutropha H16 유래의 PHB 생산 오페론이 함유된 DNA 절편을 BamHI/EcoRI으로 절단하여, pBluescript II (Stratagene)의 BamHI/EcoRI 인식부위에 삽입함으로써 pReCAB 재조합 벡터를 제조하였다.
pReCAB 벡터는 PHA 합성효소(phaCRE)와 단량체공급효소(phaARE&phaBRE)가 PHB 오페론 프로모터에 의해 항시적으로 발현되며, 대장균에서도 잘 작동된다고 알려져 있다(Lee et al., Biotech.Bioeng., 44:1337,1994). pReCAB벡터를 BstBI/SbfI으로 절단하여 R.eutropha H16 PHA 합성효소 (phaCRE)를 제거한 다음, 상기에서 수득한 phaC1Ps6-19유전자를 BstBI/SbfI 인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1-ReAB 재조합 벡터를 제조하였다.
BstBI/SbfI 인식부위가 각각 양끝에 하나씩만 포함된 phaC1Ps6-19합성효소 유전자 절편을 만들기 위해 우선 내재하고 있는 BstBI 위치를 SDM(site directed mutagenesis) 방법으로 아미노산의 변환없이 제거하였고, BstBI/SbfI 인식부위를 첨가하기 위해 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.
서열번호 5: 5- atg ccc gga gcc ggt tcg aa - 3
서열번호 6: 5- CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC - 3
서열번호 7: 5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG - 3
서열번호 8: 5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC - 3
서열번호 9: 5- GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG - 3
서열번호 10: 5- aac ggg agg gaa cct gca gg - 3
상기 phaC1Ps6-19합성효소의 PHB 합성 여부를 확인하기 위하여, pPs619C1-ReAB 재조합 벡터를 E.coli XL-1Blue(Stratagene, USA)에 형질전환 시키고, 이를 PHB 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육시킨 결과 PHB 생성이 관찰되지 않았다.
SCL(short chain length) 활성에 영향을 미치는 아미노산 위치 3 곳을 아미노산 서열 배열분석을 통해 찾았고, 서열번호 11~16의 프라이머를 사용한 SDM 방법을 이용하여 하기 표 1과 같은 phaC1Ps6-19합성효소 변이체들을 만들었다.
서열번호 11: 5- CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3
서열번호 12: 5- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3
서열번호 13: 5- CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC- 3
서열번호 14: 5- GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG- 3
서열번호 15: 5- atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3
서열번호 16: 5- ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat- 3
phaC1Ps6-19 합성효소 변이체
재조합 벡터 핵산 치환 아미노산 치환 프라이머
pPs619C1200-ReAB AGC →ACC S325T 서열번호 11/12
CAG →ATG Q481M 서열번호 13/14
pPs619C1300-ReAB GAA →GAT E130D 서열번호 15/16
AGC →ACC S325T 서열번호 11/12
CAG →ATG Q481M 서열번호 13/14
이들 재조합 벡터를 E.coli XL-1Blue에 형질전환 시키고, 이를 PHB 검출배지 (LB agar, glucose 20g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육시켰다. 그 결과, pPs619C1200-ReAB로 형질전환된 E.coli XL-1Blue와 pPs619C1300-ReAB로 형질전환된 E.coli XL-1Blue에서 모두 PHB 생성을 확인할 수 있었다.
즉, 단량체 공급효소인 phaARE와 phaBRE에 의해 글루코스로부터 3HB-CoA가 생성되고, 이를 기질로 하여 phaC1Ps6-19합성효소 SCL 변이체들(phaC1Ps6-19200&phaC1Ps6-19300)이 PHB를 합성한 것이다.
여기에 락테이트-글라이콜레이트 공중합체 합성시 필요한 단량체인 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 제공하기 위한 프로피오네이트 CoA 트랜스퍼라아제가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현되는 시스템을 구축하기 위하여 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 프로피오네이트 CoA 트랜스퍼라아제(CP-PCT)를 사용하였다.
CP-PCT는 Clostridium propionicum 의 염색체 DNA를 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 PCR하여 얻어진 단편을 사용하였다. 이 때, 원래 야생형 CP-PCT에 존재하는 NdeI site를 cloning의 용이성을 위해 SDM방법을 이용하여 제거하였다.
서열번호 17: 5-GGAATTCATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA-3
서열번호 18: 5-gc tctaga tta gga ctt cat ttc ctt cag acc cat taa gcc ttc tg-3
또한, SbfI/NdeI인식부위를 첨가하기 위해 서열번호 19과 20의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.
서열번호 19: 5-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg- 3
서열번호 20: 5-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c- 3
phaC1Ps6-19합성효소 SCL 변이체인 phaC1Ps6-19300를 함유한 pPs619C1300-ReAB 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 Ralstonia eutrophus H16 유래의 단량체 공급효소 (phaARE&phaBRE)를 제거한 다음, 상기 PCR 클로닝한 CP-PCT 유전자를 SbfI/NdeI인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1300-CPPCT 재조합 벡터를 제조하였다(도 1).
1-2. pPs619C1300-CPPCT540 재조합 벡터의 제작
CP-PCT의 경우 대장균에서 고발현될 경우 심각한 대사 장애를 일으켜 독성을 나타낸다고 알려져 있는데, 일반적으로 재조합 단백질 발현에 널리 사용되는 tac 프로모터나 T7 프로모터를 사용한 IPTG에 의한 발현유도 시스템에서는 유도제 첨가와 동시에 재조합 대장균이 모두 사멸하였다.
따라서, Clostridium propionicum propionate CoA transferase 변이체를 제조하기 위하여, 약하게 발현되지만 미생물 성장에 따라 지속적으로 발현되는 항시적 발현 시스템을 사용하여 락테이트-글라이콜레이트 공중합체 및 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체 합성에 성공하였다.
CP-PCT 유전자에 무작위적 돌연변이(random mutagenesis)를 도입하기 위해 상기 1-1 에서 제작된 pPs619C1300-CPPCT을 주형으로 하고, 서열번호 21 및 22의 프라이머를 이용하여 Mn2+이 첨가되고 dNTPs의 농도 차이가 존재하는 조건에서 Error-prone PCR을 실시하였다.
서열번호 21: 5-CGCCGGCAGGCCTGCAGG-3
서열번호 22: 5-GGCAGGTCAGCCCATATGTC-3
그 후, 무작위적 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 상기 서열번호 21 및 22의 프라이머를 이용하여 일반 조건에서 PCR하였다.
phaC1Ps6-19합성효소 SCL 변이체인 phaC1Ps6-19300를 함유한 pPs619C1300-CPPCT 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 야생형 cp-pct를제거한후, 상기 증폭된 돌연변이 PCR 단편을 SbfI/NdeI인식부위에 삽입시킨 ligation mixture를 만들어 E. coli JM109에 도입하여 ~105정도 규모의 CP-PCT 라이브러리를 제작하였다.
상기 제작된 CP-PCT 라이브러리는 고분자 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 1g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 3일간 생육시킨 후 고분자 생성 여부를 확인하는 스크리닝 작업을 수행하여 ~80여 개체의 후보를 1차 선정하였다. 이들 후보를 고분자가 생성되는 조건에서 4일간 액체 배양(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 1g/L, ampicillin 100mg/L, 37℃)하였고, FACS(Florescence Activated Cell Sorting) 분석을 통하여 최종 2개체를 선정하였다.
상기 제작된 CP-PCT 변이체의 돌연변이 위치를 찾기 위해 유전자 염기서열을 분석하였고 그 결과는 다음 표 2와 같다.
CP-PCT 1차 변이체
CP-PCT 변이체 버전 핵산 치환
CP-PCT Variant 512 A1200G
CP-PCT Variant 522 T78C, T669C, A1125G, T1158C
상기 최종 선별된 돌연변이체들(CP-PCT Variant 512, CP-PCT Variant 522)을 기본으로 다시 상기 Error-prone PCR의 방법으로 무작위적 돌연변이를 수행하여 다양한 CP-PCT 변이체들을 얻을 수 있었다. 그 중, 하기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같은 CP-PCT 변이체 532와 540이 있었다.
CP-PCT 2차 변이체
CP-PCT 변이체 버전 Mutations Silent Mutations
CP-PCT Variant 532 Ala243Thr A1200G
CP-PCT Variant 540 Val193Ala T78C, T669C, A1125G, T1158C
그 후, CpPct540 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 상기 서열번호 19 및 20의 프라이머를 이용하여 일반조건에서 PCR하였다. 상기 pPs619C1300-CPPCT 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 CPPCT 부분을 제거한 후, 상기 증폭된 CpPct532 PCR 단편을 SbfI/NdeI인식부위에 삽입시킨 ligation mixture를 만들어 pPs619C1300-CPPCT540 벡터를 제조하였다(한국특허공개 2009-0017252).
1-3. pPs619C1310-CPPCT540 재조합 벡터의 제작
슈도모나스 속 MBEL 6-19 (Pseudomonas sp. MBEL 6-19)의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 변이체를 사용하여, lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용하여 락테이트-글라이콜레이트 공중합체 및 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체를 제조할 수 있는 시스템을 발명하였다.
상기 1-1에서 제작된 phaC1Ps6-19합성효소 변이체(phaC1Ps6-19300)를 기초로 하여 서열번호 23 및 24의 프라이머를 사용한 SDM 방법을 이용하여 E130D, S477F 및 Q481K 이 변이된 아미노산 서열을 가진 Pseudomonas 속 MBEL 6-19 유래 PHA 합성효소 변이체(phaC1Ps6-19310)를 제작하였다(한국공개특허 2008-0047279).
서열번호 23:5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cgc ggg cat atc- 3'
서열번호 24: 5'-gat atg ccc gcg gct cga cag cac gaa ttc- 3
이로부터 얻은 재조합 벡터(도2, pPs619C1310-CPPCT540)를 E. coli JM109에 형질전환시키고, 이를 3HB가 포함된 중합체 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 2g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육시킨 결과, 중합체 생성을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 재조합 대장균의 제작 및 이를 이용한 락테이트-글라이콜레이트 공중합체의 제조
실시예 1에서 제작된 pPs619C1310-CpPCT540을 대장균 XL1-Blue에 도입하여 재조합 대장균 XL1-Blue(pPs619C1310-CpPCT540)를 제작한 다음, 플라스크 배양을 수행하였다. 먼저 재조합 대장균 XL1-Blue(pPs619C1310-CpPCT540)를 20g/L의 포도당(glucose)과 2g/L의 글라이콜레이트가 함유된 MR 배지에서 3일 동안 배양하였다. MR 배지의 조성은 다음과 같다: KH2PO4 6.67g, (NH4)2HPO4 4g, MgSO4·7H2O 0.8g, citric acid 0.8g, 및 trace metal solution 5mL. Trace metal solution(per liter): 5M HCl 5mL, FeSO4·7H2O 10g, CaCl2 2g, ZnSO4·7H2O 2.2g, MnSO4·4H2O 0.5g, CuSO4·5H2O 1g, (NH4)6Mo7O2·4H2O 0.1g, 및 Na2B4O2·10H2O 0.02g.
상기 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 동결건조시킨 다음, 클로로포름을 이용하여 균체에 축적된 고분자 물질을 회수하였다. 고분자의 모노머 조성을 가스크로마토그래피로 분석한 결과, P(6mol% LA-co-94mol% GA) 임을 확인하였다. 이 때, 락테이트 모노머(LA)는 탄소원인 포도당으로부터 대장균 내부에서 자체 생성된 락테이트로부터 제공된다. 락테이트-글라이콜레이트 공중합체를 합성한 재조합 대장균 균주의 세포를 현미경으로 관찰하였다 (도 6).
실시예 3: 재조합 대장균의 제작 및 이를 이용한 락테이트-글라이콜레이트-하이드록시알카노에이트 공중합체의 제조
실시예 1에서 제작된 pPs619C1310-CpPCT540을 대장균 XL1-Blue에 도입하여 재조합 대장균 XL1-Blue(pPs619C1310-CpPCT540)를 제작한 다음, 플라스크 배양을 수행하였다.
먼저 재조합 대장균 XL1-Blue(pPs619C1310-CpPCT540)를 20g/L의 포도당(glucose)과 2g/L의 글라이콜레이트 및 2g/L의 2-hydroxybutyrate (2HB)가 함유된 MR배지 또는 20g/L의 포도당(glucose)과 2g/L의 글라이콜레이트, 2g/L의 2-hydroxybutyrate (2HB) 및 2g/L의 3-hydroxybutyrate (3HB)가 함유된 MR배지에서 3일간 배양시켰다. 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 동결건조시킨 다음, 클로로포름을 이용하여 각각 균체에 축적된 고분자 물질을 회수하였다. 고분자의 모노머 조성을 가스크로마토그래피로 분석한 결과, 각각 P(53mol% 2HB-co-17mol% LA-co-30mol% GA) 및 P(30mol% 2HB-co-43mol% 3HB-co-9mol% LA-co-22mol% GA)임을 확인하였다. 이 때, 락테이트 모노머(LA)는 탄소원인 포도당으로부터 대장균 내부에서 자체 생성된 락테이트로부터 제공된다. 2HB-락테이트-글라이콜레이트 공중합체 또는 2HB-3HB-락테이트-글라이콜레이트 공중합체를 합성한 재조한 대장균 균주의 세포를 현미경으로 관찰하였다 (도 7 및 도 8).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 Clostridium propionicum 유래 pct 유전자와 Pseudomonas sp. MBEL 6-19 유래 phaC1 돌연변이체를 포함하는 재조합 플라스미드 pPs619C1300-CpPCT의 제작 과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 Clostridium propionicum 유래 pct 돌연변이체와 Pseudomonas sp. MBEL 6-19 유래 phaC1 돌연변이체를 포함하는 재조합 플라스미드 pPs619C1310-CpPCT540의 제작 과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 포도당, 글라이콜레이트를 이용하여 글라이콜레이트 중합체(PGA)를 합성하는 경로를 나타낸 모식도이다.
도 4는 포도당, 글라이콜레이트를 이용하여 락테이트-글라이콜레이트 공중합체(PLGA)를 합성하는 경로를 모식하는 그림이다.
도 5는 포도당, 글라이콜레이트, 3HB, 2HB 를 이용하여 글라이콜레이트-락테이트-3HB-2HB 공중합체를 합성하는 경로를 모식하는 그림이다.
도 6은 P(LA-co-GA)를 합성한 대장균 XL1-Blue (pPs619C1310-CpPCT540)의 현미경사진이다.
도 7은 P(LA-co-GA-co-2HB)를 합성한 대장균 XL1-Blue (pPs619C1310-CpPCT540)의 현미경 사진이다.
도 8은 P(LA-co-GA-co-2HB-co-3HB)를 합성한 대장균 XL1-Blue (pPs619C1310-CpPCT540)의 현미경사진이다.
<110> Korea Advance Institute Science and Technology LG CHEM, LTD <120> Method for Preparing Poly(lactate-co-glycolate) or Poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate) Copolymers Using Cells or Plants Having Producing Ability of Poly(lactate-co-glycolate) or Poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate) Copolymers <130> P09-B032 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1572 <212> DNA <213> Clostridium propionicum <400> 1 atgagaaagg ttcccattat taccgcagat gaggctgcaa agcttattaa agacggtgat 60 acagttacaa caagtggttt cgttggaaat gcaatccctg aggctcttga tagagctgta 120 gaaaaaagat tcttagaaac aggcgaaccc aaaaacatta cctatgttta ttgtggttct 180 caaggtaaca gagacggaag aggtgctgag cactttgctc atgaaggcct tttaaaacgt 240 tacatcgctg gtcactgggc tacagttcct gctttgggta aaatggctat ggaaaataaa 300 atggaagcat ataatgtatc tcagggtgca ttgtgtcatt tgttccgtga tatagcttct 360 cataagccag gcgtatttac aaaggtaggt atcggtactt tcattgaccc cagaaatggc 420 ggcggtaaag taaatgatat taccaaagaa gatattgttg aattggtaga gattaagggt 480 caggaatatt tattctaccc tgcttttcct attcatgtag ctcttattcg tggtacttac 540 gctgatgaaa gcggaaatat cacatttgag aaagaagttg ctcctctgga aggaacttca 600 gtatgccagg ctgttaaaaa cagtggcggt atcgttgtag ttcaggttga aagagtagta 660 aaagctggta ctcttgaccc tcgtcatgta aaagttccag gaatttatgt tgactatgtt 720 gttgttgctg acccagaaga tcatcagcaa tctttagatt gtgaatatga tcctgcatta 780 tcaggcgagc atagaagacc tgaagttgtt ggagaaccac ttcctttgag tgcaaagaaa 840 gttattggtc gtcgtggtgc cattgaatta gaaaaagatg ttgctgtaaa tttaggtgtt 900 ggtgcgcctg aatatgtagc aagtgttgct gatgaagaag gtatcgttga ttttatgact 960 ttaactgctg aaagtggtgc tattggtggt gttcctgctg gtggcgttcg ctttggtgct 1020 tcttataatg cggatgcatt gatcgatcaa ggttatcaat tcgattacta tgatggcggc 1080 ggcttagacc tttgctattt aggcttagct gaatgcgatg aaaaaggcaa tatcaacgtt 1140 tcaagatttg gccctcgtat cgctggttgt ggtggtttca tcaacattac acagaataca 1200 cctaaggtat tcttctgtgg tactttcaca gcaggtggct taaaggttaa aattgaagat 1260 ggcaaggtta ttattgttca agaaggcaag cagaaaaaat tcttgaaagc tgttgagcag 1320 attacattca atggtgacgt tgcacttgct aataagcaac aagtaactta tattacagaa 1380 agatgcgtat tccttttgaa ggaagatggt ttgcacttat ctgaaattgc acctggtatt 1440 gatttgcaga cacagattct tgacgttatg gattttgcac ctattattga cagagatgca 1500 aacggccaaa tcaaattgat ggacgctgct ttgtttgcag aaggcttaat gggtctgaag 1560 gaaatgaagt cc 1572 <210> 2 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. 6-19 <400> 2 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atgcccggag ccggttcgaa 20 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgttactctt gttactcatg atttgattgt ctctc 35 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtacgtgcac gaacggtgac gcttgcatga gtg 33 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aacgggaggg aacctgcagg 20 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctgaccttgc tggtgaccgt gcttgatacc acc 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggtggtatca agcacggtca ccagcaaggt cag 33 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cgagcagcgg gcatatcatg agcatcctga acccgc 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gcgggttcag gatgctcatg atatgcccgc tgctcg 36 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 atcaacctca tgaccgatgc gatggcgccg acc 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ggtcggcgcc atcgcatcgg tcatgaggtt gat 33 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggaattcatg agaaaggttc ccattattac cgcagatga 39 <210> 18 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gctctagatt aggacttcat ttccttcaga cccattaagc cttctg 46 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 aggcctgcag gcggataaca atttcacaca gg 32 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcccatatgt ctagattagg acttcatttc c 31 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cgccggcagg cctgcagg 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggcaggtcag cccatatgtc 20 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gaattcgtgc tgtcgagccg cgggcatatc 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gatatgcccg cggctcgaca gcacgaattc 30

Claims (22)

  1. 락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포 또는 식물을 배양 또는 재배하는 것을 포함하는,
    락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    세포 또는 식물은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 함유하는 세포 또는 식물에 락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자가 형질전환된 것인
    락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 함유하는 세포는 Aeromonas 속 미생물, Achromobacter 속 미생물, Acidovorax delafieldii, Acidovax facilis,, Acinetobacter 속 미생물, Actinomyces 속 미생물, Aeromonas 속 미생물, Alcaligenes 속 미생물, Alteromonas 속 미생물, Amoebobacter 속 미생물, Aphanocapa sp., Aphanothece sp. Aquaspirillum autotrophicum, Azorhizobium caulinodans, Azospirillum sp., Azospirillum 속 미생물, Azotobacter 속 미생물, Bacillus 속 미생물, Beggiatoa 속 미생물, Beijerinckia 속 미생물, Beneckea 속 미생물, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Caryophamon latum, Caulobacter 속 미생물, Chlorogloea 속 미생물, Chromatium 속 미생물, Chromobacterium 속 미생물, Clostridium 속 미생물, Comamonas 속 미생물, Corynebacterium 속 미생물, Cyanobacteria 속 미생물, Derxia 속 미생물, Desulfonema 속 미생물, Desulfosacina variabilis, Desulfovibrio sapovorans, Ectothiorhodospira 속 미생물, Ferrobacillus ferroxidans, Flavobacterium sp., Haemophilus influenzae, Halobacterium 속 미생물, Haloferax mediterranei, Hydroclathratus clathratus, Hydrogenomonas facilis, Hydrogenophaga 속 미생물, Hyphomicrobium 속 미생물, Ilyobacter delafieldii, Labrys monachus, Lamprocystis reseopersicina, Lampropedia hyalina, Legionella sp., Leptothrix discophorus, Methylobacterium 속 미생물, Methylosinus 속 미생물, Micrococcus 속 미생물, Mycobacterium 속 미생물, Nitrobacter 속 미생물, Nocardia 속 미생물, Paracoccus dentrificans, Oscillatoria limosa, Penicillium cyclopium, Photobacterium 속 미생물, Physarum ploycephalum, Pseudomonas 속 미생물, Ralstonia 속 미생물, Rhizobium 속 미생물, Rhodobacillus 속 미생물, Rhodobacter 속 미생물, Rhodococcus 속 미생물, Rhodocyclus 속 미생물, Rhodomicrobium vannielii, Rhodopseudomonas 속 미생물, Rhodospirillum 속 미생물, Sphingomonas paucimobilis, Spirillum 속 미생물, Spirulina 속 미생물, Staphylococcus 속 미생물, Stella 속 미생물, Streptomyces 속 미생물, Syntrophomonas wolfei, Thermophilic cyanobacteria, Thermus thermophilus, Thiobacillus A2, Thiobacillus 속 미생물, Thiocapsa 속 미생물, Thiocystis violacea, Vibrio parahaemolyticus, Xanthobacter autotrophicus, Xanthomonas maltophilia, 및 Zoogloea 속 미생물로 구성된 군에서 선택되는 것인
    락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    세포 또는 식물은 락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자로 형질전환된 것인
    락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체의 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제 유전자(pct)인 것인
    락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체의 제조방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소의 유전자는,
    (a) 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G 변이;
    (b) 서열번호 1의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C;
    (c) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Gly335Asp 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G 변이;
    (d) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Ala243Thr 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G;
    (e) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Gly 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C 변이;
    (f) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp257Asn 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G 변이;
    (g) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Asn 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C 변이; 및
    (h) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Thr199Ile 변이 및 서열번호 1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C로 구성된 군에서 선택되는 변이를 함유하는 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제 변이체를 코딩하는 유전자인
    락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체의 제조방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자는 phaC1인
    락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체의 제조방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열에서,
    (i) S325T 및 Q481M;
    (ii) E130D, S325T 및 Q481M;
    (iii) E130D, S325T, S477R 및 Q481M; 및
    (iv) E130D, S477F 및 Q481K로 구성된 군에서 선택되는 변이를 함유하는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체를 코딩하는 유전자인
    락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체는 추가로 하이드록시알카노에이트 모노머를 포함하는 것인
    락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 하이드록시알카노에이트는 2-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionate), 3-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(hydroxyvalerate), 4-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 탄소수가 6∼14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acids), 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시 도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-펜텐산(pentenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-trans-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-cis-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-trans-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-노넨산(nonenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-데센산(decenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5,8-cis-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸발레르산(methylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸헵탄산(methylheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸-6-옥텐산(octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산(hydroxysuccinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아디핀산(hydroxyadipinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아젤라인산(hydroxyazelaic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid,)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시피메린산(hydroxypimelic acid)-프로필에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-벤질에스테르, 3-하이드록시(hydroxy)-8-아세톡시옥탄산(acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-아세톡시노난산(acetoxynonanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시(nitrophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-페닐발레르산(phenylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-시클로헥실부탄산(cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시(dihydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4,5-에폭시데칸산(epoxydecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6,7-에폭시도데칸산(epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8,9-에폭시(epoxy)-5,6-cis-테트라데칸산(tetradecanoic acid), 7-시아노(cyano)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 9-시아노(cyano)-3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-플루오로헵탄산(fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-플루오로노난산(fluorononanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-클로로헥산산(chlorohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-클로로옥탄산(chlorooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-브로모헥산산(bromohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-브로모옥탄산(bromooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-11-브로모운데칸산(bromoundecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-부텐산(butenoic acid), 6-하이드록시(hydroxy)-3-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸부탄산(methylbutyric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸발레르산(methylvaleric acid) 및 3-하이드록시(hydroxy)-2,6-디메틸-5-헵텐산(heptenoic acid)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인
    락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 공중합체는 poly(2HB-co-lactate-co-glycolate), poly(2HB-co-3HB-co-lactate-co-glycolate), poly(3HB-co-lactate-co-glycolate), poly(4HB-co-lactate-co-glycolate), poly(3HP-co-lactate-co-glycolate), poly(3HB-co-4HB-co-lactate-co-glycolate) 및 poly(3HP-co-4HB-co-lactate-co-glycolate)로 구성된 군에서 선택되는 것인
    락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체의 제조방법.
  12. 락테이트 모노머 및 글라이콜레이트 모노머를 포함하는 공중합체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 공중합체는 2-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionate), 3-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(hydroxyvalerate), 4-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 탄소수가 6∼14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acids), 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시 도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-펜텐산(pentenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-trans-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-cis-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-trans-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-노넨산(nonenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-데센산(decenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5,8-cis-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸발레르산(methylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸헵탄산(methylheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸-6-옥텐산(octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산(hydroxysuccinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아디핀산(hydroxyadipinic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시아젤라인산(hydroxyazelaic acid)-메틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid,)-메틸에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-에틸에스테르, 3-하이드록시피메린산(hydroxypimelic acid)-프로필에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-벤질에스테르, 3-하이드록시(hydroxy)-8-아세톡시옥탄산(acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-아세톡시노난산(acetoxynonanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시(nitrophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-페닐발레르산(phenylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-시클로헥실부탄산(cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시(dihydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4,5-에폭시데칸산(epoxydecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6,7-에폭시도데칸산(epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8,9-에폭시(epoxy)-5,6-cis-테트라데칸산(tetradecanoic acid), 7-시아노(cyano)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 9-시아노(cyano)-3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-플루오로헵탄산(fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-플루오로노난산(fluorononanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-클로로헥산산(chlorohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-클로로옥탄산(chlorooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-브로모헥산산(bromohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-브로모옥탄산(bromooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-11-브로모운데칸산(bromoundecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-부텐산(butenoic acid), 6-하이드록시(hydroxy)-3-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸부탄산(methylbutyric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸발레르산(methylvaleric acid), 및 3-하이드록시(hydroxy)-2,6-디메틸-5-헵텐산(heptenoic acid)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 하이드록시알카노에이트를 추가로 포함하는 것인 공중합체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 공중합체는 2-하이드록시부티레이트(2HB)-락테이트-글라이콜레이트 공중합체 [poly(2HB-co-lactate-co-glycolate)]인 공중합체.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 공중합체는 2-하이드록시부티레이트-3-하이드록시부티레이트-락테이트-글라이콜레이트 공중합체 [poly(2HB-co-3HB-co-lactate-co-glycolate)]인 공중합체.
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