KR101065016B1 - Anti Infulenza Virus Composition - Google Patents

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Abstract

본 발명은 팥꽃나무 추출물, 팥꽃나무 용매 분획물, 다프난 타입의 디테르펜 화합물인 겐크와다프닌 또는 유안후아신을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공한다. 본 발명 조성물의 유효성분은 NK 세포로부터 항바이러스 사이토카인인 IFN-γ의 분비량을 현저히 증가시킨다. 본 발명 조성물의 유효성분은 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스 동물 모델에서, 모델 마우스의 체중감소 억제, 섭취 식이량(feed intake) 감소 억제, 허파 조직의 염증 반응 억제 및 바이러스 감염의 억제 효능을 나타낸다. 본 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스성 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로 제조될 수 있을 뿐만 아니라, 인플루엔자 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물 또는 동물 사료 첨가용 조성물로 개발될 수 있다. The present invention provides an anti-influenza virus composition comprising an azalea extract, an azalea solvent fraction, a daphnan-type diterpene compound, genkwadaffin or yuanhuacin as an active ingredient. The active ingredient of the composition of the present invention significantly increases the secretion amount of IFN-γ, an antiviral cytokine, from NK cells. The active ingredient of the composition of the present invention shows the effect of suppressing weight loss, suppressing feed intake, inhibiting inflammatory response of lung tissue and inhibiting viral infection in model mouse infected with influenza virus. The composition of the present invention may be prepared as a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of influenza viral diseases, as well as a functional food composition or animal feed addition composition for the prevention or improvement of influenza viral diseases.

팥꽃나무 추출물, 디테르펜 화합물, 겐크와다프닌, 유안후아신, 인터페론-감마, 인플루엔자 바이러스 Azalea Extract, Diterpene Compound, Genkwadaffin, Yuanhuacin, Interferon-gamma, Influenza Virus

Description

항 인플루엔자 바이러스 조성물{Anti Infulenza Virus Composition} Anti-Influenza Virus Composition

본 발명은 팥꽃나무 (Daphne genkwa) 추출물, 팥꽃나무 용매 분획물 또는 다프난 타입 디테르펜 (daphnane type diterpene) 화합물을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to an anti-influenza virus composition comprising an active ingredient of Daphne genkwa extract, a bean extract solvent fraction or daphnane type diterpene compound.

팥꽃나무 (Daphne genkwa) 추출물은 동양 전통의학에서 이뇨제, 진해제, 거담제 및 부종을 치료하는데 사용되어 왔으나, 이의 생물학적 활성은 아직까지 명확히 알려져 있지 않다. Daphne genkwa extract has been used to treat diuretics, antitussives, expectorants and edema in oriental traditional medicine, but its biological activity is not yet known.

IFN (interferon)-γ는 면역시스템의 활성화된 T 세포 및 NK 세포가 바이러스, 기생충 및 종양세포와 같은 외부물질에 의한 침입에 대응하여 생성하는 천연 단백질이다. IFN-γ는 사이토카인과 같은 당단백질에 속한다. IFN-γ는 바이러스 감염의 중요 지시자인 이중나선 RNA의 존재에 대응하여 다양한 세포들에 의해 생성된다. IFN-γ는 숙주세포내의 바이러스 복제를 억제하고, NK 세포를 활성화시키며, 림프 세포에 대한 항원 제시를 증가시키고, 숙주세포의 바이러스 감염에 대한 내성을 증가시킴으로써 면역 반응을 돕는다. 항원이 매칭되는 T 세포 및 B 세포에 제시되면 이들 세포들이 증식하여 외부물질을 전략적이면서 특이적인 방법으로 제거한다. 이러한 점에서 항원제시는 면역반응에서 매우 중요한 기작이다. IFN (interferon) -γ is a natural protein produced by activated T cells and NK cells of the immune system in response to invasion by foreign substances such as viruses, parasites and tumor cells. IFN- [gamma] belongs to glycoproteins such as cytokines. IFN- [gamma] is produced by various cells in response to the presence of double helix RNA, an important indicator of viral infection. IFN- [gamma] assists the immune response by inhibiting viral replication in host cells, activating NK cells, increasing antigen presentation to lymphoid cells, and increasing host cell resistance to viral infections. When antigens are presented to matching T and B cells, these cells proliferate to remove foreign material in a strategic and specific manner. In this respect, antigen presentation is a very important mechanism in the immune response.

NK (Natural Killer) 세포는 선천 및 획득 면역 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다. NK 세포는 세포독성 및 사이토카인 생성을 통해 이의 효능(effector function)을 매개한다. NK 세포는 수용체 및 타겟 세포에 대한 리간드에 의해 매개되는 세포독성 효능 세포로 기능한다. 세포독성에 대한 NK 특이 수용체는 자연 세포독성 수용체(natural cytotoxic receptors, NCRs)로 불리우는 NKp46 (7), NKp30 (8) 및 NKp44 (9) 등이다. NCRs에 대한 리간드로는 인플루엔자 바이러스(IV)의 히마글루티닌(hemagglutinin, HA), 센다이 바이러스(Sendai virus, (SV)의 히마글루티닌-뉴라미니다아제(hemagglutinin-neuraminidase,HN)(10), 막-결합된 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(membrane-associated heparin sulfate proteoglycans)(11) 등이 알려져 있다. 또한, NK 세포는 IFN-γ와 같은 사이토카인 분비를 통해 획득 면역 반응의 발달을 돕는데 중요한 역할을 한다(12). IFN-γ가 뮤린 사이토메갈로바이러스 (murine cytomegalovirus) 감염에서 항-바이러스 활성을 갖는다는 것이 보고되었다. NK 세포의 효능은 직접적인 선천 방어 및 획득 면역 반응의 형성에 모두 관여하고 있다. 몇 가지 마우스 모델에서, NK 세포들이 종양의 발달과 미생물 감염을 억제하였다. 특히, NK 세포는 마우스 사이토메갈로바이러스 (mouse cytomegalovirus, MCMV) 감염의 초기 단계에서 직접 바이러스 감염된 세포를 사멸시키고 IFN-γ를 생성시킴으로써 조절자 역할을 한다. NK 세포내 에서 IFN-γ 생성에 대한 주요 경로는 PKCθ의 활성화에 의존한다. Tassi et al은 ITAMs를 통해 신호를 전달하는 NK-세포 수용체가 관여함으로써 PKCθ가 신속하게 활성화된다고 보고하였다. PKCθ 결핍 마우스로부터 NK 세포를 분석한 결과 PCKθ는 ITAM-매개 IFN-γ 분비에서 필수 요소라는 것을 알 수 있었다(13). Natural Killer (NK) cells are known to be involved in innate and acquired immune responses. NK cells mediate their effector function through cytotoxicity and cytokine production. NK cells function as cytotoxic potency cells mediated by ligands to receptors and target cells. NK specific receptors for cytotoxicity include NKp46 (7), NKp30 (8) and NKp44 (9), which are called natural cytotoxic receptors (NCRs). Ligands for NCRs include hemagglutinin (HA) of influenza virus (IV) and hemagglutinin-neuraminidase (HN) of Sendai virus (SV) (10). Membrane-associated heparin sulfate proteoglycans (11), etc. Also known are NK cells that play an important role in helping the development of acquired immune responses through cytokine secretion such as IFN-γ. (12) It has been reported that IFN- [gamma] has antiviral activity in murine cytomegalovirus infection The efficacy of NK cells is involved in both direct innate defense and formation of acquired immune responses. In some mouse models, NK cells suppressed tumor development and microbial infection, in particular, NK cells were the first to infect mouse cytomegalovirus (MCMV). It acts as a modulator by directly killing virus infected cells and producing IFN- [gamma] in a step.The main pathway for IFN- [gamma] production in NK cells depends on the activation of PKC [theta] Tassi et al. It was reported that PKCθ is rapidly activated by the involvement of the delivering NK-cell receptor, and analysis of NK cells from PKCθ deficient mice revealed that PCKθ is an essential factor in ITAM-mediated IFN-γ secretion (13).

PLCγ도 IFN-γ 분비에서 매우 본질적인 기초 인자이다. IFN-γ의 기저수준은 PLCγ2-결핍 NK 세포내에서 현저하게 감소하였고, 야생형 세포와는 달리, 항-NK1.1 에 의한 자극에 의하더라도 IFN-γ 분비가 확대되는 결과를 보이지 않았다(14). PLCγ2-결핍 NK 세포들은 IFN-γ 또는 GM-CSF 생성 능력이 심각하게 손상되었고, PLCγ2는 NK1.1-매개 사이토카인 생성 뿐만 아니라 NKG2D에서도 중요한 역할을 한다(15). 마우스내에서, FcRs (FcR)의 γ-사슬을 포함하며, 이 수용체는 결합된 adaptor's ITAMs 의 티로신 잔기 인산화 결과에 이르게 되고, 이는 다시 티로신 키나아제 Syk를 모이게 한다. 이 키나아제는 T 세포 활성화용 링커, 76 kDa, PLC, PI3K 및 Erk 키나아제를 포함하는 다수의 하부의 신호전달 매개자들을 활성화시킨다. 종합적으로 이 신호전달 매개자들은 유전자 전사와, NK 세포가 타겟 세포들을 용해시키는데 사용하는 용해성 과립의 엑소시토시스(exocytosis)를 위한 세포 프로그램을 개시하고, 친-염증성 케모카인 및 사이토카인, 특히 IFN-γ를 생성시킨다(16). PLCγ is also a very essential basal factor in IFN-γ secretion. Basal levels of IFN-γ were markedly decreased in PLCγ2-deficient NK cells, and unlike wild-type cells, IFN-γ secretion was not increased even by anti-NK1.1 stimulation (14). . PLCγ2-deficient NK cells have severely impaired IFN-γ or GM-CSF production capacity, and PLCγ2 plays an important role in NKG2D as well as NK1.1-mediated cytokine production (15). In mice, it contains the γ-chain of FcRs (FcR), which results in tyrosine residue phosphorylation of bound adapter's ITAMs, which in turn aggregates tyrosine kinase Syk. This kinase activates a number of underlying signaling mediators including linkers for T cell activation, 76 kDa, PLC, PI3K and Erk kinases. Collectively, these signaling mediators initiate cellular programs for gene transcription and exocytosis of soluble granules that NK cells use to lyse target cells and produce pro-inflammatory chemokines and cytokines, especially IFN-γ. (16).

인플루엔자 (Influenza)는 인플루엔자 바이러스인 RNA 바이러스 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae)가 조류 및 포유동물에 감염하여 발생되는 감염성 질환이다. 인플루엔자라는 명칭은 영향(influence)라는 뜻의 이탈리아어 influenza 로부 터 유래되었다. 인간의 경우, 인플루엔자는 오한, 열, 인두염, 근육통, 심한 두통, 기침 등의 증상을 나타낸다. 인플루엔자는 계절 전염병으로 전세계적으로 년간 수십만명의 사망자를 내며, 광역적으로 유행하는 경우 수백만명이 목숨을 잃는다. 인플루엔자 바이러스에는 인플루엔자 바이러스 A, B, C형 세가지가 존재하지만 사람에게 병을 일으키는 것은 A형과 B형으로 알려져 있다. B형은 증상이 약하고 한 가지 종류만 존재하지만, A형은 바이러스 표면에 있는 H항원과 N항원의 종류에 따라 여러 가지 종류가 존재한다. 보통 사람에게 병을 일으키는 항원의 종류는 H1, H2, H3와 N1, N2이다. 조류에서 나타나는 H항원과 N항원은 보통 사람에게는 병을 일으키지 않지만, 바이러스 내에서 유전자 돌연변이가 일어나거나 사람에게 병을 일으키는 종류의 항원과 유전자를 교환하면 사람에게도 쉽게 병을 일으키는 형태로 변할 수 있다. 사람에게 기존에 면역이 없는 이러한 새로운 인플루엔자 바이러스가 나타나면 전세계를 휩쓰는 대유행을 일으킬 수 있다. 현재 항-인플루엔자 바이러스 약제로는 체내에서 바이러스의 확산을 막는 작용을 하는 oseltamivir (상표명 Tamiflu) 및 zanamivir (상표명 Relenza)와 같은 뉴라미니다아제(neuraminidase) 억제제가 사용되고 있다. 이러한 약제들은 인플루엔자 바이러스 A형 및 B형 모두에 약효가 있는 것으로 알려져 있다. Influenza is an infectious disease caused by infection of birds and mammals by the influenza virus RNA virus Orthomyxoviridae. The name influenza comes from the Italian influenza which means influence. In humans, influenza presents symptoms such as chills, fever, pharyngitis, muscle pain, severe headache, and cough. Influenza is a seasonal epidemic that kills hundreds of thousands of people annually worldwide, and millions of people die in widespread epidemics. There are three types of influenza viruses, influenza viruses A, B, and C, but it is known that in humans it causes A and B. Type B has mild symptoms and only one type exists, but there are various types of type A depending on the type of H and N antigens on the surface of the virus. Common types of antigens that cause illness in humans are H1, H2, H3 and N1, N2. The H and N antigens present in birds do not usually cause disease in humans, but they can be easily changed into humans by genetic mutations in the virus or by exchanging genes with antigens that cause disease in humans. The emergence of these new influenza viruses, which are not previously immune to humans, can cause a worldwide pandemic. Currently, anti-influenza virus drugs include neuraminidase inhibitors such as oseltamivir (trademark Tamiflu) and zanamivir (trademark Relenza), which act to prevent the spread of the virus in the body. These drugs are known to be effective against both influenza virus type A and B.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확 하게 설명된다. Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly described.

본 발명자들은 식물로부터 유래된 천연 추출물로부터 항바이러스 효능을 발휘할 수 있는 물질을 발굴하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 팥꽃나무 추출물, 팥꽃나무 용매 분획물, 또는 단일 화합물로 분리된 다프난 타입의 디테르펜(daphnane type diterpene) 화합물이 NK 세포에서 IFN-γ의 분비를 현저히 증가시키고, 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스 모델에서 항 인플루엔자 바이러스 활성이 매우 뛰어남을 확인하여 본 발명을 완성하였다. The present inventors have tried to find a substance capable of exhibiting antiviral efficacy from natural extracts derived from plants. As a result, a mouse model of S. aureus extract, S. aureus solvent fraction, or daphnane type diterpene compound isolated as a single compound significantly increased the secretion of IFN-γ in NK cells and was infected with influenza virus. It was confirmed that the anti-influenza virus activity is very excellent in the present invention was completed.

따라서, 본 발명의 목적은 팥꽃나무 추출물 또는 팥꽃나무 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공하는 것에 있다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide an anti-influenza virus composition comprising a sorbus extract or sorbus solvent fraction as an active ingredient.

또한, 본 발명의 다른 목적은 디테르펜 화합물 겐크와다프닌(genkwadaphnin) 또는 유안후아신(yuanhuacine)을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공하는 것에 있다. Another object of the present invention is to provide an anti-influenza virus composition comprising a diterpene compound genkwadaphnin or yuanhuacine as an active ingredient.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. The objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 팥꽃나무 추출물 또는 팥꽃나무 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공한다. According to one aspect of the present invention, the present invention provides an anti-influenza virus composition comprising a bean extract or a bean extract solvent fraction as an active ingredient.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides an anti-influenza virus composition comprising a compound represented by the following formula (1) as an active ingredient.

[화학식 1] [Formula 1]

Figure 112009023687605-pat00002
Figure 112009023687605-pat00002

단, 상기 화학식 1에서, R은 -C6H5 또는 -CH=CHCH=CH(CH2)4CH3 이다. However, in Chemical Formula 1, R is —C 6 H 5 or —CH═CHCH = CH (CH 2 ) 4 CH 3 .

본 발명자들은 식물로부터 유래된 천연 추출물로부터 항바이러스 효능을 발휘할 수 있는 물질을 발굴하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 팥꽃나무 추출물, 팥꽃나무 용매 분획물, 또는 단일 화합물로 분리된 다프난 타입의 디테르펜(daphnane type diterpene) 화합물이 NK 세포에서 IFN-γ의 분비를 현저히 증가시키고, 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스 모델에서 항 인플루엔자 바이러스 활성이 매우 뛰어남을 확인하여 본 발명을 완성하였다. The present inventors have tried to find a substance capable of exhibiting antiviral efficacy from natural extracts derived from plants. As a result, a mouse model of S. aureus extract, S. aureus solvent fraction, or daphnane type diterpene compound isolated as a single compound significantly increased the secretion of IFN-γ in NK cells and was infected with influenza virus. It was confirmed that the anti-influenza virus activity is very excellent in the present invention was completed.

본 발명 조성물의 유효성분인 팥꽃나무 추출물은 팥꽃나무 식물로부터 당업계에 공지된 다양한 추출방법에 의해 얻을 수 있다. 바람직하게는, 공지된 통상적 인 추출용매, 바람직하게는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 이용하여 얻을 수 있다. The red bean extract of the present invention as an active ingredient of the composition can be obtained by various extraction methods known in the art from the red bean plant. Preferably, a known conventional extraction solvent, preferably (a) water, (b) anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (methanol, ethanol, propanol, butanol, etc.), (c) the lower alcohol and It can be obtained using a mixed solvent with water, (d) acetone, (e) ethyl acetate, (f) chloroform or (g) 1,3-butylene glycol.

본 명세서에서, 용어 "팥꽃나무 용매 분획물"은 상기 추출 시 이용하였던 용매와 다른 용매를 이용하여 상기 팥꽃나무 추출물로부터 본 발명에서 목적으로 하는 활성을 분획하여 얻은 활성 분획물(fraction)을 의미한다. 팥꽃나무 용매 분획물을 얻기 위하여 사용되는 용매는 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 추출용매도 가능하며, 바람직하게는, (a) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (b) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (c) 아세톤, (d) 에틸 아세테이트, (e) 클로로포름, (f) 1,3-부틸렌글리콜, (g) 헥산, (h) 디에틸에테르, 또는 (i) 부틸아세테이트이다. In the present specification, the term "single flower solvent fraction" refers to an active fraction obtained by fractionating the activity desired in the present invention from the red bean flower extract using a solvent different from the solvent used at the time of the extraction. The solvent used to obtain the sorbus solvent fraction may be any extraction solvent conventionally used in the art, and preferably, (a) anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (e.g. methanol, ethanol, propanol) , Butanol, normal-propanol, iso-propanol and normal-butanol, etc.), (b) a mixed solvent of the lower alcohol with water, (c) acetone, (d) ethyl acetate, (e) chloroform, (f) 1 , 3-butylene glycol, (g) hexane, (h) diethyl ether, or (i) butyl acetate.

본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물"은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 상술한 용매 분획물도 포함한다. The term "extract" as used herein has the meaning commonly used in the art as crude extract as described above, but broadly also includes the solvent fractions described above.

본 발명에서 팥꽃나무 추출물은 팥꽃나무의 줄기, 뿌리, 잎, 꽃잎, 꽃 봉오리로부터 얻을 수 있으며, 보다 바람직하게는 팥꽃나무의 꽃잎 또는 꽃 봉오리로부터 얻을 수 있다. Red bean extract in the present invention can be obtained from the stem, root, leaves, petals, buds of the red bean blossom, more preferably from the petals or buds of the red bean blossom.

본 발명 조성물에서 유효성분인 상기 화학식 1에서 R= -C6H5인 경우의 화합물은 다프난 타입 디테르펜(daphnane-type diterpene) 화합물로서 IUPAC 체계에 의한 정식 명칭은 12-O-벤조일-5-히드록시-6,7-에폭시-레시니페로놀-9,13,14-오르토벤조에이트(12-O-benzoyl-5-hydroxy-6,7-epoxy-resiniferonol-9,13,14-orthobenzoate)이다. 본 명세서에서는 상기 화합물을 지칭하기 위해 "겐크와다프닌 (genkwadaphnin)"또는 "GD-1"의 용어를 혼용하여 기재한다. In the composition of the present invention, the compound in the case of R = -C 6 H 5 as an active ingredient is a daphnane-type diterpene compound, and the official name according to the IUPAC system is 12-O-benzoyl-5 12-O-benzoyl-5-hydroxy-6,7-epoxy-resiniferonol-9,13,14-orthobenzoate -hydroxy-6,7-epoxy-resiniferonol-9,13,14-orthobenzoate )to be. In this specification, the term “genkwadaphnin” or “GD-1” is used interchangeably to refer to the compound.

또한, 본 발명 조성물의 다른 유효성분인 상기 화학식 1에서 R= -CH=CHCH=CH(CH2)4CH3인 경우의 화합물을 지칭하기 위해 본 명세서에서 "유안후아신 (yuanhuacine)"의 용어를 사용하여 기재한다. In addition, the term "yuanhuacine" in the present specification to refer to a compound in the case of R = -CH = CHCH = CH (CH 2 ) 4 CH 3 in the formula 1 which is another active ingredient of the present invention composition. It describes using.

상기 본 발명 조성물에서 화합물 "GD-1"또는 "유안후아신"은 IFN-γ 유도 활성을 갖는 것이라면, 화학적으로 합성된 것을 사용할 수도 있으며, 상기 팥꽃나무 추출물 또는 팥꽃나무 용매 분획물로부터 분리 정제한 것을 사용할 수도 있다. Compound "GD-1" or "yuanhuacin" in the composition of the present invention, if it has IFN-γ-inducing activity, may be used chemically synthesized, and purified from the sorbus extract or sorbus solvent fractions Can also be used.

상기"겐크와다프닌" 또는 "유안후아신"을 상기 팥꽃나무 추출물 또는 용매 분획물로부터 단일 화합물 형태로 분리하기 위해서, 용매 처리하여 수득한 팥꽃나무 추출물 또는 분획물에 추가 정제과정을 행할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻을 수 있다. In order to separate the "genwadafnin" or "yuanhuacin" from the sorbus extract or solvent fraction in the form of a single compound, the sorbus extract or fraction obtained by solvent treatment may be further purified. For example, separation using ultrafiltration membranes having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), etc. Can be.

본 발명의 팥꽃나무 추출물, 팥꽃나무 용매 분획물, 겐크와다프닌(GD-1), 유 안후아신은 NK 세포에서 IFN-γ의 분비를 현저히 증가시킴으로써 항 인플루엔자 바이러스 효능을 발휘한다. IFN-γ는 Th1 세포, Tc 세포, 수지상세포 (dendritic cell) 및 NK 세포 등에 의해 분비되는 이량체 사이토카인으로서 타입 II (type II) 인터페론에 속한다. IFN-γ은 본래부터 대식세포(macrophage) 활성자로 불리울 만큼 식세포 활성작용이 강하며, 현재 연구된 바에 의하면 약 30개 정도의 유전자의 전사 변화를 유도하여 하기와 같은 다양한 면역 및 세포 반응을 생성하는 것으로 알려져 있다: ⅰ) 대식세포의 항원제시 증가, ⅱ) 대식세포에서 리소좀(lysosome) 활성 증가 및 활성화, ⅲ) Th2 세포 활성억제, ⅳ) 정상세포에서 클래스 I MHC 분자의 발현증가, ⅴ) 백혈구세포의 이동성 증가, 및 ⅵ) NK 세포 활성의 증가. Red bean extract of the present invention, red bean solvent solvent fraction, genwadafnin (GD-1), huahuacin exerts anti-influenza virus efficacy by significantly increasing the secretion of IFN-γ in NK cells. IFN- [gamma] belongs to type II interferon as a dimeric cytokine secreted by Th1 cells, Tc cells, dendritic cells, NK cells and the like. IFN-γ is inherently strong in phagocytic activity, so-called macrophage activator, and currently research has induced various transcriptional and cellular responses by inducing transcriptional changes of about 30 genes. Iii) increased antigenic presentation of macrophages, ii) increased and activated lysosome activity in macrophages, iv) inhibitory Th2 cell activity, iv) increased expression of class I MHC molecules in normal cells, iii) Increased mobility of leukocytes, and iii) increased NK cell activity.

본 발명 조성물의 항 바이러스 효능이 적용될 수 있는 인플루엔자 바이러스는 포유동물(mammals) 또는 조류(birds)에 감염할 수 있는 인플루엔자 바이러스를 포함하며, 예를 들어, 조류, 사람, 개, 말, 돼지, 고양이 등을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. Influenza viruses to which the antiviral efficacy of the compositions of the present invention can be applied include influenza viruses that can infect mammals or birds, and include, for example, birds, humans, dogs, horses, pigs, and cats. And the like, but is not limited thereto.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 치료 또는 예방 용도의 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention may be provided as a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of diseases caused by influenza virus.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 설명된 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰 로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. The pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient described above. Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like. It is not limited. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다. Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be. On the other hand, the oral dosage amount of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-100 mg / kg (body weight) per day.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, may be administered by intravenous infusion, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like. It is preferable that the route of administration is determined according to the type of the disease to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스에 의해 발생되는 질환의 개선 또는 예방용 기능성 식품조성물의 형태로 제공될 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention may be provided in the form of a functional food composition for the improvement or prevention of diseases caused by influenza virus.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 후박나무 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. Functional food compositions of the present invention include ingredients that are commonly added in the manufacture of food, and include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients and seasonings. For example, when prepared with a drink, flavoring agents or natural carbohydrates may be included as additional ingredients in addition to the extract of hawthorn as an active ingredient. For example, natural carbohydrates include monosaccharides (eg, glucose, fructose, etc.); Disaccharides (eg maltose, sucrose, etc.); oligosaccharide; Polysaccharides (eg, dextrins, cyclodextrins, etc.); And sugar alcohols (eg, xylitol, sorbitol, erythritol, and the like). As the flavoring agent, natural flavoring agents (e.g., taumartin, stevia extract, etc.) and synthetic flavoring agents (e.g., saccharin, aspartame, etc.) can be used.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 조성물은 동물에서의 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 개선 또는 예방을 위한 동물 사료 첨가용 조성물의 형태로 제공될 수 있다. According to another preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention may be provided in the form of a composition for the addition of animal feed for the improvement or prevention of diseases caused by influenza virus in the animal.

본 발명의 동물 사료 첨가용 조성물은 항 인플루엔자 바이러스 효능을 가지므로 가축의 사료에 첨가하면 인플루엔자 바이러스에 의해 발생되는 질환의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있다. 본 명세서에서 사료는 가축의 생명을 유지하고 젖, 고기, 알, 털가죽 등을 생산하는 데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미한다. 사료는 영양가, 주성분, 유통, 수분함량 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며 본 발명에서 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료, 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료, 섬유질사료을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. Since the composition for adding animal feed of the present invention has anti-influenza virus efficacy, it can be expected to prevent or ameliorate a disease caused by influenza virus when added to animal feed. As used herein, the term feed refers to a substance that supplies organic or inorganic nutrients necessary to maintain livestock life and to produce milk, meat, eggs, fur, and the like. The feed may be classified into various types according to nutritional value, main ingredient, distribution, moisture content and processing type. In the present invention, the feed includes a feed, a rich feed, a supplemental feed, a protein feed, a starch feed, a fat feed, and a fiber feed. It is not limited to this.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다. The features and advantages of the present invention are summarized as follows.

i) 본 발명은 팥꽃나무 추출물, 팥꽃나무 용매 분획물, 및 다프난 타입의 디테르펜 화합물인 겐크와다프닌 및 유안후아신의 새로운 항 인플루엔자 바이러스 용도를 제시한다. i) The present invention provides a novel anti-influenza virus use of the adzuki bean extract, the adzuki bean solvent fraction, and the daphnan type diterpene compounds genwadafnin and yuanhuacin.

ii) 본 발명 조성물의 유효성분인 팥꽃나무 추출물, 팥꽃나무 용매 분획물, 겐크와다프닌, 또는 유안후아신은 NK 세포에서의 항 바이러스 물질인 IFN-γ의 분비양을 현저히 증가시킨다.ii) Red bean flower extract, red bean flower solvent fraction, genkwadaffin, or huahuacin, which are the active ingredients of the composition of the present invention, significantly increase the secretion amount of IFN-γ, an antiviral substance in NK cells.

iii) 본 발명 조성물의 유효성분은 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스 동물 모델에서, 모델 마우스의 체중감소 억제, 식이량 (feed intake) 감소 억제, 허파 조직의 염증 반응 억제 및 바이러스 감염의 억제 효능을 나타내었다. iii) The active ingredient of the composition of the present invention showed an effect of inhibiting weight loss, suppressing feed intake, inhibiting inflammatory response of lung tissue and inhibiting viral infection in a mouse animal model infected with influenza virus.

iv) 본 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 치료 또는 예방 용도의 약제학적 조성물로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 개선 또는 예방 용도의 기능성 식품 조성물과 동물 사료 첨가용 조성물로 개발이 가능하다. iv) The composition of the present invention can be used not only as a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of diseases caused by influenza virus, but also as a functional food composition and animal feed addition composition for improving or preventing diseases caused by influenza virus. This is possible.

본 발명은 팥꽃나무 추출물, 팥꽃나무 용매 분획물, 다프난 타입의 디테르펜 화합물인 겐크와다프닌 또는 유안후아신을 유효성분으로 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공한다. 본 발명 조성물의 유효성분은 NK 세포로부터 항 바이러스 사이토카인인 IFN-γ의 분비양을 현저히 증가시킨다. 본 발명 조성물의 유효성분은 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스 동물 모델에서, 모델 마우스의 체중감소 억제, 식이량 (feed intake) 감소 억제, 허파 조직의 염증 반응 억제 및 바이러스 감염의 억제 효능을 나타낸다. 본 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로 제조될 수 있을 뿐만 아니라, 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물 또는 동물 사료 첨가용 조성물로 개발될 수 있다. The present invention provides an anti-influenza virus composition comprising an azalea extract, an azalea solvent fraction, a daphnan-type diterpene compound, genkwadaffin or yuanhuacin as an active ingredient. The active ingredient of the composition of the present invention significantly increases the secretion amount of IFN-γ, an antiviral cytokine from NK cells. The active ingredient of the composition of the present invention shows the effect of inhibiting weight loss, suppressing feed intake, inhibiting inflammatory response of lung tissue, and inhibiting viral infection in a mouse animal model infected with influenza virus. The composition of the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of diseases caused by influenza virus infection, as well as a functional food composition or animal feed addition composition for the prevention or improvement of diseases caused by influenza virus infection. Can be.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예 Example

실험 재료 및 방법 Materials and Methods

GD-1 (Genekwadapnin) 및 유안후아신(Yuanhuacine)의 분리 Isolation of GD-1 (Genekwadapnin) and Yuanhuacine

GD-1 (Genekwadapnin) 및 유안후아신(Yuanhuacine)은 팥꽃나무 (Daphne genkwa)의 꽃봉오리로부터 이미 보고된 프로토콜(4)에 따라 분리하였다. 간략히 설명하면, 팥꽃나무 (Daphne genkwa)의 건조된 꽃 봉오리를 메탄올로 추출한 후, 이 메탄올 추출물을 물에 현탁시키고, n-hexane, CHCl3 및 EtOAc을 용매로 사용하여 연속적으로 추출해내었다. 각 분획물들을 실리카겔 컬럼상에 로딩하고 CHCl3 및 MeOH의 농도구배하에 용출시켜 GD-1 및 유안후아신을 얻었다. GD-1 (Genekwadapnin) and Yuanhuacine were isolated from the buds of Daphne genkwa according to the already reported protocol (4). Briefly, the dried buds of the Daphne genkwa were extracted with methanol, and then the methanol extract was suspended in water, and extracted successively using n- hexane, CHCl 3 and EtOAc as a solvent. Each fraction was loaded on a silica gel column and eluted under a concentration gradient of CHCl 3 and MeOH to give GD-1 and huahuacin.

세포 배양 Cell culture

인간 골수성 세포 (U937, THP-1, HL60, K562)의 배양은 37℃, 5％ CO2의 습화된 분위기하에서 수행하였다. IL-2 의존성 NK 세포주 NK92 (human NK lymphoma)는 ATCC (American Type Culture Collection) 로부터 구입하였다. NK92 세포는 20％ FCS (HyClone, Logan, UT), 2 mM L-글루타메이트, 100 μg/㎖ 페니실린, 100 μg/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies)을 포함하고 100 U/㎖의 IL-2 (Chiron, Emeryville, CA)가 첨가된 α-MEM (Life Technologies, Karlsruhe, Germany) 배지에서 유지하였다. Incubation of human myeloid cells (U937, THP-1, HL60, K562) was performed in a humidified atmosphere of 37 ° C., 5% CO 2 . IL-2 dependent NK cell line NK92 (human NK lymphoma) was purchased from American Type Culture Collection (ATCC). NK92 cells were treated with 20% FCS (HyClone, Logan, UT), 2 mM L-glutamate, 100 μg / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin (Life Technologies) and 100 U / ml IL-2 (Chiron, Emeryville, Α-MEM (CA) added (Life Technologies, Karlsruhe, Germany) medium.

IFN-γ 생성에 대한 ELISA 분석 ELISA analysis for IFN-γ production

인간 IFN-γ의 정량은 상업적으로 구입가능한 mAb (Endogen)을 사용하여 제조자의 지시된 프로토콜에 따라 수행하였다. 37℃에서 18 시간 인큐베이션한 후에 세포를 제거하여 상등액을 수집하였다. IL-2, TNF-α 및 IL-10을 검출하기 위해, ELISA 키트 (Endogen)를 사용하였다. 결과는 3회 수행한 값의 평균 ± SEM으로 표시하였다. Quantification of human IFN-γ was performed according to the manufacturer's directed protocol using a commercially available mAb (Endogen). After incubation at 37 ° C. for 18 hours, the cells were removed to collect the supernatant. To detect IL-2, TNF-α and IL-10, an ELISA kit (Endogen) was used. The results are expressed as the mean ± SEM of the values performed three times.

세포 분해 및 웨스턴 블롯 분석 Cytolysis and Western Blot Analysis

용해성 세포분해물들은 야생형 또는 형질전환된 SW620 세포주로부터 얼음-냉각시킨 SDS-용해 버퍼 [50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.1% SDS, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 및 Complete Protein Inhibitor Cocktail (Roche)]을 사용하여 30 분간 얼음에서 추출하여 얻었다. 30-50μg의 세포 분해물들을 10% 또는 12% 젤상에서 SDS-PAGE에 의해 분리한 후 PVDF 막 (Millipore, Billerica, MA, USA)으로 이전시켰다. PVDF막은 1차 항체와 함께 인큐베이션시킨 다음 퍼옥시다아제(peroxidase)-컨쥬게이트된 항-래빗 또는 항-마우스 IgG 2차 항체(Calbiochem, EMD Chemicals Inc., San Diego, CA, USA)로 처리한 후 밴드의 시각화를 위해 ECL 시약 (Millipore, Billerica, MA, USA)과 반응시켰다. 로딩이 동등한 양으로 이루어졌는지와 이전이 적합하게 이루어졌는지를 확인하기 위해 막을 항-α-GAPDH 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Pasadena, CA, USA)로 검사하였다. 1차 항체는 항-p50항체, 항-p65항체, 항-IFN-γ항체 (Santa Cruz Biotechnology)이었다. Soluble cell lysates were ice-cooled SDS-soluble buffer [50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.1% SDS, 1 mM Na 3 VO 4 , from wild-type or transformed SW620 cell lines. 10 mM NaF, and Complete Protein Inhibitor Cocktail (Roche)] for 30 minutes on ice. 30-50 μg of cell lysates were separated by SDS-PAGE on 10% or 12% gels and then transferred to PVDF membranes (Millipore, Billerica, Mass., USA). PVDF membranes were incubated with the primary antibody followed by treatment with peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-mouse IgG secondary antibody (Calbiochem, EMD Chemicals Inc., San Diego, CA, USA) Reaction with ECL reagents (Millipore, Billerica, MA, USA) for visualization. Membranes were examined with anti-α-GAPDH antibodies (Santa Cruz Biotechnology, Pasadena, Calif., USA) to ensure that loadings were in equal amounts and transfer was appropriate. Primary antibodies were anti-p50 antibody, anti-p65 antibody, anti-IFN-γ antibody (Santa Cruz Biotechnology).

RTRT -- PCRPCR

2 단계 RT-PCR 반응은 oligo-dT 프라이머와 역전사효소, 특이 프라이머쌍과 Taq 폴리머라아제(Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 수행하였다. 총 RNA는 표준 프로토콜에 따라 분리하였고, cDNA는 제조자의 지시서에 따라 AccuScript High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Stratagene)를 사용하여 합성하였다. 합성한 1μl의 cDNA 를 0.5 U ExTaq DNA 폴리머라아제, 1 X buffer 및 1mM dNTP mix (Takara)와 특이 프라이머 쌍으로 이루어진 20μl의 PCR 반응에 사용하였다. PCR 반응에 의한 증폭은 다음과 같은 조건에서 GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 사용하여 수행하였다; 94℃에서 5분, 이어서 94℃에서 45 초, 56℃에서 45초 및 72℃에서 1 분을 25-40 사이클 행한 후, 최종 연장반응은 72℃에서 7분간 행하였다. 표 1의 PCR 프라이머는 Primer 3 program을 사용하여 디자인하였으며 Bioneer사(대한민국, 대전)로부터 구입하였다. PCR 생성물은 1.5％ 아가로즈젤상에서 분리하여 EtBr (ethidium bromide)로 염색하여 Gel Doc 2000 UV trans-illuminator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 시각화한 후에, Quantity One software (Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 분석하였다. 각 샘플들은 3회 이상 테스트하였으며 대표 데이터를 제시하였다. Two-step RT-PCR reaction was carried out using oligo-dT primers and reverse transcriptase, specific primer pairs and Taq polymerase (Takara, Shiga, Japan). Total RNA was isolated according to standard protocol and cDNA was synthesized using AccuScript High Fidelity 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (Stratagene) according to manufacturer's instructions. Synthesized 1 μl cDNA was used for 20 μl PCR reaction consisting of 0.5 U ExTaq DNA polymerase, 1 × buffer and 1 mM dNTP mix (Takara) and specific primer pairs. Amplification by PCR reaction was performed using GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) under the following conditions; After 25-40 cycles of 5 minutes at 94 ° C, followed by 45 seconds at 94 ° C, 45 seconds at 56 ° C and 1 minute at 72 ° C, the final extension reaction was carried out at 72 ° C for 7 minutes. PCR primers of Table 1 were designed using the Primer 3 program and were purchased from Bioneer (Korea, Daejeon). PCR products were separated on 1.5% agarose gel and stained with EtBr (ethidium bromide) and visualized with Gel Doc 2000 UV trans-illuminator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), followed by Quantity One software (Bio-Rad Laboratories). Each sample was tested three or more times and representative data were presented.

공초점 현미경(Confocal microscopy) 분석 Confocal microscopy analysis

세포들을 커버슬립상에서 배양하고, 차가운 PBS에서 3회 세정한 후 상온에서 4％ 파라포름알데히드로 20 분간 고정시키고 PBS에서 0.1％ Triton X-100으로 10분 간 투과화(permeabilization)시켰다. 이어서, 세포들을 PBS내에서 1％ BSA로 30분간 블로킹한 후 항-p65 mAb로 2시간 동안 염색하였다. 마지막으로, 세포들을 FITC 컨쥬게이션된 래빗 항-마우스 IgG (Molecular Probe, Invitrogen)으로 어두운 조건에서 1 시간 동안 인큐베이션시키고 DAPI로 염색하였다. 세포를 함유하는 커버슬립을 VectaShield 마운팅 매질 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)을 사용하여 유리 슬라이드상에 올리고, Zeiss 공초점 현미경 LSM510META (Carl Zeiss, Jena, Germany)를 사용하여 관찰하였다. Cells were incubated on coverslips, washed three times in cold PBS, fixed at room temperature for 4% paraformaldehyde for 20 minutes and permeabilized with 0.1% Triton X-100 for 10 minutes in PBS. Cells were then blocked for 30 minutes with 1% BSA in PBS and then stained for 2 hours with anti-p65 mAb. Finally, cells were incubated with FITC conjugated rabbit anti-mouse IgG (Molecular Probe, Invitrogen) for 1 hour in dark conditions and stained with DAPI. Cells containing coverslips were raised on glass slides using VectaShield mounting medium (Vector Laboratories, Burlingame, Calif., USA) and observed using a Zeiss confocal microscope LSM510META (Carl Zeiss, Jena, Germany).

인플루엔자 바이러스 감염된 마우스의 체중 감소 효과 측정 Measurement of Weight Loss Effects in Influenza Virus Infected Mice

인플루엔자 바이러스는 A 타입 (H1N1)을 MDCK(Madin Darby Canine Kidny) 세포주에 감염하여 증식시켰고, 증식된 바이러스는 분할하여 초저온 냉동고에 보관하였다. 마우스 체중감소 효과를 분석하기 위하여 얼렸던 바이러스를 생쥐의 점막을 통하여 마리당 8-9 PFU를 감염시켰다. 바이러스를 감염시키고 같은 시간 마리당 40 μg의 팥꽃나무 용매 분획물, 또는 단일 화합물로 분리된 다프난 타입 디테르펜 (daphnane type diterpene) 화합물인 겐크와다프닌과 유안후아신을 경구용 존대를 사용하여 식이하였다. 식이시점은 바이러스를 감염시키는 동일한 시간과 그 다음날(바이러스 감염시키고 24시간 후), 바이러스 감염 예방효과를 보기 위해 바이러스 접종하기 전 이틀간, 치료효과를 보기 위하여 접종 다음날부터 이틀간을 각각 투여하였다. 바이러스가 투여된 시점을 기준으로 투여된 생쥐는 몸무게를 24 시간의 간격을 두고 미세량 측정저울을 이용하여 각각의 개체에 대한 몸무게를 측정하 였다. Influenza viruses were propagated by infecting A type (H1N1) cells with Maddin Darby Canine Kidny (MDCK) cell lines, and the expanded virus was divided and stored in a cryogenic freezer. To analyze the effect of mouse weight loss, the frozen virus was infected with 8-9 PFU per horse through the mucosa of mice. The virus was infected and 40 μg of adzuki bean solvent fractions per hour, or daphnane type diterpene compounds, separated into a single compound, genkwadaffin and yuanhuacin were dieted using an oral zone. The diet was administered at the same time and the next day (24 hours after infection), two days before vaccination for the virus infection, and two days after the vaccination for the treatment effect. Based on the time when the virus was administered, the mice were weighed for each individual by using micro-quantitative scales at intervals of 24 hours.

인플루엔자 바이러스 감염된 마우스의 식이 섭취량 감소 효과 측정 Measurement of Dietary Intake Reduction in Influenza Virus Infected Mice

식이 섭취량을 측정하기 위한 인플루엔자 바이러스와 팥꽃 나무 추출물의 처리는 상기한 체중감소 효과를 측정하기 위한 방법과 동일한 방법으로 행하였다. 사료 섭취률은 각 처리군의 사료투여량에서 사료 잔류량을 뺀 값으로 사료섭취량을 24 시간의 간격을 두고 미세량 측정저울을 이용하여 몸무게를 측정하였다. Treatment of influenza virus and sorbus extract for measuring dietary intake was carried out in the same manner as the method for measuring the weight loss effect described above. The feed intake rate was obtained by subtracting the remaining feed from the feed dose of each treatment group, and the weight was measured using the micro-quantitative scale at intervals of 24 hours.

인플루엔자 바이러스 감염된 마우스의 폐조직의 조직화학적 관찰 Histochemical Observation of Lung Tissues from Influenza Virus Infected Mice

인플루엔자 바이러스를 감염시키고, 팥꽃 추출액을 처리한 군과 바이러스만 감염시킨 군의 폐 조직을 각각의 시간대별로 절개하여 중성화된 포르말린에 고정시킨 다음, 4 μm의 두께로 일련의 파편을 만들었다. 이 파편들은 글라스 슬라이드에 올려 고정하였다. 고정된 절편은 10% 헤마톡시린으로 염색하고, 수분을 제거한 후 현미경으로 조직의 염증정도를 측정하였다. Lung tissues from the influenza virus-infected and albino-treated and virus-infected groups were cut in each time zone and fixed in neutralized formalin, followed by a series of fragments 4 μm thick. These fragments were mounted on glass slides and fixed. The fixed sections were stained with 10% hematoxylin, water was removed, and the degree of inflammation of the tissue was measured under a microscope.

실험 결과 Experiment result

GD-1은 NK92세포에서 IFN-γ 분비를 유도하였다 GD-1 Induced IFN-γ Secretion in NK92 Cells

본 발명자들에 의한 실험결과 팥꽃나무 (Daphne genkwa Sieb. Et Zucc) 식물로부터 분리한 GD-1이, 배양된 NK92 세포에서 사이토카인, 특히 IFN(interferon)-γ의 분비 유도능을 갖고 있음이 확인되었다. GD-1은 팥꽃나무의 건조한 꽃봉오리 추출물로부터 크로마토그래피 분획에 의해 정제하였다. GD-1 화합물은 이 화합물의 분광학적 및 물리화학적 데이터를 문헌(1-6)에 개시된 것과 비교하여, 12-O-벤조일-5-히드록시-6,7-에폭시-레시니페로놀-9,13,14-오르토벤조에이트인 것으로 최종 확인하였다. Experimental results by the present inventors confirmed that GD-1 isolated from the Daphne genkwa Sieb. Et Zucc plant has the ability to induce the secretion of cytokines, in particular IFN (interferon) -γ in cultured NK92 cells It became. GD-1 was purified by chromatography fractions from the dried bud extracts of the red bean flower. The GD-1 compound compares the spectroscopic and physicochemical data of this compound with that disclosed in literature (1-6), and compares 12-O-benzoyl-5-hydroxy-6,7-epoxy-resinifenol-9 It was finally confirmed to be, 13,14-orthobenzoate.

도 1a의 화학식에서 GD-1 (Genkwadapnin, 겐크와다프닌)은 R=-C6H5(#10)인 경우의 화합물이고, 유안후아신(Yuanhuacine)은 R=-CH=CHCH=CH(CH2)4CH3(#11)인 경우의 화합물이다. GD-1 (Genkwadapnin, Genk and dapeu Nin) in the general formula of Figure 1a, R = -C 6 H 5 (# 10) a compound in the case where, after the ammonium sulphate Aisin (Yuanhuacine) is R = -CH = CHCH = CH ( CH 2 ) 4 CH 3 (# 11).

정제한 단일 화합물 형태의 GD-1을 상기 실험 방법에 기재한 바와 같이 NK92 세포 배양액에 첨가하여 배양한 후 배양 상등액으로부터 IFN-γ의 분비량을 측정하였다. GD-1(#10) 및 유안후아신(#11)으로 처리된 NK92 세포에서 분비된 IFN-γ의 수준은 팥꽃나무 유래 총 추출물(T.E)로 처리된 세포에서 분비된 수준과 비슷하였다(도 1b). 2 ng의 총 추출물(T.E)로 처리한 NK92 세포에서는 약 3-4 ng/㎖의 IFN-γ가 분비되었다. GD-1 in the form of purified single compound was added to the NK92 cell culture as described in the above experimental method, followed by culturing to measure the secretion amount of IFN-γ from the culture supernatant. The levels of IFN-γ secreted from NK92 cells treated with GD-1 (# 10) and Yuanhuacin (# 11) were comparable to those secreted from cells treated with bilberry-derived total extract (TE) (Fig. 1b). NK92 cells treated with 2 ng of total extract (T.E) secreted about 3-4 ng / ml of IFN-γ.

도 1c 에 보여지는 바와 같이, 총 추출물(T.E)로 처리된 세포 뿐만 아니라 GD-1(#10) 및 유안후아신(#11)로 처리된 NK92 세포에서 형태학적 변화가 유도되었다. 즉, GD-1으로 처리된 NK92 세포들에서 세포 응집(cell aggregation)이 관찰되었다. 이러한 사실은 GD-1이 수개의 세포내골격(cytoskeleton) 및 세포부착 모이어티(cell adhesion moiety)의 조절과 관련되어 있을 것이라는 것을 암시한다.As shown in FIG. 1C, morphological changes were induced in cells treated with total extract (T.E) as well as NK92 cells treated with GD-1 (# 10) and huahuacin (# 11). That is, cell aggregation was observed in NK92 cells treated with GD-1. This suggests that GD-1 may be involved in the regulation of several cytoskeleton and cell adhesion moieties.

IFN-γ는 NK92 세포에서 특이적으로 유도되었다 IFN-γ was specifically induced in NK92 cells

GD-1의 IFN-γ 분비 유도능에 대한 세포 특이성 여부를 알아보기 위해, 몇 가지의 인간 골수성 세포를 NK92 세포와 동일한 조건하에서 배양한 후, GD-1 및 GD-1을 포함하는 총 추출물로 처리하였다. 상기 실험 방법 설명에 기재된 방법에 따라 배양 상등액내에서의 분비된 IFN-γ의 양을 측정하였다. 그 결과, NK92 세포를 제외하고는 GD-1 처리된 인간 골수성 세포주, U937, HL60, THP-1 및 K562에서는 IFN-γ 분비 유도가 관찰되지 않았다(도 2a). To determine cell specificity for IFN-γ secretion induction of GD-1, several human myeloid cells were cultured under the same conditions as NK92 cells, and then treated with total extracts containing GD-1 and GD-1. It was. The amount of secreted IFN-γ in the culture supernatant was measured according to the method described in the Experimental Method Description above. As a result, except for NK92 cells, induction of IFN-γ secretion was not observed in GD-1 treated human myeloid cell lines, U937, HL60, THP-1 and K562 (FIG. 2A).

한편, NK92 세포에서, CD40, LPS, TNF-α와 같은 다른 자극들에 의해서는 IFN-γ의 분비가 유도되지 않았다(도 2b). NK92 세포의 최적 배양조건과 GD-1의 처리양은 수회의 반복실험을 통해 결정하였는 바, 2 ng의 GD-1을 최종 농도로 결정하였다(도 1b 및 도 1c 참조). 2 ng의 농도에서 GD-1의 세포독성은 관찰되지 않았다. On the other hand, in NK92 cells, secretion of IFN-γ was not induced by other stimuli such as CD40, LPS, TNF-α (FIG. 2B). Optimal culture conditions and amount of GD-1 treatment of NK92 cells were determined through several repeated experiments, and 2 ng of GD-1 was determined as the final concentration (see FIGS. 1B and 1C). No cytotoxicity of GD-1 was observed at a concentration of 2 ng.

IL-12, IL-2, TNF-α, IL-10를 포함하는 사이토카인 방출에 대한 GD-1의 영향 측정은 상업적으로 구입가능한 ELISA 키트 (Endogen)를 사용하여 수행하였다. IL-10은 GD-1 처리된 NK92 세포에서만 방출되었다. 그러나, IL-12, IL-2 및 TNF-α는 GD-1 처리된 NK92 세포, 인간 골수성 세포주 U937, HL-60, THP-1, K562 모두에서 분비가 유도되지 않았다(도 2c). Measurement of the effect of GD-1 on cytokine release, including IL-12, IL-2, TNF-α, IL-10, was performed using a commercially available ELISA kit (Endogen). IL-10 was released only in GD-1 treated NK92 cells. However, IL-12, IL-2 and TNF-α did not induce secretion in all GD-1 treated NK92 cells, human myeloid cell lines U937, HL-60, THP-1, K562 (FIG. 2C).

한편, 도 2d에 나타낸 NK92 세포에서 IFN-γ 생성에 관한 배양조건 실험 결과에 의하면, GD-1 처리에 의한 IFN-γ 분비 유도는 심지어 무혈청 조건에서도 IL-2의 존재 여부에 영향을 받지 않는다는 것을 알 수 있었다. On the other hand, according to the experimental results of the culture conditions for IFN-γ production in NK92 cells shown in Figure 2d, the induction of IFN-γ secretion by GD-1 treatment is not affected by the presence of IL-2 even in serum-free conditions. I could see that.

NK92 세포에서 IFN-γ의 유도는 전사조절에 의해 조절되었다 Induction of IFN-γ in NK92 cells was regulated by transcriptional regulation

NK92 세포에서 IFN-γ 유도에 관련된 mRNA 수준의 변화를 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. NK92 세포들을 2 ng의 GD-1과 함께 6 시간 및 12 시간 동안 각각 배양하였다. 이어서, 세포를 용해시킨 후에 공지된 프로토콜에 따라 RNA를 분리하였다. RNA에 대해 poly A 프라이머와 함께 역전사 효소 (reverse transcriptase)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. IFN-γ, GranzymeB, Perforin에 대해 디자인된 프라이머를 PCR 증폭에 사용하였다(표 1). GAPDH를 내부 표준으로 사용하였다. RT-PCR was performed to determine the mRNA level involved in IFN-γ induction in NK92 cells. NK92 cells were incubated with 2 ng of GD-1 for 6 hours and 12 hours, respectively. Subsequently, after lysing the cells, RNA was isolated according to known protocols. CDNA was prepared using reverse transcriptase with poly A primer for RNA. Primers designed for IFN-γ, GranzymeB, Perforin were used for PCR amplification (Table 1). GAPDH was used as internal standard.

[표 1] PCR에 의해 cDNA 증폭에 사용된 프라이머 TABLE 1 Primers used for cDNA amplification by PCR

Figure 112009023687605-pat00003
Figure 112009023687605-pat00003

도 3a 결과에서 보여지는 바와 같이, IFN-γ의 전사물은 GD-1 처리된 NK92 세포에서 6 시간 후에 현저하게 증가하였으나, 반면 Granzyme B (Gran-B) 및 Perforin에 대한 전사물은 NK92 세포에서 다량 발현되었다. IFN-γ 유도를 위한 GD-1에 대한 반응은 전사 수준에서 1-2 시간 이내에 유도되었고(도 3c), 분비 단백 질 수준에서는 2-4 시간 이내에 유도되었다. 이는 GD-1이 초기에 IFN-γ를 효과적으로 유도한다는 것을 암시한다. As shown in the results of FIG. 3A, transcripts of IFN-γ were significantly increased after 6 hours in GD-1 treated NK92 cells, while transcripts for Granzyme B (Gran-B) and Perforin were increased in NK92 cells. It was expressed in large quantities. Responses to GD-1 for IFN-γ induction were induced within 1-2 hours at the transcription level (FIG. 3C) and within 2-4 hours at the secreted protein level. This suggests that GD-1 effectively induces IFN-γ initially.

GD-1은 NF-kB 서브유닛인 p65 및 p50을 유도하였다 GD-1 induced the NF-kB subunits p65 and p50

IFN-γ 생성에 대한 GD-1의 생물학적 역할을 조사하기 위해, GD-1 처리된 NK92 세포에서 NF-kB 서브유닛인 p65 및 p50에 대한 전사물 및 단백질의 수준을 각각 RT-PCR 및 웨스턴-블롯 분석을 통해 측정하였다. 일반적으로 NK92 세포내에서 IFN-γ의 생성은 NF-kB 신호전달 경로에 의해 매개된다고 알려져 있다.To investigate the biological role of GD-1 on IFN- [gamma] production, the levels of transcripts and proteins for the NF-kB subunits p65 and p50 in GD-1 treated NK92 cells were measured by RT-PCR and Western- respectively. Measured via blot analysis. In general, the production of IFN-γ in NK92 cells is known to be mediated by the NF-kB signaling pathway.

도 4a의 결과에서 보여지는 바와 같이, p50은 NK92 세포에서 구성적(constitutively)으로 발현되었고, p65는 GD-1 처리된 NK92 세포에서 약하게 유도되었다. p50 및 p65에 대한 웨스턴 블롯 분석을 통해 GD-1이 NF-kB 서브유닛의 단백질 수준을 상향조절한다는 것을 확인하였다. 특히, p65 단백질 수준이 GD-1 처리된 NK92 세포내에서 현저하게 증가되어 있었다(도 4b). 결과적으로, GD-1은 NF-kB 신호전달을 통해 IFN-γ의 생성에 기여할 수 있다는 것을 알 수 있었다. As shown in the results of FIG. 4A, p50 was constitutively expressed in NK92 cells and p65 was weakly induced in GD-1 treated NK92 cells. Western blot analysis for p50 and p65 confirmed that GD-1 upregulates protein levels of the NF-kB subunit. In particular, p65 protein levels were significantly increased in GD-1 treated NK92 cells (FIG. 4B). As a result, it was found that GD-1 may contribute to the production of IFN-γ through NF-kB signaling.

NF-kB 서브유닛 p65은 GD-1 처리에 의해 핵안으로 이동하였다 NF-kB subunit p65 migrated into the nucleus by GD-1 treatment

NF-kB의 전사활성은 p65가 세포질로부터 핵안으로 이동하면서 시작된다. p65의 이동을 확인하기 위해, GD-1과 함께 배양한 NK92 세포들을 슬라이드 글라스상에 부착시키고 p65 항체로 반응시켰다. 세포내부의 p65는 공초점 현미경하에서 FITC 컨쥬게이트 항-IgG 항체를 사용하여 시각화하였다. GD-1으로 처리된 NK92 세 포는 도 1c에서 나타나는 바와 같이 밀집되고 접합되는 형태를 보여주었다. GD-1 처리된 NK92 세포에서 많은 양의 이동된 p65 단백질이 DAPI로 염색된 핵에서 관찰되었다(도 5a 및 도 5b). 이러한 결과는 인간 골수종 세포인 U937에서도 명확하게 나타났다. Transcriptional activity of NF-kB begins when p65 migrates from the cytoplasm into the nucleus. To confirm the migration of p65, NK92 cells incubated with GD-1 were attached on slide glass and reacted with p65 antibody. Intracellular p65 was visualized using FITC conjugated anti-IgG antibodies under confocal microscopy. NK92 cells treated with GD-1 showed a dense and conjugated morphology as shown in FIG. 1C. Large amounts of migrated p65 protein in GD-1 treated NK92 cells were observed in the nuclei stained with DAPI (FIGS. 5A and 5B). This result was also evident in U937, a human myeloma cell.

GDGD -1 처리에 의한 By -1 treatment IFNIFN -γ의 생성은 The production of -γ NFNF -- kBkB 신호전달 경로에 의존적이다  Depends on signaling pathway

IFN-γ의 생성이 NF-kB 신호전달 경로에 의존적이라는 것을 입증하기 위해, NF-kB 억제자인 BayII, CAPE, PDTC을 GD-1과 함께 배양되는 NK92 세포에 각각 처리하였다. 도 6의 결과에서 보여지는 바와 같이, IFN-γ 분비는 25 μM의 BayII 처리된 NK92 세포내에서 완전히 중단되었다. 이는 GD-1에 의한 IFN-γ의 유도가 NF-kB 신호전달에 의해 매개된다는 것을 암시한다. 몇 가지의 신호전달 억제자, Wortmannin (PI3K 억제자), JNK Inhi II, S 203580 (p38 MAPK 억제자), PD 98059 (MAPK 키나아제 억제자), U0126 (MEK 1, 2 억제자) 및 LY27632 (ROCK 억제자), ZM336372 (Raf 키나아제 억제자), AKT 억제자, PKC 억제자, Dexamethasone은 GD-1 처리에 의한 IFN-γ의 유도를 효과적으로 차단하지 못하였다(도 6b). To demonstrate that the production of IFN- [gamma] is dependent on the NF-kB signaling pathway, NF-kB inhibitors BayII, CAPE and PDTC were each treated in NK92 cells incubated with GD-1. As shown in the results of FIG. 6, IFN-γ secretion was completely stopped in 25 μM of BayII treated NK92 cells. This suggests that the induction of IFN-γ by GD-1 is mediated by NF-kB signaling. Several signaling inhibitors, Wortmannin (PI3K inhibitor), JNK Inhi II, S 203580 (p38 MAPK inhibitor), PD 98059 (MAPK kinase inhibitor), U0126 (MEK 1, 2 inhibitor) and LY27632 (ROCK Inhibitors), ZM336372 (Raf kinase inhibitors), AKT inhibitors, PKC inhibitors, and Dexamethasone did not effectively block the induction of IFN-γ by GD-1 treatment (FIG. 6B).

인플루엔자 바이러스 감염된 마우스에서 GD-1 또는 유안후아신(yuanhuacine) 처리에 의한 체중 감소의 억제 효과 Inhibitory Effect of Weight Loss by GD-1 or Yuanhuacine Treatment in Influenza Virus Infected Mice

인플루엔자 바이러스 (type H1N1)로 감염시킨 마우스 동물 모델에서 감염된 마우스의 체중 감소에 미치는 GD-1 및 유안후아신의 영향을 측정하였다. 실험 결 과 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스는 1-6 일간 시간이 지날수록 체중이 감소한 반면, GD-1 또는 유안후아신이 투여된 마우스는 체중 감소가 억제되었다(도 7a, 도 7b, 도 7c 및 도 7d). The effects of GD-1 and yuanhuacin on weight loss in infected mice were measured in mouse animal models infected with influenza virus (type H1N1). As a result, mice infected with influenza virus lost weight over 1-6 days, whereas mice administered with GD-1 or huahuacin inhibited weight loss (FIG. 7A, FIG. 7B, FIG. 7C and FIG. 7D). ).

인플루엔자 바이러스 감염된 마우스에서 GD-1 또는 유안후아신 처리에 의한 식이 섭취량 감소의 억제 효과 Inhibitory Effects of GD-1 or Euanhuacin Treatment on Dietary Intake Reduction in Influenza Virus Infected Mice

인플루엔자 바이러스 (type H1N1)로 감염시킨 마우스 동물 모델에서 감염된 마우스의 식이량 감소에 미치는 GD-1 및 유안후아신의 영향을 측정하였다. 실험결과 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스는 4 일간 시간이 지날수록 식이 섭취량(feed intake)이 감소한 반면, GD-1 또는 유안후아신이 투여된 마우스는 식이 섭취량 감소가 억제되었다(도 8a 및 도 8b). The effect of GD-1 and yuanhuacin on dietary reduction in infected mice was measured in mouse animal models infected with influenza virus (type H1N1). Experimental results show that mice infected with influenza virus had a reduced feed intake over time for 4 days, whereas mice administered with GD-1 or huahuacin suppressed a decreased dietary intake (FIGS. 8A and 8B).

인플루엔자 바이러스 감염된 마우스의 폐조직에서 GD-1 또는 유안후아신 처리에 의한 염증 반응 억제 효과 Inhibition of Inflammatory Response by GD-1 or Euanhuacin Treatment in Lung Tissues of Influenza Virus Infected Mice

인플루엔자 바이러스 (type H1N1)로 감염시킨 마우스 동물 모델에서 GD-1 및 유안후아신의 염증 반응 억제 효과를 측정하였다. 염증 반응 억제 효과는 인플루엔자 바이러스 감염된 마우스에 GD-1 또는 유안후아신을 투여하거나 투여하지 않은 후, 마우스의 폐 조직을 조직화학적으로 염색하여 확인하였다. 바이러스로 감염된 마우스로서 GD-1 또는 유안후아신을 투여하지 않은 마우스의 폐 조직을 관찰한 결과 많은 수의 림프구(lymphocyte), 혈장 세포(plasma cell), 대식세포(macrophage) 가 간질조직(interstitium)에서 발견되었고, 폐포 조직이 부분적으로 소실되었으며, 폐포 격막이 두꺼워졌다. 반면, GD-1 또는 유안후안신을 투여한 인플루엔자 바이러스 감염된 마우스는 어떠한 염증성 세포도 발견되지 않았으며, 거의 정상의 폐 조직이 관찰되었다. Inhibitory effects of GD-1 and huahuacin on inflammatory response were measured in mouse animal models infected with influenza virus (type H1N1). The inflammatory response inhibitory effect was confirmed by histochemical staining of lung tissue of mice after or without administration of GD-1 or huahuacin to influenza virus infected mice. Lung tissues of mice infected with the virus that did not receive GD-1 or huahuacin showed a large number of lymphocytes, plasma cells, and macrophage in the interstitium. The alveolar tissue was partially lost and the alveolar septum thickened. On the other hand, influenza virus infected mice treated with GD-1 or uan Juancin did not find any inflammatory cells and almost normal lung tissue was observed.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

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도 1a는 팥꽃나무 (Genkwa daphne) 추출물로부터 분리한 화합물 GD-1(Genkwadapnin, #10) 및 유안후아신(yuanhuacine, #11)의 화학 구조를 보여준다. Figure 1a is a zinnia ( Genkwa daphne ) shows the chemical structures of compounds GD-1 (Genkwadapnin, # 10) and yuanhuacine (# 11) isolated from the extract.

도 1b는 팥꽃나무 추출물로부터 분리한 분획 (No 1-20)을 NK92 세포에 처리한 후 IFN-γ의 생성을 ELISA 키트 (Endogen)를 사용하여 행한 분석결과이다. 분획 No.10 (#10) 및 No. 11 (#11)은 각각 GD-1과 유안후아신을 나타낸다. 팥꽃나무의 총 추출물(T.E) 및 DMSO를 각각 양성 및 음성 비교 대조군으로 사용하였다. 모든 ELISA 데이터는 적어도 3회의 독립 실험의 대푯값이다. FIG. 1B is an analysis result of IFN-γ production using an ELISA kit (Endogen) after treatment of NK92 cells with a fraction (No 1-20) isolated from the sorbus extract. Fraction No. 10 (# 10) and No. 11 (# 11) represents GD-1 and huahuacin, respectively. Total extract (T.E) and DMSO of SAD were used as positive and negative comparative controls, respectively. All ELISA data are representative of at least three independent experiments.

도 1c는 GD-1(#10), 유안후아신(#11) 및 총 추출물 (T.E)의 첨가에 의해 유도된 NK92 세포의 형태적 변화를 24 웰 플레이트상에서 현미경을 통해 관찰한 결과이다. 비교군으로 분획 1(#1), 분획 6(#6) 및 DMSO을 처리한 결과도 관찰하였다. 1C shows the results of microscopic observation of morphological changes of NK92 cells induced by the addition of GD-1 (# 10), yuanhuacin (# 11) and total extract (T.E) on a 24-well plate. The results of treatment of fraction 1 (# 1), fraction 6 (# 6) and DMSO as a comparative group were also observed.

도 2a는 인간 골수종 세포주 U937, HL-60, THP-1, K562, NK92에서 GD-1 처리에 의한 IFN-γ의 생성을 평가한 결과이다. 인간 골수성 세포주에서 IFN-γ 생성에 대한 GD-1의 유효 농도는 2 ng으로 결정하였다. 모든 ELISA 데이터는 적어도 3회의 독립적인 실험의 대표 값이다. Figure 2a is the result of evaluating the production of IFN-γ by GD-1 treatment in human myeloma cell lines U937, HL-60, THP-1, K562, NK92. The effective concentration of GD-1 on IFN-γ production in human myeloid cell lines was determined to be 2 ng. All ELISA data are representative of at least three independent experiments.

도 2b는 면역 자극 CD40 (1: 10 ng/㎖, 2: 1 ng/㎖), LPS (1: 100 ng/㎖, 2: 10 ng/㎖), TNF-α (1: 5 ng/㎖, 2: 0.5 ng/㎖) 및 GD-1 (1: 20 ng/㎖, 2: 2 ng/㎖)의 존재 하에서 NK92 세포주의 IFN-γ 생성량을 측정한 결과이다. 2B shows immune stimulating CD40 (1: 10 ng / ml, 2: 1 ng / ml), LPS (1: 100 ng / ml, 2: 10 ng / ml), TNF-α (1: 5 ng / ml, IFN-γ production of the NK92 cell line was measured in the presence of 2: 0.5 ng / ml) and GD-1 (1: 20 ng / ml, 2: 2 ng / ml).

도 2c는 GD-1 처리된 인간 골수성 세포내에서 분비된 사이토카인 생성양을 측정한 결과이다. IL-12 (패널 A), IL-2 (패널 B), TNF-α (패널 C) 및 IL-10 (패널 D)의 수준은 GD-1 처리된 인간 골수성 세포주 U937, HL-60, THP-1, K562, NK92에서 측정하였다. 모든 ELISA 데이터는 3회의 독립 실험의 대푯값으로 나타내었다. 배양 상등액내의 IFN-γ는 ELISA 키트(Endogen)에 의해 측정하였다. Figure 2c is the result of measuring the amount of cytokine secreted in GD-1 treated human myeloid cells. The levels of IL-12 (Panel A), IL-2 (Panel B), TNF-α (Panel C) and IL-10 (Panel D) were GD-1 treated human myeloid cell lines U937, HL-60, THP- 1, K562, NK92. All ELISA data are presented as representative of three independent experiments. IFN-γ in the culture supernatant was measured by ELISA kit (Endogen).

도 2d는 GD-1 처리된 NK92 세포에서 IFN-γ 생성에 대한 최적 배양 조건을 확인한 실험 결과이다. NK92 세포를 GD-1 처리하여 IL-2의 존재(+) 또는 부존재(-) 하에서 연속농도 0％ - 20％의 FCS를 첨가하여 12 시간 동안 배양하였다. 배양 상등액내의 IFN-γ의 양은 ELISA 키트 (Endogen)를 사용하여 측정하였다. Figure 2d is an experimental result confirming the optimum culture conditions for IFN-γ production in GD-1 treated NK92 cells. NK92 cells were treated with GD-1 and cultured for 12 hours with the addition of FCS at a continuous concentration of 0% -20% in the presence (+) or absence (-) of IL-2. The amount of IFN-γ in the culture supernatant was measured using an ELISA kit (Endogen).

도 3a는 GD-1 처리된 NK92 세포에서 IFN-γ, Granzyme B 및 Perforin의 mRNA의 발현 수준을 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다. 내부 표준으로서, GAPDH를 사용하였다. 추출된 총 RNA의 양은 28S 및 18S으로 표준화하였다. cDNA 증폭을 위한 프라이머들은 표 1에 나타내었다. Figure 3a is the result of confirming the expression level of mRNA of IFN-γ, Granzyme B and Perforin mRNA in GD-1 treated NK92 cells by RT-PCR. As an internal standard, GAPDH was used. The amount of total RNA extracted was normalized to 28S and 18S. Primers for cDNA amplification are shown in Table 1.

도 3b는 GD-1 처리된 NK92 세포에서 IFN-γ의 생성양을 ELISA 키트를 사용하여 경시적으로 측정한 결과이다. 각 시간에서 3개의 샘플을 시험하였다. Figure 3b is the result of measuring the production of IFN-γ in GD-1 treated NK92 cells over time using the ELISA kit. Three samples were tested at each time.

도 3c는 NK92 세포를 GD-1 처리한 후 RT-PCR을 사용하여 측정한 IFN-γ 전사 활성도에 대한 동역학 결과이다. 3C is a kinetics result for IFN-γ transcriptional activity measured using RT-PCR after NK92 cells treated with GD-1.

도 4a는 GD-1 처리된 NK 세포내에서 RT-PCR 측정을 통해 NF-kB의 서브유닛 p50 및 p65의 전사가 조절되는 결과를 보여준다. LPS (1 ug/㎖) 및 DG-1(200, 20 , 2 ng/㎖)을 처리하였다. cDNA 증폭용 p50 및 p65 프라이머는 표 1에 나타내었다. 4A shows the results of regulation of the transcription of subunits p50 and p65 of NF-kB through RT-PCR measurement in GD-1 treated NK cells. LPS (1 ug / ml) and DG-1 (200, 20, 2 ng / ml) were treated. p50 and p65 primers for cDNA amplification are shown in Table 1.

도 4b는 세포내 p50 및 p65 단백질 수준을 웨스턴 블롯에 의해 측정한 결과이다. p50 및 p65에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. 도 4a 및 도 4b에 나타난 결과에 의해 NK92 세포내에서 NF-kB의 서브유닛 p50 및 p65가 GD-1에 의해 유도됨을 알 수 있다. 4B shows the results of Western blot measurement of intracellular p50 and p65 protein levels. Antibodies against p50 and p65 were purchased from Santa Cruz Biotechnology. 4A and 4B show that subunits p50 and p65 of NF-kB are induced by GD-1 in NK92 cells.

도 5a 및 도 5b는 GD-1 자극된 NK92 세포내에서 p65의 핵안으로의 이동을 보여주는 결과이다. 전사활성을 갖는 NF-kB 서브유닛의 핵안으로의 이동을 공초점 전자현미경에 의해 관찰한 결과이다. 세포내 골격의 조절은 위상차 현미경을 통해 관찰하였고, 핵을 시각화하기 위해 DAPI 염색을 수행하였다. 5A and 5B show the migration of p65 into the nucleus in GD-1 stimulated NK92 cells. The migration of the NF-kB subunit having transcriptional activity into the nucleus was observed by confocal electron microscopy. Regulation of the intracellular skeleton was observed through phase contrast microscopy and DAPI staining was performed to visualize the nucleus.

도 6a는 GD-1에 의해 유도되는 IFN-γ 생성이 NF-kB 활성에 의존한다는 것을 보여주는 결과이다. 1-100μM 농도 범위로 NF-kB 활성 억제자인 Bay-ll, CAPE, PDTC를 GD-1 처리된 NK92 세포에 처리하였다. 배양된 상등액내에서 IFN-γ의 농도는 ELISA 키트 (Endogen)를 사용하여 분석하였다. 6A is a result showing that IFN-γ production induced by GD-1 is dependent on NF-kB activity. NF-kB activity inhibitors Bay-ll, CAPE, PDTC were treated to GD-1 treated NK92 cells in a concentration range of 1-100 μM. The concentration of IFN-γ in the cultured supernatant was analyzed using an ELISA kit (Endogen).

도 6b는 GD-1 처리된 NK92 세포내에서 IFN-γ의 생성이 다양한 신호전달 경로에 관련된 억제자의 처리에 의해 차단되는지를 실험한 결과이다. NK92 세포를 2 ng의 GD-1의 존재하에서 배양하고 스톡 용액을 100-1000 배 희석한 후 첨가하였다. 배양 상등액내의 IFN-γ의 양은 ELISA 키트(Endogen)에 의해 측정하였다. FIG. 6B is an experiment showing whether IFN-γ production in GD-1 treated NK92 cells is blocked by treatment with inhibitors involved in various signaling pathways. NK92 cells were incubated in the presence of 2 ng GD-1 and added after 100-1000 fold dilution of the stock solution. The amount of IFN-γ in the culture supernatant was measured by ELISA kit (Endogen).

도 7a-도 7d는 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스의 GD-1의 항 인플루엔자 바이러스 효과를 바이러스 감염 마우스의 체중을 측정하여 확인한 결과이다. 도 7a 및 도 7b의 결과에 의하면, 인플루엔자에 감염된 마우스는 체중이 시간경과에 따라 지속적으로 감소한 반면, GD-1 물질이 투여된 마우스는 급격한 체중 감소가 나타나지 않음을 알 수 있다. 도 7c는 바이러스에 감염된 마우스의 체중이 감소한 결과를 나타내고, 도 7d는 바이러스 감염된 마우스에 본 발명의 화합물 GD-1을 투여한 경우 체중 감소가 억제됨을 보여준다. 도 7a - 도 7d에서 P10은 도 1b에 나타낸 도면에서 분획물 #10을 의미한다. 7A-7D show the results obtained by measuring the anti-influenza virus effect of GD-1 in mice infected with influenza virus by measuring the weight of virus infected mice. According to the results of FIGS. 7A and 7B, mice infected with influenza continuously decreased in weight, whereas mice treated with the GD-1 substance did not show rapid weight loss. Figure 7c shows the result of the weight loss of the virus-infected mice, Figure 7d shows that weight loss is inhibited when the compound GD-1 of the present invention administered to the virus-infected mice. In FIGS. 7A-7D, P10 refers to fraction # 10 in the diagram shown in FIG. 1B.

도 8a 및 도 8b는 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스의 GD1의 항 인플루엔자 바이러스 효과를 바이러스 감염 마우스의 식이량 감소 회복을 측정하여 확인한 결과이다. 도 8a 에서 P10은 도 1b에 나타낸 도면에서 분획물 #10을 의미한다.8A and 8B show the anti-influenza virus effect of GD1 in mice infected with influenza virus by measuring the reduced dietary recovery of virus infected mice. P10 in FIG. 8A means fraction # 10 in the diagram shown in FIG. 1B.

도 9a 및 도 9b는 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스의 허파 조직에서 GD-1 물질이 염증 반응을 억제하는 효과를 조직화학적 염색법을 통해 확인한 결과이다. 도 9b는 본 발명의 화합물이 마우스의 허파 조직에서 인플루엔자 바이러스 감염을 완전하게 억제하는 것을 보여주고 있다. 도 9b 에서 P10은 도 1b에 나타낸 도면에서 분획물 #10을 의미한다.Figures 9a and 9b is a result of confirming the effect of the GD-1 substance inhibits the inflammatory response in the lung tissue of mice infected with influenza virus through histochemical staining. 9B shows that the compounds of the present invention completely inhibit influenza virus infection in lung tissue of mice. P10 in FIG. 9B means fraction # 10 in the diagram shown in FIG. 1B.

Claims (13)

팥꽃나무 (Daphne genkwa) 추출물 또는 팥꽃나무 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물. Pharmaceutical composition for the treatment or prevention of diseases caused by influenza virus comprising an extract of Daphne genkwa or a solvent fraction of the red bean flower as an active ingredient. 제 1 항에 있어서, 상기 팥꽃나무 추출물의 추출용매는 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산 또는 디에틸에테르인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물. According to claim 1, wherein the extract solvent of the sorbus extract is anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, a mixed solvent of the lower alcohol and water, acetone, ethyl acetate, chloroform, butyl acetate, 1,3-butyl Pharmaceutical composition, characterized in that len glycol, hexane or diethyl ether. 제 1 항에 있어서, 상기 팥꽃나무 추출물은 팥꽃나무의 줄기, 뿌리, 잎, 또는 꽃으로부터 얻은 추출물임을 특징으로 하는 약제학적 조성물. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the red bean flower extract is an extract obtained from the stem, root, leaf, or flower of the red bean flower. 삭제delete 팥꽃나무 (Daphne genkwa) 추출물 또는 팥꽃나무 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물. Functional food composition for the improvement or prevention of diseases caused by influenza virus comprising the extract of Daphne genkwa (or Daphne genkwa) solvent fraction as an active ingredient. 팥꽃나무 (Daphne genkwa) 추출물 또는 팥꽃나무 용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 동물에서의 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 개선 또는 예방을 위한 동물 사료 첨가용 조성물. A composition for the addition of animal feed for the improvement or prevention of diseases caused by influenza virus in an animal comprising a bean extract (Daphne genkwa) extract or a bean extract solvent fraction as an active ingredient. 제 1 항에 있어서, 상기 팥꽃나무 추출물 또는 팥꽃나무 용매 분획물은 NK (Natural Killer) 세포에서 IFN (interferon)-γ의 분비 유도 작용을 통해 항 인플루엔자 바이러스 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물. 2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the adzuki bean extract or adzuki bean solvent fraction exhibits anti-influenza virus activity through secretion inducing action of IFN (interferon) -γ in NK (Natural Killer) cells. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition for the treatment or prevention of diseases caused by influenza virus comprising a compound represented by the formula (1) as an active ingredient. [화학식 1] [Formula 1]
Figure 112011009282502-pat00004
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 단, 상기 화학식 1에서, R은 -C6H5 또는 -CH=CHCH=CH(CH2)4CH3 이다. However, in Chemical Formula 1, R is —C 6 H 5 or —CH═CHCH = CH (CH 2 ) 4 CH 3 . 삭제delete 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물. Functional food composition for the improvement or prevention of diseases caused by influenza virus comprising a compound represented by the formula (1) as an active ingredient. [화학식 1] [Formula 1]
Figure 112011009282502-pat00029
Figure 112011009282502-pat00029
 단, 상기 화학식 1에서, R은 -C6H5 또는 -CH=CHCH=CH(CH2)4CH3 이다. However, in Chemical Formula 1, R is —C 6 H 5 or —CH═CHCH = CH (CH 2 ) 4 CH 3 . 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 동물에서의 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 개선 또는 예방을 위한 동물 사료 첨가용 조성물. A composition for animal feed for improving or preventing diseases caused by influenza virus in an animal comprising the compound represented by Formula 1 as an active ingredient. [화학식 1] [Formula 1]
Figure 112011009282502-pat00030
Figure 112011009282502-pat00030
 단, 상기 화학식 1에서, R은 -C6H5 또는 -CH=CHCH=CH(CH2)4CH3 이다. However, in Chemical Formula 1, R is —C 6 H 5 or —CH═CHCH = CH (CH 2 ) 4 CH 3 . 제 8 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 NK (Natural Killer) 세포에서 IFN (interferon)-γ의 분비 유도 작용을 통해 항바이러스 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물. The pharmaceutical composition of claim 8, wherein the compound of Formula 1 exhibits antiviral activity through secretory induction of IFN (interferon) -γ in natural killer (NK) cells. 제 12 항에 있어서, 상기 IFN-γ의 분비 유도 작용은 NF-kB의 활성화에 의한 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물. 13. The pharmaceutical composition of claim 12, wherein the secretory inducing action of IFN-γ is by activation of NF-kB.
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