KR101080288B1 - 전신-발현 프로모터 유케이1 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새로운 식물 전신-발현 프로모터 (constitutive promoter)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 애기장대 (Arabidopsis)로부터 유래한 프로모터 AtUK1, 그의 제조방법, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 식용 작물의 형질 개량에 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 전신-발현 프로모터는 외래 유전자를 발현 장소에 상관없이 발현할 수 있어 각종 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자 등의 전신-발현을 유도하거나 식량 작물에서 유용한 형질을 개량시킨 형질전환 식물을 개발하는 데 널리 사용될 수 있다.

전신-발현 프로모터 (constitutive promoter) UK1, 애기장대 (Arabidopsis), 식용 작물의 형질 개량

Description

전신-발현 프로모터 유케이1 {Constitutive promoter UK1}

본 발명은 새로운 식물 전신-발현 프로모터 (constitutive promoter)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 애기장대 (Arabidopsis)로부터 유래한 프로모터 UK1 및 그의 제조방법, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 그리고 이를 식용 작물의 형질 개량에 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 전신-발현 프로모터는 외래 유전자를 발현 장소에 상관없이 발현할 수 있어 각종 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자 등의 전신-발현을 유도하거나 식량 작물에서 유용한 형질을 개량시킨 형질전환 식물을 개발하는 데 널리 사용될 수 있다.

식물에서 외래 유전자를 전신-발현 또는 조직 특이적인 발현을 할 수 있는 형질전환 목적을 달성하는 데 사용되는 공지된 프로모터들은 그 기능에 따라서 다음과 같이 분류할 수 있다.

첫째, 전신-발현을 유도하는 프로모터를 들 수 있다. 이러한 식물 전신-발현 유도 프로모터로는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV: cauliflower mosaic virus) 의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 사용되고 있다. 또한 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 유전자 프로모터 및 옥수수 유비퀴틴 (ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근에는 벼 시토크롬 C 유전자 (OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용되고 있다 (대한민국 특허등록 제 10-0429335호). 이들은 주로 식물형질전환 기본 운반체 내에서 선발 마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 내재된다. 따라서 연구적인 측면에서는 목적 유전자의 식물체 내의 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.

둘째, 종자에 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이 종자 특이적 프로모터로는 벼의 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들이 대표적인 예이며 황금쌀 (golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린 (glutelin) 프로모터가 현재 외떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 데 많이 사용되고 있다. 또한 쌍떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴 (lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도하여 비타민 E 생성을 증진시키는 연구에서 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 등의 사례를 들 수 있고, 특히 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터의 종자 특이발현 유도는 이미 특허출원 (대한민국 특허출원 제 10-2006-0000783호)된 바 있다. 상기 종자 특이적 프로모터들은 주로 종자 자체가 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용된다.

셋째, 뿌리에 특이적으로 발현하는 프로모터를 들 수 있다. 이 뿌리 특이적 프로모터는 아직 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적인 발현이 확인된 바 있으며, 최근에는 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS)와 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이 발현을 유도하는 것이 보고되었다. 이외에도 이들 프로모터는 당근과 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도하는 것이 확인되어 특허 등록 (대한민국 등록번호 제10-0604186호, 제10-0604191호)된 바도 있었다. 이들 프로모터는 식량이나 식품, 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 뿌리작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용이 기대될 수 있다.

네째, 잎 등의 기타 조직에 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이 조직 특이 프로모터에는 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼와 옥수수 유래의 알비씨에스 (rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래의 괴경 특이 발현 유도 파타틴 (patatin) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스 (PDS: phytoene synthase) 프로모터, 그리고 배추꽃에서 화분 특이적 발현이 확인된 배추 유래 올레오신 (oleosin) 프로모터 등이 포함된다. 또한, 본 발명의 연구팀이 꽃의 웅성기관 융단조직 특이 BcA9 프로모터를 사용하여 세포에 독성을 갖는 Bt 단백질 유전자를 발현 유도시키고 이 로부터 웅성불임 작물을 개발하여 특허 등록한 바도 있었다 (대한민국 특허등록 제 10-0435143호).

이와 같이 다양한 목적에 따라 다양한 식물 유래의 프로모터들이 식물체의 각 조직에서 발견되어 보고되어 왔으며, 현재까지도 계속 개발이 진행되고 있는 중이다. 그러나 이미 상용화 되었거나 식물 연구자들 사이에 범용되는 프로모터의 종류는 대부분 상기에서 언급된 사례에 속하며, 개발자의 의도에 따라서 보다 정밀하게 유전자 발현의 장소를 조절할 수 있는 새로운 프로모터들이 앞으로도 계속 개발될 필요성이 있다.

이에 본 발명자들은 새로운 식물 전신-발현 프로모터 (constitutive promoter)를 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 애기장대 (Arabidopsis)로부터 유래한 프로모터 UK1이 전신-발현되는 것을 확인하고 서열번호 6 및 서열번호 7의 올리고 뉴클레오타이드들을 프라이머로 사용하여 상기 프로모터 UK1 부위를 증폭시킨 다음 이를 삽입한 식물 형질전환용 발현 벡터들을 제작하고 이를 애기장대에 형질전환시키며 이로부터 GUS (β-glucuronidase) 청색발색 및 GUS 전사체 측정 등으로 전신-발현 정도를 조사하여 상기 전신-발현 프로모터 UK1이 외래 유전자를 발현 장소에 상관없이 발현할 수 있는 점을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명은 새로운 식물 전신-발현 프로모터, 그의 제조방법 및 이를 식물형질 개량에 사용하는 용도를 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 이루어진 식물 전신-발현 프로모터 UK1을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물 전신-발현 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1 (수탁번호: KACC 95084P)을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6 및 서열번호 7의 올리고 뉴클레오타이드들을 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응을 실시하여 상기 식물 전신-발현 프로모터 UK1을 얻는 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전신-발현 프로모터 UK1을 사용하여 목적 유전자를 발현하는 식물 발현 벡터를 제작하고 이로 식물 운반체를 형질전환시킨 다음 이를 식물체에 도입하는 과정으로 목적 단백질을 식물체 내에서 전신적으로 (constitutively) 발현시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 새로운 식물 전신-발현 프로모터를 제공한다.

구체적으로 본 발명은 서열번호 1로 이루어진 식물 프로모터 UK1을 제공한다. 상기 식물 전신-발현 프로모터는 애기장대 속 (Arabidopsis sp.)으로부터 유래하는 것을 모두 포함할 수 있으나, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)로부터 유래하는 것이 바람직하다.

상기 전신-발현 프로모터는 애기장대에서 그 기능이 밝혀져 있지 않은 새로운 유전자의 프로모터이고, 또한 상기 전신-발현 프로모터는 유전자의 코딩 부위 상류 1,897 bp 에 해당하는 것이 바람직하다. 상기 서열번호 1의 염기서열은 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형 서열을 포함할 수 있으나, 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 전신-발현 프로모터를 증폭하는 데 사용되는 서열번호 6 및 서열번호 7의 올리고 뉴클레오티드로 이루어진 한 쌍의 프라이머를 제공한다. 상기 프라이머들은 상기 전신- 발현 프로모터인 UK1을 특이적으로 증폭하는 각각 32bp로 이루어지는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성되며, 상기 프라이머는 당업자에게 공지된 올리고 뉴클레오티드의 합성법에 따라 제조될 수 있으며, 상업적으로 합성하여 사용할 수도 있다. 상기 프라이머는 개별 염기서열의 일부에서 변이가 일어난 변형서열을 포함할 수 있다. 상기 변형서열은 변이가 이루어진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과와 미변형서열로 이루어진 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행한 결과가 실질적으로 동일한 범위 내에서의 결실, 치환 또는 부가된 서열을 의미한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6 및 서열번호 7의 올리고 뉴클레오타이드들을 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응을 실시하여 상기 식물 전신-발현 프로모터 UK1을 얻는 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물 전신-발현 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡 터를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 가지는 상기 식물 전신-발현 프로모터를 포함하는 식물 형질전환용 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1을 제공한다.

상기 식물 형질전환용 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1은 2008년 07월 04일자로 농업생명공학연구원 부설 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호: KACC 95084P).

상기 발현 벡터에는 상기 서열번호 1의 전신-발현 프로모터 이외에도 제초제 저항성 유전자 및/또는 리포터 유전자를 포함할 수 있고, 상기 제초제 저항성 유전자로는 Bar 유전자 등을 포함하는 것이 바람직하고 상기 리포터 유전자로는 Egfp:gus 유전자 등을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 식물 전신-발현 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 상기 서열번호 1의 전신-발현 프로모터 서열을 포함하는 식물 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1으로 형질전환된 식물체를 제공하고, 상기 식물체는 애기장대를 포함하여 당근, 고구마 및 무 등의 근채류 작물, 인삼 및 더덕 등의 약용식물, 옥수수 등의 사료작물 그리고 벼 등의 주곡작물 등을 포함할 수 있다. 이외에도 상기 식물체는 다양한 쌍자엽 식물을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 식물 전신-발현 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체의 종자를 제공한다. 상기 식물체의 종자는 애기장대를 포함하여 당근, 고구마 및 무 등의 근채류 작물, 인삼 및 더덕 등의 약용식물, 옥수수 등의 사료작물 그리고 벼 등의 주곡작물 등의 종자를 포함할 수 있다. 이외에도 상기 식물체의 종자는 다양한 쌍자엽 식물의 종자를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 전신-발현 프로모터를 사용하여 목적 유전자를 발현하는 식물 발현 벡터를 제작하고 이로 식물 운반체를 형질전환시킨 다음 이를 식물체에 도입하는 과정으로 목적 단백질을 식물체 내에서 전신적으로 (constitutively) 발현시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 전신-발현 프로모터를 사용하여 발현시킬 수 있는 유전자로는 모든 식물 유전자들이 포함될 수 있으나, 특히 제초제 저항성 유전자, 마커 유전자 및 리포터 유전자 등을 포함하는 것이 바람직하며, 식량 작물에서 형질을 개량시킬 수 있는 유용한 유전자 등을 포함하는 것은 더욱 바람직하다. 이외에도 프로모터의 성능을 비교하는 등의 연구적 목적으로도 다양하게 사용될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 새로운 식물 전신-발현 프로모터 (constitutive promoter)로서 애기장대 (Arabidopsis)로부터 유래한 프로모터 UK1, 그의 제조방법, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 식용 작물의 형질 개량에 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 전신-발현 프로모터는 외래 유전자를 발현 장소에 상관없이 발현할 수 있어 각종 제초제 저항성 유전자, 그 외 마커 유전자 및 리포터 유전자 등의 전신-발현을 유도하거나 식량 작물에서 유용한 형질을 개량시킨 형질전환 식물을 개발하는 데 널리 사용될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예들에서 특별히 언급되지 않은 일반적인 실험방법들은 샘브룩 등의 분자유전학 클로닝 서적을 참조하였다 (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition, 1989").

실시예 1. 애기장대로부터 유래한 UK1 유전자의 발현 양상 분석

본 발명에서는 애기장대 (Arabidopsis)로부터 유래한 그 기능이 밝혀지지 않은유전자 UK1의 발현 양상을 조사하기 위하여, 애기장대 뿌리, 잎, 줄기 및 꽃과 발달 과정 중에 있는 종자를 포함한 꼬투리로부터 전체 RNA (total RNA)를 분리하고 역전사효소를 이용한 중합효소연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 분석하였다. 전체 RNA 분리 과정을 상세히 설명하면 다음과 같다. 약 1g의 각 시료를 액체질소를 이용하여 막자사발로 분쇄하고 1.5 ml 튜브에 옮긴 다음 각 튜브에 500 ㎕의 RNA 추출 완충액 (50mM 소듐 아세테이트 (sodium acetate pH 5.5), 150mM LiCl, 5mM EDTA, 0.5% SDS)과 500㎕ 페놀을 첨가하여 혼합하였다. 이 혼합액은 65℃에서 10분 동안 처리하고 상온에서 15분 동안 교반기 (rotary shaker)를 이용해 섞어준 다음 4℃에서 원심분리(10,000rpm, 10 분)하였다. 이로부터 얻은 상등액 층은 조심스럽게 새 튜브로 옮기고 클로로포름 500㎕를 첨가하여 잘 섞어준 다음 다시 원심분리하여 상등액을 취하였다. 여기에 0.6배 부피의 8M 리튬 클로라이드 (LiCl)를 첨가하고 -20℃에 2시간 이상 보관한 다음 다시 4℃, 12,000rpm에서 20분간 원심분리하고 RNA 침전물을 4M LiCl와 80% 에탄올로 각각 한차례씩 씻어준 후 수득한 최종 RNA 침전물을 50㎕의 증류수에 녹였다.

여기서 얻은 RNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기 (UV spectrophotometer)를 이용하여 A₂₆₀/A₂₈₀를 측정하여 정량한 후, 전체 RNA 5㎍을 주형으로 50 uM oligo dT 프라이머를 이용해 50℃에서 50분, 85℃에서 5분 처리하고 얼음에서 식혔다. 여기에 다시 RNase H 를 1㎕를 첨가하고 37℃에서 20분간 처리하여 cDNA를 합성 (10X RT 완충용액, 25mM MgCl_2, 0.1M DTT, RNase OUT, SuperScript^TM RT)하였다. 이와 같이 얻은 합성된 cDNA를 주형으로 하고 상기 UK1 유전자에 대한 특이 프라이머 세트, 즉 서열번호 2의 UK1-F 프라이머와 서열번호 3의 UK1-R 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 또한 사용된 RNA의 상대적인 량을 균일하게 맞추기 위하여 애기장대 연장요소 1α (elongation factor 1a)에 대한 프라이머 세트인 서열번호 4의 EF1α-F 프라이머와 서열번호 5의 EF1α-R을 동시에 사용하여 95℃에서 7분간 변성, 95 ℃에서 30초간 반응, 60 ℃에서 30초간 어닐링반응, 72 ℃에서 30초간의 중합반응의 일련의 반응을 40회 실시한 후 72 ℃에서 7분간의 중합반응 조건 하에서 각각의 PCR 반응을 수행하였다.

상기 역전사 PCR 반응의 결과, 애기장대로부터 유래한 UK1 유전자의 전사체가 잎, 줄기, 꽃, 뿌리 및 종자를 포함한 꼬투리 조직에서 모두 전신-발현되는 것으로 검출 확인되었다. 이 때 애기장대 연장요소 1α에 특이적인 프라이머를 이용하여 사용된 RNA의 상대적인 량이 균일한 것을 증명하였다.

도 1은 애기장대의 뿌리, 잎, 줄기, 꽃 및 종자 조직에서 각각 분리한 전체 RNA와 특이 프라이머를 이용하여 증폭시킨 본 발명의 AtUK1 프로모터 유전자를 양성 대조구와 비교하여 나타낸 것이다. 이 때 M은 1Kb 플러스 DNA 사다리 마커이고, AtUK1은 애기장대 프로모터 유전자이며 EF1α는 애기장대 연장요소 1α (elongation factor 1α) 유전자이다.

실시예 2. 식물 전신-발현 프로모터 UK1을 포함하는 식물 발현 벡터의 제작

본 발명에서는 애기장대의 여러 조직에 따라 발현 양상을 상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 조사하고, 전신-발현을 보이는 단백질에 해당하는 UK1 유전자를 이미 공개되어 있는 애기장대 전체 염기서열로부터 유전자 검색하였다. 또한 상기 UK1 유전자의 개시코돈 상위에 TATA 박스 등을 포함하는 약 1.89kb 영역 (서열번호 1)을 분리하고 벨기에 겐트대학으로부터 구입한 게이트웨이 운반체 pBGWFS7을 이용하여 PAtUK1 프로모터 기능 분석용 운반체를 제작하였다. 형질전환 애기장대 식물체의 잎 조직 소량을 에펜도르프 튜브에 넣고 게놈 DNA 분리 키트 (Genomic DNA Purification Kit; I.J.BIO DNA System)을 이용하여 분리 정제하였다. DNA 용출액 은 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A₂₆₀/A₂₈₀를 측정하여 정량하였다. 애기장대로부터 분리한 게놈 DNA로부터 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아에 특이적인 재조합 염기서열 부위를 일부 포함하면서 PAtUK1을 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 하기 표 1에 나타난 바와 같은 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머 세트 (PUK1-B1 프라이머 및 PUK2-B2 프라이머)를 제작하였다. 이 프라이머 세트를 사용하여 유전자 증폭 반응 (PCR : polymerase chain reaction)을 통해 약 1.89kb의 프로모터 부위를 다시 분리하였다.

프라이머	염기서열
PUK1-B1	5'-AAAAAGCAGGCTTCCTTCAAAGCAACTCTCAT-3'
PUK1-B2	5'-AGAAAGCTGGGTAAAACGATCAACCACGTACT-3'

또한 상기 PAtUK1 프로모터 부위의 활성을 쌍자엽 식물의 형질전환에 주로 사용되는 P35S 프로모터의 활성과 비교하기 위하여, 박테리아에 특이적인 핵산서열 부위를 일부 포함하면서 P35S 프로모터를 증폭할 수 있도록 설계된 서열번호 8의 프라이머 35S-F 및 서열번호 9의 프라이머 35S-R 를 제작하여 P35S 부위를 분리하였다. 그 다음 증폭된 PCR 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아에 특이적인 핵산서열 부위 전체를 포함하는 서열번호 10의 어댑터 프라이머 B1 및 서열번호 11의 어댑터 프라이머 B2를 사용하여 각각 다시 PCR을 실시하여 증폭시켰다.

또한, 상기 이차적으로 증폭된 PCR 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지에 특이적인 핵산서열 부위를 포함하는 클로닝 벡터 pDONR221를 사용하여 BP 재조합반응을 거쳐 재조합 클로닝 벡터 pDONR-PAtUK1 및 pDONR-P35S로 제작되었다. 이와 같이 서브 클로닝된 두 종류의 이 운반체들은 최종적으로 식물형질전환용 운반체를 제작하기 위해 Egfp 유전자와 Gus 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 식물 발현 벡터 pBGWFS7를 사용하고 LR 재조합반응을 거쳐 최종적인 재조합 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1 및 pBGWFS7-P35S 로 완성되었다. 이 때, 기본 운반체 (binary vector)로 사용된 식물 발현 벡터 pBGWFS7는 미생물 선발을 위한 스펙티노마이신 (spectinomycin) 저항성 유전자를 가지며, 식물체 선발인자로 제초제 저항성 Bar 유전자를 포함하고 있다. 이와 같이 제작된 형질전환용 운반체들은 액체질소를 이용한 직접적인 아그로박테리아 형질전환방법 (Holster 등의 freeze-thaw method, 1978)에 따라 아그로박테리아 튜메파시엔스 GV3101 균주에 형질전환시킨 후, 안 등의 알카리 방법 (alkaline lysis)에 근거한 아그로박테리아 급속 선발 (quick-screen)방법을 사용하여 아그로박테리아 내로 도입시켰다.

도 2는 본 발명의 식물 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1의 유전자 지도를 모식적으로 나타낸 것이다. 이 때 LB는 좌측면, Tnos는 nos 터미네이터, BAR는 제초제 저항성 유전자, Pnos는 nos 프로모터, PAtUK1는 본 발명의 프로모터, P35S는 꽃양배추바이러스 35S 프로모터, EGfp는 녹색형광단백질 (green fluorescent protein) 유전자, GUS는 청색발색 β-글루쿠로니다제 유전자, T35S는 꽃양배추바이러스 35S 터미네이터, RB는 우측면을 나타낸다. 도 3은 대조구 식물 발현 벡터 pBGWFS7-P35S의 유전자 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.

실시예 3. 애기장대의 형질전환 및 배양

본 발명에서는 상기 실시예 2에서 제작한 식물 형질전환용 발현 벡터들을 사용하여 식물체로서 애기장대를 다음과 같이 형질전환시켰다. 먼저 파종하여 22℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육된 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia) 식물체의 일차 추대를 제거하고 최소한 3 내지 4개의 이차 추대를 유도하였다. 그 다음 식물 형질전환 운반체가 보유된 아그로박테리아 배양액을 5% 슈크로스 (sucrose)와 2,500ppm 트윈 20이 함유된 용액에 OD 0.8 정도로 희석하고 이로부터 얻은 현탁액을 꽃봉우리에 분사하여 아그로박테리아를 감염시켰다. 이 감염된 아그로박테리아를 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 하룻밤 동안 배양한 후 22℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 4 내지 5일간 배양하고 상기와 동일한 방법으로 배양 및 희석한 아그로박테리아를 재차 화기조직에 분사하였다. 그 다음 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 하룻밤동안 배양한 후 22℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 꼬투리 조직 (silique)이 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 3 내지 5주간 생육시킨 후 채종하였다. 채종된 종자는 다시 파종하여 생육 10일째 일차, 17일째 이차로 0.3% 바스타를 살포하고 이로부터 T1세대의 형질전환체를 선발하였다. T1 형질전환 식물체는 22℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 꼬투리 조직(silique)이 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 2달간 생육시킨 후 T2 종자를 채종하였다.

실시예 4. 형질전환 애기장대에서의 GUS 청색발색 반응 분석

본 발명에서는 상기 형질전환 애기장대에서의 전신-발현 여부를 GUS 청색발색 반응으로 다음과 같이 조사하였다. 먼저 본 발명의 PAtUK1 프로모터 및 P35S 프로모터로 형질전환된 T2 종자를 파종하여 생육 10일째 1차, 17일째 2차로 0.3% 바스타를 살포하여 선발된 형질전환 애기장대 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 및 꼬투리 등 여러 조직으로부터 생육 단계별로 청색발색 반응을 관찰하였다. 대조구로 비형질전환 애기장대 식물체는 바스타를 처리하지 않고 발아시켰다. 파종 후 7일, 21일 및 42일이 지난 형질전환 애기장대 식물체를 GUS 분석 완충용액 [GUS assay buffer; Sol. I: X-gluc (cyslohexyl ammonium salt) 20mM, Sol. II : NaH₂PO₄ H₂O 100mM, NaEDTA 10mM, Triton-X-100 0.1%, pH7.5]에 침지하고 37℃에서 24시간 동안 처리한 다음 70% 에탄올을 처리하여 클로로필 (chlorophyll)을 제거하였다. 식물체는 현미경 (light microscope)을 이용하거나 육안으로 관찰하였다.

그 결과 파종 7일째의 유묘단계부터 P35S 및 PAtUK1 형질전환체는 전신에 GUS 청색발색이 관찰된 반면, 비형질전환 애기장대에서는 GUS 청색발색이 전혀 보이지 않았다. 또한 21일 및 42일째의 식물체에서도 비형질전환 애기장대에서는 GUS 청색발색이 전혀 보이지 않은 반면 P35S 및 PAtUK1 형질전환체는 GUS 청색발색이 식물체 전신에서 관찰되어, PAtUK1 프로모터는 P35S 프로모터와 마찬가지로 전신- 발현 프로모터인 것을 확인할 수 있었다.

도 4는 본 발명의 식물 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1으로 형질전환된 애기장대의 유묘 및 잎 발달 과정 중의 청색발색 반응을 관찰하여 나타낸 것이다. 이 때 Col0는 비형질전환 애기장대이고, P35S::GUS는 대조구 형질전환 애기장대이며 PAtUK1::GUS는 상기 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1으로 형질전환된 애기장대이고, 7D은 파종 후 7일째 되는 애기장대 유묘이고 21D는 파종 후 21일째 되는 애기장대이며 42D는 파종 후 42일째 되는 애기장대이다.

실시예 5. 형질전환 애기장대에서의 GUS 청색발색 정량 분석

본 발명에서는 상기 형질전환 애기장대에서의 전신-발현 정도를 GUS 청색발색 정량분석으로 다음과 같이 조사하였다. 먼저 본 발명의 프로모터의 GUS 청색발색 발현량을 측정하기 위하여, PAtUK1 프로모터를 이용하여 형질전환된 애기장대 T2세대 2계통과 대조구로 P35S 프로모터로 형질전환된 애기장대와 비형질전환 애기장대의 잎, 뿌리, 줄기, 꼬투리와 꽃에서 전체 단백질을 각각 분리하였다. 전체 단백질을 분리하기 위해 액체질소를 이용하여 막자사발로 분쇄한 약 50 mg의 조직별 시료를 1.5 ml 튜브에 옮긴 다음 각 튜브에 100 ㎕의 단백질 추출 완충액 (50mM 소듐 포스페이트, pH 7.0, 10mM 디티오트레이톨 (Dithiothreitol; DTT), 1mM 디소듐EDTA, 0.1% SDS, 0.1% 트리톤 X-100)을 넣고 격렬하게 혼합하였다. 혼합액은 4℃, 15,000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 새 튜브에 옮긴 후 이 중 50㎕를 취하여 37℃로 맞춰진 50㎕의 분석용액 [1.2mM MUGluc, 10.0mM β-머캅토에탄올 (β-mercaptoethanol in 1X 반응완충용액), FluorAce β-글루쿠로니다제 리포터 분석키트 (β-glucuronidase reporter assay kit, Bio-Rad)]과 혼합하고 이를 37℃ 물수조에서 30분간 반응시켰다. 여기에 1x 반응 정지 완충용액 (Stop buffer)를 각 샘플에 100㎕씩 잘 섞어주고 형광광도계 (여기 필터 355nm, 방출 필터 460nm)를 이용하여 GUS 활성을 정량하였다. 도 5는 본 발명의 PAtUK1 프로모터가 발현하는 청색발색 단백질을 정량하여 양성대조구과 비교하여 나타낸 것이다. 그 결과, 본 발명의 PAtUK1 프로모터는 P35S 프로모터와 거의 동일하거나 좀 더 증가한 정도로 외래 유전자를 발현할 수 있는 전신-발현 프로모터인 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. RT-PCR 반응으로 형질전환 애기장대에서의 전신-발현 조사

본 발명에서는 형질전환 애기장대에서 진신-발현 여부를 역전사효소-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 실시하여 다음과 같이 조사하였다. 먼저 형질전환 T2 종자를 파종하여 생육 10일째 1차, 17일째 2차로 0.3% 바스타를 살포하고 이로부터 선발된 형질전환 애기장대 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 및 꼬투리 (개화 후 3주째의 종자 포함) 등 여러 조직을 채집하였다. 그 다음 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 추출한 전체 RNA 약 10㎍ 주형으로 50uM oligo dT 프라이머를 이용해 50℃에서 50분, 85℃에서 5분 처리하고 얼음에서 식힌 후 여기에 다시 RNase H 를 1㎕를 첨가하고 37℃에서 20분간 처리하여 cDNA를 합성(10X RT 완충용액, 25mM MgCl_2, 0.1M DTT, RNase OUT, SuperScript^TM RT)하였다. 이 합성된 cDNA를 주형으로 청색발색 유전자인 GUS 특이 프라이머 세트인 서열번호 12의 프라이머 GUS-F 프라이머 및 서열번호 13의 프라이머 GUS-R 프라이머 그리고 사용된 RNA의 상대적인 량이 균일한 것을 증명하기 위한 애기장대 연장요소 1a 프라이머 세트인 서열번호 4의 프라이머 EF1α-F 및 서열번호 5의 프라이머 EF1α-R를 이용하여 95℃에서 7분간 변성, 95 ℃에서 30초간 반응, 60 ℃에서 30초간 어닐링반응, 72 ℃에서 21초간의 중합반응의 일련의 반응을 40회 실시한 후 72 ℃에서 7분간의 조건 하에서 각각 PCR 반응을 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 PAtUK1 프로모터로 형질전환된 애기장대의 잎, 줄기, 꽃, 뿌리 및 종자꼬투리 전신 조직에서 청색발색 단백질 유전자 GUS의 전사체가 뚜렷이 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 이 때 애기장대 연장요소 EF1α를 이용하여 사용된 RNA의 상대적인 량이 균일한 것을 입증하였다.

도 6은 본 발명의 식물 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1으로 형질전환된 애기장대의 각 조직에서 추출한 전체 RNA를 이용하여 역전사반응 후 청색발색 단백질 유전자 GUS와 양성 대조구로 애기장대 내재유전자인 연장인자 1α 유전자를 각각 특이적으로 증폭하는 프라이머로 증폭된 유전자 밴드를 보여주는 전기영동 사진이다. 이 때 M은 1Kb 플러스 DNA 사다리 마커이고, GUS는 청색발색의 베타-글루쿠로니다제 (β-glucuronidase) 유전자이며, EF1a는 애기장대 연장요소 1α 유전자이고, 1: 비형질전환 애기장대의 잎, 2: 비형질전환 애기장대의 꽃, 3: 비형질전환 애기장대의 줄기, 4: 비형질전환 애기장대의 종자, 5: 비형질전환 애기장대의 뿌리, 6: PAtUK1으로 형질전환된 애기장대의 잎, 7: PAtUK1으로 형질전환된 애기장대의 꽃, 8: PAtUK1으로 형질전환된 애기장대의 줄기, 9: PAtUK1으로 형질전환된 애기장대의 종자, 10: PAtUK1으로 형질전환된 애기장대의 뿌리, 11: P35S로 형질전환된 애기장대의 잎, 12: P35S로 형질전환된 애기장대의 꽃, 13: P35S로 형질전환된 애기장대의 줄기, 14: P35S로 형질전환된 애기장대의 종자,15: P35S로 형질전환된 애기장대의 뿌리를 나타낸 것이다.

[서열목록]

서열번호 1

TCCTTCAAAG CAACTCTCAT ATCTTCAAAC TTGACACAAT CACCATACAA AAACTCACCA AGTTTCTTCA ACTCAACATC TTCCAAATCA TCAGAAAACG

GTTTAATCGG AAACGCATTC TCCGGTTGAA GCGCGTACGA GTTCGGATTA TCATCAACAA TCACCACGCG CCTCAAATCT CTCATCACAA ACCCTAAATC

CTTCACTAAC CTCCCATCAA TTTCGCTACA CGCGTCTCTG TAAAAGCTAC GCGATATCAC GCGCCGCTCT GGATCCAATT TATCGAGCAC TAACGACGCG

TACTCTCTCA ATCCCGCCGT GAAAACAACG ATCTGGTACT TTTCTCCGAT CTTCTTCAAA AACTCGTCGA CTCCTGGCCG TTTGATCACG AAAAACGTTA

AGATCTGACC GTCGATTTTG GGATTCACGA CGAAATCATA CGGTACTTCT GGTTTCTCCA TTGATGAATG AACAAGAGTT TCGTCTAGAT CTAACACGAT

CGTCTTCTTC GTCTCGTCGA ATGATTTACC AGATCTTTCG TGAAACAATG AATACGGAGA ATTCTGAAAA TCTTCGCGAG GTTTGAGGAT TTTGAATCCT

TTTGTTGCGT GACGAGAAAA CAAACAGAGA AAAGTTCGAT GACATCTGTA GATCGATTTG TTGATGGTGG CGATTACGGT GGTTGTGGCC GGAGACGGTG

AGCATCCGAT CTGAGATTTC CGGTGACGGC GGAGGTAGTT ACGTTGGTGA CGGCTGATGG ATTTTGTCGT TTTCTTGAGT ATGAGTTTCG TCGCCATTGA

AGAAGAAAGA GAGAGATTAG AGTTTGCGAG ATTTTTGGGA GAGAGAGGAG AGTGATGATG TTGTATTTAA ATTAGGATCG GTGTAACGGT CATGTGTTTA

TTTTAGGTTC GGAATCCGAA GCAAAGCTTG ATTCGGAAGC AGTTTTTTTT TTTTTTTAAA GTTTGGACCT ACACGGAGTT TACGTTGTAT TATTACCGTT

GGGAATTCTA TATTAATCTC GAGATTCATT TCCTAAATTA AGAAACAAAA TTCTATATAT AACACAGAAT AGACAAATAT TATATATATA TATATATTTA

TCTTATTATA TAAATTGTGA ATCATAAAAG GTGTTCAAAG AACAGACAAA ATGATCTAAT ATATGATATG AGTTCTTAAT AGTTTCTAAT TTTTAATTAC

ATAAATTCTA TTTGTAGTTG TAAATTTAAT GTGACAAAAT ATTGTCAAAG TGTTCATAAT TCATATTCAA AACTATTGTA TTGGAGTGAA ACGACTTGAA

ACAAAACAAA ACAAAGTCCT ACATAACATC TATAAAACTT TATCTAAAAA ACAATAAATA AAGTTCACAA AAATTTAATT TATATCAAAG CGAACCGCTT

TAATTATGTT GCTTGGATGT CATAACTTAA CACATTTTGA TGTGGAGAAG GAAAAAAAAA TAGATTTTGA TAGTTCAATT AATATTTTAA TAATGAAATA

AAACTTGACT TGACATGAAA AAAATCGAAA CTTAGATAAA TCATAAAACC CGGCCCGTAT ATAGATTTTT TTTGAAAAAG ACTATAACGA TCTTTTTTTT

TTCTATGAAG ATTATACAGA GTCCAACCAA ATTCAAGAAT CTCAATTATA AGTGCCAAGT GGCCAAAGGT AATCACCATC ATTAACATAT CCACGTGTCA

TCCACAAAGC TCAATCTCAA TATTTCTCGC CACATAACCA CAAACAACGC AATGACGTGT CCTTCTCAAA TCATCCACGT CACATTTTGC TCATGCAGCA

ATGACACCAA ACACAATCAC ATCCCATATT TATAATAACA CACAAAAGAA AGAAAAGATA CATAAAATTT GTATAATAGT ACGTGGTTGA TCGTTTT

서열번호 2

5'-AGTATGGAATCTCGACGGAATCTT-3'

서열번호 3

5'-ATTTGTTTACGTTGAAGGTGGTTAT-3'

서열번호 4

5'-GTTTCACATTAACATTGTGGTCATT-3'

서열번호 5

5'-GAGGTACCAGTAATCATGTTCTTG-3'

서열번호 6

5'-AAAAAGCAGGCTTCCTTCAAAGCAACTCTCAT-3'

서열번호 7

5'-AGAAAGCTGGGTAAAACGATCAACCACGTACT-3'

서열번호 8

5'-AAAAAGCAGGCTGGTCCCCAGATTAGCCT-3'

서열번호 9

5'-AGAAAGCTGGGTCCCGGGGATCCTCTAGA-3'

서열번호 10

5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'

서열번호 11

5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'

서열번호 12

5'-ACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGC-3'

서열번호 13

5'-CTCCCTGCTGCGGTTTTTCA-3'

도 1은 애기장대의 뿌리, 잎, 줄기, 꽃 및 종자 조직에서 각각 분리한 전체 RNA와 특이 프라이머를 이용하여 증폭시킨 본 발명의 AtUK1 프로모터 유전자를 양성 대조구와 비교하여 나타낸 것이다.

M: 1Kb 플러스 DNA 사다리 마커; AtUK1: 애기장대 프로모터 유전자; 및 EF1α: 애기장대 연장요소 1α 유전자.

도 2는 본 발명의 식물 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1의 유전자 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.

LB: 좌측면; Tnos: nos 터미네이터; BAR: 제초제 저항성 유전자; Pnos: nos 프로모터; PAtUK1: 본 발명의 프로모터; P35S: 꽃양배추바이러스 35S 프로모터; EGfp: 녹색형광단백질 (green fluorescent protein) 유전자; GUS: 청색발색 β-글루쿠로니다제 유전자; 및 T35S: 꽃양배추바이러스 35S 터미네이터; RB: 우측면.

도 3은 대조구 식물 발현 벡터 pBGWFS7-P35S의 유전자 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 식물 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1으로 형질전환된 애기장대의 유묘 및 잎 발달 과정 중의 청색발색 반응을 관찰하여 나타낸 것이다.

Col0: 비형질전환 애기장대; P35S::GUS: 대조구 형질전환 애기장대; PAtUK1::GUS: pBGWFS7-PAtUK1으로 형질전환된 애기장대; 7D: 파종 후 7일째 애기장대 유묘; 21D: 파종 후 21일째 애기장대; 42D: 파종 후 42일째 애기장대.

도 5는 본 발명의 PAtUK1 프로모터가 발현하는 청색발색 단백질을 정량하여 양성대조구과 비교하여 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 식물 발현 벡터 pBGWFS7-PAtUK1으로 형질전환된 애기장대의 각 조직에서 분리한 전체 RNA와 특이 프라이머를 이용하여 증폭시킨 본 발명의 프로모터 유전자를 양성 대조구 및 GUS 유전자와 비교하여 나타낸 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Constitutive promoter UK1 <130> PA080072 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1897 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 tccttcaaag caactctcat atcttcaaac ttgacacaat caccatacaa aaactcacca 60 agtttcttca actcaacatc ttccaaatca tcagaaaacg gtttaatcgg aaacgcattc 120 tccggttgaa gcgcgtacga gttcggatta tcatcaacaa tcaccacgcg cctcaaatct 180 ctcatcacaa accctaaatc cttcactaac ctcccatcaa tttcgctaca cgcgtctctg 240 taaaagctac gcgatatcac gcgccgctct ggatccaatt tatcgagcac taacgacgcg 300 tactctctca atcccgccgt gaaaacaacg atctggtact tttctccgat cttcttcaaa 360 aactcgtcga ctcctggccg tttgatcacg aaaaacgtta agatctgacc gtcgattttg 420 ggattcacga cgaaatcata cggtacttct ggtttctcca ttgatgaatg aacaagagtt 480 tcgtctagat ctaacacgat cgtcttcttc gtctcgtcga atgatttacc agatctttcg 540 tgaaacaatg aatacggaga attctgaaaa tcttcgcgag gtttgaggat tttgaatcct 600 tttgttgcgt gacgagaaaa caaacagaga aaagttcgat gacatctgta gatcgatttg 660 ttgatggtgg cgattacggt ggttgtggcc ggagacggtg agcatccgat ctgagatttc 720 cggtgacggc ggaggtagtt acgttggtga cggctgatgg attttgtcgt tttcttgagt 780 atgagtttcg tcgccattga agaagaaaga gagagattag agtttgcgag atttttggga 840 gagagaggag agtgatgatg ttgtatttaa attaggatcg gtgtaacggt catgtgttta 900 ttttaggttc ggaatccgaa gcaaagcttg attcggaagc agtttttttt tttttttaaa 960 gtttggacct acacggagtt tacgttgtat tattaccgtt gggaattcta tattaatctc 1020 gagattcatt tcctaaatta agaaacaaaa ttctatatat aacacagaat agacaaatat 1080 tatatatata tatatattta tcttattata taaattgtga atcataaaag gtgttcaaag 1140 aacagacaaa atgatctaat atatgatatg agttcttaat agtttctaat ttttaattac 1200 ataaattcta tttgtagttg taaatttaat gtgacaaaat attgtcaaag tgttcataat 1260 tcatattcaa aactattgta ttggagtgaa acgacttgaa acaaaacaaa acaaagtcct 1320 acataacatc tataaaactt tatctaaaaa acaataaata aagttcacaa aaatttaatt 1380 tatatcaaag cgaaccgctt taattatgtt gcttggatgt cataacttaa cacattttga 1440 tgtggagaag gaaaaaaaaa tagattttga tagttcaatt aatattttaa taatgaaata 1500 aaacttgact tgacatgaaa aaaatcgaaa cttagataaa tcataaaacc cggcccgtat 1560 atagattttt tttgaaaaag actataacga tctttttttt ttctatgaag attatacaga 1620 gtccaaccaa attcaagaat ctcaattata agtgccaagt ggccaaaggt aatcaccatc 1680 attaacatat ccacgtgtca tccacaaagc tcaatctcaa tatttctcgc cacataacca 1740 caaacaacgc aatgacgtgt ccttctcaaa tcatccacgt cacattttgc tcatgcagca 1800 atgacaccaa acacaatcac atcccatatt tataataaca cacaaaagaa agaaaagata 1860 cataaaattt gtataatagt acgtggttga tcgtttt 1897 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 agtatggaat ctcgacggaa tctt 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 atttgtttac gttgaaggtg gttat 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 gtttcacatt aacattgtgg tcatt 25 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 5 gaggtaccag taatcatgtt cttg 24 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 6 aaaaagcagg cttccttcaa agcaactctc at 32 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 7 agaaagctgg gtaaaacgat caaccacgta ct 32 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 8 aaaaagcagg ctggtcccca gattagcct 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 9 agaaagctgg gtcccgggga tcctctaga 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 10 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 11 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 12 acctgcgtca atgtaatgtt ctgc 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 13 ctccctgctg cggtttttca 20

Claims (7)

1. 서열번호 1로 이루어진 식물 전신-발현 프로모터 UK1.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 전신-발현 프로모터는 애기장대 (Arabidopsis thaliana)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 식물 전신-발현 프로모터 UK1.
3. 서열번호 6 및 서열번호 7의 올리고 뉴클레오타이드들을 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응을 실시하여 제 1항의 식물 전신-발현 프로모터 UK1을 얻는 제조방법.
4. 제 1항의 식물 전신-발현 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터.
5. 제 4항에 있어서,

   상기 재조합 발현 벡터는 pBGWFS7-PAtUK1 (수탁번호: KACC 95084P)인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
6. 제 4항의 재조합 발현 벡터로 형질전환시킨 형질전환 식물체.
7. 제 1항의 전신-발현 프로모터를 사용하여 목적 유전자를 발현하는 식물 발현 벡터를 제작하고 이로 식물 운반체를 형질전환시킨 다음 이를 식물체에 도입하는 과정으로 목적 단백질을 식물체 내에서 전신적으로 (constitutively) 발현시키는 방법.

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