KR101080594B1 - 암의 치료를 위한 이미다졸리디노닐 아미노피리미딘 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Plk1의 억제를 통해 암의 치료를 위한 임상적 용도를 갖는 것으로 여겨지는 신규한 이미다졸리디노닐 아미노피리미딘 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

<화학식 I>

식 중,

R¹은 아미노메틸, (C₁-C₃ 알킬)아미노메틸, 디(C₁-C₂ 알킬)아미노메틸, N-에틸-N-메틸-아미노메틸, 1-아미노에틸, 1-((C₁-C₂ 알킬)아미노)-에틸, 3,3,3-트리플루오로프로필아미노메틸, 에티닐, 2-히드록시-에톡시, 2-히드록시에틸아미노메틸, 2-시아노에틸아미노메틸, 모르폴린-4-일메틸, 메톡시메톡시메틸, 시클로프로필, 1-아제티디닐메틸, 1-피롤리디닐메틸 또는 1,3-디옥솔란-2-일이고;

R²는 수소 또는 할로이고;

R³은 수소 또는 할로이며;

단, R²와 R³ 중 적어도 하나는 수소이고;

R⁴는 수소, 메틸 또는 할로이고;

----는 존재하거나 또는 존재하지 않는 단일 결합이다.

Plk1, 이미다졸리디노닐 아미노피리미딘 화합물, 암

Description

암의 치료를 위한 이미다졸리디노닐 아미노피리미딘 화합물 {IMIDAZOLIDINONYL AMINOPYRIMIDINE COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF CANCER}

Plk1은 폴로 박스(polo box) 도메인으로 공지된 포스포세린/트레오닌 결합 도메인을 특징으로 하는 단백질 키나제의 소규모 패밀리에 속한다. Plk1은 세포 주기의 조절에 있어서 중심 역할을 수행한다. 여타 기능들 중에서 특히, Plk1은 암 세포가 분열되는 단계인 유사분열의 개시, 진행 및 종결을 조절하는 것으로 생각된다. 따라서, 암 세포에서 Plk1을 차단하는 것은 그의 분열 또는 유사분열을 방지한다.

빈카 알칼로이드 (나벨빈(NAVELBINE®)), 탁소이드 (탁소테르(TAXOTERE®)) 및 토포이소머라제 II 억제제 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN®))와 같은 유사분열을 저해하는 강력한 항암제들이 확인되었다. 벨케이드(VELCADE®)는 26S 프로테오좀을 억제하는 항신생물제이다. 그러나, 이들 약물은 정상적인 비-분열 세포에 대해 상당한 부작용을 초래한다. Plk 억제제는 특히 분열 세포를 표적으로 하고, 바람직하지 못한 독성을 회피할 수 있을 것이다.

Plk1의 억제제는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, WO 06/066172를 참조한다. 추가적으로, WO 06/021548에는 특정 디히드로프테리디논 유사체 (예를 들어, BI-2536)가 Plk1의 억제제로 개시되어 있다. 현재, BI-2536은 II기 임상 시험 중이나, 높은 클리어런스(clearance) (CL > 1000 mL/분)를 가지며, 인간의 골수억제에 의해 투여가 제한된다. 개선된 효능 또는 약동학 특성을 갖는 Plk1을 억제하는 추가적인 화합물에 대한 요구가 여전히 존재한다. 경구로 투여될 수 있는 Plk1 억제제를 가지는 것 또한 유리할 것이다.

본 발명은 Plk1의 억제를 통해 암의 치료를 위한 임상적 용도를 갖는 것으로 여겨지는 신규한 이미다졸리디노닐 아미노피리미딘 화합물을 제공한다. 이들 특정 화합물은 WO 06/066172에 개시된 화합물에 비해 개선된 효능을 갖는 것으로 여겨진다. 추가적으로, 이들 특정 화합물은 BI-2536에 비해 개선된 약동학 특성을 갖는 것으로 여겨진다. 추가로, 시험한 본 발명의 화합물의 경구 생체이용률에 기인하여, 이들 특정 화합물이 경구로 투여될 수 있을 것으로 여겨진다.

<발명의 개요>

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

식 중,

R¹은 아미노메틸, (C₁-C₃ 알킬)아미노메틸, 디(C₁-C₂ 알킬)아미노메틸, N-에틸-N-메틸-아미노메틸, 1-아미노에틸, 1-((C₁-C₂ 알킬)아미노)-에틸, 3,3,3-트리플루오로프로필아미노메틸, 에티닐, 2-히드록시-에톡시, 2-히드록시에틸아미노메틸, 2-시아노에틸아미노메틸, 모르폴린-4-일메틸, 메톡시메톡시메틸, 시클로프로필, 1-아제티디닐메틸, 1-피롤리디닐메틸 또는 1,3-디옥솔란-2-일이고;

R²는 수소 또는 할로이고;

R³은 수소 또는 할로이며;

단, R²와 R³ 중 적어도 하나는 수소이고;

R⁴는 수소, 메틸 또는 할로이고;

----는 존재하거나 또는 존재하지 않는 단일 결합이다.

본 발명은 비-소세포 폐암, 구인두암, 식도암, 위암, 흑색종, 피부의 표피양 암종, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 직장결장암, 신경아교종, 아교모세포종, 갑상선 암종, 자궁경부암, 췌장암, 전립선암, 간모세포종 및 비-호지킨 림프종 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료가 필요한 포유동물에 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 상기 암의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 의약의 제조에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 비-소세포 폐암, 구인두암, 식도암, 위암, 흑색종, 피부의 표피양 암종, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 직장결장암, 신경아교종, 아교모세포종, 갑상선 암종, 자궁경부암, 췌장암, 전립선암, 간모세포종 및 비-호지킨 림프종 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물에서의 암의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제와 함께 포함하는, 비-소세포 폐암, 구인두암, 식도암, 위암, 흑색종, 피부의 표피양 암종, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 직장결장암, 신경아교종, 아교모세포종, 갑상선 암종, 자궁경부암, 췌장암, 전립선암, 간모세포종 및 비-호지킨 림프종 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료에 적합한 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

식 중,

R¹은 디메틸아미노메틸, 모르폴리닐메틸, 메톡시메톡시메틸, 시클로프로필 또는 1,3-디옥솔란-2일이고;

R²는 수소 또는 할로이고;

R³은 수소 또는 할로이며;

단, R²와 R³ 중 적어도 하나는 수소이고;

R⁴는 수소 또는 할로이다.

상기 화학식에 사용된 일반적인 화학 용어들은 그들의 통상의 의미를 갖는다. 예를 들면, 용어 "C₁-C₃ 알킬"은 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 및 이소프로필을 의미한다. "C₁-C₂ 알킬"은 "C₁-C₃ 알킬"의 의미에 포함되며 메틸 및 에틸을 의미한다. 용어 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 의미한다.

본 발명의 대부분의 또는 모든 화합물이 염을 형성할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 본 발명의 화합물은 아민이고, 따라서 수많은 임의의 무기산 및 유기산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가염을 형성한다. 그러한 제약상 허용되는 산 부가염 및 그들의 통상적인 제조 방법론은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)]; 문헌 [S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, "Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977]을 참조한다.

a) R¹이 디메틸아미노메틸인 화학식 I의 화합물;

b) R¹이 메틸아미노메틸인 화학식 I의 화합물;

c) R¹이 아미노메틸인 화학식 I의 화합물;

d) R²가 수소인 화학식 I의 화합물;

e) R³이 할로인 화학식 I의 화합물;

f) R³이 플루오로인 화학식 I의 화합물;

g) R⁴가 할로인 화학식 I의 화합물;

h) R⁴가 플루오로인 화학식 I의 화합물;

i) R¹이 디메틸아미노메틸이고, R²가 수소이고, R³이 플루오로이고, R⁴가 플루오로인 화학식 I의 화합물;

j) R¹이 메틸아미노메틸이고, R²가 수소이고, R³이 플루오로이고, R⁴가 플루오로인 화학식 I의 화합물; 및

k) R¹이 아미노메틸이고, R²가 수소이고, R³이 플루오로이고, R⁴가 플루오로인 화학식 I의 화합물이 바람직하다.

<반응식>

당업자는 본 발명의 화합물의 모든 치환체가 화합물을 합성하기 위해 이용되는 특정 반응 조건들을 허용하는 것은 아님을 알 것이다. 이들 잔기는 합성에서 편리한 시점에 도입될 수 있거나, 또는 보호된 후에 필요하거나 원하는 경우 탈보호될 수 있다. 당업자는 보호기가 본 발명의 화합물의 합성에서 임의의 편리한 시점에서 제거될 수 있음을 알 것이다. 질소 및 산소 보호기를 도입하고 제거하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다; 예를 들어, 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed., John Wiley and Sons, New York, Chapter 7 (1999)]을 참조한다. 또한, 당업자는 수많은 상황에서, 잔기들이 도입되는 순서는 중요한 것이 아님을 것을 알 것이다. 본 발명의 화합물을 제조하기 위해 요구되는 단계들의 특정 순서는 합성되는 특정 화합물, 출발 화합물, 및 치환된 잔기의 상대적 가변성에 따라 달라질 수 있다.

하기 반응식에서 모든 치환체는, 달리 언급하지 않는 한, 상기 정의한 바와 같고 반응물은 당업계에 잘 공지되고 알려져 있는 것이거나 제법 및 실시예에서 예시된 것이다.

2-할로피리미딘 화합물 (1)을 1-(2-아미노에틸)-2-이미다졸리디논 (2) 또는 1-(2-아미노에틸)-1,3-디히드로-2H-이미다졸-2-온 (3)과 반응시켜 친핵성 치환 반응을 통해 화합물 (4)를 제공한다. 이러한 반응은 n-부탄올, 디옥산 등과 같은 적합한 용매 중에서 수행된다. 일반적으로, 반응은 오일조 또는 마이크로파 반응기를 사용하여 약 120℃ 내지 150℃의 온도에서 수행된다. 이러한 반응을 위한 전형적인 화학량론은 과량의 산 스캐빈저, 예컨대 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸 아민의 존재하에 아민 (2) 또는 (3) 약 1 당량 또는 (2) 또는 (3) 2 당량이다.

임의적인 단계에서, 화합물 (4)의 제약상 허용되는 염을 형성한다. 이러한 염의 형성은 당업계에 잘 공지되고 알려져 있는 것이다.

쉽게 이해되는 바와 같이, 화합물 (1)은 당업계에 잘 공지되어 있고 잘 확립된 절차로 본원에 기재된 것과 유사한 방법으로 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들면, 스즈끼(Suzuki) 커플링 방법으로 임의로 치환된 피리디닐 화합물을 임의로 치환된 벤조티오페닐 화합물과 커플링시킴으로써 화합물 (1)을 제조한다. 생성된 스즈끼 부가물을 당업계에 잘 공지된 방법으로 보로닐화시키고 추가로 스즈끼 커플링 방법을 통해 임의로 치환된 피리미딘 할라이드에 커플링시킨다. 또한, 화합물 (1)을 제조하는데 요구되는 단계를, 이후의 탄소-탄소 결합 형성, 커플링 반응 등이 화합물 (4)를 제공하도록 화합물 (1)에 대한 중간체와 화합물 (2) 또는 (3)의 반응을 포함하는 임의의 순서로 수행할 수 있음이 이해된다.

본 발명은 하기 실시예 및 제법에 의해 추가로 설명된다. 이들 실시예 및 제법은 단지 예시적인 의미이고, 어떤 식으로든 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 실시예 및 제법에서 사용된 용어들은 달리 나타내지 않는 한 그들의 통상의 의미를 갖는다. 하기 실시예 화합물들은 켐드로우(ChemDraw®) 버전 10을 사용하여 명명하였다.

제법

제법 1

2-벤조[b]티오펜-7-일-4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란

플라스크 내의 디메틸 술폭시드 (DMSO) (10 mL) 중에 7-브로모-벤조[b]티오펜 (426 mg, 2 mmol), 비스(피나콜라토)디보론 (756 mg, 3 mmol), [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐 (II) (디클로로메탄과의 착물 (1:1)) (81 mg, 0.1 mmol), 칼륨 아세테이트 (294 mg, 3 mmol)를 합하였다. 5분 동안 혼합물을 통해 질소를 버블링시켰다. 플라스크를 밀봉하여 오일조에 넣고 100℃에서 4시간 동안 가열하였다. 혼합물을 클로로포름/이소프로판올 (3/1)로 희석시켰다. 용액을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기 용액을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 암색 잔류물로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 → 헥산 중 20％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 표제 화합물 (342 mg, 66％)을 무색 고체로서 수득하였다. MS (ES) m/z 261 [M+1]⁺.

제법 2

벤조[b]티오펜-7-보론산

기계적 교반기가 장치된 12 L 용량의 모르톤(Morton) 플라스크 내의 무수 테트라히드로푸란 (THF) (4000 mL) 중에 7-브로모벤조[b]티오펜 (300 g, 1.41 mmol) 및 트리이소프로필보레이트 (403.6 g, 2.15 mmol)를 합하고 질소하에 드라이-아이스/아세톤 조에서 -70℃로 냉각시켰다. n-부틸 리튬 (헥산 중 1.6 M, 714 g, 1.68 mmol)을 -67.5℃ 미만의 내부 온도를 유지하도록 하는 속도로 적가하였다. 첨가를 완료한 후에, 반응 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 냉각조를 제거하고 물 4 L를 서서히 첨가하였다. 그 후에, 진한 HCl (75 mL)을 용액의 pH가 약 pH = 2일 때까지 첨가하였다. 슬러리를 1시간 동안 교반하였다. 충분한 5 N 수성 NaOH를 첨가하여 혼합물의 pH를 약 pH = 12로 조정하였다. 층을 분리하고 수성층을 보관하였다. 유기층을 메틸-tert-부틸 에테르 4 L로 희석시키고 5 N 수성 NaOH 1 L로 추출하였다. 층을 분리하였다. 수성층을 이전의 수성 추출물과 합하였다. 수성층을 추가의 메틸-tert-부틸 에테르 (4 L)로 세척하였다. 층을 분리하고 수성층을 기계적 교반기가 장치된 12 L 용량의 3-목 둥근 바닥 플라스크로 옮겼다. 용액을 빙수조에서 +5℃로 냉각시켰다. 진한 HCl을 용액의 pH가 약 pH = 2일 때까지 서서히 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고 생성 고체를 여과하였다. 고체를 깔때기 상에서 물 2 L로 2회 세정하고 30분 동안 공기-건조시켰다. 고체를 50℃ 진공 오븐에 두고 진공하에 밤새 건조시켰다. 건조된 고체를 n-헵탄 2 L로 30분 동안 슬러리화함으로써 황색 고체를 제거하였다. 다시 고체를 여과하고, 30분 동안 공기-건조시킨 다음 40℃에서 밤새 진공 건조시켜 표제 화합물 (188.8 g, 75％)을 백색 고체로서 수득하였다.

제법 3

5-브로모메틸-2-플루오로-4-요오도-피리딘

플라스크에서, 2-플루오로-4-요오도-피콜린 (10.0 g, 42.19 mmol), N-브로모숙신이미드 (9.76 g, 54.85 mmol), 2,2'-아조비스이소부티로니트릴 (3.46 g, 21.10 mmol) 및 무수 CCl₄ (100 mL)를 합하였다. 70℃에서 질소하에 16시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시켰다. 디클로로메탄으로 희석시키고 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 층을 분리하고 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 진공하에 농축시켜 조 생성물을 제공하였다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 1％ → 15％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 표제 화합물 (8.27 g, 62％)을 수득하였다. MS (EI) m/z 315 M⁺.

제법 4

4-(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일메틸)-모르폴린

플라스크에서, 5-브로모메틸-2-플루오로-4-요오도-피리딘 (6.13 g, 19.40 mmol), 모르폴린 (3.38 g, 38.80 mmol) 및 무수 CH₃CN (100 mL)을 질소하에 합하였다. N,N-디이소프로필에틸아민 (6.76 mL, 38.80 mmol, 2 M THF 용액)을 첨가하였다. 81℃에서 2시간 동안 가열한 후에 실온으로 냉각시켰다. 디클로로메탄으로 희석시키고 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기층을 수성층으로부터 분리하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 진공하에 농축시켜 조 표제 화합물 6.23 g (99.7％)을 제공하였다. MS (ES) m/z 323 [M+1]⁺.

하기 화합물은 적절한 아민과 함께 4-(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일메틸)-모르폴린에 대한 것과 유사한 절차를 이용하여 합성하였다.

제법 14

(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일메틸)-(3,3,3-트리플루오로-프로필)-카르밤산 tert-부틸 에스테르

아세토니트릴 (2 mL) 중 5-브로모메틸-2-플루오로-4-요오도-피리딘 (0.315 g, 997 μmol)의 용액을 실온에서 아세토니트릴 (2 mL) 중 3,3,3-트리플루오로프로필아민 히드로클로라이드 (298 mg, 1.99 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (521 ㎕, 2.99 mmol)의 용액에 적가하였다. 혼합물을 밤새 교반하였다. 디이소프로필에틸아민 (522 ㎕, 2.99 mmol) 및 디-tert-부틸디카르보네이트 (1.088 g, 4.99 mmol)를 혼합물에 첨가하고 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 농축시키고 생성물을 80 g 실리카 겔 상에서 1:1 헥산/디클로로메탄 → 50％ 에틸 아세테이트/1:1 헥산 디클로로메탄의 구배로 용리시킴으로써 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (813 mg)을 (3,3,3-트리플루오로-프로필)-카르밤산 tert-부틸 에스테르와의 1:1 혼합물로서 제공하였다. MS (ES) m/z 449 [M+1]⁺.

하기 화합물은 (6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일메틸)-(3,3,3-트리플루오로-프로필)-카르밤산 tert-부틸 에스테르에서와 유사한 절차를 이용하여 합성하였다.

제법 16

[6-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-피리딘-3-일메틸]-(3,3,3-트리플루오로-프로필)-카르밤산 tert-부틸 에스테르

DMSO (5 mL) 중 (6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일메틸)-(3,3,3-트리플루오로-프로필)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (600 mg, 1.3 mmol), 칼륨 아세테이트 (262.8 mg, 2.7 mmol), 비스(피나콜라토)디보론 (407.9 mg, 1.6 mmol), 및 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II) CH₂Cl₂ (109.2 mg, 133.9 μmol)의 현탁액을 탈기시켰다. 밀봉된 용기에서 혼합물을 80℃에서 4시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 에틸 아세테이트로 희석시켰다. 유기 용액을 3회 분량의 물 및 1회 분량의 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과한 다음 증발시켰다. 조 생성물을 디클로로메탄과 함께 25 g 실리카 겔 로딩 컬럼 상으로 로딩하고 헥산 → 디클로로메탄, 이어서 디클로로메탄 → 에틸 아세테이트의 구배로 40 g 실리카 겔 컬럼으로 용리시켜 표제 화합물 (600 mg)을 암색 오일로서 제공하였다. 생성물은 여전히 이전 단계로부터의 (3,3,3-트리플루오로-프로필)-카르밤산 tert-부틸 에스테르를 함유하였다. 추가 정제 없이 진행하였다. GC (EI) m/z 448 M⁺.

제법 17

2-플루오로-5-메톡시메톡시-피리딘

6-플루오로-피리딘-3-올 (3.5 g, 30.95 mmol)을 디메틸포름아미드 (20 mL) 중 수소화나트륨 (1.49 g, 37.14 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 클로로메틸 메틸 에테르 (2 g, 25.0 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물로 희석시켰다. 유기층을 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 혼합물을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 갈색 오일로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 10％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 표제 화합물 (4.30 g, 88.4％)을 황색 오일로서 수득하였다.

제법 18

2-플루오로-4-요오도-5-메톡시메톡시-피리딘

THF (60 mL) 중 2-플루오로-5-메톡시메톡시-피리딘 (4.1 g, 26.1 mmol)의 용액을 -75℃로 냉각시켰다. tert-부틸리튬 (펜탄 중 1.7 M, 30.4 mL, 51.66 mmol)을 30분에 걸쳐서 첨가하였다. 혼합물을 추가로 30분 동안 교반하였다. 요오드 (9.8 g, 38.61 mmol, 테트라히드로푸란 60 mL에 용해되었음)를 첨가하였다. 첨가를 완료한 후에 1시간 동안 교반하였다. 교반하면서 1시간에 걸쳐서 온도를 실온으로 상승시켰다. 혼합물을 물로 처리하였다. 용액을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기층을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 혼합물을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 갈색 고체로 농축시켰다. 갈색 고체를 헥산으로 분쇄하였다. 여과하여 표제 화합물 (3.9 g, 52.8％)을 갈색 고체로서 수득하였다.

제법 19

6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-올

HCl (물 중 3 M, 31 mL, 93.01 mmol)을 THF (20 mL) 중 2-플루오로-4-요오도-5-메톡시메톡시-피리딘 (3.9 g, 13.78 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 냉각시켰다. 포화 중탄산나트륨 수용액을 서서히 첨가하면서 pH를 7로 조정하였다. 용액을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기층을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 혼합물을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 농축시켜 표제 화합물 (3.2 g, 97.18％)을 황색 고체로서 수득하였다. MS (EI) m/z 240 [M+1]⁺.

제법 20

2-플루오로-4-요오도-5-[2-(테트라히드로-피란-2-일옥시)-에톡시]-피리딘

6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-올 (0.5 g, 2.09 mmol)을 디메틸포름아미드 (6 mL) 중 수소화나트륨 (광유 중 60％ 분산액, 0.1 g, 2.51 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 2-(2-브로모-에톡시)-테트라히드로-피란 (0.51 g, 2.34 mmol)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물로 희석시켰다. 유기층을 포화 수성 염화나트륨 및 물로 세척하였다. 혼합물을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 농축시켜 황색 오일을 제공하였다. 오일을 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 10％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 표제 화합물 (0.58 g, 75.5％)을 밝은 황색 오일로서 수득하였다. MS (EI) m/z 368 [M+1]⁺.

제법 21

4-클로로-3-트리메틸실릴에티닐-피리딘

톨루엔 (20 mL) 중 4-클로로-3-요오도 피리딘 (2.0 g, 8.3 mmol)의 용액에 트리페닐 포스핀 (0.219 g, 0.83 mmol), 구리 요오다이드 (0.079 g, 0.41 mmol) 및 팔라듐 (II) 아세테이트 (0.093 g, 0.41 mmol)를 첨가하고, 트리에틸아민 (3.49 mL, 25 mmol)을 실온에서 적가한 후에 트리메틸실릴아세틸렌 (1.65 mL, 11.69 mmol)을 실온에서 계속해서 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 진공하에 톨루엔을 증발시킴으로써 반응 혼합물을 농축시켰다. 헥산으로 분쇄하고 이어서 헥산층을 4 내지 5회 따라냄으로써 화합물 (거의 순수함)을 추출하였다. 진공하에 헥산을 증발시키고 건조시켜 순수 화합물 (1.68 g, 96％)을 수득하였다.

제법 22

(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일메틸)-메틸-카르밤산 tert-부틸 에스테르

질소하에 (6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일메틸)-메틸-아민 (8 g, 30.07 mmol)의 조 혼합물을 무수 아세토니트릴 (50 mL) 중 디이소프로필에틸아민 (10.49 mL, 60.14 mmol)과 합하였다. 디-tert-부틸디카르보네이트 (13.13 g, 60.14 mmol)를 첨가하고 밤새 교반하였다. 혼합물을 포화 중탄산염, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기층을 수성층으로부터 분리하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 유기 용매를 건고 상태가 될 때까지 제거하여 조 생성물을 제공하였다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 5％ → 25％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 표제 화합물 (8.24 g, 75％)을 제공하였다. MS (ES) m/z 367 [M+1]⁺.

제법 23

1-(6-플루오로-피리딘-3-일)-에탄올

메틸 마그네슘 브로마이드 (에테르 중 3 M, 12 mL, 36 mmol)를 0℃에서 질소하에 THF (20 mL) 중 6-플루오로-피리딘-3-카르브알데히드 (3 g, 24 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 계속해서 밤새 실온에서 교반하였다. 혼합물을 1 N HCl로 가수분해시키고 묽은 수산화암모늄으로 약 pH 9로 염기성화하였다. 생성물을 클로로포름/이소프로필 알콜 (3/1)로 추출하였다. 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 황색 오일로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 10％ 메탄올)에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일 (2.3 g, 68％)로서 제공하였다. MS (ES) m/z 142 [M+1]⁺.

제법 24

2-플루오로-5-(1-메톡시메톡시-에틸)-피리딘

N,N'-디이소프로필에틸아민 및 클로로메톡시메탄을 디클로로메탄 중 1-(6-플루오로-피리딘-3-일)-에탄올 (3.0 g, 21.3 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 계속해서 30분 동안 0℃에서 교반한 후에, 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 클로로포름/이소프로필 알콜 (3/1)로 희석시켰다. 용액을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 암색 잔류물로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 → 헥산 중 20％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 생성물을 무색 고체 (3 g, 66％)로서 수득하였다. MS (ES) m/z 186 [M+1]⁺.

제법 25

5-아지도메틸-2-플루오로-4-요오도-피리딘

둥근 바닥 플라스크 내의 디메틸포름아미드 (10 mL) 중에 5-브로모메틸-2-플루오로-4-요오도-피리딘 (0.45 g, 1.4 mmol), 나트륨 아지드 (370 mg, 5.7 mmol), 및 18-크라운 에테르 (45 mg, 0.17 mml)를 합하였다. 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 클로로포름으로 희석시키고, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기층을 수성층으로부터 분리하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 유기 용매를 진공하에 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조 물질을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 20％ 메틸 아세테이트로 용리함)에 의해 정제하여 표제 화합물 (무색 오일, 0.0.32 g, 82％)을 제공하였다. MS (ES) m/z 279 [M+1]⁺.

제법 26

(4-클로로-피리딘-3-일)-모르폴린-4-일-메타논

무수 THF (15 mL) 중에 4-클로로니코틴산 (0.10 g, 6.0 mmol) 및 1,1'-카르보닐디이미다졸 (0.97 g, 6.0 mmol)을 합하였다. 실온에서 질소하에 90분 동안 교반하였다. 모르폴린 (1.58 mL, 18.0 mmol)을 첨가하고 실온에서 질소하에 15시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄으로 희석시키고, 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 층을 분리하고 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 진공하에 농축시켰다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 [5％ → 25％ (디클로로메탄 중 10％ 2 M 암모니아/메탄올 용액)/디클로로메탄]에 의해 정제하여 표제 화합물 (1.17 g, 86％)을 제공하였다. MS (ES) m/z 227 [M+1]⁺.

제법 27

4-(4-클로로-피리딘-3-일메틸)-모르폴린

(4-클로로-피리딘-3-일)-모르폴린-4-일-메타논 (1.17 g, 5.17 mmol)을 무수 THF (10 mL)에 용해시켰다. 2 M BH₃-Me₂S/THF (15 mL, 31.0 mmol)의 용액을 실온에서 질소하에 적가하였다. 실온에서 15시간 동안 질소하에 교반하였다. 메탄올 (11.0 mL)을 매우 서서히 적가하였다. 60℃에서 3시간 동안 가열하고, 실온으로 진공하에 냉각시켜 표제 화합물 (1.1 g, 100％)을 수득하였다. MS (ES) m/z 213 [M+1]⁺.

제법 28

5-[1,3]디옥솔란-2-일-2-플루오로-피리딘

압력 용기에서, 6-플루오로-피리딘-3-카르브알데히드 (4 g, 32 mmol), 에틸렌 글리콜 (3 g, 48 mmol), 염화구리 (II) 이수화물 (0.56 g, 3.2 mmol) 및 THF (10 mL)를 합하였다. 혼합물을 100℃에서 1시간 동안 가열하였다. 혼합물을 클로로포름-이소프로판올 (3:1, 100 mL)로 희석시켰다. 유기상을 포화 수성 염화나트륨 및 물로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 갈색 오일로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 20％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 표제 화합물 (2.1 g, 39％)을 담황색 오일로서 수득하였다. MS (ES) m/z 170 [M+1]⁺.

제법 29

5-[1,3]디옥솔란-2-일-2-플루오로-3-요오도-피리딘

THF (20 mL) 중 5-[1,3]디옥솔란-2-일-2-플루오로-피리딘 (2.0 g, 11.8 mmol)의 용액을 -75℃로 냉각시켰다. 리튬 디이소프로필아미드 (THF 중 2 M, 6 mL, 12 mmol)을 30분에 걸쳐서 첨가하였다. 혼합물을 추가로 3시간 동안 교반하였다. 요오드 (3.0 g, 11.8 mmol, THF 100 mL에 용해되었음)를 첨가하였다. 첨가를 완료한 후에 2시간 동안 교반하였다. 물 (100 mL)을 혼합물에 첨가하고 교반하면서 온도를 1시간에 걸쳐서 실온으로 상승시켰다. 혼합물을 포화 나트륨 티오술페이트 수용액 (50 mL)으로 처리하였다. 용액을 에테르로 추출하였다. 용액을 진공하에 갈색 오일로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 → 헥산 중 20％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 표제 화합물 (2.1 g, 60％)을 황색 오일로서 수득하였다. MS (ES) m/z 296 [M+1]⁺.

하기 화합물은 5-[1,3]디옥솔란-2-일-2-플루오로-3-요오도-피리딘에 대한 것과 유사한 절차를 이용하여 제조하였다.

제법 31

5-[1,3]디옥솔란-2-일-2-플루오로-4-요오도-피리딘

THF (20 mL) 중 5-[1,3]디옥솔란-2-일-2-플루오로-3-요오도-피리딘 (2.0 g, 6.8 mmol)의 용액을 -75℃로 냉각시켰다. 리튬 디이소프로필아미드 (THF 중 2 M, 3.4 mL, 6.8 mmol)을 30분에 걸쳐서 첨가하였다. 혼합물을 추가로 3시간 동안 교반하였다. 물 (100 mL)을 첨가하고 교반하면서 온도를 1시간에 걸쳐서 실온으로 상승시켰다. 용액을 에테르로 추출하였다. 용액을 진공하에 갈색 오일로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 → 헥산 중 15％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 표제 화합물 (1.03 g, 51％)을 황색 오일로서 수득하였다. MS (ES) m/z 296 [M+1]⁺.

하기 화합물은 5-[1,3]디옥솔란-2-일-2-플루오로-4-요오도-피리딘에 대한 것과 유사한 절차를 이용하여 합성하였다.

제법 33

1-(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일)-에탄올

메탄올 (10 mL) 중 2-플루오로-4-요오도-5-(1-메톡시메톡시-에틸)-피리딘 (1 g, 3.2 mmol)의 용액에 1 N HCl (5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 2 N 탄산나트륨으로 희석시켰다. 생성물을 클로로포름으로 추출하였다. 유기상을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 농축시켜 조 물질을 제공하였다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 10％ 메탄올)에 의해 정제하여 생성물을 백색 고체 (0.75 g, 87％)로서 수득하였다. MS (ES) m/z 268 [M+1]⁺.　　

제법 34

5-(1-아지도-에틸)-2-플루오로-4-요오도-피리딘

테트라-N-부틸암모늄 아지드를 디클로로메탄 (150 mL) 중 트리페닐핀 (11 g, 42 mmol) 및 1,4-시클로헥사디엔-2,2-디카르보니트릴, 4,5-디클로로-3,6-디옥소- (9 g, 40 mmol)의 용액에 빙조 냉각하에 첨가하였다. 이어서 1-(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일)-에탄올 (6.7 g, 25.1 mmol)을 상기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공하에 약 50 mL로 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (헥산 → 헥산 중 20％ 에틸 아세테이트 구배)에 의해 정제하여 표적 생성물을 무색 오일 (5.7 g, 78％)로서 제공하였다. MS (ES) m/z 293 [M+1]⁺.

제법 35

R-5-(1-아지도-에틸)-2-플루오로-4-요오도-피리딘

키랄 크로마토그래피 (키랄팩(Chiralpak®) AS-H 컬럼, 15:85:이소프로필 알콜/C7, 270 nm)에 의해 5-(1-아지도-에틸)-2-플루오로-4-요오도-피리딘 (11.7 g)을 분리하여 R-1-(1-아지도-에틸)-4-플루오로-2-요오도-벤젠 (3.82 g, 33％)을 제공하였다.

제법 36

1-(6-클로로-피리딘-3-일)-에틸아민

티탄 테트라(이소프로폭시드) (18.27 g, 64.27 mmol) 및 암모니아 (160.7 mmol, MeOH 중 2 M) 중 1-(6-클로로-피리딘-3-일)-에타논 (5 g, 32.14 mmol)의 혼합물을 N₂하에 6시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 혼합물에 나트륨 테트라히드로보레이트 (1.82 g, 48.21 mmol)를 첨가하고 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 수산화암모늄으로 켄칭시키고 혼합물을 여과하였다. 여과물로부터 용매를 제거하고 잔류물을 디클로로메탄으로 추출하고, 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과한 다음 용매를 제거하여 암황색 오일 (4.2 g)을 수득하였다. MS (ES) m/z 157 [M+1]⁺.

제법 37

[1-(6-클로로-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르

아세토니트릴 (50 mL) 중 1-(6-클로로-피리딘-3-일)-에틸아민 (4.2 g, 26.82 mmol)의 용액에 디이소프로필에틸아민 (5.2 g, 40.23 mmol) 및 디-tert-부틸디카르보네이트 (7.02 g, 32.18 mmol)를 첨가하고 혼합물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 포화 NaHCO₃ (200 mL)로 세척하고 디클로로메탄으로 추출하고, 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 5％ → 20％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 백색 고체 (5.1 g)를 수득하였다. MS (ES) m/z 257 [M+1]⁺.

제법 38

[1-(6-클로로-4-요오도-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르

tert-부틸리튬 (35 mL, 59.6 mmol)을 N₂하에 -78℃에서 THF (60 mL) 중 [1-(6-클로로-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (5.1 g, 19.87 mmol)의 용액에 첨가하였다. 30분 후에, THF (20 mL) 중 요오드 (7.6 g, 29.8 mmol)를 30분에 걸쳐서 -78℃에서 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후에 실온으로 가온시켰다. 물로 켄칭시키고, 포화 수성 염화나트륨이 포함된 에틸 아세테이트로 추출하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 5％ → 20％ 에틸 아세테이트) 상에서 정제하여 생성물 (1 g)을 수득하였다. MS (ES) m/z 383 [M+1]⁺.

제법 39

5-(1-아지도-에틸)-2-플루오로-피리딘

빙조에서 냉각 유지된 1 L 용량의 플라스크에, 트리페닐포스핀 (27.9 g, 106.3 mmol), 1,4-시클로헥사디엔-1,2-디카르보니트릴, 4,5-디클로로-3,6-디옥소-(24.12 g, 106.3 mmol)를 첨가하였다. 디클로로메탄을 교반하면서 서서히 첨가하였다 (150 mL). 암색 용액에 테트라-N-부틸암모늄 아지드 (30.23 g, 106.3 mmol)를 서서히 첨가한 후에, 디클로로메탄 (10 mL)에 용해된 1-(6-플루오로-피리딘-3-일)-에탄올 (10 g, 70.85 mmol)을 첨가하였다. 플라스크를 빙조로부터 꺼내어 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 회전식 증발기에서 제거하고 정상 크로마토그래피 (헥산 중 5％ → 20％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일 (7.75 g)로서 수득하였다. GCMS (EI) m/z 166 M⁺.

제법 40

1-(6-플루오로-피리딘-3-일)-에틸아민

5-(1-아지도-에틸)-2-플루오로-피리딘 (4.09 g, 24.59 mmol)을 60 psi 압력하에 에탄올 (200 mL) 중에서 PtO₂ (6％ w/w)의 존재하에 수소화하였다. 혼합물을 4시간 후에 여과하고, 용매를 회전식 증발기에서 제거하고, 생성 오일을 진공하에 건조시켜 생성물 (3.149 g)을 수득하였다. GCMS (EI) m/z 140 M⁺.

제법 41

[1-(6-플루오로-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르

아세토니트릴 (100 mL) 중 1-(6-플루오로-피리딘-3-일)-에틸아민 (14.86 g, 106.01 mmol)의 용액에 디이소프로필에틸아민 (37 mL, 212 mmol) 및 디-tert-부틸디카르보네이트 (46.27 g, 212 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반하였다. 포화 NaHCO₃로 세척하고, 디클로로메탄으로 추출하고, 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 10％ → 70％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 생성물을 백색 고체 (20 g)로서 수득하였다. MS (ES) m/z 241 [M+1]⁺.

제법 42

[1-(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르

무수 THF (90 mL) 중 [1-(6-플루오로-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (9.3 g, 38.8 mmol)의 용액을 무수 THF (70 mL) 중의 tert-부틸리튬 (68.4 mL, 116.3 mmol, 펜탄 중 1.7 M 용액)에 15분에 걸쳐서 N₂하에 -78℃에서 첨가하였다. -78℃에서 1시간 동안 교반하였다. 무수 THF (90 mL) 중 요오드 (14.8 g, 58.2 mmol)의 용액을 15분에 걸쳐서 첨가하였다. -78℃에서 2시간 동안 교반하였다. 0℃로 가온시켰다. 물을 첨가하였다. 실온으로 가온시켰다. 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 Na₂CO₃ 용액, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 농축시키고 플래쉬 크로마토그래피 (5％ → 20％ 에틸 아세테이트/헥산)에 의해 조 물질을 정제하였다. 목적 생성물 [1-(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (2.8 g, 20％)를 수득하였다. MS (ES) m/z 367 [M+1]⁺.

제법 43

에틸-[1-(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르

수소화나트륨 (84.0 mg, 2.1 mmol, 광유 중 60％ 분산액)을 디메틸포름아미드 (10 mL) 중 [1-(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (0.37 g, 1.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 교반하였다. 요오도에탄 (0.2 mL, 2.1 mmol)을 첨가하였다. 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 물로 켄칭시켰다. CH₂Cl₂로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 조 생성물 에틸-[1-(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (0.4 g, 97％)를 90％ HPLC 순도로 수득하였다 (MS (ES) m/z 395 [M+1]⁺).

하기 화합물은 에틸-[1-(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르와 유사한 절차를 이용하여 제조하였다.

제법 45

2-플루오로-4-요오도-3-메톡시메톡시메틸-피리딘

클로로메틸 메틸 에테르 (2 g, 25.0 mmol)를 디클로로메탄 (5 mL) 중 2-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일)-메탄올 (1.0 g, 3.95 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (5 g, 39 mmol)의 용액에 서서히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 클로로포름으로 희석시켰다. 유기층을 포화 수성 염화나트륨 및 물로 세척하였다. 혼합물을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 갈색 오일로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 10％ 메탄올)에 의해 정제하여 표제 화합물 (0.90 g, 77％)을 황색 오일로서 수득하였다. MS (ES) m/z 298 [M+1]⁺.

제법 46

5-시클로프로필-2-플루오로-피리딘

플라스크에서, 2-플루오로-5-요오도-피리딘 (1.12 g, 5 mmol), 시클로프로필보론산 (645 mg, 7.5 mmol), 팔라듐 아세테이트 (56 mg, 0.25 mmol), 인산칼륨 (3.2 g, 15 mmol), 및 톨루엔-물 (20:1, 21 mL)을 합하였다. 혼합물을 100℃에서 4시간 동안 가열하였다. 혼합물을 클로로포름-이소프로판올 (3:1, 100 mL)로 희석시켰다. 유기상을 포화 수성 염화나트륨 및 물로 세척하였다. 혼합물을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 갈색 오일로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 20％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 표제 화합물 (430 mg, 63％)을 담황색 오일로서 수득하였다.

제법 47

5-시클로프로필-2-플루오로-3-요오도-피리딘

THF (20 mL) 중 5-시클로프로필-2-플루오로-피리딘 (1.3 g, 9.5 mmol)의 용액을 질소하에 드라이 아이스-아세톤 조에서 -75℃로 냉각시켰다. 리튬 디이소프로필아미드 (THF 중 2 M, 6 mL, 12 mmol)를 30분에 걸쳐서 첨가하였다. 혼합물을 추가로 3시간 동안 교반하였다. 요오드 (2.9 g, 11.4 mmol, THF 50 mL에 용해되었음)를 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 물 (100 mL)을 첨가하고 교반하면서 온도를 1시간에 걸쳐서 실온으로 상승시켰다. 혼합물을 포화 나트륨 티오술페이트 수용액 (50 mL)으로 처리하였다. 용액을 에테르로 추출하였다. 용액을 진공하에 갈색 오일로 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 → 헥산 중 20％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 표제 화합물 (1.7 g, 68％)을 황색 오일로서 수득하였다.

제법 48

5-시클로프로필-2-플루오로-4-요오도-피리딘

THF (20 mL) 중 5-시클로프로필-2-플루오로-3-요오도-피리딘 (1.7 g, 6.5 mmol)의 용액을 질소하에 드라이 아이스-아세톤 조에서 -75℃로 냉각시켰다. 리튬 디이소프로필아미드 (THF 중 2 M, 3.9 mL, 7.8 mmol)를 30분 동안 첨가하였다. 혼합물을 추가로 3시간 동안 교반한 후에 물 (100 mL)을 첨가하였다. 그 후에 교반하면서 온도를 1시간 동안 실온으로 상승시켰다. 용액을 에테르로 추출하였다. 용액을 진공하에 갈색 오일로 농축시켰다. 오일을 컬럼 크로마토그래피 (헥산 → 헥산 중 15％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 생성물을 황색 오일 (1.1 g, 65％)로서 수득하였다.

제법 49

4-(4-벤조[b]티오펜-7-일-6-플루오로-피리딘-3-일메틸)-모르폴린

4-(6-플루오로-4-요오도-피리딘-3-일메틸)-모르폴린 (0.48 g, 1.5 mmol), 2-벤조[b]티오펜-7-일-4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란 (0.47 g, 1.8 mmol) 및 탄산나트륨 (0.39 g, 3.75 mmol)을 CH₃CN (8 mL) 및 물 (4 mL) 중에 합하였다. 혼합물을 질소로 5분 동안 퍼징하였다. [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센] 디클로로팔라듐(II) (디클로로메탄과의 착물 (1:1)) (5.0 mg, 0.6 mmol)을 첨가하고 질소로 추가로 5분 동안 퍼징하였다. 혼합물을 120℃에서 10분 동안 마이크로파 반응기에서 가열하고 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기층을 분리하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과하고 진공하에 농축시켜 조 혼합물을 제공하였다. 컬럼 크로마토그래피 (메탄올/디클로로메탄 중 0.1％ → 1％ 2 M 암모니아)에 의해 정제하여 표제 화합물 (0.43 g, 87％)을 수득하였다. MS (ES) m/z 329 [M+1]⁺.

하기 화합물은 적절한 출발 물질과 함께 4-(4-벤조[b]티오펜-7-일-6-플루오로-피리딘-3-일메틸)-모르폴린의 절차를 이용하여 제조하였다.

제법 57

1-(4-벤조[b]티오펜-7-일-6-플루오로-피리딘-3-일)-에틸아민

둥근 바닥 플라스크 내의 에탄올 (10 mL) 중 R-5-(1-아지도-에틸)-4-벤조[b]티오펜-7-일-2-플루오로-피리딘 (580 mg, 1.9 mmol)의 용액에 히드라진 포름산 염 (1:1) 및 라니 니켈 0.5 g을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 희석된 탄산나트륨 용액에 부었다. 생성물을 클로로포름으로 추출하고, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기층을 수성층으로부터 분리하고 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 유기 용매를 진공하에 증발시켜 목적 생성물을 황색 고체 (530 mg, 100％)로서 제공하였다. MS (ES) m/z 273 [M+1]⁺.

제법 58

[1-(4-벤조[b]티오펜-7-일-6-플루오로-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르

둥근 바닥 플라스크 내의 디옥산 (30 mL) 및 물 (10 mL) 중 1-(4-벤조[b]티오펜-7-일-6-플루오로-피리딘-3-일)-에틸아민 (530 mg, 1.9 mmol)의 용액에 디-tert-부틸디카르보네이트 (647 mg, 2.9 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 클로로포름으로 붓고, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기층을 수성층으로부터 분리하고 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 유기 용매를 진공하에 증발시켜 조 물질을 제공하였다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (헥산 → 헥산 중 20％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 목적 생성물을 백색 고체 (550 mg, 76％)로서 제공하였다. MS (ES) m/z 373 [M+1]⁺.

제법 59

4-벤조[b]티오펜-7-트리메틸실릴에티닐-1-피리딘

THF:H₂O의 용액에 4-클로로-3-트리메틸실릴에티닐-피리딘 (1.0 g, 4.78 mmol)을 첨가하고, 탄산칼륨 (1.97 g, 14.3 mmol) 및 2-벤조[b]티오펜-7-일-4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란 (1.49 g, 5.72 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 탈기시켰다. Pd 촉매 (0.218 g, 0.2 mmol) 및 트리(tert-부틸 포스피노)테트라플루오로보레이트 (0.120 g, 0.4 mmol)를 N₂ 분위기하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 가열하였다. 모든 THF를 진공하에 증발시키고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, 유기층을 추출한 다음 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 여과하고 진공하에 농축시킨 다음, 조 물질을 실리카 겔 (60-120 메쉬) 컬럼을 통해 통과시켜 순수 화합물을 제공하였다. 수율 (0.7 g, 48％), MS (ES) m/z 308 [M+1]⁺.

제법 60

4-{4-[2-(2-클로로-피리미딘-4-일)-벤조[b]티오펜-7-일]-6-플루오로-피리딘-3-일메틸}-모르폴린

용액 A: 무수 THF (5 mL) 중에 4-(4-벤조[b]티오펜-7-일-6-플루오로-피리딘-3-일메틸)-모르폴린 (0.43 g, 1.31 mmol) 및 트리이소프로필보레이트 (0.43 g, 2.63 mmol)를 질소하에 -78℃에서 합하였다. 시클로헥산 중 1.5 M 리튬 디이소프로필아미드 모노(THF) (2.2 mL, 3.28 mmol)를 질소하에 첨가하였다. 질소하에 -78℃에서 1시간 동안 교반하고 반응물을 실온으로 가온시켰다.

용액 B: THF (7 mL) 및 물 (3 mL) 중에 2,4-디클로로피리미딘 (0.29 g, 1.97 mmol), 2-(디-tert-부틸포스포)비페닐 (0.01 g, 0.04 mmol) 및 탄산나트륨 (0.42 g, 3.94 mmol)을 합하였다. 질소로 5분 동안 퍼징하였다. [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II) (디클로로메탄과의 착물 (1:1)) (0.05 g, 0.07 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 질소하에 가열하였다.

용액 A를 시린지를 통해 20분에 걸쳐서 용액 B에 적가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 질소하에 60℃에서 가열하고 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기층을 분리하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과하고 진공하에 농축시켜 조 생성물을 제공하였다. 컬럼 크로마토그래피 [메탄올/디클로로메탄 중 0.1％ → 1％ 2 M 암모니아]에 의해 정제하여 표제 화합물 (0.42 g, 73％)을 수득하였다. MS (ES) m/z 441 [M+1]⁺.

하기 화합물은 적절한 출발 물질을 사용하여 본질적으로 4-{4-[2-(2-클로로-피리미딘-4-일)-벤조[b]티오펜-7-일]-6-플루오로-피리딘-3-일메틸}-모르폴린의 제법에 따라 제조하였다.

제법 75

(2-아지도카르보닐-에틸)-카르밤산 tert-부틸 에스테르

에틸 클로로포르메이트 (2.52 g, 23.25 mmol)를 THF (60 mL) 중 3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로피온산 (4 g, 21.14 mmol) 및 4-메틸 모르폴린 (2.35 g, 23.25 mmol)의 용액에 -20℃에서 적가하였다. 40분 후에, 현탁액을 -5℃로 가온시키고 물 (10 mL) 중 나트륨 아지드 (3.44 g, 52.85 mmol)의 용액을 적가하였다. 10분 후에, 혼합물을 에틸 아세테이트 (60 mL)로 희석시키고 물, 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 유기 용매를 제거하여 생성물을 투명 오일 (4.3 g, 95％)로서 수득하였다.

제법 76

(2-이소시아나토-에틸)-카르밤산 tert-부틸 에스테르

톨루엔 (50 mL) 중 (2-아지도카르보닐-에틸)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (4.3 g, 20.07 mmol)의 용액을 65℃에서 N₂ 기체의 방출이 중단될 때까지 25분 동안 교반하였다. 용액을 냉각시켰다.

제법 77

{2-[3-(2,2-디에톡시-에틸)-우레이도]-에틸}-카르밤산 tert-부틸 에스테르

2,2-디에톡시 에탄아민 (3.33 g, 25.04 mmol)을 톨루엔 (50 mL) 중 (2-이소시아나토-에틸)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (3.73 g, 20.03 mmol)의 용액에 첨가하였다. 1시간 후에, 혼합물을 농축시켜 백색 고체 (6.39 g)를 수득하였다.

제법 78

[2-(2-옥소-2,3-디히드로-이미다졸-1-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르

메탄올 (75 mL) 및 물 (40 mL) 중에 {2-[3-(2,2-디에톡시-에틸)-우레이도]-에틸}-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (6.5 g, 20.35 mmol)를 용해시켰다. 반응 혼합물에 HCl (0.4 N, 50 mL)을 30분에 걸쳐서 적가하였다. 혼합물을 밤새 교반하고 KOH (0.4 M, 50 mL)를 첨가함으로써 중화시키고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 클로로포름으로 추출하고 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 회전식 증발기에서 용매를 제거하여 조 백색 고체를 제공하였다. 컬럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 1％ → 10％ MeOH)에 의해 정제하여 순수 생성물을 백색 고체 (2.53 g, 11.13 mmol)로서 수득하였다. GCMS (EI) m/z 227 M⁺.

제법 79

1-(2-아미노-에틸)-1,3-디히드로-이미다졸-2-온; 트리플루오로-아세트산과의 화합물

트리플루오로-아세트산 (10 mL)을 디클로로메탄 (10 mL) 중 [2-(2-옥소-2,3-디히드로-이미다졸-1-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (2.5 g, 11 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 회전식 증발기에서 대부분의 용매 및 트리플루오로-아세트산을 제거하고 진공하에 황색의 농후한 오일을 건조시켜 생성물을 얻었다. GCMS (EI) m/z 127 M⁺.

제법 80

{1-[6-플루오로-4-(2-{5-플루오로-2-[2-(2-옥소-2,3-디히드로-이미다졸-1-일)-에틸아미노]-피리미딘-4-일}-벤조[b]티오펜-7-일)-피리딘-3-일]-에틸}-카르밤산 tert-부틸 에스테르

압력 용기 내의 N-메틸피롤리돈 (1.0 mL) 중에 (1-{4-[2-(2-클로로-5-플루오로-피리미딘-4-일)-벤조[b]티오펜-7-일]-6-플루오로-피리딘-3-일}-에틸)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (150 mg, 0.3 mmol), 1-(2-아미노-에틸)-1,3-디히드로-이미다졸-2-온 (70 mg, 0.55 mmol) 및 트리에틸아민 (80 mg, 0.8 mmol)을 합하였다. 반응 혼합물을 마이크로파 반응기에서 1시간 동안 130℃에서 가열한 후에 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기층을 수성층으로부터 분리하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 유기 용매를 증발시켜 조 물질을 제공하였다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 10％ 메탄올)에 의해 정제하여 목적 생성물 (80 mg, 74％)을 수득하였다. MS (ES) m/z 538 [M+t-Bu]⁺, 494 [M-Boc]^-, 616 [M+Na]⁺.

제법 81

2-클로로-4-[7-(3-트리메틸실라닐에티닐-피리딘-4-일)-벤조[b]-티오펜-2-일]-피리미딘

2,4-디클로로 피리미딘 (0.29 g, 1 mmol) 및 탄산나트륨 (2.0 M, 0.273 g, 2.6 mmol)을 둥근 바닥 플라스크 내의 THF 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 탈기시키고 Pd 촉매 (0.053 g, 0.06 mmol)를 첨가한 후에, 반응 혼합물을 1.5시간 동안 환류시켰다. 동시에 또다른 둥근 바닥 플라스크에, 4-벤조[b]티오펜-7-트리메틸실릴에티닐-1-피리딘 (0.40 g, 1.3 mmol)을 N₂ 분위기하에 첨가하고, 트리스-이소프로필 보레이트 (0.59 mL, 2.5 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 리튬 디이소프로필아미드 (1.9 mL, 3.8 mmol)를 -78℃에서 적가하였다. 용액을 1.5시간 동안 -78℃에서 교반하였다. 1.5시간 후에, 상기 용액을 제1 환류 반응 혼합물에 첨가하였다. 다시, 반응 혼합물을 2시간 동안 더 환류시켰다. 모든 THF를 진공하에 증발시키고 에틸 아세테이트에 녹임으로써 반응 혼합물을 추출하고 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기상을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 진공하에 농축시켜 조 화합물을 제공하였다. 조 물질을 실리카 겔 (60-120 메쉬) 컬럼을 통해 통과시켜 순수 화합물을 용리시켰다. 수율 (0.180 g, 33％).

　　　하기 중간체는 2-클로로-4-[7-(3-트리메틸실라닐에티닐-피리딘-4-일)-벤조[b]-티오펜-2-일]-피리미딘에 대해 사용된 것과 유사한 절차로 제조하였다.

하기 중간체는 적절한 출발 물질을 사용하여 본질적으로 하기 1-(2-{4-[7-(5-디메틸아미노메틸-2-플루오로-피리딘-4-일)-벤조[b]티오펜-2-일]-5-플루오로-피리미딘-2-일아미노}-에틸)-이미다졸리딘-2-온의 제법에 따라 제조하였다.

제법 91

1-(2-[4-[7-(3-트리메틸실라닐에티닐-피리딘-4-일)-벤조[b]-티오펜-2-일]-피리미딘-2-일-아미노)-에틸 이미다졸리딘-2-온

2-클로로-4-[7-(3-트리메틸실라닐에티닐-피리딘-4-일)-벤조[b]-티오펜-2-일]-피리미딘 (0.180 g, 0.4 mmol)을 밀봉된 튜브에 첨가하고 여기에 n-부탄올 (2 mL)을 첨가하였다. N-2-아미노 에틸 이미다졸리딘-2-온 (0.103 g, 0.8 mmol)을 첨가하였다. 튜브를 밀봉하고 오일조에서 4 내지 5시간 동안 120℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시키고 조 물질을 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 수율 (0.1 g, 49％);

하기 중간체는 1-(2-[4-[7-(3-트리메틸실라닐에티닐-피리딘-4-일)-벤조[b]-티오펜-2-일]-피리미딘-2-일-아미노)-에틸 이미다졸리딘-2-온에 대해 사용된 것과 유사한 절차로 제조하였다.

제법 93

1-(2-{5-플루오로-4-[7-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-벤조[b]티오펜-2-일]-피리미딘-2-일아미노}-에틸)-이미다졸리딘-2-온

플라스크 내의 DMSO (80 mL) 중에 7-1-{2-[4-(7-브로모-벤조[b]티오펜-2-일)-5-플루오로-피리미딘-2-일아미노]-에틸}-이미다졸리딘-2-온 (5.5 g, 12.6 mmol), 비스(피나콜라토)디보론 (3.84 g, 15.3 mmol), (1,1'-비스(디페닐포스피노)-페로센)디클로로팔라듐(II) (1.0 g, 1.3 mmol), 칼륨 아세테이트 (2.5 g, 25 mmol)를 합하였다. 질소를 혼합물을 통해 10분 동안 버블링시켰다. 플라스크를 밀봉하고 이것을 오일조에 넣어 85℃에서 밤새 가열하였다. 혼합물을 클로로포름/이소프로필 알콜 (3/1)로 희석시켰다. 용액을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 이것을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 진공하에 암색 잔류물로 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (헥산 → 헥산 중 20％ 에틸 아세테이트 → 디클로로메탄 중 10％ 메탄올)에 의해 정제하여 생성물을 갈색 고체 (5 g, 82％)로서 수득하였다. MS (ES) m/z 484 [M+1]⁺.

하기 화합물은 1-(2-{5-플루오로-4-[7-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-벤조[b]티오펜-2-일]-피리미딘-2-일아미노}-에틸)-이미다졸리딘-2-온에 대해 기재된 것과 유사한 절차로 제조하였다.

제법 97

1-(2-{4-[7-(5-아지도메틸-2-플루오로-피리딘-4-일)-벤조[b]티오펜-2-일]-5-플루오로-피리미딘-2-일아미노}-에틸)-이미다졸리딘-2-온

DMSO (87 mL) 및 물 (3 mL) 중에 5-아지도메틸-2-플루오로-4-요오도-피리딘 (70 mg, 0.25 mmol) 및 1-(2-{5-플루오로-4-[7-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-벤조[b]티오펜-2-일]-피리미딘-2-일아미노}-에틸)-이미다졸리딘-2-온 (100 mg, 0.21 mmol), 비스(디페닐포스피노)페로센)디클로로 팔라듐 (8.5 mg, 0.01 mmol) 및 NaHCO₃ (35 mg, 0.41 mmol)를 합하였다. 혼합물을 질소를 통해 5분 동안 2회 퍼징하였다. 혼합물을 오일조에서 1시간 동안 85℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 클로로포름/이소프로필 알콜 (93/1)로 희석시키고, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기층을 수성층으로부터 분리하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 유기 용매를 제거하여 조 혼합물을 제공하였다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 10％ 메탄올)에 의해 정제하여 표제 화합물 (105 mg, 100％)을 수득하였다. MS (ES) m/z 508 [M+1]⁺.

하기 중간체는 1-(2-{4-[7-(5-아지도메틸-2-플루오로-피리딘-4-일)-벤조[b]티오펜-2-일]-5-플루오로-피리미딘-2-일아미노}-에틸)-이미다졸리딘-2-온에 대해 기재된 것과 유사한 절차로 제조하였다.

제법 102

Tert-부틸 1-(6-클로로-4-(2-(5-플루오로-2-(2-(2-옥소이미다졸리딘-1-일)에틸아미노)피리미딘-4-일)벤조[b]티오펜-7-일)피리딘-3-일)에틸카르바메이트

마이크로파 바이알에서, 아세토니트릴 (7 mL) 및 물 (3 mL) 중에 [1-(6-클로로-4-요오도-피리딘-3-일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (250 mg, 0.65 mmol) 및 1-(2-{5-플루오로-4-[7-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-벤조[b]티오펜-2-일]-피리미딘-2-일아미노}-에틸)-이미다졸리딘-2-온 (380 mg, 0.78 mmol), 비스(디페닐포스피노)페로센)디클로로 팔라듐 (53 mg, 0.07 mmol) 및 NaHCO₃ (110 mg, 1.31 mmol)를 합하였다. 혼합물을 질소로 5분 동안 퍼징하였다. 혼합물을 마이크로파하에 100℃에서 15분 동안 가열하였다. 용매를 회전식 증발기에서 제거하였다. 정상 컬럼 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 0.5％ → 5％ MeOH를 사용하여 정제함으로써 회백색 고체 생성물 (220 mg)을 얻었다. MS (ES) m/z 612 [M+1]⁺.

제법 103

Tert-부틸 (6-플루오로-4-(2-(5-플루오로-2-(2-(2-옥소-2,3-디히드로-1H-이미다졸-1-일)에틸아미노)피리미딘-4-일)벤조[b]티오펜-7-일)피리딘-3-일)메틸(메틸)카르바메이트

n-부탄올 (10.0 mL) 중에 {4-[2-(2-클로로-5-플루오로-피리미딘-4-일)-벤조[b]티오펜-7-일]-6-플루오로-피리딘-3-일메틸}-메틸-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (0.52 g, 1.04 mmol) 및 트리에틸아민 (0.87 mL, 6.24 mmol)을 합하였다. 1-(2-아미노-에틸)-1,3-디히드로-이미다졸-2-온; 트리플루오로-아세트산과의 화합물 (0.75 g, 3.12 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 완료되도록 120℃에서 54시간 동안 가열한 후에, 실온으로 냉각시켰다. 용매를 회전식 증발기에서 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 메탄올 용액 중 0.5％ → 6％ 2 M NH₃)에 의해 정제하여 목적 생성물 (0.28 g)을 얻었다. MS (ES) m/z 594 [M+1]⁺.

실시예 1

1-(2-{4-[7-(5-((디메틸아미노)메틸)-2-플루오로-피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일]-5-플루오로피리미딘-2-일아미노}에틸)이미다졸리딘-2-온

{4-[2-(2-클로로-5-플루오로-피리미딘-4-일)-벤조[b]티오펜-7-일]-6-플루오로-피리딘-3-일메틸}-디메틸-아민 (0.25 g, 0.59 mmol) 및 트리에틸아민 (0.25 mL, 1.78 mmol)을 n-부탄올 (8.0 mL) 중에 합하였다. 1-(2-아미노에틸)이미다졸리딘-2-온 (0.23 g, 1.78 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 120℃에서 밤새 (15시간) 가열한 후에, 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기층을 수성층으로부터 분리하고 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 유기 용매를 제거하여 조 물질을 제공하였다. 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (메탄올 용액/디클로로메탄 중 0.5％ → 10％ 2 N NH₃)에 의해 정제하여 표제 화합물 (0.19 g, 63％)을 수득하였다. MS (ES) m/z 510 [M+1]⁺.

하기 화합물은 적절한 출발 물질을 사용하여 본질적으로 1-(2-{4-[7-(5-((디메틸아미노)메틸)-2-플루오로-피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일]-5-플루오로피리미딘-2-일아미노}에틸)이미다졸리딘-2-온의 제법에 따라 제조하였다.

하기 실시예는 1-(2-{4-[7-(5-아지도메틸-2-플루오로-피리딘-4-일)-벤조[b]티오펜-2-일]-5-플루오로-피리미딘-2-일아미노}-에틸)-이미다졸리딘-2-온에 대해 기재된 것과 유사한 절차로 제조하였다.

실시예 18

1-(2-{5-플루오로-4-[7-(2-플루오로-5-((메틸아미노)메틸)피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일]-피리미딘-2-일아미노}에틸)이미다졸리딘-2-온

[4-(2-{5-플루오로-2-[2-(2-옥소-이미다졸리딘-1-일)-에틸아미노]-피리미딘-4-일}-벤조[b]티오펜-7-일)-6-플루오로-피리딘-3-일메틸]-메틸-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (0.19 g, 0.32 mmol)를 무수 CH₂Cl₂ (1.4 mL) 및 CF₃COOH (1.4 mL) 중에 용해시켰다. 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 완전히 제거하였다. 트리플루오로-아세트산 염을 CH₂Cl₂로 희석시켰다. 포화 NaHCO₃ 용액, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. MgSO₄로 건조시켰다. 여과한 후에, 용매를 제거하였다. 진공하에 밤새 건조시켜 표제 화합물 (0.12 g, 78％)을 수득하였다. MS (ES) m/z 495 [M+1]⁺.

하기 실시예는 1-(2-{5-플루오로-4-[7-(2-플루오로-5-메틸아미노메틸-피리딘-4-일)-벤조[b]티오펜-2-일]-피리미딘-2-일아미노}-에틸)-이미다졸리딘-2-온에 대해 기재된 것과 유사한 절차로 제조하였다.

실시예 23

1-(2-{5-플루오로-4-[7-(2-플루오로-5-((메틸아미노)메틸)피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일]피리미딘-2-일아미노}에틸)-1H-이미다졸-2(3H)-온

트리플루오로-아세트산 (1 mL)을 디클로로메탄 (1 mL) 중 [6-플루오로-4-(2-{5-플루오로-2-[2-(2-옥소-2,3-디히드로-이미다졸-1-일)-에틸아미노]-피리미딘-4-일}-벤조[b]티오펜-7-일)-피리딘-3-일메틸]-메틸-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (280 mg, 0.47 mmol)의 용액에 첨가하였다. 1시간 동안 교반하고 용매를 회전식 증발기에서 제거하였다. 포화 NaHCO₃로 세척하고 디클로로메탄으로 추출하고, 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 용매를 회전식 증발기에서 제거하여 고체를 수득하고 진공하에 건조시켜 생성물 (196 mg)을 수득하였다. MS (ES) m/z 494[M+1]⁺.

실시예 24

1-{2-[5-플루오로-4-(7-{2-플루오로-5-[(3,3,3-트리플루오로-프로필아미노)-메틸]-피리딘-4-일}벤조[b]티오펜-2-일)피리미딘-2-일아미노]에틸}이미다졸리딘-2-온

염화수소 (2 mL, 디에틸 에테르 중 1 M)를 디클로로메탄 (3 mL) 중 [6-플루오로-4-(2-{5-플루오로-2-[2-(2-옥소-이미다졸리딘-1-일)-에틸아미노]-피리미딘-4-일}-벤조[b]티오펜-7-일)-피리딘-3-일메틸]-(3,3,3-트리플루오로-프로필) 카르밤산 tert-부틸 에스테르 (0.136 g, 200.68 μmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 용매를 증발시키고 생성 고체를 디클로로메탄에 현탁시키고 30％ 수성 탄산칼륨으로 처리하였다. 유기상을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고 유기 용액을 디클로로메탄과 함께 25 g 실리카 겔 로딩 컬럼에 로딩하고 40 g 실리카 겔 컬럼으로 디클로로메탄 → 에틸 아세테이트, 이어서 에틸 아세테이트 → 에틸 아세테이트 중 10％ 메탄올로 용리시켜 표제 화합물을 제공하였다. 물질을 추가로 HPLC (HPLC 조건: 38-42％ CH₃CN/10 mM NH₄HCO₃, pH 10, 20 mL/분, 엑스브라이드(XBride®) MS C₁₈ 19 x 100 mm)에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 모아서 농축시켰다. 잔류물을 2회 분량의 무수 에탄올, 1회 분량의 톨루엔과 함께 공-증발시키고, 디클로로메탄이 포함된 10 mL 용량의 둥근 바닥 플라스크로 옮겼다. 물질을 디클로로메탄 헥산 공-증발을 이용하여 고체로 전환시켜 표제 화합물 45 mg (39％)을 황색 고체로서 제공하였다. MS (ES) m/z 578 [M+1]⁺.

하기 실시예는 1-{2-[5-플루오로-4-(7-{2-플루오로-5-[(3,3,3-트리플루오로-프로필아미노)-메틸]-피리딘-4-일}벤조[b]티오펜-2-일)피리미딘-2-일아미노]에틸}이미다졸리딘-2-온에 대해 기재된 것과 유사한 절차로 제조하였다.

실시예 26

1-(2-{4-[7-(5-(아미노메틸)-2-플루오로피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일]-5-플루오로피리미딘-2-일아미노}에틸)이미다졸리딘-2-온

둥근 바닥 플라스크 내의 에탄올 (10 mL) 중 1-(2-{4-[7-(5-아지도메틸-2-플루오로-피리딘-4-일)-벤조[b]티오펜-2-일]-5-플루오로-피리미딘-2-일아미노}-에틸)-이미다졸리딘-2-온 (105 mg, 0.3 mmol)의 용액에 히드라진 포름산 염 (1:1) 2 g 및 라니 니켈 0.5 g을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 희석된 탄산나트륨 용액에 부었다. 생성물을 클로로포름으로 추출하고, 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 유기층을 수성층으로부터 분리하고 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 여과한 후에, 유기 용매를 진공하에 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조 물질을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (클로로포름/메탄올/수산화암모늄, 7/3/0.05)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 고체 (0.50 mg, 53％)로서 제공하였다. MS (ES) m/z 482 [M+1]⁺.

실시예 27 및 28

R-1-[2-(4-{7-[5-(1-아미노에틸)-2-플루오로피리딘-4-일]벤조[b]티오펜-2-일}-5-플루오로피리미딘-2-일아미노)에틸]이미다졸리딘-2-온 및 S-1-[2-(4-{7-[5-(1-아미노에틸)-2-플루오로피리딘-4-일]벤조[b]티오펜-2-일}-5-플루오로피리미딘-2-일아미노)에틸]이미다졸리딘-2-온

1-[2-(4-{7-[5-(1-아미노에틸)-2-플루오로피리딘-4-일]벤조[b]티오펜-2-일}-5-플루오로피리미딘-2-일아미노)에틸]이미다졸리딘-2-온 (180 mg, 0.36 mmol)을 키랄 HPLC (키랄팩® AD-H, 9/1 EtOH/아세토니트릴, 0.2％ N,N-디메틸에탄올아민, 1 mL/분, 225 nm)에 의해 분리하여 S-거울상이성질체 (50 mg, 28％)로서 제1 분획을, 또한 R-거울상이성질체 (51 mg, 28％)로서 제2 분획을 제공하였다. MS (ES) m/z 496 [M+1]⁺.

실시예 29

1-[2-(5-플루오로-4-{7-[2-플루오로-5-(2-히드록시에톡시)피리딘-4-일]벤조[b]티오펜-2-일}피리미딘-2-일아미노)에틸]이미다졸리딘-2-온

피리디늄 p-톨루엔술포네이트 (4.3 mg, 0.02 mmol)를 에탄올 (4 mL) 중 1-{2-[5-플루오로-4-(7-{2-플루오로-5-[2-(테트라히드로-피란-2-일옥시)-에톡시]-피리딘-4-일}-벤조[b]티오펜-2-일)-피리미딘-2-일아미노]-에틸}-이미다졸리딘-2-온 (100 mg, 0.17 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 55℃에서 밤새 교반하였다. 용액을 냉각시켰다. 용액을 진공하에 황색 오일로 농축시켰다. 오일을 컬럼 크로마토그래피 (메틸렌 클로라이드 → 메틸렌 클로라이드 중 10％ 메탄올)에 의해 정제하여 표제 화합물 (75 mg, 87％)을 밝은 황색 고체로서 수득하였다. MS (ES) m/z 513 [M+1]⁺.

실시예 30

1-(2-(4-(7-(3-에티닐피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸) 이미다졸리딘-2-온

둥근 바닥 플라스크 내의 메탄올에 1-(2-[4-[7-(3-트리메틸실라닐에티닐-피리딘-4-일)-벤조[b]-티오펜-2-일]-피리미딘-2-일-아미노)-에틸 이미다졸리딘-2-온 (0.1 g, 0.19 mmol)을 첨가하였다. 탄산칼륨 (0.053 g, 0.38 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 모든 용매를 진공하에 증발시켰다. 화합물을 디클로로메탄으로 희석시키고 물로 세척함으로써 추출하였다. 화합물을 진공하에 건조시켰다 (0.083 g, 40％). MS (ES) m/z 441.26 [M+1]⁺.

하기 실시예는 1-(2-(4-(7-(3-에티닐피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸)이미다졸리딘-2-온에 대해 사용된 것과 유사한 절차로 제조하였다.

실시예 32

1-(2-(4-(7-(5-(1-아미노에틸)-2-클로로피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일)-5-플루오로피리미딘-2-일아미노)에틸)이미다졸리딘-2-온

트리플루오로-아세트산 (1 mL)을 디클로로메탄 (1 mL) 중 tert-부틸 1-(6-클로로-4-(2-(5-플루오로-2-(2-(2-옥소이미다졸리딘-1-일)에틸아미노)피리미딘-4-일)벤조[b]티오펜-7-일)피리딘-3-일)에틸카르바메이트 (220 mg, 0.36 mmol)의 용액에 첨가하였다. 1시간 동안 교반하고 용매를 회전식 증발기에서 제거하였다. 포화 NaHCO₃로 세척하고 디클로로메탄으로 추출하고, 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 용매를 회전식 증발기에서 제거하여 고체를 수득하고 진공하에 건조시켜 생성물 (158 mg)을 수득하였다. MS (ES) m/z 512 [M+1]⁺.

생성물 (90 mg, 0.18 mmol)을 키랄 HPLC (키랄팩® AS-H, 100％ MeOH/0.02％ 디메틸에탄올아민 ＼CO₂, 5 mL/분, 225 nm)에 의해 분리하여 최초 용리되는 이성질체 (39 mg)를 수득하였다. MS (ES) m/z 512 [M+1]⁺.

실시예 33 및 34

S-1-(2-(4-(7-(5-(1-(에틸아미노)에틸)-2-플루오로피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일)-5-플루오로피리미딘-2-일아미노)에틸)이미다졸리딘-2-온 및 R-1-(2-(4-(7-(5-(1-(에틸아미노)에틸)-2-플루오로피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일)-5-플루오로피리미딘-2-일아미노)에틸)이미다졸리딘-2-온

1-(2-(4-(7-(5-(1-(에틸아미노)에틸)-2-플루오로피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일)-5-플루오로피리미딘-2-일아미노)에틸)이미다졸리딘-2-온 (150 mg, 0.29 mmol)을 키랄 HPLC (키랄팩® AD-H 30％ MeOH/0.2％ 이소프로필아민/CO₂ 5 mL/분 225 nm)에 의해 분리하여 S-거울상이성질체 (58.4 mg, 38％)로서 제1 분획을, 또한 R-거울상이성질체 (58.4 mg, 38％)로서 제2 분획을 제공하였다. MS (ES) m/z 524 [M+1]⁺.

실시예 35 및 36

S-1-(2-(5-플루오로-4-(7-(2-플루오로-5-(1-(메틸아미노)에틸)피리딘-4-일)벤조[b] 티오펜-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸)이미다졸리딘-2-온 및 R-1-(2-(5-플루오로-4-(7-(2-플루오로-5-(1-(메틸아미노)에틸)피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸)이미다졸리딘-2-온

1-(2-(5-플루오로-4-(7-(2-플루오로-5-(1-(메틸아미노)에틸)피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸)이미다졸리딘-2-온을 1-(2-{5-플루오로-4-[7-(2-플루오로-5-메틸아미노메틸-피리딘-4-일)-벤조[b]티오펜-2-일]-피리미딘-2-일아미노}-에틸)-이미다졸리딘-2-온에 대해 기재된 것과 유사한 절차로 제조하였다. 1-(2-(5-플루오로-4-(7-(2-플루오로-5-(1-(메틸아미노)에틸)피리딘-4-일)벤조[b]티오펜-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸)이미다졸리딘-2-온 (196 mg, 0.38 mmol)을 키랄 HPLC (키랄팩® AD-H, 40％ EtOH (0.2％ 이소프로필아민)/CO₂ 5 mL/분, 225 nm)에 의해 분리하여 S-거울상이성질체 (60.2 mg, 31％)로서 제1 분획을, 또한 R-거울상이성질체 (58.9 mg, 30％)로서 제2 분획을 제공하였다. MS (ES) m/z 510 [M+1]⁺.

분석

Plk1은 수많은 인간 종양, 예컨대 비-소세포 폐암, 구인두암, 식도암, 위암, 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 직장결장암, 아교모세포종, 유두암, 췌장암, 전립선암, 간모세포종 및 비-호지킨 림프종 암에서 과다 발현되는 것으로 밝혀졌다. 또한, Plk1 발현은 비-소세포 폐암, 구인두암, 식도암, 흑색종, 직장결장암, 간모세포종 및 비-호지킨 림프종 암에서 예후적 의미를 갖는다 (문헌 [Strebhardt, K. and A. Ullrich. Nature Reviews Cancer 6(4): 321-30 (2006)]). Plk1 인산화된 기질은 중심체 성숙, 유사분열에의 진입, 자매 염색분체 분리 및 세포질분열을 조정함으로써 유사분열의 진행을 조절한다 (문헌 [Eckerdt and Strebhardt 2006; Strebhardt and Ullrich 2006; van de Weerdt, B. C. and R. H. Medema. Cell Cycle 5(8): 853-64 (2006)]). 항체 주입을 이용한 Plk1 기능의 억제, 우성인 음성 Plk1의 발현, 및 안티센스 mRNA 감소는 단극 방추체 및 후기 정지를 초래하여 종양 세포주에서는 유사분열기 세포사를 유도하나, 정상 비-형질전환 1차 세포주에서는 가역적 G2 정지를 유도한다.

추가적으로, Plk는 횡문양 종양의 치료에 유용할 수 있다고 보고되었다 (문헌 [Morozov A., et al., Clinical Cancer Research. 13(16):4721-30, (Aug 15, 2007)]).

BI-2536은 HCT116, A549 및 NCIH460 뮤린 이종이식물을 사용한 전임상 모델 에서 활성이 입증되었다 (문헌 [Baum, A., P. Garin-Chesa, et al. (2006). #C191 In vivo activity of BI 2536, a potent and selective inhibitor of the mitotic kinase PLK1, in a range of cancer xenografts. AACR-NCI-EORTC International Conference on "Molecular Targets and Cancer Therapeutics", Philidelphia, PA]).

하기 분석의 결과는 본 발명의 화합물이 항암제로서 유용하다는 증거를 입증한다.

Plk1 의 발현 및 정제

수많은 공급원, 예컨대 인사이트(Incyte) (기탁 번호: NM_005030)로부터 얻을 수 있는 인간 Plk1 cDNA를, His₆ 태그, 예컨대 C-말단 FLAG-His₆ 태그를 발현하는 폴리뉴클레오티드 서열과 그의 말단 중 하나에서 직접 연결시키고, 적절한 발현 벡터, 예컨대 pFastBac™ 벡터 (인비트로젠(Invitrogen))에 삽입하고, 적절한 시스템, 예컨대 xPlkk1에 대해 문헌 [Yue-Wei Qian, et al., Science, 282, 1701 (1998)]에 보고된 것과 유사한 배큘로바이러스에 형질감염시킬 수 있다. 바이러스 발현 시스템을 사용하는 경우에는, 바이러스 (예를 들어, Plk1-Flag-His₆ 태그 폴리뉴클레오티드 구조물을 함유하는 배큘로바이러스)를 적합한 숙주 세포, 예컨대 Sf9 세포의 배양물에 감염시켰다. 충분한 양의 Plk1-Flag-His₆ 태그 융합 단백질이 발현되었을 때, 예를 들어 주입 후 약 46시간에, 배양물을 오카다산(okadaic acid) (0.1 μM)으로 충분한 시간 동안 (예를 들어, 3시간) 처리하여야 한다. Plk1- Flag-His₆ 태그 융합물을 당업계에 잘 공지된 방법으로 금속 친화성 수지, 예컨대 탈론(TALON™) (클론테크(Clontech), 카탈로그 #635503)을 사용하여 세포 펠렛으로부터 정제하였다. 정제된 Plk1-Flag-His₆ 태그 융합물을, 사용할 때까지 적은 분취량으로 적합한 배지 (예컨대 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.01％ 트리톤(TRITON®) X-100, 1 mM 디티오트레이톨 (DTT), 10％ 글리세롤, pH 7.5)에서 -80℃에서 보관하였다. 정제된 Plk1-Flag-His₆ 태그 융합 단백질의 본질은 MALDI (매트릭스-보조 레이저 이탈/이온화)에 의해 확인되었다.

GST - Cdc25C (1-206)의 발현 및 정제

임의의 적절한 공급원, 예컨대 인사이트 (기탁 번호: AY497474)로부터 얻을 수 있는 인간 Cdc25C cDNA를 임의의 편리한 발현 시스템에서 발현시킬 수 있고, 이후에 문헌 [Bin Ouyang et al, Oncogene, 18, 6029-6036 (1999)]에 기재된 것과 유사한 잘 공지된 방법에 의해 정제하였다. 한 편리한 시스템은 pGEX-2T 벡터 (아머샴(Amersham))로 형질전환된 이.콜라이(E. coli) BL21을 18℃에서 밤새 성장시키는 것을 포함하고, 여기에서 인간 Cds25C에 대한 cDNA는 1 mM 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드를 사용하여 발현을 유도하도록 가공되었다. Plk1에 대한 기질인 발현된 GST-Cdc25C(1-206)를 글루타티온 세파로스(GLUTATHIONE SEPHAROSE®) 4B에 의해 정제하고, 적절한 용액 (예컨대 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.5) 중에 -80℃에서 적은 분취액으로 보관할 수 있다.

Plk1 억제 분석

Plk1 키나제 반응물은 50 mM HEPES, pH 7.3, 1.0 mM 디티오트레이톨, 5.0 μM ATP, 10 mM MgCl₂, 0.01％ 트리톤® X-100, 0.4 μCi ³³P-ATP, 및 0.06 ㎍/㎕ GST-Cdc25c(1-206) 펩티드를 함유하는 완충액 중에 Plk1-Flag-His₆ 태그 융합 효소 (0.2 ng/㎕)를 함유한다. 화합물을 DMSO 중 10 mM 스톡으로서 공급하였다. 화합물을 20％ DMSO 중에서 1:3으로 연속 희석시켜 10-지점 농도-반응 곡선을 만들고, 그 후에 반응 혼합물 중에서 1:5 (4％ 최종 DMSO 농도 중 20 μM 내지 0.001 μM 최종)로 희석시켜 화합물 활성을 측정하였다. 반응을 실온에서 60분 동안 수행한 후에, 10.0％ H₃PO₄ 60 ㎕를 첨가함으로써 켄칭시켰다. 반응 혼합물 (85 ㎕)을 10.0％ H₃PO₄ 30 ㎕로 사전 습윤화된 96 웰 포스포셀룰로스 여과 플레이트에 옮기고, 실온에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션한 후에, 0.5％ H₃PO₄로 3회 세척하였다. 웰을 건조시킨 후에, 마이크로신트TM20(MicroScintTM20) (팩커드(Packard)) 40 ㎕를 첨가하고, 이어서 월락 마이크로베타 제트(Wallac MICROBETA® Jet) 상에서 계수하였다. 예를 들어, 액티비티 베이스(ACTIVITY BASE™) 소프트웨어 (IDBS), 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여, 10-지점 농도 반응 데이터로부터의 억제율 값을 후속적으로 분석하였다. 절대 IC₅₀ 값을 초래된 곡선 피트로부터 계산하였다. 모든 예시된 화합물은 3.6의 최소 유의 비율 (MSR)로 100 nM 미만의 IC₅₀을 가졌다. 예를 들어, 실시예 4는 약 25 nM의 IC₅₀을 가졌다.

pHH3 ( S10 ), 유사분열기 세포 및 DNA 함량 분석

어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC)으로부터의 HeLa 세포를 96 웰 베크만 디킨슨 바이오코트(Beckman Dickinson BIOCOAT™) 플레이트에 200개의 세포/웰로 플레이팅하고, 37℃, 5％ CO₂에서 10％ FBS (우태혈청)를 함유하는 MEM (최소 필수 배지, 예를 들어 깁코(GIBCO), 카탈로그 #11095) 중에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 0.5 μM 내지 0.0098 μM 범위에 걸쳐 10 지점에서 투여함으로써 화합물 (0.25％ DMSO 중)을 배지에 첨가하여 세포를 처리하였다. 화합물에의 23시간 노출 후에, 세포를, 예를 들어 프레페르(PREFER™) 고정제 [아나테크 리미티드(Anatech LTD.), 카탈로그 #414]로 30분 동안 고정시키고, 이어서 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 0.1％ 트리톤® X100 용액을 사용하여 15분 동안 투과성으로 만들었다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후에, RNAse 50 ㎍/mL로 분해시켰다. 1차 항체, 포스포히스톤 H3 (업스테이트(Upstate) Cat #06-570)을 4℃에서 밤새 1％ 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS 중에서 1:500으로 세포에 첨가하였다. 3회의 PBS 세척 후에, 세포를 알렉사488(Alexa488) 표지된 2차 항체 (인비트로젠 cat #A11008)와 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 다시 이들을 PBS로 3회 세척한 후에, 15 μM 프로피디움 요오다이드 (몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes) cat #P3566)를 30분 동안 첨가하여 핵을 염색하였다. 형광 플레이트를 아큐멘 익스플로러(ACUMEN EXPLORER™) [레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기 (488 nm 아르곤 이온 레이저 여기 및 다중 광전자증배관 검출 포함), 티티피 랩테크 리미티드(TTP LABTECH LTD)에서 제조됨]로 스캐닝하여 포스포히스톤 H3, DNA 함량 및 DNA 응축에 의해 측정되는 유사분열기 세포를 측정하였다. 영상 분석은 다양한 부분집단에서 세포를 확인하기 위한 세포 형광 신호에 기반하였다. pHH3(S10) 양성 세포는 역치보다 큰 500 내지 530 nm에서의 평균 강도에 의해 확인되었다. 프로피디움 요오다이드/DNA로부터의 655 내지 705 nm에서의 총 강도를 사용하여 개별 세포 (2N 내지 4N의 DNA 함량을 갖는 세포) 및 세포 주기에서의 부분집단 (2N 세포, 4N 세포)을 확인하였다. 575 내지 640 nm에서의 피크 강도를 사용하여, 4N 세포 중에서 유사분열기 세포를 확인하기 위한 마커로서 사용되는 DNA 응축을 확인하였다. 분석 결과는 각각 확인된 부분집단의 백분율, ％pHH3, ％2N, ％4N, ％유사분열기 세포수 및 ％총 세포수이었다. EC₅₀은 액티비티 베이스™를 사용하여 각 결과에 대해 4 파라미터 로지스틱에 피팅시킨 곡선에 의해 측정하였다. pHH3(s10), DNA 함량 및 유사분열에 대하여 얻어진 EC₅₀은 각각 2.6, 2.4 및 2.5의 MSR을 가졌다. 예를 들어, 실시예 4는 pHH3(s10) EC₅₀ = 24 nM (n = 1), DNA 함량 EC₅₀ = 35 nM (n = 2) 및 유사분열 EC₅₀ = 22 nM (n = 1)을 가졌다.

항증식성 분석

세포 증식에 대한 화합물의 효과는 당업계에 잘 공지된 세포 및 세포 증식 방법을 사용하여 측정할 수 있다 (문헌 [Robert C. Squatrito et al., Gynecological Oncology, 58, 101-105, (1995)]). 예를 들어, 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 얻을 수 있는 HCT116 세포를 96-웰 플레이트에 약 2000개의 세포/ 웰로 시딩하고, 습윤화된 CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 부착시킬 수 있다. 20 내지 24시간의 인큐베이션에 이어, 하프-로그(half-log) 연속 희석된 화합물을 첨가하고, 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣었다. 적절한 노출 기간 (예를 들어, 72시간) 후에, 세포 증식을 잘 공지된 방법을 사용하여 평가하였다. 한 방법에서, 테트라졸륨 염, 예컨대 알라마르 블루(Alamar Blue™) 10 ㎕를 세포 플레이트에 첨가하였다. 염료에의 적절한 노출 후에, 형광도 (530 nm 여기, 580 nm 방출)를 측정하였다. 얻어진 IC₅₀은 3.1의 MSR을 가졌다. 예를 들어, 실시예 4는 44 nM (n = 3)의 IC₅₀을 가졌다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 다양한 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로 제형화된다. 가장 바람직하게는, 상기 조성물은 경구 투여용이다. 상기 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds., 19^th ed., Mack Publishing Co., 1995)]을 참조한다.

화학식 I의 화합물은 일반적으로 광범위한 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 1일 투여량은 통상적으로 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 약 20 mg, 바람직하게는 체중 1 kg 당 0.1 내지 20 mg의 범위 내에 있다. 일부 경우에서, 상기 범위의 하한보다 낮은 투여량 수준이 보다 적절할 수 있고, 반면 여타 경우에서는 보다 많은 용량이 어떠한 유해한 부작용도 초래하지 않으면서 이용될 수 있으므로, 상기 투여량 범위는 어떤 식으로든 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아니다. 실제로 투여되는 화합물의 양은 치료되는 증상, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물 또는 화합물들, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 환자 증후의 중증도를 비롯한 해당 상황에 비추어, 의사에 의해 결정될 것임을 알 것이다.

Claims (11)

1. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

   

   식 중,

   R¹은 아미노메틸, (C₁-C₃ 알킬)아미노메틸, 디(C₁-C₂ 알킬)아미노메틸, N-에틸-N-메틸-아미노메틸, 1-아미노에틸, 1-((C₁-C₂ 알킬)아미노)-에틸, 3,3,3-트리플루오로프로필아미노메틸, 에티닐, 2-히드록시-에톡시, 2-히드록시에틸아미노메틸, 2-시아노에틸아미노메틸, 모르폴린-4-일메틸, 메톡시메톡시메틸, 시클로프로필, 1-아제티디닐메틸, 1-피롤리디닐메틸 또는 1,3-디옥솔란-2-일이고;

   R²는 수소 또는 할로이고;

   R³은 수소 또는 할로이며;

   단, R²와 R³ 중 적어도 하나는 수소이고;

   R⁴는 수소, 메틸 또는 할로이고;

   ----는 존재하거나 또는 존재하지 않는 단일 결합이다.
2. 삭제
3. 제1항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 비-소세포 폐암, 구인두암, 식도암, 위암, 흑색종, 피부의 표피양 암종, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 직장결장암, 신경아교종, 아교모세포종, 갑상선 암종, 자궁경부암, 췌장암, 전립선암, 간모세포종 및 비-호지킨 림프종 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
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