KR101084942B1 - Anti?arthritic agent using Cyathula officinalis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 천우슬 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체는 연골세포에서 관절 연골 파괴에 가장 중추적인 역할을 하는 MMP-13의 발현 저해 효과를 보이며, 토끼 연골조직 배양(rabbit cartilage tissue culture)을 통하여 콜라겐 분해 산물(collagen degradation product) 및 프로테오글리칸(proteoglycan)의 생성 억제효과를 재확인하였고, 최종적으로 이러한 항염증작용을 in vivo 동물모델에서 확인한 바, MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.The present invention relates to a composition containing Cyathula officinalis extract, fraction or sesquiterpene derivative isolated therefrom as an active ingredient, and in detail, the extract from Chunthula extract, fraction or the present invention. One sesquiterpene derivative has been shown to inhibit the expression of MMP-13, which plays a pivotal role in the destruction of articular cartilage in chondrocytes, and to reduce collagen degradation through rabbit cartilage tissue culture. product) and proteoglycan production inhibitory effects were reconfirmed. Finally, the anti-inflammatory action was confirmed in an animal model in vivo, and the pharmaceutical composition and health function useful for the prevention and treatment of diseases caused by MMP-13 overexpression. It can be used in food.
천우슬, 세스퀴테르펜(sesquiterpene), 연골세포, MMP-13, 항염증, 관절염, 5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one, atractylenoide Ⅰ Cheonwooseul, sesquiterpene, chondrocytes, MMP-13, anti-inflammatory, arthritis, 5α-H-10-β-selina-4 (14), 7 (11) -dien-8-one, atractylenoide I
Description
본 발명은 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for the prevention and treatment of diseases caused by overexpression of MMP-13 containing Cyathula officinalis extract, fraction or sesquiterpene derivative isolated therefrom as an active ingredient.
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관절염에는 여러 종류가 있으나, 이중 가장 많은 환자들이 겪는 퇴행성관절염(골관절염, osteoarthritis)은 관절의 연골이 닳아 없어지면서 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환이다. 이 질환은 주로 노인 인구에 발생하여 삶의 질을 현저히 떨어뜨리는데, 손, 발, 척추와 체중부과를 많이 받는 관절, 즉, 고관절이나, 무릎관절에서 많이 발생한다. 또한, 류마티스성 관절염은 면역체계의 이상으로부터 발병하는 자가면역 질환이다. 이들 관절염증질환의 원인은 서로 다르고, 아직 모든 것이 다 밝혀져 있지 않지만, 질병의 진행을 도우며 악화시키는 매개체(mediator)들에 관하여는 많은 부분이 밝혀져 있다. 즉, 인터루킨-1(interleukin-1) 등의 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine), 에이코사노이드(eicosanoid)(프로스타글란딘(prostaglandins) 및 류코트리엔(leukotrienes)) 및 이들을 다량 생합성하는 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2), 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase) 등의 효소류들이 관련되어 있다. 최종적으로는 이들 매개체들의 작용으로 기질성 금속단백분해효소(matrix metalloproteinase; MMP)가 과발현되고, 이들의 작용으로 결국 연골 및 관절의 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 파괴가 일어나, 질병을 진행시키며 서서히 악화되는데, MMP 중 관절에서는 MMP-13(포유류 콜라겐분해효소(mammalian collagenase))이 가장 핵심적인 역할을 한다고 알려져 있다. There are many types of arthritis, but osteoarthritis is the disease that most patients suffer from local degenerative changes as the cartilage of the joints wears off. The disease mainly affects the elderly population and significantly reduces the quality of life, most commonly in the joints of the hands, feet, spine and weight, namely the hip and knee joints. Rheumatoid arthritis is also an autoimmune disease that develops from abnormalities of the immune system. The causes of these arthritis diseases are different and not all is known yet, but much is known about the mediators that help and exacerbate disease progression. That is, proinflammatory cytokines such as interleukin-1, eicosanoids (prostaglandins and leukotrienes), and cyclooxygenase-2 which biosynthesize them in large quantities. Enzymes such as cyclooxygenase-2) and 5-lipoxygenase are involved. Finally, the action of these mediators overexpresses matrix metalloproteinases (MMPs), and their actions eventually lead to the destruction of the extracellular matrix (ECM) of cartilage and joints, leading to disease progression. MMP-13 (mammalian collagenase) plays a key role in joints.
연골의 성분인 ECM은 크게 프로테오글리칸(proteoglycan)과 당단백질(glycoprotein)로 대별할 수 있다. 이것은 관절연골에 있는 연골세 포(chondrocyte)와 염증의 진행에 따라 모이는 활막(synovial membrane)의 섬유아세포 유사 활막세포(fibroblast-like synoviocyte; FLS)에서 생합성되어 세포외로 분비되며, 이들의 turn-over를 위하여 따로 MMP를 생산하여 분비한다. 즉, 이들 세포가 한쪽으로는 ECM을 생합성하며, 한쪽으로는 MMP를 생산하여 이들의 균형을 잡아 관절의 건강과 유연함을 유지한다. 그러나 관절염 상황에서는 위에서 설명한 매개체들의 자극에 의하여 이들 세포로부터 MMP가 높은 농도로 유도 발현되고, 이들이 ECM을 병적으로 공격하여 관절이 서서히 파괴된다. ECM, a component of cartilage, can be roughly classified into proteoglycans and glycoproteins. It is biosynthesized and secreted extracellularly from chondrocytes in the articular cartilage and fibroblast-like synoviocytes (LFS) of the synovial membrane that collect as the inflammation progresses. MMP is produced and secreted separately. That is, these cells biosynthesize ECM on one side and MMP on one side to balance them to maintain joint health and flexibility. However, in arthritis situations, MMPs are induced and expressed at high concentrations from these cells by stimulation of the above-described mediators, and they attack the ECM pathologically and the joints are gradually destroyed.
천우슬(Cyathula officinalis)은 비름과(Amaranthaceae)에 속하는 다년생 초본으로 건조한 뿌리를 약용하며 월경부조의 치료 및 이뇨제로 중국에서 사용되고 있다(중화인민공화국약전, 중국약전위원회, 1부, p.28, 2000). 천우슬의 성분연구로는 Zhou등(Zhou et al., Chemical study on Cyathula officinalis Kuan, Journal of Asian Natural Products Research, 7, pp.245-252, 2005)이 4-[(1-ethoxy-2-hydroxy)ethyl]phenol, 2,3-isoproplylidene cyasterone, 24-hydroxycyasterone, 2,3-isopropylidene isocycasterone, N-[(3,4,5-trimethoxy)phenyl]formamide, 6,7-dimethoxycoumarin, butanedioic acid, p-hydroxybenzoic acid, betavulgarin, daidzin, puerarin, phenyl 1-β-D-glucopyranoside, cyasterone, sengosterone, amarasterone A, precyasterone, isocyasterone 및 makisterone B 등을 분리, 보고하였으며, Okuzumi 등(Okuzumi et al., Structural elucidation of cyasterone stereoisomers isolated from Cyathula officinalis, Organic Biomolecular Chemistry, 3, pp.1227-1232, 2005)이 Cyasterone, 28-Epi-cyasterone 및 25-Epi- 28-epi-cyasterone 등을 분리, 보고하였다. 또한, Zhou등[Zhou et al., Glycosides from Roots of Cyathula officinalis Kuan, Journal of Integrative Biology, 47(3), pp.368-374, 2005)은 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-(n-butyl-β-D-glucopyranosiduronate)]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid, 3-O-(methyl-β-D-glucopyranosiduronate)-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic aicd, 3-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid, 3-O-β-D-glucuronopyranosyl oleanolic acid, 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-(β-D-glucuronopyranosyl)] oleanolic acid, 3-O-(β-D-glucuronopyranosyl)-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic aicd, 28-O-β-D-glucuronopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl hederagenin, 3-O-[α-L-rhamopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 및 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rahmnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 등을 분리하였고, MDA-MB-231(a human breast cancer cell line)에 대한 세포독성(cytotoxicity)을 측정하여 활성물질로 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-(n-butyl-β-D-glucopyranosiduronate)]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid와 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-(β-D-glucuronopyranosyl)] oleanolic acid를 보고하였으며, Chen등(Chen et al., Structural elucidation and antitumor activity of a fructan from Cyathula officinalis Kuan, Carbohydrate Research, 338, pp.1235-1241, 2003)은 폴리사카라이드(polysacccharide)인 fructan계열의 화합물을 분리하여 구조를 동정하고 Lewis pulmonary carcinoma cells을 대상으로 항암활성을 측정 하여 보고하였다. Cyathula officinalis is a perennial herb belonging to the Amaranthaceae, medicated with dry roots and used in China as a treatment and diuretic for menstrual relief (People's Republic of China, Pharmacopeia of China,
천우슬(Cyathula officinalis)은 국내에서 자생하는 우슬[쇠무릎(Achyranthes japonica Nakai)의 뿌리]과는 완전히 다른 기원의 식물이다(중화인민공화국약전, 중국약전위원회, 1부, p.28, 2000; 약전분과위원회, 제 9개정 대한약전해설서, p.1159, 2008). 우슬의 염증관련 저해작용에 대하여는 여러 논문을 통하여 잘 알려져 있으나, 천우슬에 대해서는 관련된 학술보고 및 특허가 전무하다. 그러므로 천우슬의 염증 억제작용 특히 관절염 억제작용은 현대 과학적으로 증명된 것이 없으며, 작용기전에 대한 보고도 전무하다. Cyathula officinalis is a plant of a completely different origin from the domestically-grown hyssop (root of Achyranthes japonica Nakai) (People's Republic of China Pharmacopoeia, Chinese Pharmacopeia Commission,
이에 본 발명자들은 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체에 의한 관절파괴 저해작용, 관절염의 예방 및 치료 효과 및 그 작용기전에 대해 지속적으로 연구한 결과, 연골세포에서 관절 연골 파괴에 가장 중추적인 역할을 하는 MMP-13의 발현 저해 효과, 콜라겐 분해 산물(collagen degradation product) 및 프로테오글리칸(proteoglycan)의 생성 억제효과를 확인하였고, 토끼 연골조직 배양(rabbit cartilage tissue culture)을 통하여 상기 작용을 재확인 하였으며, 최종적으로 이러한 항염증작용을 in vivo 동물모델에서 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have continuously studied the inhibitory effect of joint destruction by the extract of Cyathula officinalis, fractions or sesquiterpene derivatives isolated therefrom, the prevention and treatment effect of arthritis, and the mechanism of action thereof. Inhibition of MMP-13 expression, collagen degradation product and proteoglycan production, which are the most important factors in the destruction of articular cartilage in cells, were confirmed, and rabbit cartilage tissue culture The above action was reconfirmed, and finally, the anti-inflammatory action was confirmed in an animal model in vivo to complete the present invention.
상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성 분으로 함유하는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention is to prevent and treat diseases caused by MMP-13 overexpression containing Cyathula officinalis extract, fraction or sesquiterpene derivatives isolated therefrom as an active ingredient. Provide a pharmaceutical composition.
또한, 본 발명은 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food for the prevention and improvement of diseases caused by overexpression of MMP-13 containing Cyathula officinalis extract, fraction or sesquiterpene derivatives isolated therefrom as an active ingredient. to provide.
본원에서 정의되는 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체는 하기 구조식 (Ⅰ)의 5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one 또는 구조식 (Ⅱ)의 atractylenoide Ⅰ임을 특징으로 한다:Sesquiterpene derivatives as defined herein include 5α-H-10-β-selina-4 (14), 7 (11) -dien-8-one of formula (I) or atractylenoide of formula (II) It is characterized by I:
본원에서 정의되는 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알콜, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매에 용해된 상태의 추출물을 포함한다.The extract as defined herein is water, lower alcohols of C 1 to C 4 , hexane, chloroform, methylene chloride, ethyl acetate, glycerin, butylene glycol or a mixed solvent thereof, preferably water, ethanol, methanol, hexane, Chloroform, methylene chloride, ethyl acetate or mixed solvents thereof, more preferably water, ethanol, chloroform or extracts dissolved in a mixed solvent thereof.
본원에서 정의되는 분획물은 천우슬의 극성용매 가용 분획물 또는 비극성용매 가용 분획물임을 특징으로 한다.The fractions defined herein are characterized as being polar solvent soluble fractions or nonpolar solvent soluble fractions of shallow dew.
본원에서 정의되는 상기 극성용매 가용 분획물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 또는 부탄올에 용해된 상태의 분획물을 포함한다.The polar solvent soluble fraction as defined herein includes fractions dissolved in water, methanol, ethanol, butanol or a mixed solvent thereof, preferably water or butanol.
본원에서 정의되는 상기 비극성용매 가용 분획물은 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린 또는 부틸렌글리콜, 바람직하게는 헥산 또는 메틸렌클로라이드에 용해된 상태의 분획물을 포함한다.The nonpolar solvent soluble fraction as defined herein comprises a fraction dissolved in hexane, chloroform, methylene chloride, ethyl acetate, glycerin or butylene glycol, preferably in hexane or methylene chloride.
본원에서 정의되는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환은 급.만성 염증성 질환, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 척추관절병증, 강직성 척추염, 루푸스(Lupus) 관절염, 신경계의 수초탈락 질환, 치근막 질환, 당뇨성 망막변성, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 원추 각막 또는 쇼그렌 증후군, 바람직하게는 급.만성 염증성 질환, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 척추관절병증, 강직성 척추염 또는 루푸스(Lupus) 관절염, 보다 바람직하게는 퇴행성 관절염 또는 류마티스 관절염이다.Diseases caused by MMP-13 overexpression as defined herein include acute and chronic inflammatory diseases, degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, degenerative cartilage loss due to traumatic joint injury, spondyloarthropathy, ankylosing spondylitis, lupus arthritis, the nervous system Demyelination, periodontal disease, diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy, immature retinopathy, keratoconus or Sjogren's syndrome, preferably acute and chronic inflammatory disease, degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, degenerative cartilage due to traumatic joint injury Loss, spondyloarthropathy, ankylosing spondylitis or Lupus arthritis, more preferably degenerative arthritis or rheumatoid arthritis.
이하, 본 발명의 천우슬 추출물 및 분획물을 수득하는 방법 및 이로부터 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 분리하는 방법을 상세히 설명한다.Hereinafter, a method of obtaining the cheonwoo seol extract and fractions of the present invention and a method of separating sesquiterpene derivatives therefrom will be described in detail.
천우슬(Cyathula officinalis)에 추출용매로서 물, C1 내지 C4의 저급 알콜, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매를 시료 중량의 1 내지 1000배, 바람직하게는 10 내지 500배(v/w) 가하여 4 내지 40℃, 바람직하게는 10 내지 33℃에서 1 내지 5시간, 바람직하게는 3시간씩 2회 연속 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 또는 가열추출 등으로 추출한 후, 감압에서 건조하여 본 발명의 추출물을 수득할 수 있다. Water, C 1 to C 4 lower alcohols, hexane, chloroform, methylene chloride, ethyl acetate, glycerin, butylene glycol or mixed solvents thereof, preferably water, ethanol, methanol as extraction solvent in Cyathula officinalis , Hexane, chloroform, methylene chloride, ethyl acetate or a mixed solvent thereof, more preferably water, ethanol, chloroform or a mixed solvent thereof from 1 to 1000 times, preferably 10 to 500 times (v / w) the sample weight ) And then extracted at 4 to 40 ° C., preferably at 10 to 33 ° C. for 2 to 5 hours, preferably for 3 hours, by continuous cold extraction, hot water extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction or heat extraction, and then decompression. It can be dried at to obtain an extract of the present invention.
또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 분획물은 상기에서 얻은 추출물, 바람직하게는 천우슬 에탄올 추출물을 추출물 중량의 0.1 내지 1000배, 바람직하게는 1 내지 500배 부피(v/w)의 물에 현탁시킨 후, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 부탄올을 순차적으로 가하여 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 4회 분획하여 헥산, 메틸렌클로라이드 등의 비극성 용매에 용해된 상태의 비극성 용매 가용 분획물; 및 부탄올, 물 등의 극성용매에 용해된 상태의 극성 용매 가용 분획물을 수득할 수 있다.In addition, the polar or non-polar solvent soluble fraction of the present invention is the extract obtained above, preferably Cheonwooseol ethanol extract 0.1 to 1000 times the weight of the extract, preferably 1 to 500 times the volume (v / w) of water After suspension, hexane, methylene chloride and butanol are added sequentially to fractionate 1 to 5 times, preferably 2 to 4 times, and the non-polar solvent soluble fraction dissolved in a non-polar solvent such as hexane, methylene chloride; And polar solvent soluble fractions dissolved in a polar solvent such as butanol and water.
또한, 천우슬의 뿌리를 물 및 에탄올 혼합용매로 가열추출하는 제 1단계; 수득한 추출물에 클로로포름과 증류수를 가하고 분획하여 클로로포름 가용성 분획물을 수득하는 제 2단계; 클로로포름 가용성 분획물을 클로로포름 : 메탄올 = 15 : 1을 용매로 오픈 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 5개의 분획으로 나누는 제 3단계; 상기 제 3단계에서 수득한 분획을 대상으로 헥산 : 에틸아세테이트 = 4 : 1을 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 6개의 소분획으로 나누는 제 4단계; 상기 제 4단계에서 수득한 소분획을 대상으로 헥산 : 에틸아세테이트 = 9 : 1을 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 4개의 소분획으로 나누는 제 5단계; 상기 제 5단계에서 수득한 소분획을 대상으로 물 및 메탄올 혼합용매 또는 클로로포름을 용매로 ODS 컬럼 크로마토그래피 또는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하는 제 6단계의 제조공정을 통하여 본 발명의 화합물을 분리정제 할 수 있다.In addition, the first step of extracting the root of the natural dew with heat and ethanol mixed solvent; Adding a chloroform and distilled water to the obtained extract and fractionating to obtain a chloroform soluble fraction; Chloroform soluble fraction is subjected to open column chromatography with chloroform: methanol = 15: 1 in a solvent and divided into five fractions; A fourth step of subjecting the fractions obtained in the third step to hexane: ethyl acetate = 4: 1 by silica gel column chromatography with a solvent and dividing it into six small fractions; A fifth step of subjecting the small fraction obtained in the fourth step to hexane: ethyl acetate = 9: 1 using silica gel column chromatography with a solvent and dividing the same into four small fractions; The compound of the present invention can be separated and purified from the small fraction obtained in step 5 by ODS column chromatography or silica gel column chromatography using a mixed solvent of water and methanol or chloroform as a solvent. Can be.
본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 천우슬(Cyathula officinalis) 추출 물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.The present invention provides a method for the prevention and treatment of diseases caused by MMP-13 overexpression containing Cyathula officinalis extract, fraction or sesquiterpene derivatives isolated therefrom as an active ingredient. Provide a pharmaceutical composition.
본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물을 함유하는 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물, 분획물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.Pharmaceutical compositions containing extracts, fractions or compounds of the invention comprise from 0.1 to 50% by weight of said extract, fraction or compound, relative to the total weight of the composition.
그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.However, the composition is not limited thereto, and may vary depending on the condition of the patient, the type of disease, and the progress of the disease.
본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물 자체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다. The extracts, fractions or compounds of the present invention are medicaments that can be used with confidence even when taken for long periods of time because of their low toxicity and side effects.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.The compositions of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물, 분획물 또는 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물, 분획물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.The compositions of the present invention can be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods. Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition comprising the extract, fraction or compound include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium Phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, It is prepared by mixing sucrose or lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. In addition to water and liquid paraffin, simple diluents commonly used, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included . Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. As the non-aqueous solvent and suspending agent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물은 1일 0.5 g/kg 내지 5 g/kg으로, 바람직하게는 1 g/kg 내지 3 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The preferred dosage of the composition of the present invention varies depending on the condition and the weight of the patient, the degree of disease, the type of drug, the route of administration and the period of time, but can be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the extract, fraction or compound of the present invention is preferably administered at 0.5 g / kg to 5 g / kg, preferably 1 g / kg to 3 g / kg per day. The administration may be carried out once a day or divided into several doses. Accordingly, the dosage is not limited in any way to the scope of the present invention.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.The composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration may be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intra-uterine or intracerebroventricular injections.
또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for the prevention of diseases caused by MMP-13 overexpression containing Cyathula officinalis extract, fractions or sesquiterpene derivatives isolated therefrom as an active ingredient. Provide health functional food for improvement.
본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물을 포함하는 조성물은 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.Compositions comprising the extracts, fractions or compounds of the present invention can be used in a variety of drugs, foods and beverages for the prevention and improvement of diseases caused by MMP-13 overexpression. Foods to which the extract, fraction or compound of the present invention may be added include, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, dietary supplements, and the like, and are powders, granules, tablets, capsules, or beverages. Available in form.
본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물은 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물, 분획물 또는 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. Extracts, fractions or compounds of the present invention may be added to foods or beverages for the purpose of preventing and ameliorating diseases caused by MMP-13 overexpression. At this time, the amount of the extract, fraction or compound in the food or beverage is generally added to the health food composition of the
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물, 분획물 또는 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.In addition to containing the extracts, fractions or compounds as essential ingredients in the indicated proportions, the health beverage composition of the present invention has no particular limitations on the liquid components and contains various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks. can do. Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as disaccharides such as glucose and fructose such as maltose, sucrose and the like and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like Sugar, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As flavoring agents other than those described above, natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract (e.g., Rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. The proportion of said natural carbohydrates is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 mL of the composition of the present invention.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.In addition to the above-mentioned composition, the composition of the present invention can be used as a flavoring agent such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, coloring agents and intermediates (cheese, chocolate etc.), pectic acid and its salts, Salts, organic acids, protective colloid thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated beverages and the like. In addition, the compositions of the present invention may contain flesh for the production of natural fruit juices and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical, but is generally selected in the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
본 발명의 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체는 연골세포에서 관절 연골 파괴에 가장 중추적인 역할을 하는 MMP-13의 발현 저해 효과를 보였으며, 토끼 연골조직 배양(rabbit cartilage tissue culture)을 통하여 콜라겐 분해 산물(collagen degradation product) 및 프로테오글리칸(proteoglycan)의 생성 억제효과를 확인하였고, 최종적으로 이러한 항염증작용을 in vivo 동물모델에서 확인한 바, MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.Cyathula officinalis extract, fraction or sesquiterpene derivatives isolated therefrom showed an inhibitory effect on the expression of MMP-13, which plays a pivotal role in the destruction of articular cartilage in chondrocytes. Inhibition of the production of collagen degradation products and proteoglycans through rabbit cartilage tissue culture was confirmed. Finally, the anti-inflammatory action was confirmed in an in vivo animal model. It can be used in pharmaceutical compositions and health functional foods useful for the prevention and treatment of diseases caused by overexpression.
이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by reference examples, examples and experimental examples.
단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.However, the following Reference Examples, Examples, and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following Reference Examples, Examples, and Experimental Examples.
비교예Comparative example 1. 국산 1. Domestic 우슬Dew 추출물의 제조 Preparation of Extract
경동시장에서 구입한 국산 우슬(Achyranthes japonica Nakai) 100g에 100% 에탄올을 1ℓ가하여 20℃에서 3시간씩 2번 연속적으로 냉침추출한 후, 감압에서 건조하여 국산 우슬 추출물을 5.4g 수득하여 하기 실험예의 비교용 시료로 사용하였다.100 g of ethanol (Achyranthes japonica Nakai) purchased from Gyeongdong market was added 100 g of ethanol and cold extraction was performed twice at 20 ° C. for 3 hours, followed by drying under reduced pressure to obtain 5.4 g of domestic dew extract. Used as a sample for.
실시예Example 1. One. 천우슬Cheolwoo Seol 추출물의 제조 Preparation of Extract
경동시장에서 구입한 천우슬(Cyathula officinalis) 각각 100g씩에 증류수, 5 내지 100% 수용성 에탄올, 100% 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 에틸아세테이트를 1ℓ씩 각각 가하여 20℃에서 3시간씩 2번 연속적으로 냉침추출한 후, 감압에서 건조하여 본 발명의 천우슬 추출물을 수득하여 하기 실험예의 시료로 사용하였다. 각각의 추출물의 수율은 하기 표 1에 나타내었다.To 100 g of Cyathula officinalis purchased from Kyungdong Market, distilled water, 5 to 100% water-soluble ethanol, 100% methanol, hexane, methylene chloride , chloroform, and ethyl acetate were added 1 liter each, twice at 20 ° C for 3 hours. Continuous cold extraction, and then dried under reduced pressure to obtain the cheonwooseol extract of the present invention was used as a sample of the following experimental example. The yield of each extract is shown in Table 1 below.
실시예Example 2. 2. 천우슬Cheolwoo Seol 극성용매 및 Polar solvents and 비극성용매Nonpolar Solvent 가용 Available 분획물의Fraction 제조 Produce
상기 실시예 1을 반복하여 수득한 100% 에탄올 추출물(CO-EtOH) 100 g을 물 0.2ℓ에 넣은 후, 분획깔대기에서 각각 0.5ℓ의 헥산, 메틸렌클로라이드, 부탄올로 차례로 3회 분획하여 헥산 분획물(5.4g), 메틸렌클로라이드 분획물(9.2g), 부탄올 분획물(21.7g) 및 나머지 물 분획물(36.2g)을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다. 각각의 분획물의 수율은 하기 표 2에 나타내었다.100 g of 100% ethanol extract (CO-EtOH) obtained by repeating Example 1 was added to 0.2 l of water, and then fractionated three times with 0.5 l of hexane, methylene chloride, and butanol in a fraction funnel, respectively, in hexane fraction ( 5.4 g), methylene chloride fraction (9.2 g), butanol fraction (21.7 g) and the remaining water fraction (36.2 g) were obtained and used as samples in the following experimental example. The yield of each fraction is shown in Table 2 below.
실시예Example 3. 3. 천우슬로부터From heavenly dew 세스퀴테르펜Sesquiterpenes (( sesquiterpenesesquiterpene ) 유도체의 분리 및 동정Isolation and Identification of Derivatives
천우슬의 뿌리로부터 활성 화합물을 분리하기 위하여 천우슬의 뿌리 6 ㎏을 95% 에탄올 18ℓ로 가열추출하여 에탄올 추출물 1.2 ㎏을 수득하였다. 수득한 에탄올 추출물에 클로로포름 4ℓ과 증류수 2ℓ를 가하고 분획하여 클로로포름 가용성 분획물 10 g을 수득하였다. 활성-추적 분리(Activity-guided separation)기술을 이용하여, 계속적으로 클로로포름 가용성 분획물 10 g을 실리카겔(silica gel) 200 g을 충진제로 사용하고, 유리 분리관(glass column; φ5× 50㎝)을 이용하여, 클로로포름 : 메탄올 = 15 : 1을 용매로 오픈 컬럼 크로마토그래피(open column chromatography)를 실시하여 5개의 분획(Ⅰ~Ⅴ)으로 나누었다. 분획 Ⅱ를 대상으로 헥산 : 에틸아세테이트 = 4 : 1을 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography; φ3×40㎝)를 실시하여 6개의 소분획(Ⅱ-1 ~ Ⅱ-6)으로 나누었다. 소분획 Ⅱ-2를 다시 헥산 : 에틸아세테이트 = 9 : 1을 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(φ3×40㎝)를 실시하여 4개의 소분획(Ⅱ-2-1 ~ Ⅱ-2-4)으로 나누었다. 소분획 Ⅱ-2-2를 80% 메탄올을 용매로 ODS 컬럼 크로마토그래피(φ3×20㎝)를 실시하여 화합물 1을 10 ㎎ 수득하였다. 또한, 소분획 Ⅱ-2-3을 100% 클로로포름을 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(φ3×20㎝)를 실시하여 화합물 2를 17 ㎎ 수득하였다. In order to separate the active compound from the root of the dew drop, 6 kg of the root drop of the dew drop was heat-extracted with 18 L of 95% ethanol to obtain 1.2 kg of ethanol extract. Chloroform in the obtained ethanol extract 4 L and 2 L of distilled water were added and fractionated to obtain 10 g of a chloroform soluble fraction. Using activity-guided separation technology, 10 g of chloroform soluble fraction was continuously used with 200 g of silica gel as a filler and a glass column (φ5 × 50 cm) was used. Chloroform: methanol = 15: 1 was subjected to open column chromatography with a solvent, and divided into five fractions (I to V). For fraction II, hexane: ethyl acetate = 4: 1 was subjected to silica gel column chromatography (φ3 × 40 cm) with a solvent, which was divided into six small fractions (II-1 to II-6). The subfraction II-2 was further subjected to silica gel column chromatography (φ3 × 40 cm) with hexane: ethyl acetate = 9: 1 to be divided into four subfractions (II-2-1 to II-2-4). . Small fraction II-2-2 was subjected to ODS column chromatography (φ3 × 20 cm) with 80% methanol as a solvent to obtain 10 mg of
화합물 1 - 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ : 0.77 (3H, s), 1.82 (3H, s), 1.99 (3H, s), 4.61 (1H, s), 4.86 (1H, s) ; 13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ : 17.33 (C-15), 22.32 (C-13), 23.14 (C-2), 23.26 (C-12), 29.19 (C-6), 36.78 (C-1 or C-3), 38.20 (C-10), 41.25 (C-1 or C-3), 47.06 (C-5), 57.61 (C-9), 106.95 (C-14), 131.55 (C-7), 142.74 (C-11), 149.08 (C-4), 203.83 (C-8)Compound 1 - 1 H-NMR (600 MHz, CDCl 3) δ: 0.77 (3H, s), 1.82 (3H, s), 1.99 (3H, s), 4.61 (1H, s), 4.86 (1H, s) ; 13 C-NMR (150 MHz, CDCl 3 ) δ: 17.33 (C-15), 22.32 (C-13), 23.14 (C-2), 23.26 (C-12), 29.19 (C-6), 36.78 ( C-1 or C-3), 38.20 (C-10), 41.25 (C-1 or C-3), 47.06 (C-5), 57.61 (C-9), 106.95 (C-14), 131.55 ( C-7), 142.74 (C-11), 149.08 (C-4), 203.83 (C-8)
화합물 2 - 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ : 0.93 (3H, s, CH3), 1.89 (3H, d, J=1.2 Hz, CH3), 4.62 (1H, s, C=CH2), 4.90 (1H, s, C=CH2), 5.59 (1H, s, C=CH); 13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ : 8.46 (C-13), 18.57 (C-14), 22.66 (C-6), 23.00 (C-2), 36.18 (C-3), 38.13 (C-10), 39.10 (C-1), 48.41 (C-5), 107.48 (C-15), 119.16 (C-9), 120.45 (C-11), 147.99 (C-4), 148.09 (C-8), 148.34 (C-7), 171.38 (C-12)Compound 2 - 1 H-NMR (600 MHz, CDCl 3) δ: 0.93 (3H, s, CH 3), 1.89 (3H, d, J = 1.2 Hz, CH 3), 4.62 (1H, s, C = CH 2 ), 4.90 (1H, s, C = CH 2 ), 5.59 (1H, s, C = CH); 13 C-NMR (150 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.46 (C-13), 18.57 (C-14), 22.66 (C-6), 23.00 (C-2), 36.18 (C-3), 38.13 ( C-10), 39.10 (C-1), 48.41 (C-5), 107.48 (C-15), 119.16 (C-9), 120.45 (C-11), 147.99 (C-4), 148.09 (C -8), 148.34 (C-7), 171.38 (C-12)
상기 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼을 문헌(Nishikawa et al., Yakugaku Zasshi, 97, pp.515-518, 1977)과 비교하여 화합물 1은 그 구조를 5α-H-10-β-Selina-4(14),7(11)-dien-8-one으로, 화합물 2는 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼을 문헌(Endo et al., Chem . Phram . Bull., 27, pp.2594-2958, 1979; Pachaly et al., Planta Med., 55, pp.59-61, 1989)과 비교하여 그 구조를 Atractylenoide Ⅰ으로 각각 동정하였다.The 1 H-NMR and 13 C-NMR spectra are described in Nishikawa et al., Yakugaku Compared to Zasshi , 97 , pp. 515-518, 1977), the
참고예Reference Example 1. 토끼 관절의 연골 조직 배양 및 활성화 1.Cartilage Tissue Culture and Activation of Rabbit Joints
Baek등의 방법에 따라(Baek et al., Biol. Pharm. Bull. 29, pp.1423-1430, 2006), 토끼 관절의 연골 조직(rabbit articular cartilage slice)을 잘라내고 complete DMEM 배지에서 14일 동안 배양하였다. 그 후 연골(cartilage)을 잘라 각각 48-웰 플레이트에 넣고, IL-1α 10ng/ml을 처리하여 25일간 배양하였다. 이때, 검체를 여러 농도로 처리하여 배양한 후, 3, 7, 14 및 28일에 상등액을 얻어, 하기 실험예 2에서 사용하였다.According to Baek et al. (Baek et al., Biol. Pharm. Bull. 29 , pp. 1423-1430, 2006), the rabbit articular cartilage slices were cut out for 14 days in complete DMEM medium. Incubated. After that cartilage (cartilage) was cut into each 48-well plate, and treated with IL-1α 10ng / ml and incubated for 25 days. At this time, the sample was treated at various concentrations and cultured, and then, the supernatant was obtained on
실험예Experimental Example 1. One. 천우슬의Heavenly MMPMMP -13 발현 저해 효과-13 expression inhibition effect
상기 실시예에서 수득한 천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물의 MMP-13 발현 저해 효과를 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험하였다(Pei et al., Osteoarthritis Cartilage, 14, pp.749-758, 2006).In order to confirm the inhibitory effect of MMP-13 expression of the cheonwooseol extract, fractions and compounds isolated from the above-mentioned examples, experiments were carried out as follows using the method described in the literature (Pei et al., Osteoarthritis Cartilage, 14 , pp. 749-758, 2006).
인간 연골육종 세포주(Human chondrosarcoma cell line)인 SW1353(ATCC사)을 10% FBS와 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민이 첨가된 DMEM을 사용하여 배양하였다. 배지 내로 분비되는 MMP-13의 발현을 확인하기 위해서 serum-free DMEM 조건하에서 IL-1β를 10 ng/ml 농도로 처리하고 24시간 경과 후, 상등액을 얻어 다음의 방법과 같이 웨스턴 블랏(western blot)을 시행하여 이들 MMP의 양을 확인하였다. 세포배양 상등액에 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid, Sigma)을 최종농도 15%로 첨가하여 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 다음, 상등액을 버리고 아세톤(acetone)을 1 ml 첨가한 후, vortex하여 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 다시 상등액을 버리고 실온에서 30분 이상 건조시킨 다음, 1X sample buffer를 20 ul 넣고 vortex한 후 3분간 가열하여 10% gel에 전기영동시켰다. PVDF로 1시간 transfer시킨 후, anti-MMP-13 antibody(Sigma, M4052)를 1:5000으로 5% 탈지유(skim milk)에 희석하여 1시간 반응시키고, anti-rabbit antibody(Cell signaling)를 1:2000으로 5% 탈지유(skim milk)에 희석하여 1시간 반응시켰다. ECL 용액(Amersham)을 첨가하여 x-ray film에 감광시켰다.SW1353 (ATCC), a human chondrosarcoma cell line, was incubated with DMEM supplemented with 10% FBS, penicillin / streptomycin and glutamine. In order to confirm the expression of MMP-13 secreted into the medium, after treatment with IL-1β at a concentration of 10 ng / ml under serum-free DMEM conditions, after 24 hours, the supernatant was obtained and western blot as follows. The amount of these MMPs was confirmed by the test. Add trichloroacetic acid (Sigma) to the cell culture supernatant at a final concentration of 15%, centrifuge at 12,000 rpm for 10 minutes, discard the supernatant, add 1 ml of acetone, and vortex at 12,000 rpm. Centrifuged for 10 minutes. Again, the supernatant was discarded and dried at room temperature for at least 30 minutes. After adding 20 ul of 1X sample buffer and vortexing, the mixture was heated for 3 minutes and electrophoresed on a 10% gel. After transfer to PVDF for 1 hour, anti-MMP-13 antibody (Sigma, M4052) was diluted 1: 5000 to 5% skim milk and reacted for 1 hour, and anti-rabbit antibody (Cell signaling) was 1: In 2000, 5% skim milk was diluted and reacted for 1 hour. ECL solution (Amersham) was added and photosensitive to x-ray film.
상기 비교예에서 수득한 국산 우슬 추출물 및 실시예 1 내지 실시예 3에서 수득한 천우슬 추출물, 분획물 및 화합물들을 각각 SW1353(1×106 cells/well)에 처리한 후, MMP-13의 양을 검정하였고, 그 결과는 blot의 scanning(HP Lajerjet 3052)을 통하여 정량적으로 하기 표 3 및 도 1에 나타내었다.After treating the domestic dew extract obtained in the Comparative Example and the Cheonwoose extract, fractions and compounds obtained in Examples 1 to 3 to SW1353 (1 × 10 6 cells / well), respectively, the amount of MMP-13 was Assays, and the results are shown in Table 3 and FIG. 1 quantitatively through blot scanning (HP Lajerjet 3052).
[5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one]
[5α-H-10-β-selina-4 (14), 7 (11) -dien-8-one]
실험결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 비교예에서 수득한 국산 우슬의 100% 에탄올 추출물은 MMP-13 저해 효과가 전혀 없었던 반면에, 천우슬의 추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용 분획물의 MMP-13의 저해능이 월등히 높음을 확인할 수 있었다. 또한, 천우슬의 비극성 분획으로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체 화합물 1 및 화합물 2가 활성물질임을 확인할 수 있었다. 이 결과는 천우슬의 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물이 관절에서의 ECM의 분해를 억제하여 관절염치료제로 작용할 것이라는 예상이 가능하게 하였다. As a result, as shown in Table 3, the 100% ethanol extract of domestic dew was obtained in the comparative example had no effect of inhibiting MMP-13, whereas the MMP-13 of the extract of cheonwoose, soluble fraction of polar solvent and nonpolar solvent. It was confirmed that the inhibitory ability of is much higher. In addition, it was confirmed that sesquiterpene
실험예 2. 글라이코스아미노글라이칸 및 콜라겐 분해 산물의 측정Experimental Example 2 Measurement of Glycosaminoglycans and Collagen Degradation Products
상기 실시예에서 수득한 천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물의 MMP 발현 저해에 따른 콜라겐 분해 산물(collagen degradation product) 및 프로테오글리칸(proteoglycan)의 양에 미치는 영향을 다음과 같이 확인하였다.The effects on the amount of collagen degradation products and proteoglycans according to the inhibition of MMP expression of the cheonwooseol extract, fractions and compounds isolated therefrom obtained in the above examples were identified as follows.
연골 글라이코스아미노글라이칸(Cartilage glycosaminoglycan)의 분해율(degradation)을 측정하기 위하여는 1,9-dimethylene blue 용액을 사용하여 535nm에서 글라이코스아미노글라이칸을 정량하였고, 그 결과를 하기 수학식 1을 이용하여 분해율을 계산하여 하기 표 4에 나타내었다. In order to measure the degradation of cartilage glycosaminoglycan, 1,9-dimethylene blue solution was used to quantify glycosaminoglycan at 535 nm, and the result was expressed using
또한, 연골의 콜라겐 분해율을 측정하기 위하여, 상기 참고예 1에서 준비한 배양 21일째의 상등액에 들어 있는 type II 콜라겐 분해 산물(collagen degradation product)을 sircol collagen type II cleavage ELISA assay를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 하기 수학식 1을 이용하여 분해율을 계산하여 하기 표 4에 나타내었다. 양성대조군으로는 Prednisolone(50 uM)을 사용하였다.In addition, in order to measure the collagen degradation rate of cartilage, the type II collagen degradation product contained in the supernatant of the 21st day of culture prepared in Reference Example 1 was measured by using a sircol collagen type II cleavage ELISA assay, and The results are shown in Table 4 by calculating the decomposition rate using the following equation (1). Prednisolone (50 uM) was used as a positive control.
실험결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 천우슬 100% 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물, 클로로포름 추출물 및 화합물 1은 유의적으로 ECM의 분해를 억제하였고, 관절연골의 분해가 저해되는 결과를 확인할 수 있었다.Experimental results, as shown in Table 4, cheonwooseol 100% ethanol extract, methylene chloride fraction, chloroform Extract and
실험예 3. 급성염증 동물모델(in vivo)에서의 항염증작용Experimental Example 3. Anti-inflammatory activity in acute inflammation animal model (in vivo)
상기 실시예에서 수득한 천우슬 추출물 및 이로부터 분리한 화합물의 항염증효과를 확인하기 위하여, 급성염증의 모델로써 carrageenan-유도 발 부종(paw edema) ICR 마우스(20-22 g, Orient-Bio 사)를 사용하여 하기와 같이 실험하였다(Winter et al., Proc. Soc. Exp. Bil. Med. 111, pp.544-547, 1962). In order to confirm the anti-inflammatory effect of the Cheonwoo seul extract obtained in the above example and the compound isolated therefrom, carrageenan-induced paw edema ICR mouse (20-22 g, Orient-Bio) as a model of acute inflammation (Winter et al., Proc. Soc. Exp. Bil. Med. 111 , pp. 544-547, 1962).
천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물을 경구투여하고, 1시간 후, 1% λ-carrageenan(CGN) 용액을 오른쪽 발바닥에 주사하였다. 5시간 후에 발 부종(paw edema)을 물-치환법(water-displacement)으로 측정하였으며, 표 5에 나타내었다. 양성대조군으로는 Prednisolone(sigma, 5 mg/kg)을 사용하였다.Cheonwooseol extract, fractions and compounds isolated therefrom were orally administered, and after 1 hour, 1% λ-carrageenan (CGN) solution was injected into the right foot. After 5 hours, paw edema was measured by water-displacement and is shown in Table 5. Prednisolone (sigma, 5 mg / kg) was used as a positive control.
실험결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 천우슬 100% 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물, 클로로포름 추출물 및 화합물 1은 급성염증 동물모델에서 유의적으로 항염증작용을 나타냄을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in Table 5, 100% ethanol extract, methylene chloride fraction, chloroform extract and
실험예Experimental Example 4. 만성염증 동물모델( 4. Animal model of chronic inflammation inin vivovivo )에서의 ) In 류마티스관절염Rheumatoid arthritis 억제작용 Inhibitory effect
상기 실시예에서 수득한 천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물의 항염증효과를 확인하기 위하여, 만성염증의 모델로써 열처리된 건조 우락균(Mycobacterium butyricum)을 오른쪽 발바닥에 주사한 웅성의 SD rat(200-220 g, Orient-Bio사)를 사용하여 하기와 같이 실험하였다(Kim et al., Planta Med. 65, pp.465-467, 1999).In order to confirm the anti-inflammatory effects of the Chunwoo seol extract, fractions and compounds isolated therefrom, the male SD rats injected with the dried Mycobacterium butyricum heat treated as a model of chronic inflammation in the right plantar (200-220 g, Orient-Bio) was used as the experiment (Kim et al., Planta Med. 65 , pp. 465-467, 1999).
천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물을 매일 경구투여하고, 2차 염증(Secondary inflammation)인 후기 단계(late phase)의 부종(16일째)과 adjuvant를 투여하지 않은 발(왼쪽 발)의 부종을 관절 염증(arthritic inflammation)으로 하여 저해능을 계산하여 하기 표 6에 나타내었다. 양성대조군으로는 Prednisolone(5 mg/kg/day)을 사용하였다.Cheonwooseol extract, fractions and compounds isolated therefrom are administered orally daily, edema of late phase, secondary inflammation (day 16), and edema of the foot (left foot) without adjuvant It was shown in Table 6 to calculate the inhibitory ability to the arthritic inflammation (arthritic inflammation). Prednisolone (5 mg / kg / day) was used as a positive control.
실험결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 천우슬 100% 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물 및 화합물 1은 만성염증 동물모델에서 류마티스성 관절염을 유의적으로 억제하는 효과를 확인할 수 있었다.As a result of the experiment, as shown in Table 6, 100% ethanol extract, methylene chloride fraction and
실험예 5.퇴행성관절염모델(in vivo)에서의 퇴행성관절염 억제작용Experimental Example 5 Inhibition of Degenerative Arthritis in a Model of Degenerative Arthritis
상기 실시예에서 수득한 천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물의 퇴행성관절염 억제활성을 확인하기 위하여, in vivo 동물모델로서 rat model을 사용하여 하기와 같이 실험하였다(Guingamp et al., Arthritis Rheum. 40, pp.1670-1679, 1997). In order to confirm the degenerative arthritis inhibitory activity of the Cheonwoo seul extract, fractions and compounds isolated therefrom, the rat model was used as an in vivo animal model (Guingamp et al., Arthritis Rheum). 40 , pp. 1670-1679, 1997).
요오드 초산(Iodoacetic acid) 30 ul을 SD rat(200-220 g, Orient-Bio사)의 오른다리 무릎에 관절강주사로 투여하였다. 천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물을 5일/week씩 매일 1회 경구 투여하였다. 요오드 초산 투여 4주 후에 rat를 희생시키고 무릎관절을 절개한 후, 조직학적(histology) 방법에 따라 조직을 고정하고, 사프라닌 O(safranin O) 염색한 다음, 현미경 관찰하여 결과를 도 2에 나타내었다.30 ul of Iodoacetic acid was administered to the knee of the right leg of SD rat (200-220 g, Orient-Bio). Cheonwoo Seol extract, fractions and compounds isolated therefrom were administered orally once daily at 5 days / week. After 4 weeks of iodine acetate administration, the rats were sacrificed and the knee joints were dissected, the tissues were fixed according to histological methods, safranin O stained, and the results were observed under a microscope. Indicated.
실험결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 천우슬 100% 에탄올 추출물(300 mg/kg/day) 및 천우슬 메틸렌클로라이드 분획물(100 mg/kg/day)은 in vivo에서 퇴행성관절염 저해작용을 보였고, 관절의 파괴를 억제하였음을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 2, 100% ethanol extract (300 mg / kg / day) and methylene chloride fraction (100 mg / kg / day) of thunderwool showed degenerative arthritis inhibitory activity in vivo, and joints It was confirmed that the destruction of.
실험예 6. 급성독성실험Experimental Example 6. Acute Toxicity Test
식약청의 규정에 따라 급성독성시험을 ICR 마우스를 대상으로 하기와 같이 실시하였다. In accordance with the provisions of the KFDA, acute toxicity test was conducted in ICR mice as follows.
상기 실시예 1 내지 실시예 3에서 수득한 천우슬 100% 에탄올 추출물(CO-EtOH, 2 g/kg까지), 천우슬 메틸렌클로라이드 분획물(CO-F-DCM, 1 g/kg까지), 천우슬 클로로포름 추출물(CO-CF, 1 g/kg까지), 화합물 1(5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one, 400 mg/kg까지)을 0.1% 카르복시 메틸 셀룰로오스(CMC)에 녹인 후, 2배씩 희석한 검체를 경구투여하고 3일 동안 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다. Cheonwooseol 100% ethanol extract obtained in Examples 1 to 3 (CO-EtOH, up to 2 g / kg), Cheonwoose methylene chloride fraction (CO-F-DCM, up to 1 g / kg), Cheonwooseol Chloroform extract (CO-CF, up to 1 g / kg), Compound 1 (5α-H-10-β-selina-4 (14), 7 (11) -dien-8-one, up to 400 mg / kg) After dissolving in 0.1% carboxy methyl cellulose (CMC), two-fold diluted samples were orally administered and observed for 3 days of mortality, clinical symptoms, and weight changes of the animals. Hematological and hematological biochemical tests were performed. By visual observation, abnormalities of organs and chest organs were observed.
실험결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특이할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 발견되지 않아, 이들은 인체에 안전하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.As a result, no clinical symptoms or dead animals were found in all animals treated with the test substance, and no toxic changes were found in weight changes, blood tests, blood biochemical tests, and autopsy findings. It is believed to be able.
하기에 본 발명의 천우슬 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.Hereinafter, the preparation examples of the composition containing the sesame terpene extract, fractions or sesquiterpene derivatives separated therefrom of the present invention will be described, but the present invention is not intended to be limited thereto, but is intended to be described in detail only.
제제예 1. 산제의 제조Formulation Example 1 Preparation of Powder
CO-EtOH 20 mgCO-EtOH 20 mg
유당 100 mgLactose 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.The above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
제제예 2. 정제의 제조Formulation Example 2 Preparation of Tablet
CO-F-DCM 10 mgCO-F-
옥수수전분 100 mgCorn starch 100 mg
유당 100 mgLactose 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg2 mg magnesium stearate
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.After mixing the above components, tablets are prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
제제예 3. 캅셀제의 제조 Formulation Example 3 Preparation of Capsule
CO-CF 10 mgCO-CF 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg3 mg of crystalline cellulose
락토오스 14.8 mgLactose 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mgMagnesium Stearate 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.According to a conventional capsule preparation method, the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare capsules.
제제예 4. 주사제의 제조Formulation Example 4 Preparation of Injection
화합물 1(5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one) 10 mg10 mg of compound 1 (5α-H-10-β-selina-4 (14), 7 (11) -dien-8-one)
만니톨 180 mgMannitol 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mgSterile distilled water for injection 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mgNa2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.According to the conventional method for preparing an injection, the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).
제제예 5. 액제의 제조Formulation Example 5 Preparation of Liquid
화합물 2(atratylenolide I) 20 mg20 mg of compound 2 (atratylenolide I)
이성화당 10 g10 g of isomerized sugar
만니톨 5 g5 g of mannitol
정제수 적량Purified water
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.After dissolving each component in purified water according to the usual method of preparing a liquid solution, adding lemon flavor appropriately, mixing the above components, adding purified water, adjusting the whole to 100 ml by adding purified water, and then filling into a brown bottle. The solution is prepared by sterilization.
제제예 6. 건강 식품의 제조Formulation Example 6 Preparation of Healthy Food
CO-EtOH 1000 ㎎CO-EtOH 1000 mg
비타민 혼합물 적량Vitamin mixture quantity
비타민 A 아세테이트 70 ㎍70 [mu] g of vitamin A acetate
비타민 E 1.0 ㎎Vitamin E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 ㎎0.13 mg vitamin B1
비타민 B2 0.15 ㎎0.15 mg of vitamin B2
비타민 B6 0.5 ㎎0.5 mg vitamin B6
비타민 B12 0.2 ㎍0.2 [mu] g vitamin B12
비타민 C 10 ㎎10 mg vitamin C
비오틴 10 ㎍Biotin 10 μg
니코틴산아미드 1.7 ㎎Nicotinic acid amide 1.7 mg
엽산 50 ㎍50 ㎍ of folic acid
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎Calcium pantothenate 0.5 mg
무기질 혼합물 적량Mineral mixture quantity
황산제1철 1.75 ㎎1.75 mg of ferrous sulfate
산화아연 0.82 ㎎0.82 mg of zinc oxide
탄산마그네슘 25.3 ㎎Magnesium carbonate 25.3 mg
제1인산칼륨 15 ㎎15 mg of potassium phosphate monobasic
제2인산칼슘 55 ㎎Secondary calcium phosphate 55 mg
구연산칼륨 90 ㎎Potassium citrate 90 mg
탄산칼슘 100 ㎎100 mg of calcium carbonate
염화마그네슘 24.8 ㎎Magnesium chloride 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.Although the composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixture is comparatively mixed with a composition suitable for health food as a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional method for producing healthy foods , Granules can be prepared and used in the manufacture of health food compositions according to conventional methods.
제제예Formulation example 7. 건강 음료의 제조 7. Manufacture of health drinks
CO-F-DCM 1000 ㎎CO-F-DCM 1000 mg
구연산 1000 ㎎Citric acid 1000 mg
올리고당 100 g100 g of oligosaccharide
매실농축액 2 gPlum concentrate 2 g
타우린 1 gTaurine 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖Purified water was added to a total of 900 ml
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. The above components were mixed according to a conventional health drink manufacturing method, and the mixture was heated at 85 DEG C for about 1 hour with stirring, and the solution thus prepared was filtered to obtain a sterilized 2-liter container, which was sealed and sterilized, ≪ / RTI >
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the composition ratio is a mixture of the components suitable for the preferred beverage as a preferred embodiment, the blending ratio may be arbitrarily varied according to the regional and national preferences such as the demand level, the demanding country, and the intended use.
도 1은 MMP-13의 발현 저해능(E: CO-EtOH(200 ug/ml), 1: CO-F-BuOH(50 ug/ml), 2: CO-F-hexane(50 ug/ml), 3: CO-F-DCM(50 ug/ml), 4: 물 분획물(50 ug/ml), Co-1: 5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one, Co-2: atractylenolide I)을 나타낸 도이고, 1 shows the inhibition of expression of MMP-13 (E: CO-EtOH (200 ug / ml), 1: CO-F-BuOH (50 ug / ml), 2: CO-F-hexane (50 ug / ml), 3: CO-F-DCM (50 ug / ml), 4: water fraction (50 ug / ml), Co-1: 5α-H-10-β-selina-4 (14), 7 (11) -dien -8-one, Co-2: is a diagram showing atractylenolide I),
도 2는 조직 검사 결과(a: Control, b: Iodoacetate-treated, c: CO-EtOH(300 mg/kg/day), d: CO-F-DCM(100 mg/kg/day))를 나타낸 도이다.Figure 2 is a diagram showing the results of the biopsy (a: Control, b: Iodoacetate-treated, c: CO-EtOH (300 mg / kg / day), d: CO-F-DCM (100 mg / kg / day)) to be.
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