KR101059871B1 - 신나마이드 유도체 및 이를 이용한 신경전구세포 또는 줄기세포의 신경세포로의 분화 유도용 조성물 - Google Patents

신나마이드 유도체 및 이를 이용한 신경전구세포 또는 줄기세포의 신경세포로의 분화 유도용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 신규한 신나마이드(cinnamide) 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 이를 이용한 신경전구세포(neural precursor cell) 또는 줄기세포(stem cell)의 신경세포로의 분화유도용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따라 신나마이드 유도체를 이용하여 분화된 신경세포는 신경 손상질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다:
<화학식 1>
Figure 112009012114585-pat00001
상기 식에서,
R은 하나 이상의 F, Cl 또는 Br이다.
신나마이드 유도체, 신경전구세포, 줄기세포, 신경세포, 분화

Description

신나마이드 유도체 및 이를 이용한 신경전구세포 또는 줄기세포의 신경세포로의 분화 유도용 조성물{CINNAMIDE DERIVATIVES AND COMPOSITION FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF NEURAL PRECURSOR CELLS OR STEM CELLS INTO NEURAL CELLS USING SAME}
본 발명은 신규한 신나마이드(cinnamide) 유도체, 및 이를 이용한 신경전구세포(neural precursor cell) 또는 줄기세포(stem cell)의 신경세포로의 분화유도용 조성물에 관한 것이다.
뇌졸중(stroke), 알츠하이머병, 파킨슨병, 탈수초질환(demyelinating disease), 척추 손상(spinal cord injury) 등은 신경 세포 손상에 의해 신경기능에 이상이 생기는 질환이다. 상기 질환들로 인해 손상된 신경세포를 치료하는 방법은 약물요법 또는 외과적 수술이 일반적이지만, 이러한 치료는 정상적인 세포에도 손상을 입혀 문제점으로 지적되고 있다.
이에 최근에는 질환에 의해 파괴되거나 손상된 세포를 외부로부터 공급해 주 는 세포 치료제가 효과적인 것으로 제시되고 있다. 이러한 세포 치료제로는 줄기세포(stem cell)가 각광을 받고 있다.
줄기세포란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있고, 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되고 이러한 분화는 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다양한 세포로도 분화될 수 있는, 분화의 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
뇌신경계 조직을 다른 조직과는 달리 면역거부반응이 거의 없기 때문에, 줄기세포를 이식하였을 때 이식된 세포의 장기간 생존을 기대할 수 있고, 따라서 신경세포 손상에 의해 유발되는 다양한 신경 질환(neuronal diseases)에 대한 세포 치료제로서도 많은 연구가 이루어지고 있다. 이에, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병, 탈수초질환, 척추손상 등의 질환 치료에 줄기세포를 적용하려는 시도가 현재 진행 중이다(Isacon O, Deacon T, Trends. Neurosci., 10:477-482(1997); Studer et al., Nat. Neurosci., 1:290-295 (1998)). 그러나, 세포 치료제로서의 줄기세포의 유용성을 높이기 위해서는 줄기세포를 효율적으로 특정세포로 분화시키는 기술이 필요하다. 본 발명자들은 신규한 신나마이드 유도체 화합물이 줄기세포를 특정세포로 분화시키는 것을 밝혀내었으며, 나아가 그 효율 또한 대단히 높은 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 줄기세포를 특정세포로 효율적으로 분화시킬 수 있는 신나마이드 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신나마이드 유도체를 포함하는, 신경전구세포(neural precursor cell) 또는 줄기세포(stem cell)의 신경세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 신경전구세포 또는 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시된 신나마이드 유도체 또는 그의 염을 제공한다:
Figure 112009012114585-pat00002
상기 식에서,
R은 하나 이상의 F, Cl 또는 Br이다.
상기 다른 목적에 따라, 상기 화학식 1로 표시된 신나마이드 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 신경전구세포(neural precursor cell) 또는 줄기세포(stem cell)의 신경세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 조성물을 신경전구세포 또는 줄기세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 신경전구세포 또는 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 신나마이드 유도체를 이용하여 신경전구세포 또는 줄기세포를 신경세포로 분화시킬 수 있으므로, 이렇게 분화된 신경세포를 포함하는 조성물은 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 척수 손상 질환을 포함하는 신경 손상 질환의 세포 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.
본 발명에서 사용된 용어 "신경 손상 질환"은 운동 및 감각에 관여하는 신경이 손상되어 운동 및 감각을 포함하는 행동기능에 이상이 있는 질환을 의미하며, 이러한 질환은 뇌졸중(stroke), 알츠하이머병, 파킨슨병 및 척추 손상 질환(spinal cord injury disease)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "치료"는 1) 아직 신경 손상 질환을 보유하고 있다고 진단되지 않았으나, 이러한 경향이 있는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 질병 또는 장애가 발생되는 것의 예방, 2) 신경 손상 질환의 억제, 즉 발전의 억제, 및 3) 신경 손상 질환의 경감을 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "신경세포(neural cell)"는 중추신경계 또는 말초신경계의 뉴론(neuron) 및/또는 글리아, 예를 들면 성상세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte) 및/또는 슈반세포(Schwann cell)를 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신나마이드 유도체 또는 그의 염을 제공한다:
<화학식 1>
Figure 112009012114585-pat00003
상기 식에서,
R은 하나 이상의 F, Cl 또는 Br이다.
본 발명에 따른 화학식 1의 바람직한 화합물로서 하기 화합물들을 들 수 있다:
(E)-4-(3-(3-(4-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드;
(E)-4-(3-(3-(2-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드;
(E)-4-(3-(3-(3-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드; 및
(E)-4-(3-(3-(2,4-다이플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드.
본 발명에 따른 화학식 1의 신나마이드 유도체는 하기 반응식 1로 표시되는 합성경로에 따라 제조할 수 있다:
Figure 112009012114585-pat00004
상기 반응식 1에 도시한 바와 같은 본 발명의 신나마이드 유도체의 제조 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 먼저, 화학식 2의 화합물을 팔라듐 촉매 존재하에 에틸 아크릴레이트와 반응시켜 화학식 3의 화합물을 제조한 후, 제조된 화학식 3의 화합물을 (O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)하이드록실아민(NH2OTHP) 및 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보디이미드 염산염(EDCI)과 반응시켜 화학식 4의 화합물을 제조할 수 있다. 이어, 화학식 4의 화합물을 테트라하이드로푸란(THF), LiOH와 물의 혼합 용매 및 에탄올(EtOH)의 용매와 반응시켜 가수분해함으로써 화학식 5의 화합물을 제조할 수 있다(단계 A).
한편, 화학식 6의 니트로 페놀을 치환된 벤질 할라이드 유도체와 반응시켜 화학식 7의 화합물을 제조하고, 제조된 화학식 7의 화합물을 금속 염화물과 환원반응시켜 화학식 8의 화합물을 제조할 수 있다(단계 B).
상기 단계 A에서 제조된 화학식 5의 화합물과 상기 단계 B에서 제조된 화학식 8의 화합물을 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보디이미드 염산염(EDCI) 존재하에 반응시켜 화학식 9의 화합물을 제조한 후, 이를 산 존재해에서 탈보호 반응시켜 본 발명의 화학식 1의 화합물을 제조할 수 있다(단계 C).
본 발명의 화학식 1의 신나마이드 화합물은 신경전구세포 또는 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 능력이 탁월하다. 따라서, 본 발명은 상기 화학식 1의 신나마이드 유도체 또는 그의 염을 유효 성분으로 포함하는, 신경전구세포 또는 줄기세포의 신경세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에서 화학식 1의 신나마이드 유도체는 0.1 내지 100 uM의 양, 바람직하게는 10 내지 20 uM의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명에 의해 분화될 수 있는 줄기세포는 특정한 신경계 세포를 만들어내는 신경전구세포의 단계를 거쳐서 신경세포로 분화하게 된다. 따라서, 미분화 상태이면서, 무한정 증식 및 신경세포로의 분화기능을 갖는 세포라면 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 배아생식 줄기세포, 배아종양 줄기세포 등으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 신경전구세포 또는 줄기세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 신경전구세포 또는 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
상기 배양은 고농도 글루코스가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Hyclone)과 같은 세포배양용 배지에서 수행될 수 있으며, 배양배지에는 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 글루타민(glutamine) 등이 추가로 첨가될 수 있다. 배양기간은 3 내지 10일이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화된 신경세포를 유효 성분으로 포함하는, 신경세포손상 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 신경세포를 치료학적으로 유효한 양으로 신경세포 손상 질환의 치료가 필요한 대상의 손상부위에 투여할 경우, 주변 중추신경계 또는 말초신경계의 신경전구세포 또는 신경줄기세포를 신경세포로 분화시켜 손상된 신경 기능을 회복시키고 신경 손상 질환을 치료할 수 있다. 이때 상기 대상은 인간을 포함하는 포유동물일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 구소 투여용 제제 등이 바람직하다. 이때, 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 함께 사용할 수 있다.
신경 세포의 1회 투여량은 1 x 105 세포/kg(체중), 바람직하게는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효 성분의 실제 투여량은 분화 및 증식하고자 하는 신경세포의 양, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등 여러 관련 인자를 고려하여 결정할 수 있으며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 형태로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: (E)-4-(3-(3-(4-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00005
1-1. (E)-4-(3-에톡시-3-옥소프로프-1-에닐)벤조산의 제조
Figure 112009012114585-pat00006
쉴드 튜브(Shield tube)에서 4-요오도벤조산 (3g, 12.09mmole)을 다이메틸포름아마이드(DMF) 30mL에 녹인 후 포타슘 아세테이트(KOAC; 2.37g, 24.19 mmole)와 팔라듐 아세테이트(Pd(OAC)2; 135mg, 5mol%), 테트라부틸 암모늄 클로라이드(nBu4NCl; 3.36g, 12.09mmole) 및 에틸 아크릴레이트(6.05g, 60.45mmole)를 넣은 후 125℃에서 4시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면 실온으로 냉각시킨 후, 포화 NH4Cl을 넣고 에틸아세테이트(EtOAc)로 추출하였다. 이어, 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과, 감압 및 농축한 후, 정제 없이 하기 실시예 1-2에 이용하였다(갈색 고체 3.3 g, 100 %).
TLC (EtOAc/Hex = 1/1) Rf 0.5
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.34 (t, J =7.2 Hz, 3H), 4.3 (q, J =7.2 Hz, 2H), 6.5 (d, J =16.0 Hz, 1H), 7.6 (d, J =8.2 Hz, 2H), 7.7 (d, J =16.0 Hz, 2H), 8.1 (d, J =8.2 Hz, 2H)
LC/MS(M+H):
1-2. (E)-에틸-3-(4-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시카바모일)페닐)아크릴레이트의 제조
Figure 112009012114585-pat00007
상기 실시예 1-1에서 제조한 (E)-4-(3-에톡시-3-옥소프로프-1-에닐)벤조산 (3.3g, 14.98mmole)을 다이메틸포름아마이드(DMF) 40mL에 녹인 후 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보디이미드 염산염(EDCI); 2.87g, 14.98mmole)과 트라이에틸아민(TEA; 4.5g, 44.98mmole) 및 O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)하이드록실아민(NH2OTHP; 2.63g, 22.48mmole)을 넣고 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응이 종결되면 포화 NH4Cl을 넣고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이어, 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과, 감압 및 농축한 후, 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다(흰색 고체 2.09 g, 43 %).
TLC (EtOAc/Hex = 1/1) Rf 0.6
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 1.34 (t, J =7.2 Hz, 3H), 1.5-1.9 (m, 6H), 3.65 (m, 1H), 4.0 (m, 1H), 4.26 (q, J =7.2 Hz, 2H), 5.09 (s, 1H) 6.46 (d, J =16.0 Hz, 1H), 7.54 (d, J =8.2 Hz, 2H), 7.65 (d, J =16.0 Hz, 2H), 7.8 (d, J =8.2 Hz, 2H), 9.4 (bs, 1H)
LC/MS(M+H): X
1.3 (E)-3-(4-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시카바모일)페닐)아크릴산의 제조
Figure 112009012114585-pat00008
상기 실시예 1-2에서 제조한 (E)-에틸 3-(4-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시카바모일)페닐)아크릴레이트 (2g, 6.29mmole)를 테트라하이드로푸란(THF) 30mL에 녹인 후 H2O 15 mL에 LiOH (800mg, 18.79mmole)를 녹인 용액을 넣고, 에탄올(EtOH) 15mL을 천천히 가한 후 실온에서 12시간 교반시켰다. 반응이 종결되면 감압 농축하고 물에 녹인 후 2N HCl로 pH를 2로 조정하고 에틸 아세테이트로 추출한 후, Na2SO4로 건조시키고, 여과, 감압 농축한 후, 표제의 화합물을 얻었다(흰색 고체 1.5 g, 50 %).
TLC (EtOAc/Hex = 1/0) Rf 0.5
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 1.6-1.9 (m, 6H), 3.63 (m, 1H), 4.12 (m, 1H), 5.09 (s, 1H) 6.67 (d, J =16.0 Hz, 1H), 7.7 (d, J =8.2 Hz, 2H), 7.69 (d, J =16.0 Hz, 2H), 7.8 (d, J =8.2 Hz, 2H)
LC/MS(M+H): 291.94
1-4. 1-(4-플루오로벤질옥시)-3-나이트로벤젠의 제조
Figure 112009012114585-pat00009
3-나이트로페놀 (1g, 7.19mmole)을 아세톤 10mL에 녹인 후, 4-플루오로벤질브로마이드 (1.49g, 7.9mmole) 및 K2CO3 (1.98g, 14.38mmole)을 넣은 후 60℃에서 3 시간 교반하였다. 반응이 종결되면 감압 농축, 물에 녹인 후 에틸 아세테이트로 추출한 후, Na2SO4로 건조시키고, 여과, 감압 농축 후 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다(흰색 고체 1.28 g, 73 %).
TLC (EtOAc/Hex = 5/95) Rf 0.3
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.10 (s, 2H), 7.06-7.12 (m, 2H), 7.25-7.3 (m, 1H), 7.39-7.46 (m, 3H) 7.79-7.86 (m, 2H)
LC/MS(M+H): 248.22
1-5. 3-(4-플루오로벤질옥시)아닐린의 제조
Figure 112009012114585-pat00010
상기 실시예 1-3에서 제조한 1-(4-플루오로벤질옥시)-3-나이트로벤젠 (500mg, 2.02mmole)을 에탄올 10mL에 녹인 후 염화 주석(1.72g, 9.10mmole)을 넣고 65℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 감압 농축, 얼음에 녹인 후 0.5N Na2CO3를 넣고 pH를 9로 조정한 후 CH2Cl2로 3회 추출하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과, 감압 농축 후 표제의 화합물을 얻었다(흰색 고체 300mg, 70%).
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 5.08 (s, 2H), 6.80-6.95 (m, 3H), 7.07-7.13 (m, 2H) 7.33 (t, J =8.1 Hz, 1H), 7.44-7.48 (m, 2H)
LC/MS(M+H): 218.12
1-6.(E)-4-(3-(3-(4-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)벤즈아마이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00011
상기 실시예 1-3에서 제조한 (E)-3-(4-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시카바모일)페닐)아크릴산 (100mg, 0.34mmole)에 EDCI (66mg, 0.34mmole)와 다이메틸아미노피리딘(DMAP; 42mg, 0.34mmole) 및 상기 실시예 1-5에서 제조한 3-(4-플루오로벤질옥시)아닐린 (112mg, 0.51mmole) 넣고 건조 테트라하이드로푸란 5mL에 녹인 후 N2 풍선을 달고 실온에서 12시간 교반시켰다. 반응이 종결되면 농축한 후, 물에 녹이고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이어, Na2SO4로 건조시키고, 감압 농축 후 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다(고체 127mg, 76%).
TLC (EtOAc/Hex = 1/1) Rf 0.3
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 2.00-2.27 (m, 6H), 3.42 (s, 1H), 3.99-4.03 (m, 1H), 4.47-4.55 (m, 1H), 5.44 (s, 2H) 7.12-7.21 (m, 1H), 7.20 (d, J =15.7 Hz, 1H), 7.45-7.64 (m, 4H), 7.82-7.88 (m, 3H), 8.03-8.08 (m, 3H), 8.20 (d, J =8.3 Hz, 2H)
LC/MS(M+H): 491.16, 492.17
1-7.(E)-4-(3-(3-(4-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아미이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00012
상기 실시예 1-6에서 제조한 (E)-4-(3-(3-(4-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)벤즈아마이드 (120mg, 0.24mmole)를 메탄올(MeOH) 5mL 및 CH2Cl2 2mL에 녹인 후 얼음 상에서 트라이플루오로 아세트산(TFA; 280mg, 2.45mmole)를 천천히 넣은 후 실온에서 12시간 교반시켰다. 반응이 종결되면 농축 후, 여과, CH2Cl2로 세척하여 표제의 화합물을 얻었다(연분홍색 고체 89mg, 91%).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 4.71 (s, 2H) 6.37-6.39 (m, 1H), 6.53 (d, J =15.7 Hz, 1H), 6.84-6.89 (m, 4H), 7.13-7.17 (m, 3H), 7.24 (d, J =15.7 Hz 1H), 7.33 (d, J =8.1 Hz, 2H), 7.45 (d, J =8.1 Hz, 2H), 8.74 (bs, 1H), 9.91 (bs, 1H), 10.94 (bs, 1H)
LC/MS(M+H): 407.10, 408.08
실시예 2: (E)-4-(3-(3-(2-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00013
2-1. 1-플루오로-2-((3-나이트로페닐옥시)메틸)벤젠의 제조
Figure 112009012114585-pat00014
3-나이트로페놀 (1g, 7.19mmole)을 아세톤 10mL에 녹인 후, 2-플루오로벤질브로마이드 (1.49g, 7.9mmole) 및 K2CO3 (1.98g, 14.38mmole)을 넣은 후 60℃에서 3시간 교반하였다. 반응이 종결되면 감압 농축, 물에 녹인 후 에틸 아세테이트로 추출한 후, Na2SO4로 건조시키고, 여과, 감압 농축 후 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다(흰색 고체 1.74g, 98%).
TLC (EtOAc/Hex = 5/95) Rf 0.3
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.20 (s, 2H), 7.09-7.52 (m, 6H), 7.84-7.86 (m, 2H)
LC/MS(M+H): 247.99
2-2. 3-(2-플루오로벤질옥시)아닐린의 제조
Figure 112009012114585-pat00015
상기 실시예 2-1에서 제조한 1-플루오로-2-((3-나이트로페닐옥시)메틸)벤젠 (1.0g, 4.04mmole)을 에탄올 20mL에 녹인 후 염화 주석(3.45g, 18.20mmole)을 넣고 65℃에서 2시간 교반하였다. 반응이 종결되면 감압 농축, 얼음에 녹인 후 0.5N Na2CO3를 넣고 pH를 9로 조정한 후 CH2Cl2로 3회 추출하고, Na2SO4로 건조시키고 여과, 감압 농축 후 표제의 화합물을 얻었다(흰색 고체 610mg, 70%).
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 5.15 (s, 2H), 6.41-6.48 (m, 3H), 7.06-7.11 (m, 1H), 7.17-7.28 (m, 2H) 7.39-7.46 (m, 1H), 7.56-7.61 (m, 1H)
LC/MS(M+H): 218.06
2-3. (E)-4-(3-(3-(2-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)벤즈아마이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00016
상기 실시예 1-3에서 제조한 (E)-3-(4-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시카 바모일)페닐)아크릴산 (50mg, 0.17mmole)에 EDCI (33mg, 0.17mmole)와 다이메틸아미노피리딘(DMAP; 21mg, 0.17mmole) 및 상기 실시예 2-2에서 제조한 3-(2-플루오로벤질옥시)아닐린 (56mg, 0.26mmole)을 넣고 건조 테트라하이드로푸란 5mL에 녹인 후 N2 풍선을 달고 실온에서 12시간 교반시켰다. 반응이 종결되면 농축한 후, 물과 염수에 녹이고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이어, Na2SO4로 건조시키고, 여과, 감압 농축 후 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다(고체 64mg, 77%).
TLC (EtOAc/Hex = 1/1) Rf 0.1
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 1.77-2.12 (m, 6H), 3.81-3.84 (m, 1H), 4.28-4.38 (m, 1H), 5.25 (s, 1H), 5.33 (s, 2H), 6.96-6.99 (m, 1H), 7.06 (d, J =15.7 Hz, 1H), 7.29-7.56 (m, 4H), 7.52-7.56 (m, 1H), 7.69-7.74 (m, 2H), 7.84-7.90 (m, 3H), 8.01 (d, J =8.3 Hz, 2H)
LC/MS(M+H): 491.05, 492.03
2-4. (E)-4-(3-(3-(2-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00017
상기 2-3에서 제조한 (E)-4-(3-(3-(2-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)벤즈아마이드(58mg, 0.118mmole)를 메탄올 3mL 및 CH2Cl2 2mL에 녹인 후 얼음상에서 테트라하이드로푸란(134mg, 1.18mmole)를 천천히 넣은 후 실온에서 12시간 교반시켰다. 반응이 종결되면 농축 후, 여과, CH2Cl로 세척하여 표제의 화합물을 얻었다(연분홍색 고체 45mg, 94%).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 5.04 (s, 2H) 6.67-6.82 (m, 2H) 7.16-7.35 (m, 12H), 9.01 (bs, 1H), 10.18 (bs, 1H), 11.25 (bs, 1H)
LC/MS(M+H): 406.94, 407.95
실시예 3: (E)-4-(3-(3-(3-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00018
3-1. 1-플루오로-3-((3-나이트로페닐옥시)메틸)벤젠
Figure 112009012114585-pat00019
3-나이트로페놀(1g, 7.19mmole)을 아세톤 10mL에 녹인 후, 3-플루오로벤질브로마이드 (1.49g, 7.9mmole) 및 K2CO3 (1.98g, 14.38mmole)을 넣은 후 60℃에서 3시간 교반하였다. 반응이 종결되면 감압 농축, 물에 녹인 후 에틸 아세테이트로 추출한 후, Na2SO4로 건조시키고, 여과, 감압 농축 후 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다(흰색 고체 1.76g, 99%).
TLC (EtOAc/Hex = 5/95) Rf 0.3
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.14 (s, 2H), 7.02-7.48 (m, 6H), 7.81-7.87 (m, 2H)
LC/MS(M+H): 248.01
3-2. 3-(3-플루오로벤질옥시)아닐린의 제조
Figure 112009012114585-pat00020
상기 실시예 3-1에서 제조한 1-플루오로-3-((3-나이트로페닐옥시)메틸)벤젠 (1.0g, 4.04mmole)을 에탄올 20mL에 녹인 후 염화 주석(3.45g, 18.20mmole)을 넣고 65℃에서 2시간 교반하였다. 반응이 종결되면 감압 농축, 얼음에 녹인 후 0.5N Na2CO3를 넣고 pH를 9로 조정한 후 CH2Cl2로 3회 추출하고, Na2SO4로 건조시키고 여과, 감압 농축 후 표제의 화합물을 얻었다(흰색 고체 630mg, 72%).
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 5.10 (s, 2H), 6.40-6.47 (m, 3H), 7.04-7.12 (m, 2H), 7.22-7.31 (m, 2H) 7.40-7.48 (m, 1H)
LC/MS(M+H): 218.06
3-3. (E)-4-(3-(3-(3-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)벤즈아마이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00021
상기 실시예 1-3에서 제조한 (E)-3-(4-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시카바모일)페닐)아크릴산 (50mg, 0.17mmole)에 EDCI (33mg, 0.17mmole)와 다이메틸아미노피리딘(DMAP; 21mg, 0.17mmole) 및 상기 실시예 3-2에서 제조한 3-(3-플루오로벤질옥시)아닐린(56mg, 0.26mmole)을 넣고 건조 테트라하이드로푸란 3mL에 녹인 후 N2 풍선을 달고 실온에서 12시간 교반시켰다. 반응이 종결되면 농축한 후, 물과 염수를 넣고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이어, Na2SO4로 건조시키고, 여과, 감압 농축 후 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다(고체 70mg, 84%).
TLC (EtOAc/Hex = 1/1) Rf 0.2
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 1.57-1.92 (m, 6H), 3.61-3.65 (m, 1H), 4.07- 4.16 (m, 1H), 5.05 (s, 1H), 5.10 (s, 2H), 6.74-6.77 (m, 1H), 6.85 (d, J =15.7 Hz, 1H), 7.00-7.05 (m, 1H), 7.16-7.21 (m, 2H), 7.25 (d, J =7.9 Hz, 2H), 7.34-7.41 (m, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.64-7.70 (m, 3H), 7.81 (d, J =8.2 Hz, 2H)
LC/MS(M+H): 491.02, 492.06
3-4. (E)-4-(3-(3-(3-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-(하이드록시벤즈아마이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00022
상기 실시예 3-3에서 제조한 (E)-4-(3-(3-(3-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)벤즈아마이드 (62mg, 0.126mmole)를 메탄올 4mL 및 CH2Cl2 2mL에 녹인 후 얼음상에서 트라이플루오로아세트산(TFA; 145mg, 1.26mmole)를 천천히 넣은 후 실온에서 12시간 교반시켰다. 반응이 종결되면 농축 후, 여과, CH2Cl2으로 세척하여 표제의 화합물을 얻었다(연분홍색 고체 45mg, 90%).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 5.07 (s, 2H), 6.70 (d, J =7.14 Hz, 1H), 6.83 (d, J =15.7 Hz, 1H), 7.08-7.26 (m, 5H), 7.38-7.46 (m, 2H), 7.55 (d, J =15.7 Hz, 1H), 7.64 (d, J =8.0 Hz, 2H), 7.76 (d, J =8.0 Hz, 2H), 9.05 (bs, 1H), 10.21 (bs, 1H), 11.25 (bs, 1H)
LC/MS(M+H): 406.94, 407.97
실시예 4: (E)-4-(3-(3-(2,4-다이플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00023
4-1. 2,4-다이플루오로-1-((3-나이트로페닐옥시)메틸)벤젠의 제조
Figure 112009012114585-pat00024
3-나이트로페놀(1g, 7.19mmole)을 아세톤 10mL에 녹인 후, 2,4-플루오로벤질브로마이드 (1.63g, 7.9mmole) 및 K2CO3 (1.98g, 14.38mmole)을 넣은 후 60℃에서 3시간 교반하였다. 반응이 종결되면 감압 농축, 물에 녹인 후 에틸 아세테이트로 추출한 후, Na2SO4로 건조시키고, 여과, 감압 농축 후 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다(흰색 고체 1.87g, 98%).
TLC (EtOAc/Hex = 5/95) Rf 0.3
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.14 (s, 2H), 6.85-6.96 (m, 2H), 7.26-7.31 (m, 1H), 7.43-7.51 (m, 2H), 7.82-7.88 (m, 2H)
LC/MS(M+H): 265.05
4-2. 3-(2,4-다이플루오로벤질옥시)아닐린의 제조
Figure 112009012114585-pat00025
상기 실시예 4-1에서 제조한 2,4-다이플루오로-1-((3-나이트로페닐옥시)메틸)벤젠 (1.0g, 3.77mmole)을 에탄올 20mL에 녹인 후 염화 주석 (3.20g, 16.96mmole)을 넣고 65℃에서 2시간 교반하였다. 반응이 종결되면 감압 농축, 얼음에 녹인 후 0.5N Na2CO3를 넣고 pH를 9로 조정한 후 CH2Cl2로 3회 추출하고, Na2SO4로 건조시키고 여과, 감압 농축 후 표제의 화합물을 얻었다(흰색 고체 880mg, 98%).
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 5.03 (s, 2H), 6.32-6.39 (m, 3H), 6.94-7.03 (m, 3H), 7.49-7.54 (m, 1H)
4-3.(E)-4-(3-(3-(2,4-다이플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)벤즈아마이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00026
상기 실시예 1-3에서 제조한 (E)-3-(4-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시카 바모일)페닐)아크릴산 (50mg, 0.17mmole)에 EDCI (33mg, 0.17mmole)와 DMAP (21mg, 0.17mmole) 및 상기 실시예 4-2에서 제조한 3-(2,4-다이플루오로벤질옥시)아닐린 (61mg, 0.26mmole)을 넣고 건조 테트라하이드로푸란 3mL에 녹인 후 N2 풍선을 달고 실온에서 12시간 교반시켰다. 반응이 종결되면 농축한 후, 물과 염수에 녹이고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이어, Na2SO4로 건조시키고, 여과, 감압 농축 후 관 크로마토그래피로 분리하여 표제의 화합물을 얻었다(고체 66mg, 77%).
TLC (EtOAc/Hex = 1/1) Rf 0.2
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 1.56-1.92 (m, 6H), 3.60-3.66 (m, 1H), 4.09-4.16 (m, 1H), 5.06 (s, 1H), 5.10 (s, 2H), 6.75-6.83 (m, 1H), 6.85 (d, J =15.7 Hz, 1H), 6.94-7.03 (m, 2H), 7.16-7.27 (m, 2H), 7.50-7.59 (m, 2H), 7.65-7.70 (m, 3H), 7.82 (d, J =8.2 Hz, 2H)
LC/MS(M+H): 509.02, 510.03
4-4.(E)-4-(3-(3-(2,4-다이플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드로벤즈아마이드의 제조
Figure 112009012114585-pat00027
상기 4-3에서 제조한 (E)-4-(3-(3-(2,4-다이플루오로벤질옥시)페닐아미노)- 3-옥소프로프-1-에닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)벤즈아마이드 (62mg, 0.126mmole)를 메탄올 4mL 및 CH2Cl2 2mL에 녹인 후 얼음상에서 트라이플루오로아세트산(TFA; 145mg, 1.26mmole)를 천천히 넣은 후 실온에서 12시간 교반시켰다. 반응이 종결되면 농축 후, 여과, CH2Cl2로 세척하여 표제의 화합물을 얻었다(연분홍색 고체 45mg, 90%).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 5.04 (s, 2H) 6.72 (d, J =7.0 Hz, 1H), 6.84 (d, J =15.8 Hz, 1H), 7.09-7.11 (m, 1H), 7.19-7.30 (m, 3H), 7.45 (s, 1H), 7.53-7.59 (m, 4H), 7.65 (d, J =8.1 Hz, 2H), 7.76 (d, J =8.1 Hz, 2H), 9.06 (bs, 1H), 10.22 (bs, 1H), 11.25 (bs, 1H)
LC/MS(M+H): 424.95
실험예: 쥐의 간엽줄기세포의 신경세포로의 분화 유도
<1-1> 신경세포의 분화형태 관찰
본 발명에 따른 화합물에 의한 줄기세포의 신경세포로의 분화 능력을 확인하기 위해 하기와 같은 생체외(in vitro) 실험을 수행하였다.
먼저, 8 주령의 피셔(Fisher) 쥐(입수처: 중앙실험동물)의 대퇴골에서 골수 세포를 분리한 다음 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium) 배양액에서 37℃에 서 배양하였다. 배양한 세포를 1 x 105개의 세포 농도로 T75 배양용기(Nunc)에 넣고 10 일간 37℃에서 3일간 한번씩 배지를 교환하는 조건으로 배양하였다. 이후 세포를 떼어내어 1 x 105개의 세포 농도로 동일 배양 배지를 함유한 배양용기에 넣은 다음 37℃에서 3일간 한번씩 배지를 교환하는 조건으로 10일간 추가 배양하였다. 이러한 과정을 5회 반복하여 간엽줄기세포를 얻었다.
상기에서 얻어진 간엽줄기세포를 1 x 105 개의 세포 농도로 DMEM 배지를 함유한 직경 100 mm의 배양 접시에 넣고, 상기 실시예 1 내지 4의 화합물을 10 uM 농도로 각각 1회 처리 후 2일간 배양하여 신경세포의 분화 형태를 관찰하여 그 결과를 도 1b 내지 1e에 나타내었다. 이때 DMSO만 처리한 세포를 음성 대조군(도 1a 참고)으로 사용하였다.
도 1a 내지 1e에 도시된 바와 같이, 본 발명의 화합물을 처리한 세포는 음성 대조군과 비교하여 세포에서부터 길게 뻗은 수상돌기(dendrite)와 유사한 구조가 형성되는 것을 알 수 있었고, 이는 신경세포로 분화한 것으로 판단되었다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 48시간 이내에 신경전구세포의 신경세포로의 분화를 충분히 유도할 수 있음을 알 수 있다.
<1-2> 세포내 생화학적 변화 관찰
상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 화합물에 대해, 신경세포 분화마커인 뉴런특이 에놀라제(neuron-specific enolase, NSE)의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 단 백질 수준에서 관찰하였다.
상기 실험예 1-1에서 간엽줄기세포에 실시예 1의 화합물 10 uM의 농도로 처리하여 2일간 배양하여 얻어진 세포와 아무것도 처리하지 않은 세포(control; 대조군)에 NSE 항체(입수처: abcam)를 처리하여 각각 면역세포화학검사(문헌[Klaus Scheller et. al., immunocytochemistry, European journal of cell biology, 79: 299-307 (2000)] 참조)를 수행한 결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 화합물을 처리한 세포에서만이 NSE의 발현이 증가하는 것으로 보아 골수유래 간엽줄기세포가 신경세포로 분화하였음을 확인할 수 있었다.
<1-3> 세포내 신경관련 유전자 발현 변화 관찰
상기 실험예 1-1에서 간엽줄기세포에 실시예 1의 화합물 10 uM의 농도로 처리하여 2일간 배양하여 얻어진 세포의 세포내 전사인자(mRNA)를 추출하여 역전사 효소(Bioneer)를 사용하여 상보DNA(cDNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 PCR(증폭반응) kit(Bioneer)을 이용하여 DNA를 증폭하여 1.5% 아가로즈 젤로 DNA를 크기별로 분리하여 영상장치를 사용하여 세포내 전사인자의 양의 증감을 확인하였다. 구체적으로, 증폭 용액은 반응한 cDNA와 각각의 DNA 프라이머(서열번호: 1 및 2의 Rat GAPDH 유전자의 프라이머; 서열번호 3 및 4의 NPY 유전자의 프라이머; 서열번호 5 및 6의 NPW 유전자의 프라이머; 및 서열번호 7 및 8의 ZCCH12 유전자의 프라이머)(하기 표 1 참고) 및 PCR 키트(bioneer)를 섞어서 PCR 기계(Bio-rad)에 넣고 DNA 증폭 조건(94℃에서 30초간 반응후, 55℃에서 30초간 반응하고, 72℃에서 30초간 반응 후 이 반응을 30회 반복)으로 반응시켰다.
신경세포 특이 유전자인 NPY(문헌[Morris, BJ. (1989)., J Comp Neurol 290: 358-368] 참고), NPW(문헌[Meghan M. (2005)., Actions of neuropeptide W in paraventricular hypothalamus: implications for the control of stress hormone secretion. AJP/288: 270-275] 참고) 및 ZCCH12(Sizn1; Ginam C. (2008)., Mol. Cell biology/28: 1565-1572] 참고)의 발현을 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 이때, 양성 대조군으로 대한민국 특허출원 제 2008-0111603호의 실시예 1의 화합물을 처리한 참고 신경세포를 사용하고, 음성 대조군으로 DMSO만을 처리한 간엽줄기세포를 사용하였다. 또한, mRNA의 양을 보정하기 위해 GAPDH를 대조유전자로 사용하였다.
Figure 112009012114585-pat00028
도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 4의 화합물이 간엽줄기세포에 신경세포특이유전자의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다.
도 1a 내지 1e는 본 발명의 화합물을 처리한 간엽줄기전구세포가 신경세포로의 분화하는지 여부를 도립상 현미경으로 관찰한 것이다.
도 2는 본 발명의 화합물을 처리한 간엽줄기전구세포에서 NSE의 발현을 웨스턴 블롯하여 확인한 것이다.
도 3은 본 발명의 화합물을 처리한 간엽줄기전구세포와 아무것도 처리하지 않은 간엽줄기전구세포(음성 대조군)를 RT-PCR(역전사 증폭반응)로 비교한 결과를 나타낸 것이다.
<110> Korea Research Institute of Chemical Technology <120> Cinnamide derivatives and composition for inducing differentiation of neural precursor cells or stem cells into neural cells using same <130> FPD200812-0029 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for rat GAPDH <400> 1 atgccatcac tgccactcag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for rat GAPDH <400> 2 gcatgtcaga tccacaacgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for NPY <400> 3 tccgctctgc gacactacat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for NPY <400> 4 ggcagactgg tttcacagga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for NPW <400> 5 agctgtggga ggtacgaagc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for NPW <400> 6 tgatttgctg caggaaccat 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Zcchc12 <400> 7 agcgcaaaca cacagtccat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Zcchc12 <400> 8 tttaaggctg gagcaaagca 20

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 신나마이드 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 간엽줄기세포의 신경세포로의 분화 유도용 조성물:
    <화학식 1>
    Figure 112011024425935-pat00029
    상기 식에서,
    R은 하나 이상의 F, Cl 또는 Br이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 신나마이드 유도체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물:
    (E)-4-(3-(3-(4-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드;
    (E)-4-(3-(3-(2-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드;
    (E)-4-(3-(3-(3-플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드; 및
    (E)-4-(3-(3-(2,4-다이플루오로벤질옥시)페닐아미노)-3-옥소프로프-1-에닐)-N-하이드록시벤즈아마이드.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 신나마이드 유도체 또는 그의 염을 10 내지 20 μM의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 줄기세포가 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 배아생식 줄기세포 및 배아종양 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항의 조성물을 신경전구세포 또는 간엽줄기세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 간엽줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.
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