KR101073854B1 - uridine and uridine derivatives of enhancing biosynthesis of hyaluronic acid, glycosaminoglycan and/or collagen - Google Patents
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Abstract
본 발명은 동물 및 사람세포, 동물 그리고 인체에서 히아루론산(hyaluronic acid), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 그리고 콜라겐(collagen)의 합성 촉진을 유도하는 다음 화학식 1로 표시되는 우리딘(uridine) 및 우리딘 유도체(uridine derivatives)의 유효성분을 포함하는 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환, 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 우리딘 및 우리딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환, 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 동물 및 사람세포, 동물 그리고 인체에서 히아루론산, 글리코사미노글리칸 그리고 콜라겐의 생합성을 촉진하는데 우수한 활성을 나타내는 다음 화학식 1로 표시되는 우리딘(uridine) 및 우리딘 유도체(uridine derivatives)를 유효성분으로 함유하는 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환, 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료 조성물에 관한 것이다.The present invention is an arthritis, disc (intervertebral disc prolapse), skin aging and wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, vaginal dryness, gum disease, atopic dermatitis and dry skin containing uridine and uridine derivatives as an active ingredient And to a therapeutic composition, and more particularly, to uridine and urine represented by the following Chemical Formula 1, which shows excellent activity in promoting biosynthesis of hyaluronic acid, glycosaminoglycan and collagen in animals and human cells, animals and humans. Preventive and therapeutic composition of arthritis, disc (intervertebral disc protrusion), skin aging and wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, vaginal dryness, gum disease, atopic dermatitis and dry skin containing uridine derivatives as an active ingredient It is about.
여기서 글리코사미노글리칸이라 함은 아미노당을 포함한 다당류를 의미하는 것으로 히아루론산을 포함하여 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 케라틴황산(keratan sulfate), 헤파린(heparin), 헤파린황산(heparan sulfate), 더마탄황산(dermatan sulfate) 등이 여기에 속한다. Here, glycosaminoglycan refers to polysaccharides containing amino sugars, including hyaluronic acid, chondroitin sulfate, keratan sulfate, heparin, heparan sulfate, and dermatan. Sulfuric acid (dermatan sulfate) and the like.
히아루론산 및 글리코사미노글리칸은 모든 생물체의 존재하는 생체 고분자 다당물질로 인체의 경우 피부에 56%, 근육조직에 35%, 그리고 관절 활액과 척수액등에 9%가 분포되어 생명현상을 유지하는 중요한 역할을 하는 물질로서 히아루론산 다당 1분자는 218개의 물분자와 결합하여 물리적으로 점성과 탄성을 동시에 갖는 특성이 있으며 피부의 근육과 관절에서는 충격흡수 및 윤활작용 등의 다양한 기능을 수행한다. 또한 히아루론산은 CD44, RHAMM등 다양한 세포의 수용체와 결합하여 세포분화, 증식 및 세포간의 신호전달을 통해 생명현상의 조절작용을 하는 중요한 체내 고분자 다당물질이다. Hyaluronic acid and glycosaminoglycans are biopolymer polysaccharides present in all living organisms, and the human body is distributed in 56% of skin, 35% of muscle tissue, and 9% of joint synovial fluid and spinal fluid. As a substance, 1 molecule of hyaluronic acid polysaccharide combines with 218 water molecules to have both physical viscosity and elasticity, and performs various functions such as shock absorption and lubrication in muscles and joints of the skin. In addition, hyaluronic acid is an important body polysaccharide that binds to receptors of various cells such as CD44, RHAMM, and regulates life phenomena through cell differentiation, proliferation and cell signaling.
우리 몸에서 히아루론산 및 글리코사미노글리칸 은 하루에 3g 이상이 매일 자외선이나 염증 등에 의해 생기는 유해산소기를 제거하는 과정에서 분해되며 다시 생합성 되는 빠른 대사 과정을 통해 일정 양이 유지되지만 나이가 들어감에 따라 점차 생산되는 양이 감소하기 시작한다. 분해되는 양보다 생산되는 양이 적어짐에 따라 피부는 탄력을 잃게 되면서 주름이 생기기 시작하고 관절 등에서는 충격흡수와 윤활작용이 제대로 되지 않아 점차 연골이 파괴되고 마모되는 퇴행성 질환들의 원인이 지속적으로 악화되는 악순환이 일어난다. In our bodies, hyaluronic acid and glycosaminoglycans are broken down in the process of removing harmful oxygen caused by ultraviolet rays or inflammation every day, and more than 3g per day is maintained by a fast metabolism process, which is maintained again, but with age Gradually, the amount produced decreases. As the amount produced is less than the amount to be degraded, the skin loses its elasticity, wrinkles begin to form, and in the joints, shock absorption and lubrication are not performed properly, and the causes of degenerative diseases that gradually destroy cartilage and wear are continuously worsened. A vicious cycle occurs.
지금까지 히아루론산 및 글리코사미노글리칸을 이용한 의약품 개발은 주로 백내장 수술시 안구 형태 유지를 위한 수술보조제, 수술후 유착방지제, 주름제거 주사제, 상처치유제, 서방출형제제 및 세포치료제의 Carrier, 안구건조증 치료 안약, 조직공학에서 세포증식 지지대(Scafford) 그리고 화장품의 피부보습제로 다양한 제품들이 히아루론산 및 글리코사미노글리칸 의 물리 화학적 성질을 활용하여 안전하게 사용되고있다. Until now, the development of medicines using hyaluronic acid and glycosaminoglycan has been mainly used as a surgical aid for maintaining eye shape during cataract surgery, anti-adhesion after surgery, anti-wrinkle injection, wound healing agent, sustained-release agent, and cell therapy, dry eye syndrome. As a skin moisturizer for therapeutic eye drops and tissue engineering (Scafford) and cosmetics, various products are safely used by utilizing the physicochemical properties of hyaluronic acid and glycosaminoglycan.
히아루론산 및 글리코사미노글리칸은 아미노당의 생합성 경로 중 뮤코다당을 생합성 하는 경로를 통하여 합성된다. 히아루론산 및 글리코사미노글리칸은 포도당 혹은 글리코겐을 원료로 사용하여 일련의 대사 과정을 거쳐 합성되는데 합성 경로 중 UTP 한분자가 사용되어지는데 UTP 당 유도체의 생합성에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Hyaluronic acid and glycosaminoglycans are synthesized through the biosynthesis of mucopolysaccharides in the biosynthetic pathway of amino sugars. Hyaluronic acid and glycosaminoglycan are synthesized through a series of metabolic processes using glucose or glycogen as a raw material. One molecule of UTP is used in the synthetic route, and it is known to play an important role in the biosynthesis of UTP sugar derivatives.
UTP 합성의 공급원으로 우라실, 우리딘, UMP, UDP 및 우리딘 유도체 등을 공급하여 뮤코다당의 합성을 증가시킬 수 있을 것으로 판단하였다. It was determined that uracil, uridine, UMP, UDP and uridine derivatives may be supplied as a source of UTP synthesis to increase mucopolysaccharide synthesis.
우리딘은 RNA를 구성하는데 필요한 4개의 리보뉴클레오사이드 중 하나로서 자연계에 널리 분포되어 있는 물질로 분자량은 244.20 이며, 분자식은 C9H12N2O6 로 이루어져 있다. Uridine is one of the four ribonucleosides necessary for constructing RNA and is widely distributed in nature. The molecular weight is 244.20 and the molecular formula is C9H12N2O6.
현재까지 알려져 있는 우리딘의 약리작용은 우리딘이 체내에 투여되면 우리딘키나제 효소의 촉매작용에 의하여 우리딘 5'-포스페이트로 전환됨으로써 효소의 결핍이나 피리미딘 뉴클레오타이드 결핍과 핵산합성의 결핍에 유용하여 오르틱산뇨증을 경감시키는 약제로 사용된 경우가 보고된 바 있다 (MATINDALE, 1989, 1627). 우리딘 관련 자료를 조사하여 보면 녹십자에서 콜라겐 관절염 치료제 (등록번호 특1994-0008033)로 등록되어있다. The pharmacological action of uridine, known to date, is useful for enzyme deficiency, pyrimidine nucleotide deficiency, and nucleic acid synthesis deficiency by converting uridine into uridine 5'-phosphate by uridine kinase enzyme catalysis. Has been reported to be used as a medicament to reduce ortic aciduria (MATINDALE, 1989, 1627). Investigating uridine-related data, Green Cross is registered as a therapeutic agent for collagen arthritis (Registration No. 1994-0008033).
우리딘이 현재까지 의약품에 사용된 경우를 살펴보면 다른 약효물질과 복합제제로서 혈관성 뇌질환, 간장보호, 말초신경증, 조직저산소증 등에 사용되었다. Uridine has been used in medicine to date, and it has been used as a combination drug with other drugs, vascular brain disease, hepatoprotective, peripheral neuropathy, and tissue hypoxia.
우리딘에 대한 독성 실험결과, 건강한 랫트 및 마우스에 우리딘 0.01, 0.1, 10, 100mg/Kg을 투여하고 1주일 이상 관찰하여 아무런 이상을 발견할 수 없어 거의 독성이 없음을 확인하였다. As a result of toxicity test for uridine, uridine was administered to 0.01, 0.1, 10, and 100 mg / Kg in healthy rats and mice, and observed for more than one week.
본 발명자는 우리딘 및 우리딘 유도체가 연골세포(chondrocyte cell), 섬유아세포(fibroblast cell), 활액막세포(synovial cell) 등에서 히아루론산, 글리코사미노글리칸 그리고 콜라겐의 생합성을 촉진하는 효능이 있음을 최초로 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors are the first to demonstrate that uridine and uridine derivatives are effective in promoting the biosynthesis of hyaluronic acid, glycosaminoglycans and collagen in chondrocyte cells, fibroblast cells, synovial cells, and the like. It confirmed and completed this invention.
본 발명자는 우리딘 및 우리딘 유도체가 연골세포, 활액막세포, 섬유아세포 등에서 히아루론산, 글리코사미노글리칸 그리고 콜라겐의 생합성을 촉진하는 효능이 있음을 최초로 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 동물 및 사람세포, 동물 그리고 인체에서 히아루론산 및 글리코사미노글리칸 합성 촉진을 유도하는 우리딘 및 우리딘 유도체의 유효성분을 포함하는 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환, 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료 조성물에 관한 것이다. The present inventors completed the present invention for the first time to confirm that uridine and uridine derivatives are effective in promoting biosynthesis of hyaluronic acid, glycosaminoglycan and collagen in chondrocytes, synovial membrane cells, fibroblasts, and the like. Accordingly, an object of the present invention is to provide arthritis, discs (intervertebral discs), skin aging and the like, including the active ingredients of uridine and uridine derivatives that induce the promotion of hyaluronic acid and glycosaminoglycan synthesis in animals and human cells, animals and humans. Wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, vaginal dryness, gum disease, atopic dermatitis and dry skin preventive and therapeutic composition.
본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 우리딘(uridine) 및 우리딘 유도체(uridine derivatives)와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료 조성물을 그 특징으로 한다. The present invention includes arthritis, disc (intervertebral disc protrusion), skin aging and wrinkles, dry eye, wound healing, containing uridine and uridine derivatives represented by the following formula (1) and a pharmaceutically acceptable carrier: , Scar removal, vaginal dryness, gum disease atopic dermatitis and dry skin preventive and therapeutic composition.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환, 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료에 유효한 조성물로 특히 세포내에서 히아루론산, 글리코사미노글리칸, 그리고 콜라겐의 합성 효과를 나타내는 우리딘 및 우리딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료제 조성물에 관한 것이다.The present invention is a composition effective for the prevention and treatment of arthritis, disc (intervertebral disc prolapse), skin aging and wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, vaginal dryness, gum disease, atopic dermatitis and dry skin, especially intracellular hyaluronic acid, Arthritis, disc (intervertebral disc protrusion), skin aging and wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, vaginal dryness, containing glycosaminoglycans and uridine and uridine derivatives showing the synthetic effect of collagen as active ingredients It relates to a composition for preventing and treating gum disease atopic dermatitis and dry skin.
우리딘 및 우리딘 유도체는 세포내에서 히아루론산, 글리코사미노글리칸 그리고 콜라겐의 생성을 촉진시켜 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환 아토피피부염 및 건조피부를 치료하게 된다.Uridine and uridine derivatives promote the production of hyaluronic acid, glycosaminoglycans and collagen in cells, resulting in arthritis, discs (intervertebral disc prolapse), skin aging and wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, dryness, gums Disease Atopic dermatitis and dry skin will be treated.
본 발명에 사용한 우리딘 및 우리딘 유도체는 천연에서 추출하거나 합성 방법을 사용하여 제조할 수 있다. Uridine and uridine derivatives used in the present invention can be extracted from nature or prepared using synthetic methods.
이에, 본 발명에서는 생리활성이 부여된 우리딘 및 우리딘 유도체에 대하여 연골세포, 섬유아세포, 그리고 활액막세포에서 히아루론산, 글리코사미노글리칸 그리고 콜라겐의 생체내 합성을 측정하였으며, 그 결과 이들 화합물이 우수한 활성을 보임을 확인할 수 있었다. Thus, in the present invention, the in vivo synthesis of hyaluronic acid, glycosaminoglycans and collagen in chondrocytes, fibroblasts, and synovial membrane cells for uridine and uridine derivatives to which physiological activity is given was measured. It was confirmed that the excellent activity.
본 발명은 노화과정에서 발생하는 세포의 히아루론산 및 글리코사미노글리칸 의 생산 능력의 저하를 외부 히아루론산의 주입을 통해 세포 스스로 합성능력을 일정기간 회복할 수 있다는 사실에 근거하여 세포내로 흡수가 용이한 우리딘 및 우리딘 유도체를 통해 생합성 기전을 촉진하는 새로운 치료물질에 관한 것이다. The present invention is easy to absorb into the cell based on the fact that the cellular self-synthesis capacity can be restored for a certain period of time through the injection of external hyaluronic acid, the degradation of the production capacity of hyaluronic acid and glycosaminoglycans of the cells generated during the aging process It relates to new therapeutic substances that promote biosynthetic mechanisms through uridine and uridine derivatives.
여기에는 기존의 히아루론산 및 글리코사미노글리칸 생합성 기전에 대한 연구를 통해 세포내 합성 과정에서 Rate- determining step이 존재하고 이 생합성 반응단계에 관여하는 효소의 활성이 히아루론산의 생합성 양을 결정하고 효소 활성 촉진 물질을 통해 인위적으로 빠른 시간내에 체내 히아루론산 및 글리코사미노글리칸의 양을 증가시키고 이 결과로 히아루론산 및 글리코사미노글리칸 의 생산저하 및 기능저하로 인하여 유발될 수 있는 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환 아토피피부염 및 건조피부 등의 질환 치료제 개발에 관한 것이다. Here, existing studies on hyaluronic acid and glycosaminoglycan biosynthesis mechanisms include rate-determining steps in the intracellular synthesis process, and the activity of the enzymes involved in this biosynthesis reaction step determines the amount of biosynthesis of hyaluronic acid. Promoting substances increase the amount of hyaluronic acid and glycosaminoglycans in the body artificially and in a short time, resulting in decreased production and functioning of hyaluronic acid and glycosaminoglycans. ), Skin aging and wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, vaginal dryness, gum disease atopic dermatitis and dry skin disease treatment.
여기서 관절염이라 함은 노화로 인한 퇴행성관절 및 골관절염을 말하는 것으로 관절강내의 히아루론산 및 글리코사미노글리칸의 생성부족 혹은 저분자로 인한 관절질환을 의미한다. Here, arthritis refers to degenerative joints and osteoarthritis due to aging, and refers to joint diseases due to lack of production or low molecular weight of hyaluronic acid and glycosaminoglycan in the joint cavity.
이제까지 밝혀진 퇴행성관절염에서의 히아루론산의 약효는 통증완화, 염증제거, 연골조직파괴 방지, 윤활작용으로 활동성 증가와 최근 보고에 따르면 장기간 투여시 연골세포 증식 및 연골기질 합성 촉진으로 연골 재생 효과가 임상적으로 검증되고 있으며 분자적으로 히아루론산 주사의 효과는 염증 및 통증, 연골파괴 분해효소의 유전자 발현이나 활성을 억제하는 기전 및 연골 세포 분화 및 증식과 기질물질의 생합성 증가 기전들이 밝혀지고 있다. The efficacy of hyaluronic acid in degenerative arthritis has been improved by pain relief, inflammation removal, prevention of cartilage tissue destruction, lubrication, and recent reports. Molecular effects of hyaluronic acid injection have been demonstrated to inhibit inflammation and pain, to inhibit gene expression and activity of chondrogenic enzymes, and to differentiate and proliferate chondrocytes and increase biosynthesis of matrix substances.
하지만 외부 주사된 히아루론산은 체내 반감기가 12시간 정도로 직접적으로 약효를 발휘하는 것이아니라 1주일 간격으로 5회 관절강내 주사를 통해 관절 활액막의 Type B synovial cell을 자극하여 히아루론산의 생합성을 증가시킴으로 관절내에 히아루론산의 양이 건강한 관절의 상태로 바뀌게 만들어 주는 것으로 치료 효과를 나타내며 치료 후 1년 이내에 다시 히아루론산의 생산량이 서서히 줄어들면서 관절염의 증상이 다시 재발하게 되는 현상을 통해 인체내에 히아루론산의 생합성 양의 증가가 질병 치료와 직접적 연관이 있음이 밝혀졌다. However, the externally injected hyaluronic acid does not directly exert its half-life in the body for about 12 hours, but stimulates Type B synovial cells of the synovial joint of the synovial membrane by increasing the biosynthesis of hyaluronic acid through intra-articular injection five times a week. Changes in the amount of healthy joints to the state of the joints have a therapeutic effect, the production of hyaluronic acid gradually decreases again within one year after treatment, the symptoms of arthritis recurs again increases the amount of biosynthesis of hyaluronic acid in the body It has been found to be directly related to treatment.
히아루론산 및 글리코사미노글리칸 의 생산 저하 및 기능저하로 인하여 발생되는 질환들은 장기적인 투여가 불가피한데 근본해결은 부작용이 없으면서 장기적으로 복용할 수 있는 효과적인 약물의 개발이 무엇보다 필요하다. 히아루론산을 직접 사용할 경우 국부적인 효과밖에 볼 수 없는 제한된 효능을 갖지만 우리딘 및 우리딘 유도체는 다양한 투여 경로를 갖고 있어 빠른 효과 및 안전한 치료방법으로 전신에서 히아루론산 및 글리코사미노글리칸 증가에 따른 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료 등의 다양한 용도로 개발될 수 있다. Long-term administration of diseases caused by decreased production and hypofunction of hyaluronic acid and glycosaminoglycan is inevitable. Fundamental solution is the development of effective drugs that can be taken in the long term without side effects. When hyaluronic acid is used directly, it has limited efficacy that can only be seen as a local effect, but uridine and uridine derivatives have various routes of administration, and thus, as a rapid effect and safe treatment method, arthritis due to the increase of hyaluronic acid and glycosaminoglycans in the whole body, It can be developed for various uses such as disc (intervertebral disc protrusion), skin aging and wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, vaginal dryness, gum disease atopic dermatitis and dry skin prevention and treatment.
우리딘 및 우리딘의 유도체는 다음을 포함할 수 있다. Uridine and derivatives of uridine may include the following.
우리딘의 유도체는 우라실, 우리딘모노포스페이트, 우리딘디포스페이트, triacetyl uridine, tribenzoyl uridine, 5-ethyl uridine, 2-deoxyuridine, isopropylidene uridine 등이 여기에 속한다. Uridine derivatives include uracil, uridine monophosphate, uridine diphosphate, triacetyl uridine, tribenzoyl uridine, 5-ethyl uridine, 2-deoxyuridine, and isopropylidene uridine.
따라서, 상기 화학식 1로 표시되는 우리딘 및 우리딘 유도체가 유효성분으로 함유되어 있는 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료제 조성물은 당 아미노산 합성과정의 rate-determining step의 활성화를 통하여 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료를 할 수 있음으로 인하여 히아루론산 및 글리코사미노글리칸 과 관련된 각종 질병에 대한 다양한 약제로의 개발이 가능하리라 사료된다. 본 발명에 따른 우리딘 및 우리딘 유도체에 의한 히아루론산 및 글리코사미노글리칸 관련 상기 질환 예방 및 치료제 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 우리딘 및 우리딘 유도체를 유효성분으로 함유하고, 여기에 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 필요에 따라 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환, 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료제로 제조할 수 있다.
Therefore, arthritis, disc (intervertebral disc prolapse), skin aging and wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, vaginal dryness, gum disease atopic dermatitis, containing uridine and uridine derivatives represented by Formula 1 as active ingredients And preventive and therapeutic composition of dry skin is through the activation of rate-determining step of sugar amino acid synthesis process arthritis, disc (intervertebral disc prolapse), skin aging and wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, vaginal dryness, gum disease atopy Due to the prevention and treatment of dermatitis and dry skin, it is possible to develop various medicines for various diseases related to hyaluronic acid and glycosaminoglycan. The disease prevention and treatment composition related to hyaluronic acid and glycosaminoglycan by uridine and uridine derivatives according to the present invention contains uridine and uridine derivatives represented by Formula 1 as active ingredients, It can be prepared as a preventive and therapeutic agent for arthritis, disc (intervertebral disc prolapse), skin aging and wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, vaginal dryness, gum disease, atopic dermatitis and dry skin as needed with acceptable carriers. have.
*본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 히아루론산 및 글리코사미노글리칸 관련 상기 질환 예방 및 치료제의 약학적 조성물은 상기 우리딘 및 우리딘유도체를 유효 성분으로 함유한다. 상기 우리딘 및 우리딘 유도체는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 우리딘 및 우리딘 유도체를 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 우리딘 및 우리딘 유도체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention will vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to the patient. It may be prescribed. The pharmaceutical composition of the above-mentioned prophylactic and therapeutic agents related to hyaluronic acid and glycosaminoglycan of the present invention contains the uridine and uridine derivatives as active ingredients. The uridine and uridine derivatives can be administered orally or parenterally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical formulations. That is, the uridine and uridine derivatives of the present invention can be administered in various oral and parenteral formulations during actual clinical administration, and when formulated, commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants. It is prepared using diluents or excipients. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, and capsules, and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose in uridine and uridine derivatives. And gelatin etc. are mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions and syrups, and may include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerol and gelatin may be used.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 우리딘 및 우리딘유도체의 유효용량은 농도 의존적이나 바람직하게는 0.1mg 내지 1g/㎏이고, 더욱 바람직하기로는 0.4 내지 200 mg/kg이며, 하루 1-6 회 투여될 수 있다. Dosage units may contain, for example, one, two, three or four times the individual dosage, or they may contain 1/2, 1/3 or 1/4 times. The individual dosage preferably contains an amount in which the effective drug is administered at one time, which usually corresponds to all, 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily dose. The effective dose of uridine and uridine derivatives is concentration dependent but is preferably 0.1 mg to 1 g / kg, more preferably 0.4 to 200 mg / kg, and may be administered 1-6 times a day.
또한, 본 발명은 우리딘 및 우리딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환 아토피피부염 및 건조피부 치료용 건강식품 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 건강식품이란 일반 식품에 우리딘 및 우리딘 유도체를 첨가함으로써 일반 식품의 기능을 향상시킨 식품이며, 우리딘 및 우리딘 유도체를 일반식품에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조할 수 있다. 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오고, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하였기 때문에 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.In addition, the present invention is a treatment for arthritis, disc (intervertebral disc prolapse), dry skin and wrinkles, dry eye, wound healing, scar removal, vaginal dryness, gum disease atopic dermatitis and dry skin containing uridine and uridine derivatives as an active ingredient It provides a health food composition for. In the present specification, the health food is a food that improves the function of the general food by adding uridine and uridine derivatives to the general food, and the uridine and uridine derivatives are added to the general food, or manufactured by encapsulation, powdering, and suspension. can do. When ingested, it brings a specific effect on health, and unlike the general medicine because it is made of food as a raw material has the advantage that there is no side effect that can occur when taking long-term use of the drug.
본 발명의 우리딘 및 우리딘 유도체를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 우리딘 및 우리딘 유도체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 우리딘 및 우리딘 유도체를 식품 또는 음료의 제조 시에 원료에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강식품은 상기 약학적 조성물로 이용하는 경우는 측정된 독성 범위내의 우리딘 및 우리딘 유도체를 함유되도록 하는 것이 바람직하다. When the uridine and uridine derivatives of the present invention are used as food additives, the uridine and uridine derivatives may be added as they are or used together with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods. The mixed amount of the active ingredient can be suitably determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). In general, uridine and uridine derivatives may be added in amounts of 0.0001 to 10% by weight, preferably 0.1 to 5% by weight, based on the raw materials in the manufacture of food or beverage. However, in the case of prolonged ingestion for health and hygiene purposes or for health control purposes, the amount can be adjusted below the above range. In addition, when the health food of the present invention is used in the pharmaceutical composition, it is preferable to contain uridine and uridine derivatives within the measured toxicity range.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 우리딘 및 우리딘 유도체를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 구체적으로, 우리딘 및 우리딘 유도체를 함유하는 건강 식품으로는 우리딘 및 우리딘 유도체를 주성분으로 만든 즙, 차, 젤리, 쥬스 등의 건강식품 및 기호품을 들 수 있다. There is no particular limitation on the kind of food. Examples of foods to which the uridine and uridine derivatives may be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionary, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages , Teas, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes. Specifically, health foods containing uridine and uridine derivatives include health foods and favorite products such as juice, tea, jelly, juice, etc., which have uridine and uridine derivatives as main ingredients.
본 발명은 동물 및 사람세포, 동물 그리고 인체에서 히아루론산 및 글리코사미노글리칸 합성 촉진을 유도하는 우리딘 및 우리딘 유도체의 유효성분을 이용한 관절염, 디스크(추간판돌출증), 피부노화 및 주름살, 안구건조증, 상처치유, 흉터제거, 질건조증, 잇몸질환, 아토피피부염 및 건조피부의 예방 및 치료에 활용할 수 있다. The present invention provides arthritis, disc (intervertebral disc protrusion), skin aging and wrinkles, dry eye with an active ingredient of uridine and uridine derivatives that induce the promotion of hyaluronic acid and glycosaminoglycan synthesis in animals and human cells, animals and human body It can be used for the prevention and treatment of wound healing, scar removal, vaginal dryness, gum disease, atopic dermatitis and dry skin.
도1 은 우리딘에 의한 연골세포의 증식 효과를 살펴본 그래프이다.
도2 는 우리딘에 의한 연골세포 내에서의 히아루론산 합성 정도를 살펴본 그래프이다.
도3 은 우리딘에 의한 연골세포 내에서의 GAG 합성 정도를 살펴본 그래프이다.
도4 는 우리딘에 의한 섬유아세포의 히아루론산 합성 정도를 살펴본 그래프이다.
도5 는 우리딘에 의한 섬유아세포에서의 콜라겐 합성 정도를 살펴본 그래프이다.
도6 은 우리딘에 의한 synovial 세포에서의 히아루론산 합성 정도를 살펴본 그래프이다.
도7 은 우리딘에 의한 synovial 세포에서의 콜라겐 합성 정도를 살펴본 그래프이다.
도8 은 UMP에 의한 연골세포에서의 증식 효과를 살펴본 그래프이다.
도9 는 UMP에 의한 연골세포 내에서의 히아루론산 합성 정도를 살펴본 그래프이다.
도10 은 UMP에 의한 연골세포 내에서의 GAG 합성 정도를 살펴본 그래프이다.
도11 은 UMP에 의한 섬유아세포 내에서의 히아루론산 합성 정도를 살펴본 그래프이다.
도12 는 UMP에 의한 섬유아세포 내에서의 콜라겐 합성 정도를 살펴본 그래프이다.
도13 은 UMP에 의한 synovial 세포 내에서의 히아루론산 합성정도를 살펴본 그래프이다.
도14 는 UMP에 의한 synovial 세포 내에서의 콜라겐 합성 정도를 살펴본 그래프이다.1 is a graph illustrating the proliferation effect of chondrocytes by uridine.
Figure 2 is a graph of the degree of synthesis of hyaluronic acid in chondrocytes by uridine.
3 is a graph illustrating the degree of GAG synthesis in chondrocytes by uridine.
4 is a graph illustrating the degree of synthesis of hyaluronic acid of fibroblasts by uridine.
Figure 5 is a graph of the degree of collagen synthesis in the fibroblasts by uridine.
Figure 6 is a graph of the degree of synthesis of hyaluronic acid in the synovial cells by uridine.
7 is a graph illustrating the degree of collagen synthesis in synovial cells by uridine.
8 is a graph illustrating the proliferation effect in chondrocytes by UMP.
9 is a graph illustrating the degree of hyaluronic acid synthesis in chondrocytes by UMP.
10 is a graph illustrating the degree of GAG synthesis in chondrocytes by UMP.
11 is a graph illustrating the degree of synthesis of hyaluronic acid in fibroblasts by UMP.
12 is a graph illustrating the degree of collagen synthesis in fibroblasts by UMP.
FIG. 13 is a graph illustrating the degree of hyaluronic acid synthesis in synovial cells by UMP. FIG.
14 is a graph illustrating the degree of collagen synthesis in synovial cells by UMP.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠지만 본 발명의 범위가 다음 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the scope of the present invention is not limited only to the following examples.
실시예 1 : 우리딘의 연골세포에서의 증식 효과 Example 1 Uridine Proliferation Effect in Chondrocytes
세포를 96-well plate에 3x103cell/well로 옮겨 cell을 부착시킨 후 1% FBS-DMEM 배지로 교체(FBS에 대한 영향을 최소화 시켜줌) 해주고 우리딘을 첨가하여 48시간 배양하였다. 우리딘에 대한 세포증식 정도는 Cell Proliferation Kit(XTT, Roche)를 사용하여 control군에 대한 상대적 비교를 하였다. 간단한 KIT사용 방법은 XTT labeling reagent와 Electron coupling reagent 을 혼합하여 각 well에 동일하게 처리한 다음 4 시간동안 5% CO2, 37oC incubation하여 490nm 파장에서 ELISA reader로 읽어낸다. 결과는 도 1을 참고한다.
The cells were transferred to 3x10 3 cells / well in a 96-well plate, and the cells were attached and replaced with 1% FBS-DMEM medium (minimizing the effects on FBS), followed by incubation for 48 hours with uridine. The degree of cell proliferation against uridine was compared with the control group using the Cell Proliferation Kit (XTT, Roche). The simple method of using KIT is to mix XTT labeling reagent and Electron coupling reagent in the same well, and then incubate for 5 hours at 5% CO 2 , 37 o C and read with ELISA reader at 490nm wavelength. See FIG. 1 for the results.
실시예 2 : 우리딘의 연골세포에서의 히아루론산 합성Example 2 Hyaluronic Acid Synthesis in Uridine Chondrocytes
1. 연골 세포분리 1. Chondrocyte Separation
3~4 주령 토끼에서 무균상태에서 연골조직을 분리한 후 0.2% collagenase type II로 37℃에서 4시간 처리한 후 100um filter로 filtering하여 연골 세포를 얻었다. 세포는 37℃, 5% CO2에서 연골세포배지(DMEM/F12, 10% FBS, Insulin, Nonessential amino acid, Ascorbic acid, penicillin, Gibco BRL products)로 2일마다 교체해주었다. Cartilage tissue was isolated from sterile rats at 3 to 4 weeks of age, treated with 0.2% collagenase type II at 37 ° C for 4 hours, and then filtered with 100um filter to obtain cartilage cells. Cells were replaced every 2 days with chondrocytes (DMEM / F12, 10% FBS, Insulin, Nonessential amino acid, Ascorbic acid, penicillin, Gibco BRL products) at 37 ° C and 5% CO 2 .
2. bead 만들기 2. make bead
연골세포가 2X106cell/ml가 되게 1.5% alginate solution과 혼합한 후 102mM CaCl2solution(pH7.4)내로 주사기를 이용하여 한방울씩 떨어뜨려 chondrocyte-bead를 제작하였고 마지막으로 0.15M NaCl로 씻어주었다. Bead는 37℃, 5% CO2에서 연골배양배지(DMEM/F12, Nonessential amino acid, Ascorbic acid, Penicillin, Gibco BRL products)와 우리딘을 첨가하여 실험 전까지 2일마다 교체해주었다. Chondrocytes were mixed with 1.5% alginate solution to 2X10 6 cell / ml, and then dropped into each drop of 102mM CaCl 2 solution (pH7.4) using a syringe to make chondrocyte-bead, and finally washed with 0.15M NaCl. . Beads were changed every 2 days before the experiment by adding cartilage culture medium (DMEM / F12, Nonessential amino acid, Ascorbic acid, Penicillin, Gibco BRL products) and uridine at 37 ℃ and 5% CO2.
3. Bead내 히아루론산의 함량 3. Content of Hyaluronic Acid in Bead
3-1. Bead 획득 3-1. Bead acquisition
Bead를 연골세포 배양배지와 우리딘을 첨가하여 2주간 배양한 후 PBS로 washing하였다. Bead를 수거하여 55mM sodium citrate, 30mM EDTA, 150mM sodium chloride(pH6.8) 용액에 4℃, 10~15min 동안 처리한 후 Papain 20ug/ml in 0.1M sodium acetate, 50mM sodium EDTA, 5mM L-cyctein hydrochloride(pH5.53)을 56~60℃, overnight 반응시켰다. Enzyme inhibition을 위해 10분간 heating 후 얻어진 sample을 assay전까지 -20℃에서 보관하였다. Beads were cultured for 2 weeks by adding chondrocyte culture medium and uridine and washed with PBS. The beads were collected and treated in 55mM sodium citrate, 30mM EDTA, 150mM sodium chloride (pH6.8) solution at 4 ℃ for 10-15min, followed by Papain 20ug / ml in 0.1M sodium acetate, 50mM sodium EDTA, 5mM L-cyctein hydrochloride (pH5.53) was made to react overnight at 56-60 degreeC. For enzyme inhibition, the sample obtained after heating for 10 minutes was stored at -20 ℃ until the assay.
3-2. HA assay 3-2. HA assay
Assay 하루 전 HA binding protein(HABP)를 96 well plate에서 4℃, overnight으로 코팅 후 1% BSA로 blocking 시킨다. 37℃에서 60분 동안 samples을 binding 시킨 후 0.5% PBST로 washing한다. Biotin-HABP를 60분 동안 RT에서 binding 시킨 후 Extra-avidin alkaline phosphatase를 첨가한 후 p-nitrophenyl-phosphate(PNPP)으로 발색시킨다. 이 반응은 3N-NaOH로 inhibition 시키고 405nm파장에서 흡광도를 읽는다. 결과는 도 2를 참고한다.
One day prior to assay, HA-binding protein (HABP) was coated in a 96 well plate at 4 ° C overnight and blocked with 1% BSA. After binding the samples for 60 minutes at 37 ℃ washed with 0.5% PBST. After biotin-HABP was bound for 60 minutes at RT, extra-avidin alkaline phosphatase was added and then developed with p-nitrophenyl-phosphate (PNPP). This reaction is inhibited with 3N-NaOH and the absorbance is read at 405nm wavelength. See FIG. 2 for the results.
실시예 3 : 우리딘의 연골세포에서의 GAG 합성Example 3 GAG Synthesis in Uridine Chondrocytes
96well에 Sample 적정량과 DMB(dimethylmethylene blue) dye(in formate solution) 를 mixing하여 540nm파장에서 흡광도를 읽어낸다. 결과는 도 3을 참고한다.
The absorbance is read at 540nm wavelength by mixing the sample well with 96well and DMB (dimethylmethylene blue) dye (in formate solution). See FIG. 3 for the results.
실시예 4 : 우리딘의 섬유아세포에서의 히아루론산 합성 Example 4 Hyaluronic Acid Synthesis in Uridine Fibroblasts
토끼의 섬유아세포를 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지에 배양하여, 24well-plate에 2x104cell/well로 첨가하여 재배양(subculture)하였다. 다음날, 5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 우리딘을 첨가하여 3일 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 3일 후 배지내의 total hyaluronic acid양은 HA binding protein(HABP)와 HA binding protein-biotin 의 sandwich ELIZA 방법으로 측정하여 405nm 파장에서 읽어내어 확인하였다. Standard로는 Hyaluronic acid(SIGMA H)를 사용하였다. 결과는 도 4를 참고한다.
Rabbit fibroblasts were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium containing 10% FBS (fetal bovine serum), and subcultured by adding 2 × 10 4 cells / well to a 24 well plate. The next day, uridine was added to DMEM medium containing 5% FBS and incubated at 37 ° C. for 3 days. After 3 days of culture, the total amount of hyaluronic acid in the medium was measured by the sandwich ELIZA method of HA-binding protein (HABP) and HA-binding protein-biotin. Hyaluronic acid (SIGMA H) was used as a standard. See FIG. 4 for the results.
실시예 5 : 우리딘의 섬유아세포에서의 콜라겐 합성 Example 5 Collagen Synthesis in Uridine Fibroblasts
위의 실험예 4)와 같은 방법으로 얻어진 배양액 내의 total collagen양은 Sircol red dye bind assay 방법으로 확인하였다. Dye와 결합된 collagen을 원심분리로 down시킨 후 Alkali reagent을 첨가하여 540nm 파장에서 읽어내어 확인하였다. 결과는 도 5를 참고한다.
The total collagen amount in the culture solution obtained by the same method as Experimental Example 4) was confirmed by Sircol red dye bind assay. The collagen bound with Dye was down by centrifugation, and the result was read at 540 nm by adding Alkali reagent. See FIG. 5 for the results.
실시예 6 : 우리딘의 synovial 세포 내에서의 히아루론산 생산 Example 6 Hyaluronic Acid Production in Urindine Synovial Cells
사람의 synovial 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지에 배양하여, 24well-plate에 2x104cell/well로 첨가하여 재배양(subculture)하였다. 다음날, 5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 바꾸고, 우리딘을 첨가하여 3일 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 3일 후 배지내의 total hyaluronic acid양은 HA binding protein(HABP)와 HA binding protein-biotin 의 sandwich ELIZA 방법으로 측정하여 405nm 파장에서 읽어내어 확인하였다. Standard로Hyaluronic acid(SIGMA H)를 사용하였다. 결과는 도 6을 참고한다.
Human synovial cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium containing 10% FBS (fetal bovine serum), and subcultured by adding 2 × 10 4 cells / well to a 24well-plate. The next day, the cells were changed to DMEM medium containing 5% FBS and incubated at 37 ° C. for 3 days with the addition of uridine. After 3 days of culture, the total amount of hyaluronic acid in the medium was measured by the sandwich ELIZA method of HA-binding protein (HABP) and HA-binding protein-biotin. Hyaluronic acid (SIGMA H) was used as a standard. See FIG. 6 for the results.
실시예 7 : 우리딘의 synovial 세포 내에서의 콜라겐 생산 Example 7 Uridine Collagen Production in Synovial Cells
위의 실험예 6)과 같은 방법으로 얻어진 배양액 내의 total collagen양은 Sircol red dye bind assay 방법으로 확인하였다. Dye와 결합된 collagen을 원심분리로 down시킨 후 Alkali reagent을 첨가하여 540nm 파장에서 읽어내어 확인하였다. 결과는 도 7을 참고한다.
The total collagen amount in the culture obtained by the same method as Experimental Example 6) was confirmed by Sircol red dye bind assay. The collagen bound with Dye was down by centrifugation, and the result was read at 540 nm by adding Alkali reagent. See FIG. 7 for the results.
실시예 8 : UMP의 연골세포에서의 증식 효과 Example 8 Proliferation Effect of UMP in Chondrocytes
세포를 96-well plate에 3x103cell/well로 옮겨 cell을 부착시킨 후 1% FBS-DMEM 배지로 교체(FBS에 대한 영향을 최소화 시켜줌) 해주고 UMP를 첨가하여 48시간 배양하였다. UMP에 대한 세포증식 정도는 Cell Proliferation Kit(XTT, Roche)를 사용하여 control군에 대한 상대적 비교를 하였다. 간단한 KIT사용 방법은 XTT labeling reagent와 Electron coupling reagent 을 혼합하여 각 well에 동일하게 처리한 다음 4 시간동안 5% CO2, 37oC incubation하여 490nm 파장에서 ELISA reader로 읽어낸다. 결과는 도 8을 참고한다.
The cells were transferred to 3x10 3 cells / well in a 96-well plate, and the cells were attached and replaced with 1% FBS-DMEM medium (minimizing the effects on FBS) and incubated for 48 hours with the addition of UMP. The degree of cell proliferation for UMP was compared with the control group using the Cell Proliferation Kit (XTT, Roche). The simple method of using KIT is to mix XTT labeling reagent and Electron coupling reagent in the same well, and then incubate for 5 hours at 5% CO 2 , 37 o C and read with ELISA reader at 490nm wavelength. See FIG. 8 for the results.
실시예 9 : UMP의 연골세포에서의 히아루론산 합성Example 9 Synthesis of Hyaluronic Acid from UMP Chondrocytes
Assay 하루 전 HA binding protein(HABP)를 96 well plate에서 4℃, overnight으로 코팅 후 1% BSA로 blocking 시킨다. 37℃에서 60분 동안 samples을 binding 시킨 후 0.5% PBST로 washing한다. Biotin-HABP를 60분 동안 RT에서 binding 시킨 후 Extra-avidin alkaline phosphatase를 첨가한 후 p-nitrophenyl-phosphate(PNPP)으로 발색시킨다. 이 반응은 3N-NaOH로 inhibition 시키고 405nm파장에서 흡광도를 읽는다. 결과는 도 9를 참고한다.
One day prior to assay, HA-binding protein (HABP) was coated in a 96 well plate at 4 ° C overnight and blocked with 1% BSA. After binding the samples for 60 minutes at 37 ℃ washed with 0.5% PBST. After biotin-HABP was bound for 60 minutes at RT, extra-avidin alkaline phosphatase was added and then developed with p-nitrophenyl-phosphate (PNPP). This reaction is inhibited with 3N-NaOH and the absorbance is read at 405nm wavelength. See FIG. 9 for the results.
실시예 10 : UMP의 연골세포에서의 GAG 합성Example 10 GAG Synthesis in UMP Chondrocytes
96well에 Sample 적정량과 DMB(dimethylmethylene blue) dye(in formate solution) 를 mixing하여 540nm파장에서 흡광도를 읽어낸다. 결과는 도 10을 참고한다.
The absorbance is read at 540nm wavelength by mixing the sample well with 96well and DMB (dimethylmethylene blue) dye (in formate solution). See FIG. 10 for the results.
실시예 11 : UMP의 섬유아세포에서의 히아루론산 합성 Example 11 Synthesis of Hyaluronic Acid from Fibroblasts of UMP
토끼의 섬유아세포를 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지에 배양하여, 24well-plate에 2x104cell/well로 첨가하여 재배양(subculture)하였다. 다음날, 5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 UMP를 첨가하여 3일 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 3일 후 배지내의 total hyaluronic acid양은 HA binding protein(HABP)와 HA binding protein-biotin 의 sandwich ELIZA 방법으로 측정하여 405nm 파장에서 읽어내어 확인하였다. Standard로는 Hyaluronic acid(SIGMA H)를 사용하였다. 결과는 도 11을 참고한다.
Rabbit fibroblasts were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium containing 10% FBS (fetal bovine serum), and subcultured by adding 2 × 10 4 cells / well to a 24 well plate. The next day, UMP was added to DMEM medium containing 5% FBS and incubated at 37 ° C. for 3 days. After 3 days of culture, the total amount of hyaluronic acid in the medium was measured by the sandwich ELIZA method of HA-binding protein (HABP) and HA-binding protein-biotin. Hyaluronic acid (SIGMA H) was used as a standard. See FIG. 11 for the results.
실시예 12 : UMP의 섬유아세포에서의 콜라겐 합성 Example 12 Collagen Synthesis in Fibroblasts of UMP
위의 실험예 11)과 같은 방법으로 얻어진 배양액 내의 total collagen양은 Sircol red dye bind assay 방법으로 확인하였다. Dye와 결합된 collagen을 원심분리로 down시킨 후 Alkali reagent을 첨가하여 540nm 파장에서 읽어내어 확인하였다. 결과는 도 12를 참고한다.
The total collagen amount in the culture obtained by the same method as Experimental Example 11) was confirmed by Sircol red dye bind assay. The collagen bound with Dye was down by centrifugation, and the result was read at 540 nm by adding Alkali reagent. See FIG. 12 for the results.
실시예 13 : UMP의 synovial 세포 내에서의 히아루론산 생산 Example 13 Hyaluronic Acid Production in Synovial Cells of UMP
사람의 synovial 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지에 배양하여, 24well-plate에 2x104cell/well로 첨가하여 재배양(subculture)하였다. 다음날, 5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 바꾸고, UMP를 첨가하여 3일 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 3일 후 배지내의 total hyaluronic acid양은 HA binding protein(HABP)와 HA binding protein-biotin 의 sandwich ELIZA 방법으로 측정하여 405nm 파장에서 읽어내어 확인하였다. Standard로Hyaluronic acid(SIGMA H)를 사용하였다. 결과는 도 13을 참고한다.
Human synovial cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium containing 10% FBS (fetal bovine serum), and subcultured by adding 2 × 10 4 cells / well to a 24well-plate. The next day, the cells were changed to DMEM medium containing 5% FBS and incubated at 37 ° C. for 3 days with the addition of UMP. After 3 days of culture, the total amount of hyaluronic acid in the medium was measured by the sandwich ELIZA method of HA-binding protein (HABP) and HA-binding protein-biotin. Hyaluronic acid (SIGMA H) was used as a standard. See FIG. 13 for the results.
실시예 14 : UMP의 synovial 세포 내에서의 콜라겐 생산 Example 14 Collagen Production in Synovial Cells of UMPs
위의 실험예 13)과 같은 방법으로 얻어진 배양액 내의 total collagen양은 Sircol red dye bind assay 방법으로 확인하였다. Dye와 결합된 collagen을 원심분리로 down시킨 후 Alkali reagent을 첨가하여 540nm 파장에서 읽어내어 확인하였다. 결과는 도 14를 참고한다.The total collagen amount in the culture obtained by the same method as Experimental Example 13) was confirmed by the Sircol red dye bind assay method. The collagen bound with Dye was down by centrifugation, and the result was read at 540 nm by adding Alkali reagent. See FIG. 14 for the results.
Claims (9)
상기 액체 담체는 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 에탄올 등의 알코올, 프로필렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되며;
상기 유성 담체는 각종 동식물유, 백색바셀린, 파라핀 및 왁스로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.The method of claim 8, wherein the solid carrier is selected from the group consisting of starch, lactose, mannitol, carboxymethylcellulose, corn starch and inorganic salts;
The liquid carrier is selected from the group consisting of distilled water, saline, aqueous glucose solution, alcohols such as ethanol, propylene glycol and polyethylene glycol;
The oily carrier is a cosmetic composition, characterized in that selected from the group consisting of various animal and vegetable oils, white petrolatum, paraffin and wax.
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