KR101071219B1 - 간암진단용 ＴＧＦβＲΙΙΙ 유전자의 단일 뉴클레오티드 다형성 마커 - Google Patents

간암진단용 ＴＧＦβＲΙΙΙ 유전자의 단일 뉴클레오티드 다형성 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간암 진단용 마커 및 이를 이용한 간암 감수성 예측 및 판단 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII 유전자의 엑손 부위에 존재하는 다형성에 근거한 간암 진단용 다형성 마커, 이를 이용한 간암 진단용 조성물, 진단키트, 마이크로어레이 및 간암 감수성 예측 및 판단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 간암 진단용 다형성 마커는 간암 특이적으로 유전적 감수성을 진단하는데 유용한 유전적 마커로서 사용될 수 있으며, 이를 이용하면 정확하고 간편하게 간암에 대한 감수성을 종합적으로 판단할 수 있는 효과가 있다.

Description

간암진단용 ＴＧＦβＲΙΙΙ 유전자의 단일 뉴클레오티드 다형성 마커{A Single nucleotide polymorphism of TGFβRIII gene for diagnosing a Hepatocellular carcinoma}
본 발명은 간암 진단을 위한 TGFβRIII 유전자 다형성 마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TGFβRIII 유전자의 다형성에 근거한 간암 진단용 마커 및 상기 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.
간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 해마다 50만명이 사망하는 세계에서 5번째로 발병과 사망률이 높은 종양이다(Okuda 2000). 그러나 HCC 환자의 생존율은 지난 20년에 걸쳐 개선되지 않았고, 사망률과 거의 동일한 발병율을 지니고 있다(Marrero, Fontana et al. 2005). B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 감염되어 발병하는 만성 간염 및 아플라톡신 B1(aflatoxin B1)과 같은 발암물질에의 노출은 HCC에 대한 주요 위험 인자로 알려져 있다 (Thorgeirsson and Grisham 2002).
비록 간암의 위험 요인이 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스에 의한 고질적인 감염이라고 할지라도 간암 세포 내의 분자 메커니즘은 아직도 명확히 규명되지 않은 상태이다. 최근의 연구에 의하면 간암 발생에 있어서 변형된 p53, 베타-카테닌, AXINI, p21(WAF1/CIP1) 및 p27 Kip 등의 유전자가 관련된다는 것이 밝혀졌다.
그러나 이러한 개개의 유전자의 변화들은 간암 환자들의 외적 특성과 임상 특성을 정확하게 반영하지 못하고 있다. 개체의 간암 내의 세포와 분자의 다양성은 기존의 유전자 연구 외에 새로운 접근 방식을 요구하고 있다.
이와 관련하여 마이크로어레이 테크놀로지는 개개의 유전자의 측정범위를 넘어서 한 번의 실험으로 수만여 개의 유전자 발현을 동시에 측정할 수 있는 새로운 기술로서 간암을 포함한 거의 대부분의 암 연구에 적용되어 왔으며, 암의 발생 및 진행과정에 활발하게 참여하는 유전자를 추출함으로써 암 진단 및 예후예측의 수준을 분자 수준에서 가능하도록 하였다.
간암은 조직 검사를 실시하거나 혈중 알파 태아 단백(alpha-fetoprotein, 이하 "AFP")과 같은 간암표지 단백질검사를 실시하여 간암 여부를 진단하여 왔다.
현재 간암 관련 진단, 예후 판정, 치료평가 바이오 마커로 가장 잘 알려진 것은 AFP, PIVKA(Protein Induced by Vitamin K Absence)-II 등이 있으나 특이도 및 민감도 면에서 부족한 점이 있다. 간세포암 진단에 있어서 AFP의 유용성은 잘 알려져 있다. 진행된 간세포암의 진단뿐만 아니라 간경변증의 자연경과 중 매년 3-10%의 환자에서 간세포암이 발병하기 때문에 간암 조기발견을 위한 정기적인 AFP 측정이 필요하다. 그러나 AFP는 간세포암 뿐만 아니라 알콜성 간염, 만성간염이나 간경변증과 같은 양성질환에서도 고농도로 상승하기 때문에 위양성이 많고 실제 양성율이 50-60%에 지나지 않는다(민감도는 20ng/㎖ 및 400ng/㎖에서 각각 29.9% 및 65.8%).
PIVKA-II는 DCP(des-r-carboxyprothrombin), 즉 응고작용이 없는 비정상 프로트롬빈으로서 혈청 AFP와는 독립적으로 간세포암의 진단에서 각각 48.2% 및 95.9%의 민감도와 특이도가 보고되고 있다. 이러한 생물학적 지표들은 현재 임상적으로 이용되고 있으나 모든 간암의 생물학적 특성을 반영하지 못하고 제한적으로 이용되고 있다. 따라서, 현재의 AFP나 PIVKAII보다 간암을 특이적이고 효과적으로 진단할 수 있는 마커를 발굴하고 이를 이용하여 간암을 조기 진단할 수 있는 검사 시약의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 TGFβRIII 유전자와 간암 사이의 유전학적 관련성을 최초로 발견하였고, TGFβRIII 유전자의 엑손 부위에서 6개의 단일 뉴클레오티드 다형성이 존재한다는 사실을 확인하였으며 이를 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
그러므로 본 발명의 목적은 TGFβRIII 유전자로부터 간암 진단용 단일 뉴클레오티드 다형성 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 TGFβRIII 유전자의 다형성 마커를 검출하기 위한 프라이머를 포함하는 간암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 간암을 진단할 수 있는 TGFβRIII 유전자의 다형성 부위을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
나아가 본 발명의 다른 목적은 상기 간암에 필요한 정보를 제공할 수 있는 TGFβRIII 유전자의 간암 진단용 다형성을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,
서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII(transforming growth factor receptor III) 폴리뉴클레오티드에서,
상기 서열번호 1의 44번째의 염기가 C 또는 T이고, 상기 44번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
상기 서열번호 1의 216번째의 염기가 A 또는 G이고, 상기 216번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
상기 서열번호 1의 519번째의 염기가 A 또는 G이고, 상기 519번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
상기 서열번호 1의 2028번째의 염기가 T 또는 C이고, 상기 2028번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
상기 서열번호 1의 2133번째의 염기가 G 또는 A이고, 상기 2133번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
상기 서열번호 1의 2247번째의 염기가 T 또는 C이고, 상기 2247번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 간암 진단용 다형성 마커를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 44번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 2 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 216번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 3 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 519번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 5 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 2028번째의 염기 및 2133번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 13 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 2247번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 14 영역에 위치할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간암은 인간 간세포암(HCC)일 수 있다.
또한, 본 발명은,
서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII(transforming growth factor receptor III) 폴리뉴클레오티드에서, 상기 서열번호 1의 44번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 216번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 519번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 2028번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 2133번째 염기의 다형성 부위 또는 상기 서열번호 1의 2247번째 염기의 다형성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머는, 서열번호 1의 44번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 6 및 7로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 1의 216번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 8 및 9, 또는 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 1의 519번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 14 및 15, 또는 서열번호 16 및 17로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 1의 2028번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 36 및 37로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 1의 2133번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 38 및 39로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 1의 2247번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 40 및 41로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 간암 진단용 마커인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.
나아가 본 발명은, 간암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 염기서열 분석을 통하여, 서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII(transforming growth factor receptor III) 폴리뉴클레오티드에서 상기 서열번호 1의 44번째 염기의 다형성(44C/T), 서열번호 1의 216번째 염기의 다형성(216A/G), 서열번호 1의 519번째 염기의 다형성(519A/G), 상기 서열번호 1의 2028번째 염기의 다형성(2028T/C), 서열번호 1의 2133번째 염기의 다형성(2133G/A) 또는 서열번호 1의 2247번째 염기의 다형성(2247T/C)을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염기서열 분석은 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 간암 진단용 다형성 마커는 간암 특이적으로 유전적 감수성을 진단하는데 유용한 유전적 마커로서 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 TGFβRIII 유전자의 다형성에 근거한 마커를 이용할 경우, 조기에 간암에 대한 감수성을 효과적으로 예측 및 진단할 수 있는 유용성이 있다.
도 1은 이형성 HCC 결절 (dysplastic HCC nodule)에서 TGFβ 및 TGFβ 수용체의 상이한 발현을 Heat-map으로 나타낸 것이다.
도 2는 HCC에서의 TGFβRIII의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 마이크로위성 마커들 D1S188, D1S406, D1S435 및 D1S2804를 이용하여 이형접합성 소실을 분석한 결과를 나타낸 것이다(N:정상; T:종양; 화살표:LOH를 나타낸 것임).
도 4a 및 4b는 본 발명에 따른 TGFβRIII 유전자 서열에서 엑손 뷔위에 존재하는 6개의 유전자 다형성을 표시하여 나타낸 것이다.
먼저, 본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 아래에 기술한 바와 같다.
본 발명에서 '유전적 다형성(genetic polymorphism)'은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 이라고 한다. SNP에 의한 염기서열의 변이가 아미노산의 변화를 초래하는 경우를 nonsynonymous SNP라고 하고, 아미노산의 변화를 일으키지 않는 경우를 silent SNP 또는 synonymous SNP라 한다
'마커'는 좌위 또는 연관된 좌위를 확인할 때 기준점으로 사용되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 코딩 생성물 (예를 들어, 단백질)을 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는발현된 뉴클레오티드 서열로부터 (예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.
'핵산'은 데옥시리보핵산(DNA), 및 적절하다면 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체(예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 서술된 구체예에 적용된대로, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서는 '핵산'이라는 용어와 '뉴클레오티드'가 병용하여 쓰이고 있다.
"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
'대립 인자' 또는 '대립 유전자'란 같은 염색체 위치(same chromosomal locus) 를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태(alternative forms) 중 하나를 뜻한다.
'대립유전자 빈도'는 대립유전자가 개체 내, 계통 내, 또는 계통의 집단 내에 존재하는 빈도 (비율 또는 백분율)을 지칭한다. 계통 또는 집단 내에서의 대립유전자 빈도를, 계통 또는 집단으로부터의 개체들의 샘플의 대립유전자 빈도를 평균화함으로써 추정할 수있다.
'다형성과 연관된 질환 및 상태'는 다양한 질환 또는 상태, 즉 하나 이상의 대립유전자의 동일화에 근거한 피험체에서 표시될 수 있는 감수성을 나타낸다.
'위험'은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다.
'표현형'은 유전형에 의해서 결정되는 개체의 형태학적, 생리학적,또는 생화학적 특징을 표현형이라 한다. 유전형이란 표현형과 구별되는 것으로, 개인의 유전자 구성을 뜻하며, 보다 좁은 의미로는 한 유전자 위에 존재하는 대립 유전자들(alleles)을 말한다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
임의로, 조직 또는 세포 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 얻는다. 조직 샘플은 특성상 조직과 서로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정액, 영양물질, 항생제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 하나의 일부 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미한다. 본 발명이 조직 샘플의 동일한 절편이 형태학적 및 분자적 수준 모두에 분석되거나 단백질 및 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 포함함을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.
"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종 및 육종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간암 진단 마커의 발현 유부를 확인하여 간암의 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 용어, “진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 간암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하고, 정상 세포에 비하여 간암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다,
'치료하는'이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 발명자들은 보다 정확하고 효과적으로 간암을 진단할 수 있는 방법을 연구하던 중, 간세포암(HCC, hepatocellular carcinomas) 조직에서 TGFβRIII 유전자의 발현수준이 주위의 정상조직과 차이가 있다는 결과를 통해, 간암 조직 또는 간암 세포주에서 발현되는 TGFβRIII 유전자의 발현 양상을 정상과 비교하여 확인하고, 상기 유전자의 다형성을 분석함으로써 이를 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있음을 예상하였다.
이에 본 발명자들은 TGFβRIII 유전자의 발현 양상을 간암조직과 정상조직을 대상으로 비교한 결과, 간암조직에서 TGFβRIII의 발현이 정상조직에 비해 감소된다는 것을 처음으로 규명하였으며, 나아가 간암 발생에 관여하는 TGFβRIII 유전자의 다형성을 발굴하였다.
한편, TGF β(베타)는 세포의 증식, 분화, 이동, 면역 등 다양한 세포반응을 조절하는 다기능 사이토카인으로 다양한 조직, 즉 거의 모든 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다. TGF 베타는 또한 콜라겐 및 프로테오글리칸과 같은 매트릭스 컴포넌트의 합성을 촉진하고 매트릭스 분해를 저해함으로써 세포외 매트릭스 단백질 (ECM ; Extracelluar Matrix Protein)의 생산을 조절한다. 한편, TGFβ1이 과발현되면 ECM이 과도하게 축적되어 기관(organ)에서 섬유화/경화(fibrosis/sclerosis)현상이 촉진되며, 섬유화/경화가 관련된 대부분의 질병에서 TGFb1의 과발현이 관찰되고 있다.
따라서 만성적인 TGFβ의 상향조절(과발현)은 기관 섬유화(organ fibrosis)의 주요 요인이며, 예를 들어 당뇨병성 또는 다른 만성 신장애, 간, 폐, 이자 및 다른 장기들의 섬유화가 초래될 수 있다.
또한, TGFβ는 면역억제 활성을 갖는다. TGFβ의 면역억제효과는 이의 항증식활성, 즉 T-림프구 및 B-림프구의 증식 저해로부터 일부 기인하는 것으로 알려져 있고, 종양 또는 감염에 대한 면역반응을 조절하는 작용을 하며, 특히, 발암과정에서는 복잡한 역할을 하는데, 초기 단계에는 종양억제인자로 작용하지만 이후에는 종양유발인자로 작용을 한다.
많은 종양에 있어서, TGFβ1의 혈장농도는 그 질병의 진전과 상관관계가 있다. 특히, VEGF의 생산을 상향 조절함으로써 간접적으로 혈관형성에 관여하므로 (Harmey 등 Ann. Surg. Oncol. 5(3):271-278 (1998), TGFβ1은 혈관신생 및 면역억제 활성을 통해 종양형성을 촉진시킬 수 있다.
또한, TGFβ는 3가지의 이성질체인 TGFβ1, 2 및 3가 존재하며, 이들 각각은 특정 수용체 즉, TGFβRI, TGFβRII 및 TGFβRIII에 각각 결합할 수 있으며, TGFβ가 각각의 수용체에 결합되면 신호전달 체계를 활성화시키는데, 특히 TGFβRIII는 849개의 아미노산으로 이루어져 있으며, TGFβ의 수용체 중에서 가장 많은 양으로 존재하고 있다.
최근 보고된 자료에 따르면, TGFβRIII가 암의 발생과도 관련이 있는 것으로 밝혀지고 있는데, 특히 신장세포암에서 TGFβRIII의 발현이 정상세포에 비해 감소되는 것으로 나타났고, 유방암, 전립선암 및 폐암의 경우에서도 발현이 감소되는 것으로 밝혀졌다.
그러나 아직까지 TGFβRIII의 발현정도와 간암과의 상관성에 대한 내용 및 간암 특이적으로 존재하는 TGFβRIII의 다형성에 대해서는 보고된 바가 없다.
따라서 본 발명은 간암의 발병여부를 진단할 수 있는 TGFβRIII 유전자에 존재하는 다형성 마커를 제공한다는 점에 그 특징이 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 먼저, 간암세포와 정상세포 간에 TGFβRIII 유전자의 발현정도 차이를 분석하기 위해, 간암조직 및 정상조직 샘플을 대상으로 상기 조직으로부터 RNA를 추출한 후, TGFβRIII의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행함으로써 상기 유전자의 발현양을 정량분석 하였다.
그 결과, 정상조직에 비해 간암조직의 경우, TGFβRIII의 유전자의 발현이 현저하게 감소되는 것으로 나타났다(실시예 2 참조).
또한, 본 발명자들은 간암 조직 및 세포에서만 특이적으로 발현이 감소되는 TGFβRIII의 유전자의 경우, 간암에서 높은 비율로 존재하는 TGFβRIII의 유전자의 6개 다형성을 발굴하였는데, 즉, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 간암조직 및 간암세포로부터 수득한 게놈 DNA에 대해 전체 TGFβRIII 유전자를 커버할 수 있는 프라이머를 사용하여, TGFβRIII 유전자를 증폭하였고, SSCP 분석을 통해 TGFβRIII 유전자의 다형성을 조사하였다.
그 결과, TGFβRIII 유전자에서 5개의 엑손 부분(엑손 2, 3, 5, 13 및 14)에서 6개의 다형성이 존재함을 확인할 수 있었고, 이들 6개의 다형성은 간암에서 높은 비율로 존재한다는 사실을 알 수 있었다(실시예 3 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 TGFβRIII 유전자를 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었고, 나아가 TGFβRIII 유전자에 존재하는 6개의 다형성 또한 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명에서 상기 TGFβRIII 유전자의 염기서열은 서열번호 1에 나타내었으며, 본 발명에 따른 상기 TGFβRIII 유전자에 존재하는 6개의 다형성은 하기 표에 나타낸 바와 같으며, 서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII 유전자에서 각 엑손 부위(엑손 2, 3, 5, 13 및 14)에 위치하고 있는 각각의 다형성 부위를 도 4a 및 4b에 나타내었다.
Figure 112010015712764-pat00001
그러므로 본 발명은, 서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII(transforming growth factor receptor III) 폴리뉴클레오티드에서, 상기 서열번호 1의 44번째의 염기가 C 또는 T이고, 상기 44번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 상기 서열번호 1의 216번째의 염기가 A 또는 G이고, 상기 216번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 상기 서열번호 1의 519번째의 염기가 A 또는 G이고, 상기 519번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 상기
서열번호 1의 2028번째의 염기가 T 또는 C이고, 상기 2028번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 상기 서열번호 1의 2133번째의 염기가 G 또는 A이고, 상기 2133번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 상기 서열번호 1의 2247번째의 염기가 T 또는 C이고, 상기 2247번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 간암 진단용 다형성 마커를 제공할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 간암 진단용 다형성 마커는 상기 TGFβRIII 다형성 마커와 간암 간의 새로운 상관관계를 밝힘으로써, 간암, 특히 인간 간세포암(Hepatocellular Carcinomas, HCC)에 대한 감수성을 조기 검출하고, 간암이 나타난 환자에 대한 예후, 진단 및 치료를 보조하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 간암 진단용 다형성 마커의 경우, 각 마커를 구성하고 있는 각각의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 서열번호 1의 44번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 2 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 216번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 3 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 519번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 5 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 2028번째의 염기 및 2133번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 13 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 2247번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 14 영역에 위치할 수 있다.
그러므로 본 발명에 따른 간암 진단용 마커에 포함되는 TGFβRIII 유전자의 다형성 부위는 TGFβRIII 유전자의 엑손 2, 3, 5, 13 또는 14 영역에 각각 존재하는 것일 수 있으며, 본 발명에서 이들 다형성 부위를 각각 ‘TGFβRIII 44C/T’, ‘TGFβRIII 216A/G’, ‘TGFβRIII 519A/G’, ‘TGFβRIII 2028T/C’, ‘TGFβRIII 2133G/A’및 ‘TGFβRIII 2247T/C’로 명명한다.
또한, 본 발명에서 간암 진단을 위해 사용할 수 있는 상기 다형성 마커의 경우, 상기 마커들은 일배체형 또는 이배체형 다형성 마커를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 일배체형 다형성 마커를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 간암을 진단하기 위해 사용할 수 있는 마커는 상기 기술된 바와 같이 본 발명에서 규명한 TGFβRIII 유전자의 다형성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 이 외에도 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 특히, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에서 44번째의 염기가 C 또는 T의 대립인자를 구성하는 뉴클레오티드가 코딩하는 아미노산 서열을 본 발명의 간암 진단용 다형성 마커로 사용할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1에 의해 코딩되는 TGFβRIII 단백질을 구성하는 15번째 아미노산이 세린(S) 또는 페닐알라닌(F)인 경우, 상기 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 간암 진단용 마커로 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 TGFβRIII 유전자의 다형성 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공할 수 있는데, 상기 조성물은 서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII(transforming growth factor receptor III) 폴리뉴클레오티드에서, 상기 서열번호 1의 44번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 216번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 519번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 2028번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 2133번째 염기의 다형성 부위 또는 상기 서열번호 1의 2247번째 염기의 다형성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 간암 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공할 수 있다.
상기 진단용 키트에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 즉, 간암 진단용 다형성 마커뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각 종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.
상기 “증폭할 수 있는 프라이머”란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서 상기 프라이머로는 바람직하게 서열번호 6 내지 11, 14 내지 17 및 36 내지 41로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 일 수 있다.
바람직하게 상기 프라이머는, 서열번호 1의 44번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 6 및 7로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 1의 216번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 8 및 9, 또는 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 1의 519번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 14 및 15, 또는 서열번호 16 및 17로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 1의 2028번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 36 및 37로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 1의 2133번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 38 및 39로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 1의 2247번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 40 및 41로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군 중에서 선택되는 프라이머쌍일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 간암 진단용 마커를 구성하는 폴리뉴클레오티드, 즉, 서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII(transforming growth factor receptor III) 폴리뉴클레오티드에서, 상기 서열번호 1의 44번째의 염기가 C 또는 T이고, 상기 44번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 상기 서열번호 1의 216번째의 염기가 A 또는 G이고, 상기 216번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 상기 서열번호 1의 519번째의 염기가 A 또는 G이고, 상기 519번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 상기 서열번호 1의 2028번째의 염기가 T 또는 C이고, 상기 2028번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 상기 서열번호 1의 2133번째의 염기가 G 또는 A이고, 상기 2133번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 상기 서열번호 1의 2247번째의 염기가 T 또는 C이고, 상기 2247번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공할 수 있다.
상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.
프로브 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500(1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30 ℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.
본 발명의 간암 진단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
나아가 본 발명은 간암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 간암 진단용 마커를 검출하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 검출 방법은 생물학적 샘플 중 본 발명의 마커 단백질 또는 핵산의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 본 발명에 따른 간암 진단용 마커를 검출하는 방법은 환자의 시료로부터 염기서열 분석을 통하여, 서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII(transforming growth factor receptor III) 폴리뉴클레오티드에서 상기 서열번호 1의 44번째 염기의 다형성(44C/T), 서열번호 1의 216번째 염기의 다형성(216A/G), 서열번호 1의 519번째 염기의 다형성(519A/G), 상기 서열번호 1의 2028번째 염기의 다형성(2028T/C), 서열번호 1의 2133번째 염기의 다형성(2133G/A) 또는 서열번호 1의 2247번째 염기의 다형성(2247T/C)을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 염기서열 분석은 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 본 발명의 간암 진단용 마커를 검출하는 방법은,
(a) 검체로부터 게놈 DNA를 수득하는 단계;
(b) 서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII(transforming growth factor receptor III) 폴리뉴클레오티드에서 상기 서열번호 1의 44번째 염기, 216번째 염기, 519번째 염기, 2028번째 염기, 2133번째 염기 및 2247번째 염기로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 다형성 부위를 함께 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 DNA 서열을 분석하여 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에서 44번째의 염기가 C 또는 T인지, 216번째 염기가 A 또는 G인지, 519번째 염기가 A 또는 G인지, 2028번째 염기가 T 또는 C인지, 2133번째 염기가 G 또는 A인지, 또는 2247번째 염기가 T 또는 C인지를 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
그러므로 본 발명은 상기 본 발명에 따른 간암 진단용 마커를 검출하는 방법을 통해 상기 다형성의 염기를 판별함으로써 간암의 감수성을 예측 및 판단할 수 있다.
상기에서 (a)단계의 검체로부터 핵산을 얻는 단계는 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 상기 (b)단계의 다형성 부위를 증폭하는 단계는 통상의 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다. 또한, 상기 (c)단계의 판별은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
< 실시예 1>
DNA 시료 준비
<1-1> 조직 샘플
67개의 냉동 HCCs 및 이에 상응하는 주변 정상 조직 샘플을 67명의 환자로부터 수득하여 평가하였다. 한국 가톨릭 대학의 IRB(institutional review board)로부터 승인 받고(CUMC09U029), 헬싱키 선언에 따라 모든 환자로부터 동의를 받았다. 어느 환자에서도 가족력은 없었고, 환자의 나이는 4-74살 (평균 55살)의 범위에 있었으며, 남성 48명 및 여성 19명으로 구성되었다. 주변 간 조직은 24건(35.8 %)에서 간경변이 존재하고 있었고, 40건(59.7 %)에서 만성간염이 존재하였으며, 3건 (4.5%)은 특이적 변화가 없었다. HBV가 51명(76.1%)에서 검출되었고, 4명(6%)의 환자에서 HCV가 검출되었다. 조직학적으로, 1, 39 및 27 샘플들을 각각 Edmonson grades I, II 및 III로 등급화하였다.
<1-2> 세포 배양
10개의 HCC 세포주, HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5, SNU-182, SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-423, SNU-449, 및 SNU-475를 10% FBS(Lonza, Walkersville, MD, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 함유하는 RPMI1640 배지(Lonza, Walkersville, MD, USA)에서 배양하였다. 또한, 불멸화된(immortalized) 정상 간 세포주 THLE3를 BEGM Bullet kit 및 10% FBS(Lonza, Walkersville, MD, USA)로 보충된 BEBM 배지(Lonza, Walkersville, MD, USA)에서 유지시켰다.
<1-3> DNA 추출
냉동 조직 샘플들을 액체 질소에서 미세 분말화시켰고, 이 분말을 500 μg/ml의 프로테아제 K(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 함유하는 500 μl의 용해버퍼(5 mM Tris-Cl pH8.0, 20 mM EDTA, 0.5% Triton X-100)에서 50℃ 하 밤새 배양하였다. 11 세포주들을 동일한 버퍼로 100 μg/ml의 프로테아제 K (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)의 존재 하에서 용해(lyzed)시켰다.
이후, 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알콜 (25:24:1) 용액 (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA)을 각 용해물(lysate)에 첨가하고, 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 30min) 후, 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알콜 (25:24:1)용액을 상청액에 첨가하였다. DNA를 에탄올로 -70℃에서 침전시키고 70% 에탄올로 세척하였으며, 건조된 펠렛들은 1X TE 버퍼(10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA)로 재현탁하였다.
< 실시예 2>
정량 RT PCR 분석
전체 RNA를 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA., USA)을 이용하여 설명서에 따라 냉동 조직으로부터 분리하였다. cDNA를 Transcriptor First Strand cDNA 합성 키트(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)로 합성하였다. Real-time PCR 분석은 50배 희석된 cDNA 3 μl, 0.4 pM의 센스 및 안티센스 프라이머, 6.25 μl의 iQTM SYBR　 Green supermix (Bio-rad laboratories, Hercules, CA, USA)를 함유하는 전체 부피가 12.5 μl의 혼합물을 이용하여 수행하였다. 각 반응에 첨가한 전체 cDNA의 양의 차이를 표준화하기 위하여 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자 발현을 내재성 대조군으로 사용하였다. 이후, 상기 반응 혼합물을 3분 동안 95℃에서 변성시키고, 15초 동안 95℃에서 변성시킨 후, 20초 동안 62℃에서 어닐링 및 20초 72℃에서 연장반응을 40회 반복 수행하였다. 또한, 상기 PCR에서 사용한 프라이머의 서열은 하기에 기재하였으며, 상기 PCR은 iQTM-5 (Bio-rad laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 실시간으로 모니터링하였고, 이는 동시에 Ct(threshold cycle)의 결정토록하며 PCR 산물의 기하급수적 증폭이 시작되었다. duplicate assays로부터 평균 Ct가 추가의 계산을 위해 사용되었고, 그리고GAPDH-정상화된 유전자 발현을 이하와 같은 상대적 정량화 방법을 이용하여 결정하였다. 결과를 평균값으로 나타냈다.
GAPDH에 대한 표준화된 상대적 발현 수준=2-(TGFβRIII Ct-GAPDH Ct) ⅹ 100
또한, TGF-β 및 TGF-β 수용체 패밀리가 HCC의 진행 동안 상이하게 조절되는 것을 보여주는 것은 이미 알려져 있고, TGFβRIII은 이형성 결절(dysplastic nodule), HCC의 전암(precancerous) 영역, HCC의 Edmonson 등급, 및 명시적인 HCC로부터 점차적으로 하향-조절되는 것을 도 1에 도시하였다.
프라이머 서열
프라이머 이름 염기서열 서열번호
TGFβRIII 센스 5'-ACCGTGATGGGCATTGCGTTTGCA-3' 2
TGFβRIII 안티센스 5'-GTGCTCTGCGTGCTGCCGATGCTGT-3' 3
GAPDH 센스 5'-ACCAGGTGGTCTCCTCTGAC-3' 4
GAPDH 안티센스 5'-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3' 5
그 결과, 선택된 HCC 10 중 7개의 경우, 정상조직과 비교하여 발현이 현저히 감소하는 것으로 나타났으며, 남은 3개의 경우에는 하향-조절의 평균값을 가지는 것으로 나타났다(도 2 참조).
< 실시예 3>
SSCP ( Single strand conformation polymorphism ) 및 DNA 시퀀싱 분석
상기 실시예 1의 간암 세포주들과 간암 조직들로부터 수득한 게놈 DNA에 대해 TGFβRIII 유전자의 코딩 영역을 모두 커버할 수 있는 하기 표 2의 18 세트의 프라이머를 이용하여 TGFβRIII 유전자를 각각 증폭하였으며, 이때 하기 E2F에서부터 E17R에 해당하는 프라이머 서열을 서열번호 6~47로 명명하였다.
또한, PCR 및 DNA 시퀀싱 수행을 위해 먼저, 10 ng의 주형 DNA, 0.1 mM의 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(Promega, Madison, WI, USA), 1.5 mM의 MgCl2, 0.5Unit의 Ampli Taq 금 폴리머라아제, 1 μl의 10X buffer(Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) 및 1μCi of [32P]dCTP (Amersham, Buckinghamshire, UK)를 함유하는 10 μl 반응 혼합물로 PCR을 수행하였다. PCR은 상기 반응 혼합물을 12분 동안 95℃에서 변성시키고, 그 후 30초 동안 95℃에서 변성, 30초 49-54℃에서 어닐링, 및 30초 동안 72℃에서 연장반응을 40회 반복 수행하였고, 최종 연장반응은 5분 동안 72℃에서 추가로 수행하였다. 증폭 후 PCR 산물들은 98% 포름아미드/5mmol/L NaOH를 함유하는 샘플 버퍼의 1:1 희석액에서 5분 동안 95℃에서 변성시켰으며, 10% 글리세롤로 SSCP 겔(Mutation Detection Enhancement, FMC BioProduct, Rockland, ME, USA)상에 로딩하였다. 전기영동 후, 상기 겔을 3mm 와트만 종이에 옮겨 건조시켰다. 이후 Kodak X-OMAT 필름(Eastman Kodak, Rochester, NY, USA)을 이용하여 방사능 진단법을 수행하였다.
또한, 변이 검출을 위해 변동성 전이(mobility shifts)를 보여주는 DNA를 건조된 SSCP 겔로부터 잘라내어 상기 동일한 프라이머 세트를 이용하여 40회 반복 PCR을 수행하여 DNA를 재증폭 하였고, 증폭산물은 2% 아가로오스 겔에서 전기영동 후, Qiaquick 겔 추출용 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 설명서에 따라 겔로부터 PCR 산물들을 용출하였다. 이후 PCR 산물들의 시퀀싱은 COSMO co, Ltd (Seoul, Korea)에 의뢰하여 수행하였고, 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112010015712764-pat00002
Figure 112010015712764-pat00003
그 결과, 상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 분석된 코딩 영역 모두에서 중요한 변이는 나타나지 않았으나, 5개 엑손에서 6개의 다형성이 관찰되었고, 이들 중 엑손 13(G2133A)에 위치하는 한 개의 SNP는 신규한 것으로 확인되었다. 또한, 상기 확인된 6개의 다형성이 간암에서 높은 비율로 존재한다는 사실을 본 발명에서 최초로 규명하였다.
따라서 본 발명자들은 본 발명에서 발굴한 상기 6개의 다형성을 간암 진단을 위한 신규한 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
LOH ( Loss of heterozygosity ) 분석 및 이형접합성 소실 분석
종양 및 상응하는 정상 DNA를 초위성체 마커인 D1S188, D1S406, D1S435, 및 D1S2804 마커를 이용하여 증폭하였다. 10 ng의 주형 DNA, 0.1 mM의 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (Promega, Madison, WI, USA), 1.5 mM의 MgCl2, 0.5 Unit의 Ampli Taq gold 폴리머라아제 및 1 μl의 10X 버퍼(Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) 및 1μCi의 [32P]dCTP(Amersham, Buckinghamshire, UK)를 함유하는 10 μl 반응 혼합물에서 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 변성시키고 7M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동 하였다. 전기영동 후, 상기 겔을 3mm 와트만 종이에 옮기고 건조시켰다. 이후, Kodak X-OMAT 필름(Eastman Kodak, Rochester, NY, USA)을 이용하여 방사능 진단법을 수행하였고, 종양 DNA에서 하나의 대립유전자의 완전한 부재의 확인을 직접적 가시화를 통해 LOH로 간주하였다.
상기 분석 결과, TGFβRIII 로커스에서 대립유전자 소실을 초위성체(microsatellite) 마커들 D1S188, D1S406, D1S435 및 D1S2804로 10개 정상 및 종양 샘플 세트에서 qRT-PCR에 의해 확인한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 10개 단 2개 샘플에서만 LOH가 관찰되었다. 이에 본 발명자들은 이러한 사실을 통해 간암 조직의 TGFβRIII 유전자에서는 이형접합성의 소실이 낮은 빈도로 발생한다는 것을 알 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII(transforming growth factor receptor III) 폴리뉴클레오티드에서,
    상기 서열번호 1의 44번째의 염기가 C 또는 T이고, 상기 44번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    상기 서열번호 1의 216번째의 염기가 A 또는 G이고, 상기 216번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    상기 서열번호 1의 519번째의 염기가 A 또는 G이고, 상기 519번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    상기 서열번호 1의 2028번째의 염기가 T 또는 C이고, 상기 2028번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    상기 서열번호 1의 2133번째의 염기가 G 또는 A이고, 상기 2133번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    상기 서열번호 1의 2247번째의 염기가 T 또는 C이고, 상기 2247번째의 염기를 포함하는 20~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 간암 진단용 다형성 마커.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 44번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 2 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 216번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 3 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 519번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 5 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 2028번째의 염기 및 2133번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 13 영역에 위치하고 있고, 상기 서열번호 1의 2247번째의 염기는 TGFβRIII 유전자의 엑손 14 영역에 위치하고 있는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 다형성 마커.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 간암은 인간 간세포암(HCC)인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 다형성 마커.
  4. 서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII(transforming growth factor receptor III) 폴리뉴클레오티드에서, 상기 서열번호 1의 44번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 216번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 519번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 2028번째 염기의 다형성 부위, 상기 서열번호 1의 2133번째 염기의 다형성 부위 또는 상기 서열번호 1의 2247번째 염기의 다형성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 간암 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프라이머는,
    서열번호 1의 44번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 6 및 7로 표시되는 프라이머쌍;
    서열번호 1의 216번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 8 및 9, 또는 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머쌍;
    서열번호 1의 519번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 14 및 15, 또는 서열번호 16 및 17로 표시되는 프라이머쌍;
    서열번호 1의 2028번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 36 및 37로 표시되는 프라이머쌍;
    서열번호 1의 2133번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 38 및 39로 표시되는 프라이머쌍; 및
    서열번호 1의 2247번째 염기의 다형성 부위를 검출할 수 있는 서열번호 40 및 41로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
  6. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이.
  7. 제4항의 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트.
  8. 간암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 염기서열 분석을 통하여, 서열번호 1로 표시되는 TGFβRIII(transforming growth factor receptor III) 폴리뉴클레오티드에서 상기 서열번호 1의 44번째 염기의 다형성(44C/T), 서열번호 1의 216번째 염기의 다형성(216A/G), 서열번호 1의 519번째 염기의 다형성(519A/G), 상기 서열번호 1의 2028번째 염기의 다형성(2028T/C), 서열번호 1의 2133번째 염기의 다형성(2133G/A) 또는 서열번호 1의 2247번째 염기의 다형성(2247T/C)을 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 염기서열 분석은 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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