KR101075399B1 - 이종이식 보철편의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이종이식 보철편의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명의 방법은 이종 생체조직을 무세포화한 후, 그 조직을 무-경판막압력상태에서 에타놀계용매가 함유된 글루탈알데히드 용액에 고정 처리하고 그 독성을 제거하는 항독소화 과정을 포함하여 이루어지며, 이에 의하여 제조된 이종이식 보철편은 심장판막이식술 또는 심장혈관수술시 유용하게 사용될 수 있다.

심장판막, 심낭, 혈관대체물, 무세포화, 글루탈알데히드용액, 항독소화, 이종이식, 무-경판막압력고정

Description

이종이식 보철편의 제조방법{Production method of heterograft}

본 발명은 심장판막이식술 및 심장혈관수술시 사용할 수 있는 이종이식 보철편의 제조방법에 관한 것이다.

심장 수술의 발전과 함께 선천성 복잡 심장 기형, 심장 판막 질환 및 대소 혈관 질환 등을 교정하기 위해 자기 조직이 아닌 다른 인공조직 보철편의 필요가 늘어나 그에 따른 다양한 대체제가 연구 개발, 이용되고 있으며, 특히 이종 장기로부터의 대체재는 오래 전부터 개발 사용 되고 있다. 이종조직의 판막 및 심낭의 인체내 사용을 위해서 고정용액으로 과거부터 글루탈알데히드(glutaraldehyde, GA)가 많이 사용되고 있다.

인체에 삽입된 인공조직판막이나 인공 조직 보철편 등의 부전은 생체와의 화학적, 물리적, 면역학적 반응 등에 의하여, 변성, 퇴행되고 결국 기능상실, 소멸 등의 절차를 밟게 되는데 흔히 그 대표적인 결과로 나타나는 것이 체내에서 완전 석회화되는 것이다. 과거부터 지금까지 그러한 조직의 변성이나 퇴행을 줄이기 위한 연구 는 많이 진행되어 왔지만 , 아직까지 만족할 만한 결과를 얻지 못하고 있는 실정이다.

특히 무세포화가 안된 소나 돼지의 심낭이나 판막에서 석회화의 원천적 자리를 제공하는 죽은 조직세포의 존재와 이종면역의 계속적인 함유나, 또한 이러한 돼지의 판막이나 소나 돼지 심낭 등의 조직 고정시 결합하는 글루탈알데히드의 알데히드(aldehyde)기 (-CHO)가 체내의 칼슘과 반응하여 석회화가 일어나는 원인으로 되고 있으나 이를 적절히 처리하지 않으므로 심장내 이식후 조기 석회화로서 판막부전을 초래하고 있다.

또한, 이러한 심장판막이나 심장혈관대체물은 국내에서 생산 판매되지 않고, 고가로 외국에서 전량 수입에 의존하고 있으며, 또한 국내의 연구 기술도 전무한 상태에 있다. 그리하여 인공조직판막이나 판막도관, 심장혈관대체물의 제작에 필수적이고 기초적인 조직의 고정처리법을 개발하는 것이며, 특히 면역학적으로 우수한 공법을 동시에 시도하였고, 또한 글루탈알데히드의 단독 고정방법의 단점을 극복하기 위한 것입니다. 글루탈알데히드 고정방법의 발명으로 이종이식 판막 또는 심낭편의 보관이나 취급이 쉬워진 면이 있으나, 면역 반응 및 내구성 등에서 많은 해결과제들이 남아 있어 완벽하다고 할 수 없고, 이에 여러 가지 새로운 처리기법의 필요성이 대두되고 있다.

이에, 본 발명자는 이러한 문제점들을 해결하고자 새로운 무세포화 및 용매 등을 이용한 고정처리방식 및 항독소화 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 심장판막이식술 및 심장혈관수술시 사용할 수 있는 이종이식 보철편의 제조방법 및 이에 의해 제조된 이종이식 보철편을 제공하고자 하는데 있다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 인간을 제외한 동물의 생체 조직을 무세포화하고, 상기 무세포화된 조직을 에탄올계 용매가 함유된 고농도의 글루탈알데히드 용액에 고정한 후, 상기 조직의 독성을 제거하는 단계를 포함하여 이루어지는 이종이식 보철편의 제조방법을 제공한다. 이러한 본 발명은 종래의 일반적으로 인공조직판막이나 판막도관, 심장혈관대체물등의 제작시 사용되었던 글루탈알데히드 단독 고정법과 비교하여 볼 때, 글루탈알데히드 고정시에 무수 용매를 혼합하여 사용함으로써 특히 판막의 탄력섬유(elastin)의 교차 결합을 유도하고, 조직에 생화학적 반응을 가하여, 판막이나 신선 심낭편의 고정 후 기계적 특성을 개선하고 장기적인 석회화를 감소시킬 수 있다. 또한 본 발명은, 일부 고정과정에서 고농도 글루탈알데히드를 이용한 고정 방법으로 이종이식 심낭 또는 판막을 처리함으로써 항석회화에도 기여할 수 있도록 하고, 글루탈알데히드에서 비롯될 수 있는 잔존 글루탈알데히드의 독성을 제거하는 과정을 포함시키도록 하고 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 이종이식 보철편을 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 제 1 견지에 의하면, 본 발명은 인간을 제외한 동물의 생체 조직을 무세포화하고, 상기 무세포화된 조직을 에탄올계 용매가 함유된 고농도의 글루탈알데히드 용액에 고정한 후, 상기 조직의 독성을 제거하는 단계를 포함하여 이루어지는 이종이식 보철편의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 생체조직은 심낭, 심장판막, 심막 또는 경막 중에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 소 또는 돼지 등으로부터 유래한 생체조직이다.

각 과정을 구체적으로 살펴본다. 먼저 도살장에서 비교적 무균 상태로 채취한 돼지의 대동맥 및 폐동맥판막도관과 소의 심낭과 돼지의 심낭(이하 ‘처리조직’이라 부른다)을 항생제가 함유한 생리식염수에 담아 냉장상태로 유지하여 빠른 시간 내 실험 제조실에서 전처리한 다음, 처리조직을 무세포화 한다. 상기 무세포화는 처리조직에 저장성 완충용액, 고장성 완충용액, 등장성 완충용액을 순차적으로 처리함으로써 이루어지고, 이 모든 무세포화과정에서 회전진탕(rotation shaking)을 하면서 무세포화를 진행하며, 바람직하게는 분당 50-200회 이상으로 회전진탕한다. 상기 완충용액의 처리에 있어 일부 반복처리에 의해 무세포화를 진행할 수도 있다. 바람직하게는 상기 무세포화는 3~8℃의 저장성 완충용액에서 20-36시간, 3~5℃의 고장성 완충용액에서 6~12시간, 3~5℃의 등장성 완충용액에서 11~13시간 처리하며, 보다 바람직하게는 상기 저장성 완충용액의 처리에 있어서 상기 생체조직을 저장성 완충용액에 6-14시간 동안 처리한 다음, 세정제가 포함된 저장성 완충용액에서 14-24시간 동안 처리하는 과정으로 이루어지도록 한다. 일례로서, 상기 무세포화는 심장판막의 경우, 4℃ 저장성 용액에서 6-14시간동안 처리하고, 3-8℃의 온도에서 저장성 용액과 0.1% - 1% SDS 용액을 혼합한 용액에 14-24시간처리하고, 다시 4℃ 고장성 용액에 6-12시간처리, 그 후 4℃ 등장성 용액에서 12시간 처리를 시행한다. 심낭의 경우는 상기의 판막무세포화 방법과 같이 저농도 SDS가 포함된 저장성용액을 사용하여 무세포화하거나, sodium deoxycholate를 사용하는 방법으로서, 4℃ 저장성 용액에 6-14시간, 0.5%-2% sodium deoxycholate가 포함된 3~8℃ 저장성 용액에 14~24시간, 고장성 용액에서 6~12시간, 4℃ 등장성 용액에서 12시간 처리하는 방법을 사용할 수도 있다.

이와 같이 무세포화가 완전해진 다음 무경판막압력상태(zero-pressure fixation)하에서 고정처리한다. 상기 고정 시 자연적인 형태를 유지하기 위해 형성 틀에 넣고 무경판막압력으로 고정함으로써 판막의 상방과 하방에서 동일한 수압이 가해지므로 판막 상하의 압력차가 없게 되어 최적의 상태로 고정할 수 있게 된다. 즉, 판막에 가해지는 압력이나 피로감, 충격이 제로 상태에 있을 때 고정함으로써, 판막 조직 특히 섬유소가 가장 적절한 상태를 유지하여 장기간의 운동이나 노출에도 이상적인 상태를 유지할 수 있게 된다 (도 11 참고). 특히 판막의 적절한 이완기 상태의 펴짐을 유지하기 위하여 대동맥판막은 14~20 mmHg, 폐동맥판막은 7~10 mmHg 의 부하 압력(distension pressure)을 가한 후, 판막이 뒤로 탈출되지 않음을 확인 후 무경판막압력(zero pressure)으로 고정하였다.

또한 상기 고정은 에탄올계 용매가 함유된 1-3%농도의 글루탈알데히드 용액 의 처리 전 또는 처리 후에 0.25-0.625% 농도의 글루탈알데히드 용액을 처리하거나, 에탄올계 용매가 함유된 1-3%농도의 글루탈알데히드 용액의 처리 전 및 처리 후에 0.25-0.625% 농도의 글루탈알데히드 용액을 처리할 수 있다. 상기 에탄올계 용매는 70-80%의 에탄올 또는 혼합에탄올을 사용할 수 있으며, 상기 혼합에탄올은 67.5-75% 에탄올과 2.5-5% 옥탄올 또는 옥탄디올로 이루어지는 것일 수 있다. 일례로서 상용 농도인 0.5%의 글루탈알데히드 용액에 3-5 일간 무경판막압력상태(zero-pressure fixation)하에서 고정처리하고, 그 후 고농도(1-3%)의 글루탈알데히드 용액과 70-80% 혼합 에타놀(67.5-75% ethanol + 2.5-5% octanol 또는 octanediol)이 함유된 용액에 1-2일 처리하고, 그 후에는 저농도(0.25%)에 5일 처리할 수 있다.

상기 글루탈알데히드에 고정처리한 후 리신, 그라이신, 보로하이드라이드, 글루타믹산, 아르기닌 중에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 첨가하는 것에 의하여 글루탈알데히드의 자유 알데히드기 (-CHO)를 제거함으로써 잔존 글루탈알데히드의 독성을 제거한다. 이 때 상기 첨가되는 아미노산의 농도는 0.05~0.2 M 이고, 34~42 ℃에서 24~48 시간 동안 처리하는 것이 바람직하다. 뿐만 아니라 상기 리신 또는 그라이신에 의한 diamine bridge로 인하여 항석회화 효과가 있을 뿐만 아니라, Cross-link를 증가시켜 이종이식 보철편의 두께와 장력을 증가시킬 수 있다. 일례로 상기 고정처리 후 리신(0.05-0.2M L- lysine solution (acetic acid buffer, 또는 PBS), pH 4.5~7.6)에 담가 37℃에서 24-48시간동안 처리하거나, 그라이신(0.05-0.2M Glysine with PBS solution)을 실온에서 24-48시간동안 담가 처리하거나, Sodium borohydride 용액(Sodium borohydride 0.08M in buffered glycine(0.2% HEPES, 0.2M glycine, 0.1M NAOH, pH 10.3) 또는 buffered carbonate(0.1M NaHCO₃, 0.1M Na₂CO₃, pH; 10.3)에 반응하지 않은 조직내 시약(알데하이드기)을 제거하기 위하여 실온에서 24-48시간 배양처리하거나, 완전 포화된 그루타믹 산 용액(saturated aqueous solution of L-glutamic acid, 또는 0.05-0.1M L-glutamic acid, ph 3, room temperature)이나, 2% 아르기닌(또는 0.12M, L-arginine, in PBS phosphate buffered saline (PBS) at pH 11 )등을 실온에서 24-48시간 배양처리한다. 이와 같이 여러 가지의 항독소처리법중에서 한가지 방법을 택하여 항독소처리를 시행한 후, 다합성 소독용액에 최종 소독후 2% 벤질알콜(benzyl alcohol)용액이나 1% 벤질코니움(benzylkonium)용액에 보관한다.

또한, 본 발명의 제 2견지에 의하면, 본 발명은 상기의 방법에 의하여 제조된 이종이식 보철편을 제공한다. 특히 돼지 또는 소의 심낭으로부터 상기의 방법에 의하여 제조된 이종이식 보철편은 결손심낭의 보충, 심장혈관계 결손부위의 폐쇄, 보강 등, 복잡심기형 교정 수술 등에 필요한 보철편으로서의 활용 등 심혈관계 수술에 적용가능하다. 주로 혈관 내지 심장의 일부로서 혈액이 누출없이 원하는 방향으로 흐르도록 하는 재료로서의 역할을 하게 되는데, 본 발명에 따라 제조된 이종이식 보철편은 무세포화에 의하여 면역원성이 제거되고, 그 조직의 처리에 의하여 석회화 등이 일어나지 않고, 내구성, 운동성이 개선되어 이식되는 조직 고유의 기 능이 오랫동안 유지되는 특징을 갖는다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하여 인간을 제외한 동물의 생체 조직을 무세포화하고, 상기 무세포화된 조직을 에탄올계 용매가 함유된 고농도의 글루탈알데히드 용액에 고정한 후, 상기 조직의 독성을 제거하는 단계를 포함하여 이루어지는 이종이식 보철편의 제조방법 및 이에 의하여 제조되는 항석회화 및 항독소화된 무세포성 이종이식 보철편이 제공된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1: 장력-두께 간의 구조적 특성 검사>

본 실시예에서는, 돼지의 대동맥 판막, 폐동맥 판막, 심낭 과 소의 심낭을 0.25-0.3%, 0.5-0.625%, 혹은 1, 2%, 3%의 각기 다른 글루탈알데히드 용액에 고정하여 각각의 장력과 두께를 측정하였으며, 상기 고정은 도 12에 나타낸 장치 및 원리를 이용하여 무-경판막압력 상태에서 수행하였다.

1-1 재료의 준비

도살장에서 수의사의 협조 하에 건강한 도살된 돼지에서 심장 및 심낭을 적출하고, 차가운 phosphate buffered solution (PBS, 0.1 M, pH 7.4)에 넣어 ice box에 담아 실험실로 운반하여, 냉장상태에서 대동맥 판막, 폐동맥 판막, 심낭 등을 분리 적출하여 실험에 사용하게끔 보관한다. 또한 건강한 도살된 소의 심낭을 적출하여 같은 방법으로 운반한다.

1-2 이종 판막, 심낭의 고정

도살장에서 냉장상태(4℃)로 실험실로 운반한 돼지의 대동맥 판막, 폐동맥 판막, 심낭, 소의 심낭을, 도살 후 최소 12시간 내에 즉시 고정한다.

① 글루탈알데히드로(GA)만으로 고정한 그룹은 0.5%-0.625% 혹은 1.5%, 3% 의 완충 글루탈알데히드에 담가 4C 에서 2-3일 고정 후 상온에서 0.3%-0.25% 의 완충 글루탈알데히드에서 7일 간 고정하였다.

② 글루탈알데히드의 고정과 함께 항석회화를 위한 용매를 이용한 그룹은 0.25%-0.3%, 0.5%-0.625% 혹은 1-3% 글루탈알데히드 고정전과 고정후의 방법으로 처리하였다.

- 80% 에탄올이나, 80% 혼합에탄올 (75% ethanol + 5% octanol 또는 75% ethanol + 5% octanediol), 4℃에서 고정 후 상온에서 0.25%- 0.3% 글루탈알데히드에 12일간 상온에서 고정하거나,

- 상온에서 0.5%-0.625% 글루탈알데히드 에 5일 동안 고정 후 80% ethanol 이나 75% ethanol + 5% octanol 혹은 75% ethanol + 5% octanediol (PBS buffer, Ph 7.4) 이 담긴 shaker bath 에 넣어 2-3일간 처리 후 다시 상온에서 0.25%-0.3% 글루탈알데히드에 담가 7일간 고정 하였다.

이때 이종이식 대동맥 판막과, 폐동맥 판막의 고정 시에는 자연적인 형태를 유지하기 위해 형성 틀에 넣고, 판막의 적절한 이완기 상태의 펴짐을 유지하기 위하여 대동맥판막은 14~20 mmHg, 폐동맥판막은 7~10 mmHg 의 부하 압력(distension pressure)을 가한 후, 판막이 뒤로 탈출되지 않음을 확인 후 무경판막압력(zero pressure)으로 고정하였다. 이와 같이 무경판막압력으로 고정하게 되면 판막의 상방과 하방에서 동일한 수압이 가해지므로 판막 상하의 압력차가 없게 되어 최적의 상태로 고정할 수 있게 된다. 즉, 판막에 가해지는 압력이나 피로감, 충격이 제로 상태에 있을 때 고정함으로써, 판막 조직 특히 섬유소가 가장 적절한 상태를 유지하여 장기간의 운동이나 노출에도 이상적인 상태를 유지할 수 있게 된다 (도 12참고). 고정된 심낭편들은 PBS solution으로 상온에서 여러 차례 세척한 후 4℃의 PBS solution에 보관한 후에 각종 물리적 검사를 시행하였다.

1-3 구조적 특성 검사

(1) 물리적 활성도 검사

처리된 이식편들을 검사자의 손으로 직접 촉진, 봉합, 신장시켜 보았다. 검사의 일관성을 위하여 한 사람의 흉부외과의사의 기준으로 평가하였다. 촉진은 손 으로 만져보아 조직의 부드러운 정도를 측정하고, 봉합은 5-0 prolene (Ethicon, Johnson & Johnson)을 이용하여 조직을 뚫을 때의 느낌을 기술하고, 신장도는 조직을 당겨보아 늘어나는 정도를 측정 기술 하였다.

아무것도 처리하지 않은 이식편을 0 으로 기준하여 그 다음 단계별로 촉진(부드러움=1, 약간만 부드러움=2, 보통임=3, 부드럽지 않음=4, 약간 딱딱한 느낌=5), 봉합(잘들어감=1, 약간만 잘 들어감=2, 보통임=3, 약간 저항감 느낌=4, 저항이 있음=5), 신장도(잘늘어남=1, 약간 늘어남=2, 보통임=3, 잘 늘어나지않음=4, 거의 늘어나지 않음=5) 에 따라 점수를 매겨 각각 이식편의 점수를 평균내어 저농도 GA , 고농도 GA, GA + Solvent 고정방법 별로 비교하였다.

(2) 이종 판막, 심낭의 장력 검사와 탄력성 검사

처리된 돼지 대동맥 판막, 돼지 폐동맥 판막을 펼치고 원주방향(circumferential) 과 방사방향(radial) 으로 각각 방향을 달리하여 7.0 x 5.0 mm 의 장방향 절편을 취하여 폭 5mm 에 대한 인장강도와 탄력도를 측정함으로서 그를 평균한 값이 그 판막의 인장강도 및 탄력도를 대표한 값이 되게 하였다. 마찬가지로 처리된 돼지 심낭과 소의 심낭을 펼치고 30°씩 각도를 달리하여서 얻어낼 수 있는 모두 6가지의 방향에 대해 0.5×5 cm의 장방형 절편을 취하여서 폭 5 mm에 대한 인장강도와 탄력도를 측정함으로써 그를 평균한 값이 그 심낭의 인장강도 및 탄력도의 대표값이 되도록 시도하였다. 장력의 측정은 Japan Tech & Manufacture, Digital Force Gauge, Model 5FGN, automated materials testing system을 이용 심낭은 load speed 100 mm/min, 판막은 load speed 6mm/min로 각각 달리 측정하여 단 위는 Kgf/폭5 mm로 표기하였다.

(3) 통계 방법

이종이식 판막과 심낭 장력을 Kgf/폭 5 mm , 탄력도는 처음길이에 대한 늘어난 길이의 비 % 의 평균±표준편차로 표시하였다. 열 안정성 검사시는 심낭절편의 수축시 온도를 C 로 표기하고 각 값을 평균±표준편차로 표시하였다. 각 군 간의 통계적 차이는 paired T-test 및 ANOVA test 로 검증하며, 각 실험 마다 고농도와 저농도의 글루탈알데히드 로 고정한 그룹까지의 각각의 그룹간 비교는 사후 검사 turkey b test 를 하였다. p＜0.05를 의미 있는 것으로 간주한다.

1-4 결과

(1) 물리적 활성도 검사.

한 사람의 흉부외과의사에 의한 이종이식편에 대한 촉진, 봉합, 신장도에 대한 주관적인 평가를 시행하였다. 이식편의 종류에 상관없이 아무것도 처리하지 않은 것을 0 으로 기준하여 고정 방법마다 다시 평가 하였으므로 종류별로 구분하지 않고 판막 , 심낭 군으로 나누어 평가하고 하기 표 1에 나타내었다. 촉진시는 저농도 GA, 고농도 GA, GA+Solvent 처리군간에 유의한 차이가 없었다. 봉합검사 시 저농도GA 고농도GA 처리 군 간에 느껴지는 정도는 차이가 없었으나, 저농도와 GA + Solvent 군간에 판막(P=0.018), 심낭(P=0.009) 모두 유의하게 차이가 있었다. 신장도 검사에서도 저농도와 GA + Solvent 군간에 판막(P=0.000), 심낭(P=0.0329) 모두 유의하게 차이가 있었다.

즉, 촉진소견은 통계적으로 유의한 차이가 없었고, 봉합과, 신장도면에서는 저농도 GA 에 비해 GA+ Solvent 군이 좀더 단단하게 느껴졌다. 비록 주관적이긴 하나 임상에서 외과의가 실제 수술 시 느껴지는 정도를 평가한 것으로 Solvent 첨가시 약간 단단하게 느껴짐을 확인할 수 있었다.

(2) 압력-장력,압력-탄력 비교

방향성 압력-장력, 압력-탄력도 검사에서, 돼지의 대동맥 판막의 경우 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었고, 돼지의 폐동맥 판막의 경우에도 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었다.

돼지의 심낭과 소의 심낭의 경우에도 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었다.

(3) 저농도와 고농도의 글루탈알데히드 그룹 간 비교

저농도 글루탈알데히드, 고농도 글루탈알데히드, solvent 첨가 유무 별로 검사를 하였다.

① 돼지의 대동맥 판막은 원주방향, 방사방향 모두에서 solvent 첨가 상관 없이 저농도GA 고정군과 고농도 GA 고정군간에 장력비교와 탄력도 비교에서 통계적으로 유의한 차이가 없었다(P>0.05).

② 돼지의 폐동맥 판막은 원주방향 장력비교에서는 저, 고농도 GA 그룹간에 Solvent 첨가 유무 관계 없이 차이가 없었으나, 원주방향 탄력도 비교에서 solvent 를 첨가하지 않은 그룹에서와(저농도 GA 처리 vs 고농도 GA : 50.90+23.54 vs 102.50+33.75 , p=0.028), solvent를 첨가한 그룹에(저농도 GA 처리+ solvent group vs 고농도 GA + Solvent 처리 group : 62.89+39.88 vs 108.00 + 37.75 , p=0.001)서 고농도 GA 고정시 탄력도가 증가 하였다. 또한, 방사방향 장력비교에서는 저, 고농도 GA 고정 그룹간에 Solvent 첨가 유무 관계없이 차이가 없었으나, 방사방향 탄력도 비교에서는 solvent 를 첨가한 군에서 고농도 GA로 고정 한 것에서 탄력도가 증가 하였다. (저농도 GA + solvent vs 고농도 GA + solvent : 84.39 + 26.20 vs 125.44 + 42.72 , P=0.011).

③ 소의 심낭은 solvent 첨가 상관없이 저농도 GA 고정군 과 고농도 GA 고정 군간에 장력비교에서 통계적으로 유의한 차이가 없었고(P>0.05), 탄력도 비교에서 저농도 GA 고정 시 solvent를 첨가하지 않은 군이 solvent를 첨가한 군보다 탄력도가 증가하였다(저농도 GA vs 저농도 GA + solvent : 34.26+15.29 vs 21.00+8.27 , p=0.000).

④ 돼지 심낭의 장력비교는 저농도 GA 고정군과 고농도 GA 고정군간에 장력비교에서 통계적으로 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 그러나 탄력도 비교에서는 solvent 를 첨가하지 않은 군(저농도 GA vs 고농도 GA : 13.19+5.89 vs 21.66+3.23, p=0.001)과 solvent 를 첨가한 군(저농도 GA + solvent vs 고농도 GA + solvent : 13.66+6.02 vs 20.86+7.43 p=0.000) 모두 고농도 GA 고정군에서 탄력도가 증가하였다.

본 실시예의 결과, 심혈관조직의 물리적 활성도 검사에서 촉진소견은 통계적으로 유의한 차이가 없었고, 봉합과 신장도면에서는 저농도 GA에 비해 GA+ Solvent 군이 좀더 단단하게 느껴졌다. 비록 주관적이긴 하나 임상에서 외과의가 실제 수술 시 느껴지는 정도를 평가한 것으로 Solvent 첨가시 약간 단단하게 느껴짐을 알 수 있었다.

또한, 일방향성 압력-장력, 압력-탄력도 검사에서, 돼지의 대동맥 판막의 경우 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었고, 돼지의 폐동맥 판막의 경우에도 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었다. 돼지의 심낭과 소의 심낭의 경우에도 GA 고정군 과 GA + Solvent 고정군 간에 압력-장력 및 압력-탄력도 에 통계적으로 유의하게 차이가 없었다. GA 고정시 solvent 의 사용은 통계적으로 유의한 차이를 보이는 조직의 물리적 변화는 가져오지 않았다. 결론적으로, GA의 고정은 장력과 탄력을 좋게 하지만 판막의 구조적 섬유 방향을 따라서 cross link 를 다르게 함을 알 수 있다.

<실시예 2: 고정 방법에 따른 조직학적 분석>

본 실시예에서는, 0.25% - 0.625% 글루탈알데히드 용액에 고정 전과 고정 후의 돼지 심낭과 대동맥, 폐동맥판막 및 사람의 심낭을 광학 및 전자현미경으로 비교관찰하였다. 돼지 심낭과 대동맥, 폐동맥판막을 0.25% - 0.625% 글루탈알데히드 고정 전과 고정 후에 70-80% 혼합에탄올 처리한 군과, sodium dodecylsulfate (SDS) 을 이용하여 무세포화 처리만 시행한 군, 무세포화과정 후에 0.25% - 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 70%-80% 혼합에탄올 처리 후 다시 무세포화과정을 한 후 0.25% - 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 무세포화한 후 다시 에탄올 처리 후 다시 0.25%- 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군으로 나누어 각각을 광학 및 전자현미경으로 관찰하였다. 또한 상기 고정은 무-경판막압력 상태에서 수행하였다.

2-1 재료의 준비 및 고정

건강한 도살된 돼지에서 즉시 심낭과 대동맥, 폐동맥판막을 적출하여 차가운 phosphate buffered solution (PBS, 0.1M, pH 7.4, 4℃)에 넣어 ice box에 담아 실험실로 운반한다. 도살장에서 냉장상태(4℃)로 실험실로 운반한 돼지 심낭과 대동맥판막, 폐동맥판막을 도살 후 최소 12시간 내에 즉시 고정한다. 도살장에서 적출한 돼지 심낭과 대동맥판막, 폐동맥판막을 0.625% 글루탈알데히드 solution (PBS buffer,pH 7.4)에 담가 4℃에서 2일간 고정한 후, 상온에서 7일간 추가로 고정한다. 고정이 끝나면 가로 세로 1.5 cm크기의 조직편들로 나누고 더 이상의 처치가 필요하지 않은 조직편들은 PBS solution으로 상온에서 24시간 동안 세척한 후 4℃의 PBS solution에 보관한다. 추가적인 항석회화 처리가 필요한 조직들은 바로 다음 단계로 진행한다.

2-2 조직학적 검사

(1) 광학현미경 및 전자현미경 검사

광학 현미경적 검색은 적출된 심낭 혹은 대동맥, 폐동맥 판막을 사용하였으며 2∼3 mm 두께의 조직을 Dubosqcbrasil용액에 1시간 넣어두었다가 10% 포르말린에 후 고정한 후 파라핀포매조직을 만들어 2∼4 um 절편으로 박절하여 hematoxylin-eosin, von Kossa, phosphotungstic acid hematoxylin, Movat pentachrome, elastica-van Gieson 염색을 시행하였다.

전자 현미경적 검색은 조직을 1 mm 크기로 절편하여 4% 글루탈알데히드-PBS (0.1 mol/L phosphate buffer, pH 7.4) 용액에 고정한 후 1% OsO4 (0.1 mol/L phosphate buffer, pH 7.4)에 후고정하여 Epon LX 112 fixative에 embedding을 하였다. 1 um 절편에 toluidine blue 염색을 하여 광학 현미경으로 관찰하였고 적절한 조직 표본의 위치를 결정한 후 Reichert Ultracut E-ultramicrotome (Leica, Inc., Buffalo, NY) 으로 초박절편하여 Uranyl acetate와 Lead citrate로 염색한 후 전자 현미경 JEM-100CX (Magnification; X100∼X450,000, acceleration voltage: 120 kV, JEOL USA, Inc.)으로 관찰을 하였다.

(2) 항석회화 및 무세포화처리

1) 80% Ethanol 처치

80% ethanol 처치는 조직편을 0.625% 글루탈알데히드 고정전과 고정후의 다른 2가지방법으로 24시간 처리하였고, 각각의 처리 과정 중에는 생리적 용액 (PBS)로 충분히 세척(3×10 min) 한 후 다음 단계를 시행하였다.

고정된 혹은 고정되지 않은 조직편들을 4℃ 80% ethanol solution (PBS buffer, pH 7.4)이 담긴 shaker bath에 넣어 상온에서 24시간 동안 처리 후, 4℃의 PBS solution에 보관하거나, 고정하지 않은 조직편은 세척 후 0.625% 글루탈알데히드 고정하고, 4℃의 PBS solution에 보관한다.

2) Sodium dodecyl sulfate (SDS)를 이용한 무세포화 과정 후 처리

조직편들을 Hypotonic buffer (Tris, 10 mmol/L; EDTA, Aprotinin, PH 8, Sigma Co., U.S.A.)에서 상온 14시간, 그 후 0.1-0.5% SDS를 포함한 Hypotonic buffer에서 24시간, 그 후 Isotonic buffer (Tris, 50 mmol/L; EDTA, Aprotinin, PH 8, Sigma Co., U.S.A.)에서 24시간 처리하여 무세포화과정을 시행하고 생리수에 세척 후 보관하여 무세포화만 시행한 군과, 무세포화과정에 0.625% 글루탈알데히드 고정용액에 추가 2주간 고정한 군을 나누었고, 추후 검사를 위하여 생리수(PBS) 세척 후 4℃에 보관한다.

3) Ethanol처리 및 Sodium dodecyl sulfate (SDS)를 이용한 무세포화 처리

상온에서 80% ethanol을 24시간 처리 후, 전술한 방법으로 다시 무세포화과정을 한 후 0.625% 글루탈알데히드 고정용액에 추가 2주간 고정한 군과, 먼저 무세포화한 후 24시간 ethanol 처리 후 다시 0.625% 글루탈알데히드 고정용액에 추가 2주간 고정한 군으로 실험을 진행하였다.

2-4 결과

(1) 글루탈알데히드 고정, 항석회화(ethanol), 무세포화 처리(SDS) 후 돼지 심낭의 비교

아무런 처리를 하지 않은 경우, 사람의 심낭(0.36±0.02 mm)은 돼지 심낭(0.13±0.05 mm)에 비해 세배 정도로 두꺼워 보였으며 둘다 장막층(serosal layer), 섬유층(fibrosa), 심외막 결합조직(epicardial connective tissue)로 이루어져 있었다. 장막층은 중피세포(mesothelial cell)로 이루어진 부드러운 층을 이루었다. 섬유층은 심낭의 대부분의 두께를 차지 하였고 콜라겐, 탄력섬유(elastic fibers), 신경, 혈관들, 림프관들로 이루어져 있었다. 심외막 결합조직은 느슨하게 연결된 콜라겐과 탄력섬유로 이루어져 거친 층을 이루었다(도 1).

돼지 심낭을 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군과, 0.625% 글루탈알데히드 고정전과 고정후에 80% Ethanol 처리한 군과, sodium dodecylsulfate (SDS)를 이용한 무세포화 처리만 시행한 군, 무세포화과정에 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 80% ethanol 처리 후 다시 무세포화과정을 한 후 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 무세포화한 후 다시 ethanol 처리 후 다시 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군 모두 콜라겐은 잘 유지 되고 있었다. 하지만 무세포화처리만 시행하거나 먼저 무세포화처리 후 글루탈알데히드 고정 처리한 군의 콜라겐 섬유들도 다른 군에 비해 느슨하게 연결된 양상이었다(도 2).

(2) 글루탈알데히드 고정, 항석회화, 무세포화 처리 후 돼지 대동맥 판막, 폐동맥판막의 비교

아무런 처리를 하지 않은 경우, 돼지 대동맥 판막, 폐동맥판막은 섬유판(lamina fibrosa), 해면질판(lamina spongiosa), 심실판(lamina ventricularis) 세층으로 이루어져 있었다. 섬유판은 원주형태의 콜라겐 섬유로 되어 있었으며, 해면질판은 glycosaminoglycans (proteoglycan)이 주 성분으로 되어 있었고, 심실판은 방사상의 탄력섬유를 가진 elastin으로 이루어져 있었다.

돼지 대동맥판막, 폐동맥판막을 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군과, 0.625% 글루탈알데히드 고정전과 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군과, sodium dodecylsulfate (SDS) 처리로 무세포화만 시행한 군, 무세포화과정에 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 80% ethanol 처리 후 다시 무세포화과정을 한 후 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군, 무세포화한 후 다시 ethanol 처리 후 다시 0.625% 글루탈알데히드 고정한 군 모두 세층과 콜라겐은 잘 유지 되고 있었다. 하지만 무세포화만 시행하거나 먼저 처리한 군은 심낭에서처럼 콜라겐구조는 다른 군에 비해 느슨하게 연결된 양상이었다 (도 3).

결과적으로, 본 실시예에서 이종이식 돼지심낭과 대동맥 판막, 폐동맥판막 보철편은 여러 조건하의 고정 방법들에 따라 콜라겐 골격의 전자 현미경적 구조에서 확연한 차이를 보이지 않아, GA를 이용한 각종 조직 처리과정 중 조직손상에 의한 구조적, 기계적 손실은 없는 것으로 생각되었다. 하지만 GA 고정하기 전에 SDS로 무세포화 처리를 시행한 경우 또는 무세포화처리만 시행한 경우 콜라겐 조직의 미세한 변성이 전자현미경에서 관찰 되었다.

<실시예 3: 탈세포화 조건의 최적화>

본 실시예에서는, 돼지의 대동맥 및 폐동맥판막, 대동맥 및 폐동맥벽, 돼지의 심낭을 탈세포화 세정제(detergents)에 대한 농도 및 배양시간, 온도조건, 용질에 대한 삼투압 등을 달리하고, 여러 탈세포화용액 및 그 조합을 통해 단일단계 및 여러 단계의 방법으로 배양하여 탈세포화를 시행하였다. 이렇게 탈세포화 실험을 마친 조직은 헤마톡실린-에오신 (H&E) 염색을 통해 탈세포화의 정도와 세포 외 기질의 보존 정도를 평가하였다.

3-1 재료의 준비

도살장에서 도살된 건강한 돼지의 심장과 심낭 및 소의 심낭을 수의사의 협조 하에 채취하여, 즉시 잔존 혈액을 세척한 후 4℃ 생리식염수에 담아 냉장상자에 보관하여 실험실로 가져온다. 실험실에서, 채취된 신선한 돼지 심장을 박리하여 대동맥판막 도관과 폐동맥판막 도관을 얻고, 이미 채취된 돼지의 심낭절편과 소의 심낭절편을 생리식염수로 여러번 세척하여 복합항균제제(1cc/L, antibiotic & antimycotic solution, Sigma)를 섞은 인산염완충 식염수 (phosphate buffered saline, PBS pH 7.4)에 약 1∼2시간동안 4℃에서 냉장 보관한 후 탈세포화 작업을 진행한다.

3-2 탈세포화

(1) 일반적인 원칙:

일반적으로 탈세포화처리를 시작하기 전에 복합항균제제(1 cc/L, antibiotic & antimycotic solution, Sigma, 100 U penicillin, 0.1 mg streptomycin, 0.25 g/mL amphotericin)에 의한 생체균주부담완화(Bioburden reduction) 시도를 하였고, 이후 탈세포화 과정 중에는 항생제를 사용하지 않았다. 탈세포화실험은 각각의 처리과정 중 분당 최저 200회 이상속도로 회전 진탕기(rotating shaker)에서 배양(incubation) 하였고, 다른 용액에 옮길 때에는 잔존 용매나 세정제제의 잔류를 최소화하기 위해 생리용액 (50 mL PBS)에 5∼10분간 3회 이상 세척하였다.

기본적으로 탈세포화를 위해 사용되는 용액은 시료조직부피(무게)의 15∼20배를 사용하는 것을 원칙으로 하였다. 일부 실험에서 이용되는 저장성 완충용액과 등장성 완충용액, 고장성 완충용액은 다음과 같은 조성 및 산도로 제작하여 사용하였다.

- 저장성 완충용액: Tris, 10 mmol/L; ethylendiamine tetraacetic acid, 0.1%-0.05%; aprotinin, 5-10 KIU/mL, neomycin trisulfate 50-100 mg/L; pH 8

- 등장성 완충용액: Tris, 50 mmol/L; NaCl, 0.15 mol/L; ethylendiamine tetraacetic acid, 0.1-0.05%; aprotinin, 5-10 KIU/mL, neomycin trisulfate 50-100 mg/L; pH 8

- 고장성 완충용액: Tris, 100 mmol/L; NaCl, 0.3-0.6 mol/L; ethylendiamine tetraacetic acid, 0.1-0.05%; aprotinin, 5-10 KIU/mL, neomycin trisulfate 50-100 mg/L; pH 8

그 외에 사용된 용액제제들로는 사용 용매나 세정제에 따라 인산생리용액(PBS), 증류수, 생리식염수 등이 사용되었다. 탈세포화 과정 후에는 조직을 생리식염수에 세척하고 10% 포르말린에 고정하여 조직검사와 그 외 필요한 검사들을 의뢰하였다. 탈세포화와 세포 외 기질의 보존 정도는 hematoxylin-eosin (H&E)염색으로 표본을 만들고 400배율에서 관찰하였다. 탈세포화를 평가하기 위해 탈세포화 처리를 하지 않은 시료를 H&E염색하여 대조군 표본으로 사용하였다. 일부 탈세포화 된 조직에서는 이종항원면역제거 정도를 파악하는 alpha-Gal 염색과 DAPI 염색을 함께 시행할 수도 있다.

(2) 본 실시예에서는, 여러단계의 탈세포화과정을 거치는 다단계(multi-step)방법을 이용하여 탈세포화를 수행하였다.

즉, 탈세포화의 수행을 위하여 4℃의 저장성 용액에서 6-14 시간 동안 처리하고, 0.1-1.0 % SDS 용액을 혼합한 8-10 °C의 저장성 용액에서 14-24시간 처리한 다음, 다시 고장성 용액에서 6-12 시간 처리한 후, 4℃의 등장성 용액에서 12시간 처리하였다. 모든 과정에서 200회 이상 회전진탕을 하면서 탈세포화를 진행하였다.

특히 심장판막은 4℃ 저장성 용액에서 6시간동안 처리하고, 8℃에서 저장성 용액과 0.1% - 1% SDS 용액을 혼합한 용액에 14시간처리하고, 다시 4℃ 고장성 용액에 6시간처리, 그 후 4℃ 등장성 용액에서 12시간 처리를 시행하여 탈세포화를 수행하였다.

심낭의 경우에는, 심장판막의 무세포화를 SDS용액의 낮은 농도에서 같은 방법으로 시행하거나, 혹은 다른 세제 (deoxycholate 등)를 이용하여 세정액이 혼합된 저장성 용액에 6-14시간, 0.5-2% sodium deoxycholate가 포함된 3-8℃ 저장성 용액에 14-24시간, 고장성 용액에서 6-12시간, 4℃ 등장성 용액에서 12시간 처리하였다.

3-3 결과

상기 실시예의 결과를 도4에 나타내었다. 도 4a는 상기 탈세포화 처리를 하지 않은 돼지 대동맥판막, 폐동맥판막 및 소 심낭의 H&E 염색 결과로, 파란 점 등이 탈세포화가 되지 않은 상태를 나타낸다. 도 4b는 4℃의 저장성 용액에서 6-14 시간 동안 처리하고, 0.1-1.0 % SDS 용액을 혼합한 8-10 °C의 저장성 용액에서 14-24시간 처리한 다음, 다시 고장성 용액에서 6-12 시간 처리한 후, 4℃의 등장성 용액에서 12시간 처리한 대동맥판막, 돼지 심낭, 돼지 폐동맥판막 및 소 심낭의 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다. 탈세포화가 이루어져 세포핵이 제거되었음을 확인할 수 있다.

SDS는 탈세포 효과가 매우 강력한 이온성 세정제(ionic detergent) 중 하나로서 세포의 acidic phospholipid를 제거하며, 이러한 SDS는 높은 이온성의 양측 친매성 리간드(highly ionic, amphipathic ligands)를 가지고 있고 이는 소수성 도메인(hydrophobic domain)을 통해 단백과 결합하여 친수성 도메인(hydrophilic domain)을 노출시켜 음전하(negative charge)들을 많이 만들어 단백이 친수성(hydrophilic)이 되게 하여 물과 결합함으로서 조직의 부종을 증가 시키고, 수소결합을 와해시킴으로서 콜라겐의 안전성을 감소시킨다. 또 elastin은 주로 소수성(hydrophobic)이기 때문에 SDS에 노출되면 소수성을 잃어버려 수성환경(aqueous environments)에 노출되게 된다. SDS는 다른 세정제(detergent)들과 비교하여 잔존 핵물질, vimentin 같은 세포질 단백을 거의 완전하게 제거할 수 있다고 알려져 있지만 SDS는 고유조직구조를 파괴하는 경향이 있어 glycoaminoglycan (GAG)의 감소나 콜라겐의 구조(integrity)를 약화 시킬 수 있다.

따라서 SDS 단독에 의한 탈세포화는 장기간 노출시 조직에 독성이 있고, 불완전하므로, 본 실시예에서는 상기한 바와 같이 SDS 노출 전 저장성 용액에 조직을 처치한 다음에 SDS가 혼합된 저장성 용액을 처치함으로써 저농도의 SDS와 삼투압방식을 함께 이용한 탈세포화를 최적화하였다. 저장성 용액에 조직을 전처치함으로써 삼투압을 이용하여 세포를 팽창시켜 세포막을 터트려 세포를 파괴하여 탈세포화를 일차적으로 수행한 것이다. 이 때 추가적으로 세포 지꺼기(cell debris)를 제거하기 위해 효소적 혹은 화학적 처치함으로써 탈세포화의 효율을 높일 수 있다. 가장 보편적으로 사용하는 용액은 10 mM tris buffer solution으로 여기에 chelating agent 인 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)를 섞어 세포와 세포외 기질과의 결합(binding)을 약화 시켜 세포를 잘 빠져 나오게 하고 세포 파괴시 누출되는 세포내 여러 효소의 활성을 방지하기 위해 protease inhibitor인 phenylmethylsulfonylfluoride, aprotinin, leupeptin 등을 첨가하여 사용할 수 있다. 뿐만 아니라, 이러한 저장성 용액에서의 처치를 저온(4 ℃)에서 수행할 경우 비록 여러 효소나 세정제등의 활성화나 기능을 약화시킬 수 있지만, 탈세포화과정에 비교적 장시간 노출시킴으로서 효소적, 화학적 탈세포화의 효과를 유지하고, 특히 세포외 기질의 손상을 최소화 할 수 있을 것으로 판단된다.

또한, 본 실시예에서는 저장성 용액 및 SDS를 혼합한 저장성 용액에서 조직을 처치한 다음, 고장성 용액에서 처리함으로써 삼투압을 이용하여 SDS를 비롯한 세포독성 물질을 제거할 수 있도록 하고, 저장성용액 처리에따른 조직의 부종을 완화할 수 있으며, 조직내의 콜라겐 배열을 재정돈하는 효과가 있으며, 다시 저온의 등장성 용액에 조직을 처치함으로써 조직의 삼투압을 정상화하고, 탈세포화과정에서 발생할 수 있는 세포외기질을 보호할 수 있도록 하였다.

결론적으로, 탈세포화가 최적의 탈세포화를 이루기 위해서는 조직마다 조금씩 차이가 있으나, SDS 농도는 상기와 같이 0.1-2% 이고, 저장성 완충용액에 배양하는 총시간은 20 ~ 36 시간은 되어야 할 것으로 판단되며, 저장성 용액과 고장성 용액 및 등장성 용액에 순서대로 처리하는 단계를 거치는 것이 탈세포화가 잘 이루어질 수 있다. 이 때, 고장성 용액에서는 6-12 시간 이상, 등장성 용액에서는 12 시간 이상 처리되어야 할 것으로 생각된다.

<실시예 4: 각종 고정 처리법에 대한 피로 내구성 검사>

본 실시예에서는, 준비된 처리조직을 고정 또는 탈세포화한 뒤 피로 실험 전후로 조직의 투과도와 유순도를 측정하여 비교하였고 또한 광학현미경을 통한 조직검사로 조직 구조의 가시적인 변화 정도를 확인하였다.

4-1 재료의 준비

도살장에서 수의사의 협조 하에 건강한 소나 돼지를 도살하여 즉시 소, 돼지심낭과 돼지대동맥, 폐동맥판막을 무균법으로 적출하여 차가운 phosphate buffered solution (PBS, 0.1M, pH 7.4, 4℃)에 넣어 아이스 박스에 담아 실험실로 운반한다.

4-2 탈세포화 및 고정

신선 이종 심낭편을 저장성(hypotonic) 완충용액에 12시간 동안 담가두고, 세척후 0.25% SDS를 포함한 저장성 완충용액에 16시간 동안 담가 둔 뒤, 그 후 등장액에 8시간 동안 담가 두었다. 무세포화에 사용하는 용액에는 교질(matrix)조직의 보호를 위하여 항단백분해효소제나 항섬유분해효소제등을 첨가하였으며, 전 과정은 냉장상태인 4℃, 회전 분탕기(rotating shaker)내에서 처리하고, 이후 고정 과정을 거쳤다. 대조군으로는 아무런 처리를 하지 않은 신성 이종 심낭편을 즉시 고정 처리하였다.

고정에는 글루타르알데히드와 용매(solvent)를 사용하였다. 글루타르알데히드 0.2%, 0.25%, 0.5%, 0.6%,0.625%, 1%, 2%, 3% 용액 등을 사용하였고, 용매는 에탄올(ethanol) 60%, 80%, 95% 용액이거나 67.5%-75% 에탄올과 2.5-5% 옥타놀(octanol), 혹은 2.5-5%의 옥탄디올(octanediole) 혼합 용액 등을 사용하였다. 고정의 온도는 4℃, 실온(room temperature) 또는 고온 (37-45℃)이었다.

보관을 위하여, 0.25% 또는 0.3% 글루타르알데히드를 사용하였으며, 12일간 실온에서 보관한 심낭편을 실험에 사용하였다. 실험 초기에는 0.3% 글루타르알데히드 용액을 사용하였으나 후에는 0.25%를 사용하기로 하여 방법을 통일하였다.

4-3 검사

(1) 투과도(permeability) 검사

탈세포화, 고정, 보관 등의 처리과정을 마친 심낭편에, 생리식염수를 이용하여 100mmHg의 압력 1시간 동안 한쪽 방향에서 가한 뒤, 심낭편을 투과한 생리식염수의 양을 측정한다. 1시간 동안 동일한 면적의 심낭편을 투과한 생리식염수의 부피(cc/hrcm2)로 결과를 표시한다. 투과성의 차이는 콜라겐 섬유다발의 영구적인 늘어남과 간격(gap)의 발생의 정도와 연관이 있다고 본다.

(2) 유순도(compliance) 검사

탈세포화, 고정, 보관 등의 처리과정을 마친 심낭편에, 생리식염수를 이용하여 각각 100, 120, 140, 160, 180, 200mmHg의 정수압을 한쪽 면에서 가하여, 심낭편의 변형된 부피를 측정한다. 압력이 100mmHg에서 200mmHg로 증가하는 동안 변형된 부피를 유순도의 값으로 정하며, 심낭편의 면적이 다를 경우에도 비교가 가능하도록 하기 위하여 단위 면적으로 나누어, 단위는 ㎕/mmHgcm²가 된다. 유순도의 변화는 콜라겐 섬유다발의 변성과 이완, 손상 정도와 연관이 있다고 본다.

(3) 피로 실험(fatigue test)

실험을 위해 장비를 고안하였다. 지름이 25mm인 원 모양의 심낭편에 박동성의 압력을 한쪽 방향에서 짧은 간격으로 반복해서 가할 수 있는 장치로, 생체 내에 심낭편을 이식하여 판막엽으로 사용하는 경우를 재현하기 위해 0~180 mmHg까지의 박동성 압력 재현이 가능하다. 초당 7회로 총 천 5백만 회의 압력 스트레스를 가하게 된다.

(4) 광학 현미경 검사

각각의 실험 전후 및 보관 과정까지 끝난 심낭편은 10% 포르말린 용액에 담가진 채로 즉시 병리과로 보내졌으며, 파라핀 포매조직을 만들어 2~4㎛ 절편으로 박절하여 hematoxylin-eosin 염색을 시행하였다.

4-4 결과

(1) 신선 우심낭편의 투과도와 유순도 측정

기본적인 실험결과 비교의 근거자료로서 아무런 처리를 하지 않은 신선 우심낭을 재료로 하여 투과도와 유순도를 측정하였다(표 2). 아무런 처리를 하지 않은 신선 우심낭은 고정 처리를 거친 이종 이식편에 비해 비교적 높은 투과도와 유순도를 보여 기계적 내구성이 미흡함을 보여주었다.

(2) 용매(solvent)의 혼합여부 또는 용매의 농도에 차이를 둔 실험군

이 군에 속한 샘플은 여덟 개였다(표 3, 1.~8.). 현미경 관찰상 각각의 샘플에서 피로 실험 전후에 조직학적 차이는 특별히 발견할 수 없었다(도 5a). 그러나 투과성 및 유순도 검사에 있어서는 에탄올 용매를 혼합하여 고정한 경우가 용매를 혼합하지 않은 경우에 비해 좀더 좋은 특성, 즉 피로 실험 전후로 투과성과 유순도가 낮은 상태로 유지되는 특성을 보였다(표 3). 또한, 고정 시에 용매를 혼합한 경우 중에서도 그 용매의 농도가 높은 경우에 더 좋은 결과를 보였다. 결국, 가능한 높은 농도의 용매를 사용하여 고정하는 것이 더 좋은 결과물을 만들어낸다는 결과를 얻을 수 있었다. 추가 실험을 통해 에탄올의 농도가 80%정도일 때에 가장 좋은 결과를 보임을 알 수 있었는데, 용매로서 에탄올에 더하여 옥타네디올, 옥타놀 등을 추가하였을 때에는 에탄올 농도에 큰 영향을 받지 않았다. 에탄올과 부타놀을 용매로 사용한 고정은 투과성과 유순도의 유지 측면에서는 유리하지만 외과의사가 샘플을 이용하여 실험적인 외과 수술조작을 가할 때 주관적인 불편함이 심하여 곤란하였다. 최종적으로 8개의 고정방법 중 0.6% 글루타르알데히드 용액에 80%의 에탄올을 섞어 3일간 고정한 후에 0.3% 글루타르알데히드 용액에 담가 12일간 보관한 것이 투과도, 유순도 유지가 잘 되었으며, 피로 실험 전후의 조직학적인 변화도 매우 적었다(표 3).

(3) 고농도 글루탈알데히드 사용 여부에 차이를 둔 실험군

이 군에 속한 샘플은 네 개였다. 고정용 글루탈알데히드의 농도는 대체로 저농도(1% 이하)와 고농도(2~3%정도)로 분류되는데, 이에 본 발명자들은 기존의 1% 미만 농도 글루탈알데히드를 이용한 고정법 대신 2- 3% 고농도의 글루탈알데히드와 용매를 사용하여 심낭편을 고정한 뒤 피로 실험 전후에 투과도, 유순도 및 조직학적 특성 등을 확인하였다. 그 결과 2-3% 글루탈알데히드를 사용한 군이 피로 실험 전후로 투과도, 유순도, 조직학적 특성에서 0.5% 글루탈알데히드 사용 군에 비해 열등하지 않았다. 조직학적으로도 피로 실험 전후에 큰 차이를 발견할 수 없었다(도 5b)

(4) 탈세포화(decellularization) 및 용매 사용 여부에 차이를 둔 실험군

이 군에 속한 샘플은 네 개였다. 탈세포화는 전통적으로 SDS(sodium dodecylsulfate) 용액을 사용하며 최근 다른 물질을 사용하기도 한다. 본 실험에서는 주로 0.1-0.5% SDS 용액을 사용하였으며, 탈세포화여부에 따라, 그리고 용매(에탄올)를 사용했는지 혹은 사용하지 않았는지의 여부에 따라 네 가지의 경우에 대해 피로 실험 전후로 투과성, 유순도, 조직학적 특성을 확인하였다. 그 결과 탈세포화를 시행한 샘플은 피로 실험 이전부터 투과성이 훨씬 높았고, 유순도 자체도 크게 높아져 있었다 (표 3). 피로 실험 후에는 탈세포화 시행 군과 미시행 군의 차이가 더욱 커져서, 탈세포화가 심낭편의 기계적 특성을 매우 악화시킨다고 생각되었다. 뿐만 아니라, 광학 현미경 검사에서도 탈세포화 처리 심낭편은 피로 실험 이전에 이미 콜라젠 섬유다발의 치밀도가 떨어지고, 간혹 간격(gap)이 관찰되고, 피로 실험 후에는 이러한 현상이 심화되어, 콜라겐섬유다발의 분열(fracture), 손상 및 간격(gap)이 더욱 심해지는 것을 확인할 수 있었다(도 5c)

결론적으로, 본 실시예에서 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다. 첫째, 글루타르알데히드 단독으로 사용하여 고정한 경우에 비해 에탄올 등 용매를 함께 사용하여 고정한 경우에 이종 이식편이 더 좋은 기계적 내구성을 가지게 된다. 둘째, 글루타르알데히드와 에탄올을 혼합하여 고정에 사용할 때에, 에탄올의 농도를 70-80 % 정도로 했을 경우 가장 좋은 기계물리학적 내구성을 갖게 한다. 셋째, 글루타르알데히드의 독성을 줄이기 위해 현재 잘 사용되지 않는 고농도(2-3%)의 글루타르알데히드를 사용하여 고정했을 때 그 결과물은 저농도(1%미만) 글루타르알데히드를 사용했을 때와 비슷한 정도의 기계물리학적 내구성을 갖는다. 넷째, 탈세포화는 이종 이식편의 면역원성을 줄이기 위한 필수적인 과정으로 여겨지고 있으나, 탈세포화 처리를 거친 우심낭편은 투과도 및 유순도가 증가하여 기계물리학적 성질이 나빠지고, 피로 실험을 거친 후에는 투과도와 유순도가 더욱 증가하였고, 조직검사에서도 콜라젠섬유의 손상이 심하여 기계물리학적 내구성이 떨어진다.

<실시예 5: 항독소화 처리>

5-1 재료의 준비

도살장에서 도살된 돼지 (생후3개월- 4개월)에서 즉시 심낭을 적출하여 PBS 용액 (0.1M, pH 7.4)에 넣어 ice box에 담아 실험실로 운반한다. 실험군은 총 4군 (1군: 0.625% GA, 2군: 0.625% GA + 80% Ethanol, 3군: 0.625% GA + L-lysine, 4군: 0.625% GA + 80% Ethanol + L-lysine)으로 나누어, 각 군당 심낭 절편의 개수는 8개로 하였다. 또한, Glycine은 nonpolar neutral이고, lysine은 polar basic이지만 모두 NH₃ 기가 작용하므로, 상기 lysine 대신에 glycine을 사용하여 항독소화처리를 하여도 무방하다. 기타 보로하이드라이드, 글루타믹 산, 호모시스테익 산 등의 아미노산을 처리하여 항독소화할 수 있다.

5-2 고정 및 전처치

(1) 고정: 돼지 심낭을 0.625% 글루탈알데히드 (PBS buffer, pH 7.4)에 담가 4℃에서 2일간 고정한 후, 상온에서 7일간 추가로 고정한다. 고정이 끝나면 심낭을 가로 세로 1.5cm 크기의 심낭편들로 나누어서 더 이상의 처치가 필요하지 않은 심낭편들은 PBS 용액으로 상온에서 24시간 동안 세척한 후, 쥐에게 이식한다. 추가적인 항석회화 처리가 필요한 심낭편들은 바로 다음 단계로 진행한다.

(2) Ethanol 전처치: 0.625% 글루탈알데히드 고정 처리를 마친 심낭편들을 80% ethanol (PBS buffer, pH 7.4)이 담긴 shaker bath에 넣어 상온에서 24시간 동안 처리한다. 더 이상의 처치가 필요하지 않은 심낭편들은 PBS 용액으로 상온에서 24시간 동안 세척한 후, 쥐에게 이식한다.

(3) L-lysine 전처치: 0.625% 글루탈알데히드 고정 처리나 추가 Ethanol 처리를 마친 심낭편들을 PBS 용액으로 세척한 후, 0.1M L- lysine solution (acetic acid buffer, 0.5M, pH 7.6)에 담가 37℃에서 48시간 동안 처리한다. 이후 PBS solution으로 상온에서 24시간 동안 세척한 후, 쥐에게 이식할 때까지 4℃의 PBS 용액에 보관한다.

(4) 다른 아미노산을 처리하여 항독소화할 수 있다. Glycine(0.05-0.2M Glysine with PBS solution)을 실온에서 24-48시간동안 담가 처리하거나, Sodium borohydride 용액(Sodium borohydride 0.08M in buffered glycine(0.2% HEPES, 0.2M glycine, 0.1M NAOH, pH 10.3) 또는 buffered carbonate(0.1M NaHCO3, 0.1M Na2CO3, pH; 10.3)에 반응하지 않은 조직내 시약(알데하이드기)을 제거하기 위하여 실온에서 24-48시간 배양처리하거나, 완전 포화된 그루타믹 산 용액(saturated aqueous solution of L-glutamic acid, 또는 0.05-0.1M L-glutamic acid, ph 3, room temperature)이나, 2% 아르기닌( 0.12M, L-arginine in PBS phosphate buffered saline (PBS) at pH 11 )등을 실온에서 24-48시간 배양처리한다. 상기 항독소처리를 시행한 다음 다합성 소독용액에 최종 소독후 2% 벤질알콜(benzyl alcohol)용액이나 1% 벤질코니움(benzylkonium)용액에 보관한다.

5-3 검사

(1) Purpald 검사, 두께, 장력검사

각 군당 1개의 심낭편들은 쥐에게 이식하지 않고 광학 및 전자현미경으로 미세구조를 관찰한다. L-lysine으로 글루탈알데히드 detoxification 처리를 한 심낭편에서 detoxification이 적절히 이루어졌는지 알아보기 위해 aldehyde residue evaluation을 위한 검사를 한다. 이를 위해서 심낭편을 saline으로 세척한 후 0.171M Purpald in 1M NaOH solution에 15분간 soaking한 후 공기 중에 노출시켜 심낭편의 색이 변하는데 걸리는 시간 및 보라색의 정도를 정성적으로 분석한다. Detoxification 처리를 하지 않은 심낭편들에도 같은 검사를 해서 그 결과를 비교한다.

처리된 돼지 심낭을 펼치고 30°씩 각도를 달리하여서 얻어낼 수 있는 모두 6가지의 방향에 대해 0.5 x 5cm 의 장방형 절편을 취하여서 폭 5mm에 대한 인장강도를 측정함으로써 그를 평균한 값이 그 심낭의 인장강도의 대표 값이 되도록 시도하였다. 장력의 측정은 Japan Tech & Manufacture, Digital Force Gauge, Model 5FGN, automated materials testing system을 이용 load speed 100mm/min 로 측정하여 단위는 Kg중/폭5mm 로 표기하였다. 또한 심낭의 두께와 장력과의 관계를 보기 위하여 캘리퍼스 Mitutoyo Thickness Gauge (Digimatic 543-122-15, Mitutoyo, Japan)로 표본들의 두께도 한 샘플에서도 세 번씩 측정하여 각각의 평균값을 사용하였다.

(2) 쥐 이식 모델

Zoletil(0.2cc IP), Rompun(0.1cc IP)으로 쥐를 마취한 다음 등 부위 피하조직에 4개의 pouch를 만든 후, 각각의 pouch에 위의 방법대로 처리한 심낭편들을 임의로 이식한 후 상처를 봉합한다. 심낭편 이식 후 8주가 지나면 실험을 종료하게 되며, CO2 gas를 이용하여 쥐를 마취한다. 이식 시에 만들었던 pouch를 박리하여 심낭편들을 적출해낸다. 적출해낸 각각의 심낭편들을 3등분하여 결과 분석에 사용하게 된다. 쥐의 수명은 2-3년 정도이고 생후 3주까지를 포유기로, 생후 3주에서 14주까지를 성장기로 나누고 생후 14주 이후 성체가 되며, 어린 나이 일수록 석회화가 빨리 진행되는 것으로 알려져 있으므로 본 실시예에서는 생후 3주 연령의 쥐를 사용하였다.

(3) Vonkossa 염색

광학 현미경적 검색은 적출된 심낭을 2-3mm 두께의 조직으로 잘라 Dubosqc-brasil 용액에 1시간 넣어두었다가 10% 포르말린에 후고정한 후 파라핀포매조직을 만들어 2-4um 절편으로 박절하여 hematoxylin-eosin 및 vonkossa 염색하여 조직학적 소견과 칼슘 침착의 정도를 알아본다.

(4) 칼슘 정량

각 군의 심낭편의 석회화 정도를 알아보기 위해 calcium 정량을 시행한다. 이를 위해서 심낭편을 saline으로 세척한 후 24시간 이상 hot dryer에서 건조시킨 후 각각 조직의 무게를 측정한다. Glass tube에 담아 1M HCl 용액 3 ml를 첨가하고 75oC dry oven (Fisher Scientific) 에서 가온하며 완전 용해될 때까지 24시간 이상 기다린다. 용액을 e-tube에 옮겨 automatic environmental speedvac system을 이용하여12시간 이상 증발시킨다. Pellet이 만들어지면, PBS(phosphate buffered solution) 1 ml에 담아 Automatic chemistry I.S.E (HITACHI) 장비를 이용하여 calcium content를 정량 한다.

(5) 통계 방법

통계처리는 Microsoft excel과 SPSS 14.0K를 사용하였고, 모든 통계수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 각 군간의 평균치 비교는 Student T-test로 검증하였고 각 군 간의 통계적 차이는 ANOVA 및 post-hoc test (Turkey test)로 검증하였으며 p<0.05를 의미 있는 것으로 간주한다.

5-4 결과

(1) 장력 검사

각 그룹당 5개의 심낭편을 사용하여 측정하였다. 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군이 1.20 ± 0.30 Kg 중/5mm로 가장 강했으며 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 과 L-lysine 모두 처리한 군 0.90 ± 0.22 Kg 중/5mm, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군이 0.85 ± 0.36 Kg중/5mm, 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군이 0.53 ± 0.34 Kg 중/5mm로 가장 약했다 (도 6). 각 군들간에 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (p=0.035).

(2) 두께

각 그룹당 5개의 심낭편을 사용하여 측정하였다. 각각의 심낭편을 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군이 0.18 ± 0.02 mm로 가장 두꺼웠으며, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군이 0.13 ± 0.03mm, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol과 L-lysine 모두 처리한 군이 0.12 ± 0.01mm, 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군이 각각0.10 ± 0.02mm로 가장 얇았다. 각 군들간에 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (p<0.01) (도 7).

(3) Purpald 검사

돼지 심낭을 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군과 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol과 L-lysine 처리한 군에서 약한 보라색을 띠었고 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군과 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군에서 가장 진한 보라색을 띠었다 (도 8).

(4) Vonkossa 염색

심낭은 장막층, 섬유층, 심외막 결합조직으로 이루어져 있었으며 섬유층이 심낭의 대부분의 두께를 차지 하였고 콜라겐, 탄력섬유 (elastic fibers), 신경, 혈관들, 림프관들로 이루어져 있었다. 칼슘은 주로 심외막 결합조직에 주로 침착 되어 있었고 일부는 섬유층 내로 침범하고 있었다. 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군에서는 거의 전 층에서 칼슘이 침착 되어 있었으며 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol과 L-lysine 처리한 군은 세 층이 비교적 잘 유지되면서 주로 심외막 결합조직 내에 칼슘의 침착이 관찰되었다 (도 9).

(5) 칼슘 정량

각 그룹당 4개씩의 적출한 심낭편을 사용하였다. 돼지 심낭을 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군이 13.6 ± 10.0 ug/mg으로 가장 작았고 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군이 15.3 ± 1.0 ug/mg, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol과 L-lysine 처리한 군이 16.1 ± 11.1 ug/mg, 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군이 51.2 ± 8.5 ug/mg로 가장 많았다. 0.625% 글루탈알데히드 고정만 시행한 군과 비교하여 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol 처리한 군 (p=0.008)과, 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 L-lysine 처리한 군 (p=0.002), 그리고 0.625% 글루탈알데히드 고정 후에 80% Ethanol과 L-lysine 처리한 군 (p=0.012)은 통계적으로 의미 있게 칼슘의 침착량이 적었다 (도 10).

상기와 같이 본 실시예에서 0.625% 글루탈알데히드 고정한 돼지 심낭을 80% Ethanol, L-lysine, 으로 항석회화 처리를 한 후, 각각의 이종 이식 편들의 두께와 장력을 측정하였고 또한 이를 쥐의 피하조직에 이식하여 그 효과를 알아본 결과, Ethanol, L-lysine, 그리고 Ethanol과 L-lysine을 모두 처리한 군에서만 GA 고정만 시행한 군에 비해 통계적으로 유의하게 칼슘의 침착이 적었지만 세 군간에는 차이가 없었다. 또한 이식 전 시행한 두께와 장력검사에서는 L-lysine을 처리한 군이 Ethanol 처리한 군에 비해 좋은 결과를 보였다. 이는 추가적인 Diamine bridge의 효과로 Cross-link가 늘어난 것으로 해석된다. Purpald test 결과에서는 Ethanol만 처리한 군은 GA 고정만 시행한 군과 비슷한 진한 보라색을 띤 반면, L-lysine만 처리하거나 Ethanol과 L-lysine 모두를 처리한 군은 연한 보라색을 띠었다. 이는 L-lysine 처리를 통해 효과적으로 GA의 자유 알데히드기 (-CHO)를 제거하였음을 보여 준다. 결국 이종 이식편의 석회화에는 GA의 자유 알데히드기 외에 여러 가지 반응이 작용하며 이를 억제하기 위하여 작용기전이 다른 Ethanol과 L-lysine를 같이 처리하는 것이 바람직하다. 또한, 본 실시예에서 돼지심낭 보철편은 여러 조건하의 고정 방법들에 따라 콜라겐 골격의 현미경적 구조에서 확연한 차이를 보이지 않아, GA를 이용한 각종 조직 처리과정 중 조직손상에 의한 구조적, 기계적 손실은 없는 것으로 생각되었다.

심장 수술의 증가에 따르는 보철편의 수요 증가가 계속 되는 상황에서 인공 보철편들과 타 동물로부터 채취 제작한 보철편들은 정도의 차이는 있지만 심장 내 이식 후 석회화의 진행에 따르는 중장기 수술 성적의 미흡함이 계속 문제점으로 남아 있다. 이에 본 발명에 따른 이종이식 보철편 제조방법에 의하여 기존의 보철편보다 한결 우수한 석회화 방지 및 완화 효과와 세포독성이 제거된 보철편을 제작, 상품화할 수 있을 것으로 기대되며, 특히 심장판막질환이나 심장혈관수술시 사용할 수 있는 완전 이식 가능한 심장판막이나 심장판막도관, 혈관대체물들의 제작에 적용할 수 있을 것이다.

특히 심장혈관계통의 인공조직이식편의 임상적 사용에는 크게 나누어 이종이식 심낭과 판막으로 볼 수 있다. 이종이식 심낭은 간단한 결손심낭의 보충에서부터 심장혈관계 결손부위의 폐쇄, 보강 등으로부터, 복잡심기형 교정 수술 등에 필요한 보철편으로서의 활용 등 여러 가지가 있다. 주로 혈관 내지 심장의 일부로서 혈액이 누출없이 원하는 방향으로 흐르도록 하는 재료로서의 역할을 하게 된다. 이때 면역원성을 개선하여 석회화 등이 일어나지 않고 오랫동안 제 역할을 하도록 하며, 물리학적 특성의 개선으로 수술 중 조작성도 개선될 것으로 기대하고 있다. 또한, 이식조직 판막은 심장혈관계 수술 중 특히 판막질환에 적용하고자 하는 것으로 특히 지금까지 내구성의 문제로 소아나 젊은 층에서 사용이 기피되던 단점을 극복하고, 장년, 노령층에서도 역시 내구성의 향상으로 재수술을 줄이고, 장기간의 혈역학적으로 개선된 모델을 제작할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 이종 이식 판막도관은 가장 많이 쓰일 것으로 생각되는 분0야는 선천성 심장 기형 중 라스텔리 수술을 받은 환자에서 우심실-폐동맥도관에 사용할 판막으로서이다. 기존의 우심실-폐동맥도관에 사용중인 판막은 그 내구성이 만족스럽지 못하고 수년 내에 판막구조가 파괴되거나 운동성이 저하되어 재수술(교체)이 필요하다. 본 발명에서 개발한 방법으로 고정한 이종이식 판막은 석회화가 적게 일어나고 판막 고유의 기능이 오랫동안 유지되어 한 번의 수술로 더 긴 기간동안 환자가 문제 없이 생활할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 아무런 처리를 하지 않은 경우의, alkaline toluidine blue로 염색한, 사람의 심낭과 돼지의 심낭의 조직학적 검사 사진이다. 단, 위: 광학현미경 사진(A-C: 돼지 심낭, D-F: 사람 심낭, 콜라겐 섬유가 잘 유지되고 있으며, 사람 심낭은 돼지 심낭의 2배 두께이다.), 아래: 전자현미경 사진 (A-C: 돼지 심낭, D-F: 사람 심낭, 콜라겐 섬유가 잘 유지되고 있으며 사람 심낭은 돼지 심낭의 3배 두꼐이다.)

도 2는 글루탈알데히드 고정, 항석회화(ethanol), 무세포화 처리(SDS) 후 돼지 심낭의 콜라겐 양상을 확인할 수 있는 사진이다. 콜라겐 섬유는 D,E,G를 제외하고 잘 유지되었다. 단, A: 0.625% GA, B: ethanol+0.625% GA 고정, C: 0.625% GA+ethanol, D: 무세포화 (0.25% SDS) 처리, E: 무세포화 (0.25% SDS) 처리+0.625% 고정, F: ethanol+무세포화 (0.25% SDS) 처리+0.625% GA, (G) 무세포화 (0.25% SDS) 처리+ethanol+0.625% GA.

도 3은 글루탈알데히드 고정, 항석회화, 무세포화 처리 후 돼지 대동맥 판막, 폐동맥판막의 콜라겐 양상을 확인할 수 있는 사진이다. 콜라겐 섬유는 E,F,H를 제외하고 잘 유지되었다. 단, A: 아무것도 처리하지 않은 돼지 판막, B: 0.625% GA 고정, C: ethanol 처리+0.625% GA 고정, D: 0.625% GA 고정+ethanol 처리, E: 무세포화 (0.25% SDS) 처리, F: 무세포화 (0.25% SDS) 처리+0.625% GA 고정, G: ethanol 처리+무세포화 (0.25% SDS) 처리+0.625% GA 고정, H: 무세포화 (0.25% SDS) 처리+ethanol 처리+0.625% GA 고정.

도 4a는 무세포화가 안된 돼지 대동맥판막(왼쪽 위), 폐동맥판막(오른쪽 위), 소 심낭(왼쪽 아래)의 조직학적 사진이다 (배율: 400배).

도 4b는 탈세포화된 대동맥판막(왼쪽 위), 돼지심낭(오른쪽 위), 폐동맥판막(왼쪽 아래), 소 심낭(오른쪽 아래) 의 H&E 염색 후 조직학적 사진이다 (배율: 400배).

도 5a는 용매혼합여부(1~4) 또는 용매농도의 차이(5~8)에 따른, 피로 실험 전(BF) 후(AF)의 우심낭의 조직학적 사진이다 (배율: 100배).

도 5b는 글루탈알데히드의 농도의 차이에 따른, 피로 실험 전 후의 우심낭의 조직학적 사진이다 (배율: 100배).

도 5c은 탈세포화 및 용매 (80% 에탄올) 사용여부의 차이에 따른,한 피로 실험 전 후의 우심낭의 조직학적 사진이다 (배율: 100배).

도 6은 리신, 에탄올 처리에 따른 심낭편의 장력검사 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 리신, 에탄올 처리에 따른 심낭편의 두께검사 결과를 나타낸 것이다.

도 8는 리신, 에탄올 처리에 따른 Purpaid 검사 결과를 나타낸 것이다.

도 9은 리신, 에탄올 처리에 따른 심낭의 Vonkosa 염색결과를 나타낸 것이다.

도 10은 리신, 에탄올 처리에 따른 심낭의 칼슘 정량 결과를 나타낸 것이다.

도 11는 무-경판막압력상태 고정를 설명하는 그림 및 사진을 나타낸 것이다.

Claims (13)

1. 인간을 제외한 동물의 생체 조직을 무세포화하고, 상기 무세포화된 조직을 에탄올계 용매가 함유된 고농도의 글루탈알데히드 용액에 무경판압력(zero-pressure fixation)상태에서 고정한 후, 상기 조직의 독성을 제거하는 단계를 포함하여 이루어지는 이종이식 보철편의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 생체조직은 심낭, 심장 판막, 심막 또는 경막 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 무세포화는 상기 생체조직에 저장성 완충용액, 고장성 완충용액 및 등장성 완충용액을 순차적으로 처리함으로써 이루어지고, 상기 처리시 회전진탕하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 무세포화는 3~8℃의 저장성 완충용액에서 20-36시간, 3~5℃의 고장성 완충용액에서 6~12시간, 3~5℃의 등장성 완충용액에서 11~13시간 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 저장성 완충용액의 처리는 상기 생체조직을 저장성 완충용액에 6-14시간 동안 처리한 다음, 세정제가 포함된 저장성 완충용액에서 14-24시간 동안 처리하는 과정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서, 상기 고정은 에탄올계 용매가 함유된 1-3% 농도의 글루탈알데히드 용액의 처리 전 또는 처리 후에 0.25-0.625% 농도의 글루탈알데히드 용액을 처리하거나, 에탄올계 용매가 함유된 1-3% 농도의 글루탈알데히드 용액의 처리 전 및 처리 후에 0.25-0.625% 농도의 글루탈알데히드 용액을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 에탄올계 용매는 70-80 %의 에탄올 또는 혼합에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 혼합에탄올은 67.5-75 % 에탄올과 2.5-5 % 옥탄올 또는 옥탄디올로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 독성의 제거는, 상기 고정 후 리신, 그라이신, 보로하이드라이드, 글루타믹산, 아르기닌 중에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 첨가하는 것에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 첨가되는 아미노산의 농도는 0.05~0.2 M 이고, 34~42 ℃에서 24~48 시간 동안 처리함을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1 항 내지 제 5항, 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되는 항석회화 및 항독소화된 무세포성 이종이식 보철편
13. 제 12 항에 있어서, 상기 이종이식 보철편은 심장판막, 수술용 조직패치, 조직 혈관, 인대, 힘줄 및 조직공학용 다공성 지지체에 사용되는 이종이식 보철편.

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